Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Выращивание дрозофилы Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

Способ выращивания дрозофилы под аксенический и гнотобионтных условиях представлена. Fly эмбрионы dechorionated в гипохлорит натрия, асептически переносят в стерильную диету, и выращены в закрытых контейнерах. Инокулируя диеты и эмбрионов с бактериями приводит к гнотобионтных ассоциаций, и бактериальный присутствие подтверждается металлизированный всего тела дрозофилы гомогенатах.

Introduction

Большинство животных тесно связаны с бактериями ( «микрофлора») от рождения до смерти 1. Сравнения микроорганизмов , свободной ( 'аксенический') и микроорганизмов-ассоциированных ( "обычных") животных показали микробы влияют на различные аспекты здоровья животных, в том числе обмена веществ, питательных веществ, сосудистой, печени, органов дыхания, иммунологических, эндокринных и неврологической функции 2. Плодовой мушки дрозофилы является ключевой моделью для понимания многих из этих процессов в присутствии микробов 3,4 и для изучения микробиоты влияния на здоровье животных 5,6. Нет видов бактерий присутствует в каждом человеке ( «ядро»), но Acetobacter и Lactobacillus видов численно преобладают микробиота обоих лабораторных выращенных и пойманных D. MELANOGASTER. Другое Acetobacteraceae (включая Komagataeibacter и Gluconobacter), Firmicutes (такие как Enterococcus и Leuconostoc) и энтеробактерий либо часто присутствуют у дрозофилы лиц при низкой численности, или нерегулярно присутствуют на высокой численности 7.12.

Микрофлора дрозофилы и млекопитающих непостоянно внутри и между поколениями 14,19. Микробиота непостоянство может привести к фенотипической шума при измерении микробиоты-зависимых черт. Например, для хранения Acetobacteraceae влияние липидов (триглицерида) в Drosophila 15-18. Если Acetobacteraceae более многочисленны у мух одного флакона , чем в другом 19, изогенных мух может иметь различные фенотипы 20. Решение для проблемы микробиоты непостоянства у мышей 14 был на практике с 1960 -х годов, путем введения определенного сообщества 8 доминирующих видов микроорганизмов к щенкам мыши каждое новое поколение (измененное Schaedler флоры),гарантируя, что каждый щенок подвергается воздействию тех же самых ключевых членов микробиоты мыши. Эта практика управления для микробиоты композиции , даже когда микрофлора не является основным объектом исследования 32, и устанавливает прецедент для обеспечения присутствия ключевых микробов в различных экспериментальных условиях.

Для того, чтобы определить влияние микробов на Drosophila питания, несколько протоколов , используемых для получения аксенический мух линии были разработаны, в том числе гипохлорита dechorionation эмбрионов (либо получена De Novo каждого поколения или поддерживается генерационно путем передачи стерильных диет) и лечение антибиотиками 13. Есть преимущества различных подходов, таких как легкость и быстрота для обоих лечения антибиотиками и последовательной передачи, по сравнению с более эффективного управления вмешивающихся переменных с де Novo dechorionation (например, плотность яиц, остаточных загрязняющих микробов, вне целевой антибиотик эффектов). Независимо от методаподготовка, введение указанных видов микроорганизмов к аксенический эмбрионов позволяет культуру дрозофилы с определенными ( 'гнотобионтных') общин. В качестве альтернативы, имитируя использование Schaedler флоры, это сообщество может быть привиты к условно-откладывали яйца (следующие шаги 6-7 только), чтобы обеспечить наличие признака, оказывающих влияние микробов в каждом флаконе и избежать осложнений микробиоты непостоянства. Здесь мы опишем протокол для повышения аксенический и гнотобионтных дрозофилы де Novo dechorionation эмбрионов, а также для подтверждения присутствия введенного или загрязняющего микробного таксонов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Бактерии Культура (Старт ~ 1 неделя перед собиранием яиц)

  1. Подготовка модифицированного MRS 20 (КМС) пластин и отвар трубки (таблица 1). Налейте MMRS 20 мл агара в каждую 100 мм чашку Петри и дать остыть / сухой в течение ночи или 5 КМС мл отвар на 18 мм тестовых трубок.
  2. Серия ацетобактеры pomorum, А. tropicalis, Lactobacillus Brevis и L. Plantarum на MMRS чашки с агаром. Выдержите ацетобактеры в течение ночи при 30 ° С. Выдержите Lactobacillus анаэробно путем размещения пластины в герметичном контейнере и затоплению с углекислым газом перед герметизацией. Инкубировать при 30 ° С в течение ночи.
    Примечание: L. Brevis колонии не могут быть не видны до 24-48 ч. Пластины можно хранить при температуре 4 ° С и колонии могут быть использованы в течение 3 недель.
  3. От двух до трех дней перед передачей dechorionated яйца в стерильной диете (раздел 5), выбрать одну колонию от пластины КМС в кон пробиркойчалось MMRS бульон. Grow ацетобактеры при встряхивании и расти Lactobacillus статически в течение 24 часов или до мутной, и при 30 ° С.

2. Подготовить стерильный диета

  1. Приготовьте стерильную диету (таблица 2) в колбе Эрленмейера 2 л. Микроволновая диету, пока она не закипит 3 последовательных раз; смешать между каждым кипению.
  2. Поместите колбу на мешалке для поддержания перемешивания при переносе диеты в конические центрифужные пробирки. Перенести 7,5 мл рациона до 50 мл центрифужные пробирки. Неплотно колпачок трубки, и место в покрытом автоклавируемого полипропиленовой стойку.
  3. Стерилизация летучую диеты с использованием автоклава при температуре 121 ° C и 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 25 мин. Удалите стойки из автоклава, и сразу же встряхните каждую стойку горизонтально, чтобы обеспечить рацион не отделиться во время охлаждения. Будьте осторожны, чтобы не трясти стойки вертикально, чтобы предотвратить передачу диеты на крышке или ободов трубок. Дайте остыть диеты на шейкере в течение ровно 45 мин иснова встряхнуть диету по горизонтали вручную.
    Примечание: Диета может храниться при температуре 4-15 ° С в течение до недели.
  4. В качестве альтернативы использованию покрытых автоклавируемые стоек (шаги 2.1-2.3), или поднять мух на диетах, содержащих консервант кислоты, выполните следующие действия:
    1. Готовят 1 л жидкую диету в 2-литровую колбу с мешалкой в ​​колбу. Автоклава диету.
    2. После обработки в автоклаве, добавляют 10 мл консерванта и непрерывно перемешивают на мешалке с подогревом. Когда агар охлаждали до 50-60 ° С, перемещать колбу на мешалке с подогревом в шкафу биологической безопасности и поддерживать температуру в колбе при нагревании при температуре 50-60 ° С.
    3. В шкафу биологической безопасности, пипетка ~ 7,5 мл индивидуально в конические пробирки.

3. Подготовить яйцекладка Cages

  1. Сделать виноградный сок агаром микроволновке 100 мл воды, 10 г дрожжей пивные, 10 г глюкозы и 1 г агар. Доведите до кипения 3 раза в шаге 1.1 и добавляют 10 г замороженного виноградного сока соncentrate увеличить видимость яиц на агаровой пластине.
  2. Когда агар охлаждали до 55 ° С, заливают 20 мл на 100 мм чашках Петри и позволяют затвердеть.
  3. Накройте на поверхность чашек с агаром с дрожжевой пасты путем смешивания дрожжей 1 г пивными с 15 г воды. Залить дрожжи пасту на агар пластины, убедившись, что поверхность покрыта, а затем слейте избыток, оставляя тонкий остаток дрожжей позади. Если используются несколько пластин, паста может быть последовательно вливают в несколько пластин.
  4. Передача агаром на дно клетки.
    Примечание: гастроном контейнер 32 унций является хорошей заменой для акриловых мух клеток.
    1. Сделайте крышки для гастронома контейнеров 32 унций путем разрезания отверстие в верхней части и приклеивая воздухопроницаемой сеткой над отверстием с нетоксичного клея. Если клей растворяется в воде предотвращения воздействия воды на крышке.
  5. Передача 200-300 летит в контейнер и накрыть крышкой. Накройте сетки с защитой отверстие с пустым чашку Петри крышкой для предупреждет испарение с поверхности агара, и добавьте бумагу влажную ткань на внутренней поверхности крышки, при желании. Выдержите мух при 25 ° С в течение ночи в течение 16-20 ч.

4. собирать яйца

  1. Подготовьте сито для сбора яиц, помещая нейлоновую сетку в пластиковую втулку.
  2. Чтобы получить тарелку с яйцами на него, удалить мух из клетки путем передачи пустого контейнера. Если же мухи будут использоваться на следующий день, немедленно передать в новую клетку, содержащую свеже дрожжевого агаризованной виноградный сок. Мухи могут быть использованы в течение 3-5 последовательных дней
  3. Удалить мертвых мух из агара с чистой кистью, соблюдая осторожность, чтобы не разбить агар.
  4. Сбор яиц путем промывки агаризованной дистиллированной водой, аккуратно чистит яйца с поверхности агара, и заливкой суспензии над сеткой. Повторить 3-4 раза, пока все или большинство яиц не были удалены из чашки с агаром.

5. Dechorionate яйца и передачи в стерильную DИЭПП

  1. Подготовьте кабинет по биобезопасности путем распыления внутри (в том числе сторон) с 70% -ным этанолом. Протрите дно с лабораторной ткани и стерилизовать капюшон с УФ-светом в течение ~ 15 мин. Стерилизовать все небиологических поставки (образец чашки, кисть, щипцов, контейнер для отходов, 400 мл стерилизованной воды и 100 мл 0,6% раствора гипохлорита натрия) путем распыления с этанолом и сразу же размещения в шкафу биологической безопасности. Стерилизуют ультрафиолетовым светом в течение 15 мин.
  2. Запустить первый из 2 гипохлорита натрия промывок путем размещения втулке с яйцами в мл образца чашку 120 или другой стерильный контейнер. Медленно влить ~ 90 мл 0,6% раствора гипохлорита натрия во втулку до чуть ниже обода.
  3. Полоскание яйца в течение 2,5 мин. Периодически повторно приостанавливать яйца с помощью щипцов, чтобы переместить втулку вверх и вниз в раствор гипохлорита.
  4. Перенести втулку непосредственно во вторую чашку образца, предварительно заполненный 90 мл хлорной извести, внутри шкафа биологической безопасности.
  5. Повторениешаг 5.3 внутри шкафа биологической безопасности. В конце второй обработки хлорной извести, яйца должны начать придерживаться сторон втулки.
  6. Выполните действия в кабинете биологической безопасности 5,7-5,8.
  7. Выбросьте отбеливатель и промойте втулку стерильной водой в 3 раза. Повторное приостановить яйца несколько раз в течение каждого мытья путем перемещения втулки с пинцетом. К концу третьего мытья большинство яиц должны быть прикреплены к боковой стороне втулки.
  8. Используя кисточку стерилизовали в этаноле, передавать яйца со стороны втулки к стерильной диете. Передача яйца по отдельности или небольшими партиями. Цель для 30-50 яиц в одном флаконе. Оставьте колпачки свободно, чтобы кислород, чтобы войти в трубу. Если пузырьки должны оставаться аксенический, трансфер в инкубаторе насекомых; в противном случае, добавьте бактерии, как показано ниже.

6. Сделать гнотобионтных Мухи Использование 4 видов бактерий

  1. Приготовьте бактерии
    1. Подготовьте стерилизованные шкаф биобезопасности при необходимых расходных материалов (рipettes, пипетку коробки, стерилизованные центрифужные пробирки, MRS бульоне и стоек для пробирок), как на этапе 4.1. Протрите наружную поверхность пробирки с этанолом лаборатории пропитанной протирать перед помещением в кабинете биологической безопасности.
    2. Гранул бактерии сначала путем переноса 500 мкл роста в течение ночи в стерильной пробирке. Если бактериальная плотность мала, добавить до 1,5 мл в каждую пробирку или последовательно удалить супернатант и добавить дополнительную культуру в той же трубе. Удалить образцы из шкафа биологической безопасности и центрифуги в течение 10 мин при 10000 х г. Используйте подсказки фильтра, чтобы избежать загрязнения между образцами.
    3. Определить плотность каждой культуры путем измерения OD 600. При использовании многоскважинных планшет-ридер, передача 200 мкл каждой культуры в 96-луночный планшет в 1-, 2- и 4- кратном разбавлении.
    4. Определить количество КМС, в котором, чтобы разбавить каждый клеточный осадок (5.2.2) с помощью спектрофотометра пластины для чтения и следующие уравнения. План, чтобы добавить достаточно бульона, чтобы инокуляции 50 &# 956; л в каждый флакон мух.
      1. Соберите OD 600 показания для 1: 1, 1: 2 и 1: 4 разведение каждой бактериальной культуры на тарелке чтения спектрофотометра. Выберите разбавление для каждого бактериального штамма , который производит 600 значение OD от 0,1 до 0,2 и использовать это значение и соответствующий коэффициент разбавления как 'O' и 'D' в формулах , приведенных в 6.1.4.2 или 6.1.4.3.
      2. При использовании 4 видов , описанных здесь, нормализуют клетки в эквивалентные колониеобразующих единицы (КОЕ) / мл плотности (OD 600 до преобразования КОЕ определяется ранее 20) , используя это уравнение:
        E = ((OB) х V х Г) / С
        где Е = объем ресуспендирования гранул в (мкл), O = OD 600 бактерий, B ​​= OD 600 пустой носитель, D = кратное разведение, V = мкл бактериальной культуры перед центрифугированием, C = OD 600 из заданной постоянной. См Дополнительный код файла примеры расчетов с использованием этих уравнений. Для спектрофотометраs, которая автоматически пустым, используйте "O" вместо "OB".
        Примечание: Заранее определенные константы (единицы измерения OD 600, нормированная к 10 7 КОЕ мл -1, константы , полученные в 20) следующим образом : A. tropicalis (0,052), А. pomorum (0,038), Л. Brevis (0,056), Л. Plantarum (0,077).
      3. При использовании других видов бактерий (не КОЕ / OD 600 константа не доступен), нормализуют плотность до OD 600 = 0,1 с помощью этого уравнения:
        E = ((OB) х V х Г) /0.1 OD 600
        Примечание: Единицы такие же, как на этапе 6.1.4.2. См Дополнительный код файла примеры расчетов с использованием этих уравнений.
    5. В шкафу биологической безопасности, удалить супернатант с наконечником пипетки и ресуспендируют осадок в свежих КМС или PBS в расчете на этапе 6.1.4.2.
  2. Привить Бактерии
    1. Передача 50 мкл бактерий в конические пробирки со стерильным рационеd dechorionated яйца в шкафу биологической безопасности. Добавить бактерии после переноса яйца, чтобы предотвратить загрязнение между флаконах.
    2. Поместите засеянных пробирки в термостат при температуре 25 ° С

7. Измерение КОЕ нагрузки / Тест на стерильность

  1. Для измерения нагрузки КОЕ в целом тело мухи гомогенатах, передача 5 мух (5-7 дней после вылупления) до 1,7 мл пробирке, содержащей 125 мкл керамических шариков и 125 мкл MMRS бульона. Однородный мух с помощью гомогенизатора тканей в течение 30 сек при 4,0 м / сек.
    1. В качестве альтернативы, опустить шарики и рука гомогенизировать в микропробирок с пластиковыми пестиков в течение 1 мин.
    2. Если количественного кишечную флору, стерилизует поверхность мух для удаления экзогенных микробов 22. Передача летит в микроцентрифужных пробирку, содержащую 100 мкл 70% этанола в течение 1 мин, аспирация этанола и перехода на новую пробирку микроцентрифужных для гомогенизации. Если содержание ДНК в кишечнике будет измеряться, полоскание Fили 1 мин с 0,6% раствором гипохлорита натрия перед промывкой этанолом.
  2. Развести гомогената 875 мкл MMRS, вортексе в течение 5 сек, и пипеткой 120 мкл гомогената в первую лунку микротитрационного планшета.
  3. Выполните два последовательных 1: 8 разведений с использованием 10 мкл гомогената и 70 мкл MRS в течение следующих двух скважин.
    1. Удалить 10 мкл из первой скважины и добавить его на вторую лунку, содержащую 70 мкл MRS. Смешайте содержимое второй скважины тщательно, перенос 10 мкл из второй скважины на третьей скважине, содержащей 70 мкл MRS, и тщательно перемешать. Это приводит к 3 общей концентрации исходного 1000 мкл гомогената: в неразбавленном виде, 1: 8 и 1:64.
  4. Передача 10 мкл каждого разведения к пластине КМС (используя пипетку многоканальную при желании). Слегка наклоните блюдо, чтобы распространить разведение на несколько миллиметров вниз поверхность агара и дайте жидкости высохнуть перед перемещением пластины. Жидкость сохнет по наце пластины быстро если пластины 2 дней, уменьшая смешение двух соседних капель.
  5. Инкубировать при 30 ° С в течение 1-2-х дней. Удалить пластины из инкубатора сразу различны, отдельные колонии видны, и считать от разбавления 10-100 изолированных колоний.
  6. Вычислить КОЕ на лету, используя уравнение E = С х D / P х V / F, где Е = КОЕ на лету, C = количество колоний подсчитывали, D = разбавление, P = мкл высевали, V = объем зольной гомогената и F = число мух гомогенизированных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешное разведение аксенический мух подтверждается выделением не КОЕ от гомогенизации всего тела обследуемого D. MELANOGASTER взрослых (рисунок 1). В качестве альтернативы, если гальваническим гомогенат дает колонии, Флаконы загрязнены и должны быть отброшены. Для гнотобионтных мух, каждый из четырех бактериальных изолятов были выделены из пулов 5 взрослых самцов, демонстрируя различия в общем объеме жизнеспособных КОЕ , связанных с взрослых мух (рисунок 1). Каждый вид бактерий имеет ярко выраженную морфологию и можно отличить визуально (рисунок 2). Если один или несколько типов колоний не обнаружены, возможно, были ошибки при подготовке бактериального инокулята (например, промывка, нормализующий, смешивание) или соответствующие виды не могут быть совместимы с условиями культивирования (например, дрозофила плотность 23 или генотип 24). Чтобы исключить технические ошибки мы Recдуем металлизации часть бактериальной смеси сразу же после того, как инокуляции муху ампул (этап 6.2).

Рисунок 1
Рисунок 1: Колониеобразующие единицы Найдено в аксенический и гнотобионтных дрозофилы Число колониеобразующих единиц (КОЕ) на лету в гомогенатах всего тела 4- х видов гнотобионтных и аксенными D.. MELANOGASTER. Отсутствие колоний в аксенический гомогенатах подтверждает D. MELANOGASTER стерильность. Значения представлены как среднее ± SEM из 24 значений дублированных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Дифференциация Колонии бактерий. </ сильный> КОЕ от образца гомогенизации , показывающий различные морфологию для каждого из 4- х видов в гнотобионтных D. MELANOGASTER. Acetobacter колонии ясный, светло - коричневый цвет и бывают разных размеров в зависимости от вида. ~ 24-36 ч после нанесения покрытия, A. tropicalis колонии являются непрозрачными, в то время как А. pomorum является прозрачным, хотя с течением времени разница становится менее выраженным. Л. Brevis колонии маленькие и белые и L. Plantarum колонии большие и желтые. При необходимости, рост из гомогената можно сравнить с оригинальными бактериями пластин , чтобы помочь отличить каждый тип колонии 20. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

КМС Рецепт
Сумма в г Заметки
Дистиллированная вода 1000
Универсальный Пептон 12,5
Экстракт дрожжей 7.5
глюкоза 20
дикалийфосфат 2
Аммоний цитрата 2
Ацетат натрия 5
Сульфат магния 0,1
марганцевые Сульфат 0,05
агар 12 Не добавляйте в бульон

Таблица 1: КМС рецепт.

<TR>
Дрожжи-глюкоза рецепт диеты
Сумма в г
Дистиллированная вода 500
Пивные дрожжи 50
глюкоза 50
агар 6

Таблица 2: Дрожжи-глюкоза диета рецепт.

Дополнительный код файла:. Примеры расчетов Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный здесь метод является одним из нескольких подходов для эмбрионов dechorionation 8,11,18,25,26,27 вместе с альтернативными методами выращивания аксенический мух, в том числе последовательный перевод аксенический взрослых 18,27 или лечения антибиотиками 13,18. Другие методы включают dechorionation промывок этанол и уменьшить 11,25,26 или продлить 8 гипохлорита лечение. Различные этапы стирки может помочь выращивание различных генотипов мух: в предыдущем исследовании большинство из ~ 100 Drosophila генотипы были аксенический при дыбы , как описано здесь (без промывок этанол), но некоторые линии были загрязнены и отбрасываются 24. Возможно, некоторые загрязненные линии были бы аксенический, если выращены с промывок этанолом или более гипохлорита лечения. Если метод изложенные здесь не приводит к изоляции аксенический мух для конкретных генотипов принимающих мы рекомендуем полосканий этанол или более длительного лечения гипохлорита для устранения проблемы.

лор "> Когда используются последовательные переводы Drosophila, родительское поколение аксенический производится аксенический яичной dechorionation , как описано здесь, и последующие поколения поддерживаются асептического переноса в шкафу биологической безопасности, с добавлением или без антибиотиков 18,27. Последовательная передача происходит быстрее чем получения аксенический мух заново в каждом поколении, и переносят мухи могут оставаться аксенический для нескольких поколений. Одна сложность последовательных переводов является поддержание совпавшие плотности обычных / гнотобионтных и аксенический мух, так как аксенический мухи, как правило, лежали меньше яиц по сравнению с интервалом сравнимой времени (данные не показано). Так как плотность Drosophila влияет множество признаков, в том числе бактериальной композиции в летучей диете 23,28,29, перенося яйца заново каждое поколение может быть более предпочтительным решением для мух плотности чувствительных черт. De Novo dechorionation также исключает возможность бактериального загрязнения во время переводы. Таким образом, в то время как последовательные переводы могут сэкономить время, dechorionation позволяет больший контроль над усложняющих переменных.

Антибиотики также могут быть использованы для создания аксенический мух, хотя в отличие от dechorionation, лечение антибиотиками, как правило , недостаточно , чтобы полностью удалить колонизацию микробов 13. Кроме того, антибиотики могут влиять на хозяина непосредственно. Например, повышение мух на диете с антибиотиками снижает их плодовитость и содержание белка, но эти эффекты не наблюдались у мух , привлеченных от dechorionated эмбрионов 13. Отметим , что антибиотики необходимо устранить эндосимбиотических бактерии, которые передаются по вертикали и не подвержены стерилизации поверхности, такие как Wolbachia 33.

Несколько шагов имеют решающее значение для успеха подготовки dechorionated аксенический или гнотобионтных мух. Во-первых, очень важно, чтобы встряхнуть летучей диеты, как на этапах 2.3. Если стойки не встряхивают вручную в течение примерно 15 секунд каждый до и после точного45 мин интервал на шейкере, дрожжи и агар будет оседать, уменьшая весь доступ к дрожжей и делая поверхность агара слишком мягкая для летучей культуры. Во-вторых, толщина дрожжевой пасты и концентрации агара виноградного сока пластин влияет на удаление яйца (этап 3.3). Тонкий слой, полученный с помощью 1:15 дрожжей в: разбавления водой будет препятствовать яйца от встраивания в агар при ополаскивания и удаления из пищевых пластин (шаг 4.4). В-третьих, если виноградного сока пластины слишком мягкие и распадаются во время сбора яиц, твердость пластин может быть увеличена путем добавления меньше концентрат виноградного сока к следующей партии пластин. В-четвертых, доходность яиц выше, если мухи через 24 часа, чтобы акклиматизироваться к окружающей среде клетки: эту проблему можно решить путем размещения мух в клетке ~ 40 часов до сбора, в том числе перехода на новую коллекцию клетку со свежим агаром <20 ч до желаемой даты сбора. В-пятых, если яйца не придерживаются стороны втулки во время dechorionation (шаг 5.7) RinsING период должен быть продлен на 15-30 сек (Внимание: увеличение времени ополаскивания слишком долго может убить яйца). Кроме того, потери яиц в жидких полосканий можно предотвратить путем проверки сетчатого втулке уплотнение для полного закрытия и проверки того, что яйца не проливать за пределы сита во время повторного суспендирования. Если втулка хорошо уплотнена, разлитые яйца могут быть восстановлены путем заливки мыть через сито в качестве промывного отбрасывается. В-шестых, после того, как мухи вылупились, предположительный тест, чтобы определить, есть ли мухи аксенический является изучение цвета диеты. Если мухи аксенический, верхний слой диеты будет темно-коричневого цвета кофе и никаких воздушных пузырей не будет присутствовать во время диеты. Воздушные пузырьки или коричневый цвет верхнего слоя диеты указывают на присутствие бактерий. Бактериальный присутствие должно еще быть подтверждена путем гомогенизации. В качестве альтернативы, ПЦР - амплификации гена 16S рРНК также могут быть выполнены , чтобы обнаружить unculturable микробами (например, строгие анаэробы) 30. Наконец, после того, как homogenризации, керамические шарики могут использоваться повторно качанием в растворе 2% раствора гипохлорита + 0,05 М гидроксида калия в течение 30 мин, промывание великодушно (10 и более раз) в H 2 O, промывают один раз 100% этанолом (для облегчения сушки), и сушка при 65 ° С. Если все шаги выполнены аккуратно, аксенический мухи должны быть изолированы каждый раз, когда выполняется протокол.

Эта работа описывает метод повторного ассоциирования стерильных эмбрионов дрозофилы с 4-видовой микрофлорой , которая является представителем бактериальных сообществ лабораторных мух , выращенных на диете дрожжей-глюкозы. Предыдущая работа использовала 5-видовой сообщества в том числе 4- х видов здесь и Lactobacillus fructivorans, которое было численно в изобилии в нескольких мух обследований 9,19. Мы рекомендуем опустить L. fructivorans по нескольким причинам, в том числе фенотипов в D. MELANOGASTER monoassociated с L. fructivorans в значительной степени совпадают с аксенными телenotypes 31 и L. fructivorans более привередлив , чем другие муха изолятов. Если L. fructivorans включен, он должен быть культивированы как описано для L. Plantarum и L. Brevis: статическая жидкая культура; и в герметичном контейнере залитый CO 2 для твердой культуры (последний шаг снижает уровень кислорода окружающей среды для поддержания роста Lactobacillus).

Подходы , изложенные здесь , могут быть легко изменены , чтобы поднять дрозофилы при различных гнотобионтных условиях. Например, monoassociated мухи могут быть выращены путем инокуляции стерильных Drosophila эмбрионов с одним микробных видов , в то время 15,25,31. Многовидовые объединения образуются путем инокуляции нескольких видов в эквивалентных соотношениях 20,24. Несмотря на то, мы при условии , КОЕ / OD 600 констант для каждого из 4- х видов для облегчения нормализации, он не может быть необходимо для получения постоянной для большинства видов смесей. ят Ранее было показано , что обилие микробов в 5-7 DpE взрослых существенно не отличалась в 2- х видов ассоциаций , когда начальная плотность бактерий изменялась на три порядка 20. Кроме того , кишка Drosophila является весьма разрешительный, и многие виды, которые легко культивировать на лету диете может ассоциировать с дрозофилы при высокой плотности в monoassociation (например, E.coli, B. Сенная 25) создание условий для генетической рассечение микробного воздействия микробов с обширным генетические и геномные ресурсы. И, наконец, исследования Drosophila фенотипов, которые под влиянием микробиоты могли бы адаптировать подход измененную Schaedler флоры у мышей инокуляцией естественно , установленные обычные яйца с определенным микробного сообщества , чтобы убедиться , что каждый флакон имеет доступ к определенному набору микробов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Некоторые детали этого протокола были оптимизированы с помощью доктора Адама Добсон, который также предоставили полезные замечания по рукописи. Эта работа была поддержана Фондом Национальных институтов здравоохранения (FNIH) номер гранта R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD и AED). FNIH грант номер 1F32GM099374-01 (PDN) и Университет Бригама Янга запуска средства (JMC, MLK, М. В.). Затраты на публикации были поддержаны Brigham Young University College биологических наук и кафедры растительного и животного мира наук.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Биология развития выпуск 113 аксенический гнотобиотических, Микробиомом микрофлора,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Выращивание дрозофилы<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Под аксенический и гнотобионтных Условия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter