Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Het grootbrengen de fruitvlieg Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

Een methode voor het kweken van Drosophila melanogaster onder axenic en gnotobiotische voorwaarden wordt gepresenteerd. Fly embryo's worden dechorionated in natriumhypochloriet, aseptisch in steriele voeding en grootgebracht in gesloten containers. Inenten van voeding en embryo's met bacteriën leidt tot gnotobiotische verenigingen, en bacteriële aanwezigheid wordt bevestigd door plating whole-body Drosophila homogenaten.

Introduction

De meeste dieren zijn nauw verbonden met bacteriën ( 'microbiota') vanaf de geboorte tot de dood 1. Vergelijkingen van micro-organisme-vrij ( 'axenic') en micro-organisme geassocieerde ( 'conventionele') dieren hebben aangetoond microben invloed op diverse aspecten van de gezondheid van dieren, met inbegrip van metabole, nutritionele, bloedvaten, lever, respiratoire, immunologische, endocriene en neurologische functie 2. De fruitvlieg Drosophila melanogaster is een belangrijk model voor het begrijpen van vele van deze processen in de aanwezigheid van microben 3,4 en voor het bestuderen microbiota invloed diergezondheid 5,6. Geen bacteriesoorten aanwezig in ieder individu ( 'core'), maar Acetobacter en Lactobacillus soorten numeriek domineren de microbiota van zowel laboratorium gekweekte en in het wild gevangen D. melanogaster. Andere Acetobacteraceae (inclusief Komagataeibacter en Gluconobacter), Firmicutes (zoals Enterococcus en Leuconostoc), en Enterobacteriaceae zijn ofwel vaak aanwezig in Drosophila personen bij lage overvloed, of onregelmatig aanwezig bij hoge overvloed 7-12.

De microbiota van Drosophila en zoogdieren is wisselvallig binnen en tussen de generaties 14,19. Microbiota wisselvalligheid kan leiden tot fenotypische lawaai bij het meten van microbiota-afhankelijke eigenschappen. Bijvoorbeeld, de Acetobacteraceae invloed lipide (triglyceride) opslag in Drosophila 15-18. Als Acetobacteraceae meer overvloedig in vliegen van een flacon is dan in een andere 19, kan isogene vliegen verschillende fenotypes 20 hebben. Een oplossing voor het probleem van microbiota onbestendigheid bij muizen 14 is in de praktijk sinds de 1960's, door invoering van een bepaalde gemeenschap van 8 dominante microbiële soort muizen- pups elke nieuwe generatie (gewijzigde Schaedler flora),zodat elk pup wordt blootgesteld aan dezelfde belangrijke leden van de muis microbiota. Deze praktijk bedieningsorganen voor microbiota samenstelling zelfs wanneer de microbiota is niet het primaire doel van de studie 32 en stelt precedent de aanwezigheid van belangrijke microben in verschillende experimentele omstandigheden te waarborgen.

Om de invloed van microben op Drosophila voeding te bepalen, hebben een aantal protocollen voor het afleiden van axenic fly lijnen ontwikkeld, met inbegrip van chloorbleekloog dechorionation van embryo's (hetzij afgeleid de novo elke generatie of generationally onderhouden door overschrijving op steriele diëten) en behandeling met antibiotica 13. Er zijn voordelen aan verschillende benaderingen, zoals gemak en snelheid voor beide antibiotica behandeling en seriële overdracht versus meer controle verstorende variabelen de novo dechorionation (bijvoorbeeld ei dichtheid resterende contaminerende microben, off-target antibiotische effecten). Ongeacht de wijze vanvoorbereiding, de introductie van bepaalde microbiële soorten embryo axenische maakt cultuur van Drosophila met gedefinieerde ( 'gnotobiotische') communities. Alternatief nabootsen het gebruik van Schaedler flora die gemeenschap kunnen worden geïnoculeerd conventioneel eitjes (volgende stappen 6-7) om de aanwezigheid van eigenschap beïnvloeden microben Elke flacon en ter voorkoming van complicaties van microbiota onbestendigheid. Hier beschrijven we het protocol voor het verhogen van axenic en gnotobiotische Drosophila door de novo dechorionation van embryo's, en voor het bevestigen van de aanwezigheid van ingevoerd of vervuilende microbiële taxa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultuur Bacteriën (Start ~ 1 week voor Picking eieren)

  1. Bereid gemodificeerde MRS 20 (Mmrs) borden en bouillon buizen (tabel 1). Giet 20 ml Mmrs agar in elk 100 mm Petri plaat en laat het afkoelen / droog 's nachts, of 5 ml Mmrs bouillon in 18 mm reageerbuizen.
  2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, en L. plantarum op Mmrs agarplaten. Incubeer Acetobacter overnacht bij 30 ° C. Incubate Lactobacillus anaëroob door het plaatsen van de platen in een luchtdichte container en overstromingen met kooldioxide voor het afdichten. Incubeer bij 30 ° C overnacht.
    Opmerking: L. brevis kolonies mogelijk niet zichtbaar zijn tot 24-48 uur. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C en kolonies kunnen worden gebruikt tot 3 weken.
  3. Twee tot drie dagen voor de overdracht dechorionated eieren steriele voeding (hoofdstuk 5), kies een enkele kolonie uit de Mmrs plaat in een reageerbuis conbevattende Mmrs bouillon. Acetobacter groeien onder schudden groeien en Lactobacillus statisch gedurende 24 uren of tot troebel, zowel bij 30 ° C.

2. Bereid Steriele Diet

  1. Bereid steriele dieet (tabel 2) in een 2 L Erlenmeyer kolf. Magnetron het dieet totdat de 3 opeenvolgende keer heeft gekookt; mix tussen elke kook.
  2. Plaats de kolf op een roer plaat te handhaven roeren tijdens het overbrengen dieet om conische centrifugebuizen. Transfer 7,5 ml dieet om 50 ml centrifugebuizen. Losjes cap de buizen, en plaats in een overdekte, autoclaveerbaar polypropyleen rack.
  3. Steriliseren vlieg voeding middels een autoclaaf bij 121 ° C en 15 psi gedurende 25 min. Verwijder racks uit autoclaaf, en meteen schud elk rek horizontaal naar dieet niet scheiden tijdens het afkoelen te garanderen. Wees voorzichtig om niet de rekken verticaal te schudden om de overdracht van het dieet om het deksel of velgen van de buizen te voorkomen. Laat de voeding afkoelen op een schudder gedurende precies 45 minuten enopnieuw schudden het dieet horizontaal met de hand.
    Noot: Dieet kan tot een week bewaard bij 4-15 ° C.
  4. Als alternatief voor het gebruik van overdekte autoclaveerbare racks (stappen 2.1-2.3), of vliegen op diëten met zuur conserveringsmiddel te verhogen, als volgt te werk:
    1. Bereid 1 liter vloeibaar dieet in een 2 L kolf met een roervlo in de kolf. Autoclaaf het dieet.
    2. Na behandeling in een autoclaaf, voeg 10 ml conserveringsmiddel en roer voortdurend op een verwarmde roer plaat. Wanneer de agar is afgekoeld tot 50-60 ° C, zet de kolf met een verwarmde roer plaat in een bioveiligheid kast en onderhouden kolf temperatuur door verwarming bij 50-60 ° C.
    3. In de bioveiligheid kast, pipet ~ 7,5 ml afzonderlijk in conische buizen.

3. Bereid eierleggende Cages

  1. Maak druivensap agar-platen door de magnetron 100 ml water, gist 10 g brouwer, 10 g glucose, en 1 g agar. Breng aan de kook 3 keer in stap 1.1 en voeg 10 g bevroren druivensap concentrate om de zichtbaarheid van de eieren te verhogen op de agar plaat.
  2. Wanneer agar is afgekoeld tot 55 ° C, giet 20 ml in 100 mm petrischalen en laten stollen.
  3. Bedek het oppervlak van de agar platen met een gist pasta door het mengen van gist 1 g brouwer met 15 g water. Giet gist plakken op de agar plaat ervoor te zorgen dat het oppervlak bedekt is, giet het overtollige, waardoor een dunne gist residu achter. Als er meerdere platen worden gebruikt, kan de pasta achtereenvolgens worden uitgegoten op meerdere borden.
  4. Transfer agarplaten in de bodem van een kooi.
    Opmerking: Een 32 oz deli container is een goede vervanger voor acryl fly kooien.
    1. Maak deksels voor 32 oz Deli containers door het snijden van een gat in de top en lijmen een ademende over het gat met niet-giftige lijm. Wanneer de lijm wateroplosbare voorkomen water blootstelling aan het deksel.
  5. Transfer 200-300 vliegt in de container en dek af met deksel. Bedek de mesh beschermd gat met een lege petrischaal deksel en om te voorkoment verdamping uit het agar oppervlak en voeg een vochtig tissuepapier in het deksel, indien gewenst. Incubeer vliegen bij 25 ° C geïncubeerd gedurende 16-20 uur.

4. Verzamel Eieren

  1. Bereid een zeef voor ei-collectie door het plaatsen van nylon mesh in een plastic bus.
  2. Om de plaat met eieren op te halen, te verwijderen vliegen uit de kooi door de overdracht van een lege container. Als dezelfde vliegen de volgende dag zal worden gebruikt, onmiddellijk aan een nieuwe kooi met daarin een vers gegist druivensap agar plaat. Vliegen kan worden gebruikt gedurende 3-5 opeenvolgende dagen
  3. Verwijdert dode vliegen uit de agar met een schone penseel, voorzichtig om niet breken de agar.
  4. Eieren verzamelen door het spoelen van de agarplaat met gedestilleerd water, voorzichtig borstelen eieren van het agar oppervlak, en het gieten van de suspensie op het gaas. Herhaal 3-4 totdat alle of de meeste van de eieren uit de agarplaat verwijderd.

5. Dechorionate Eieren en Transfer naar Steriele DIET

  1. Bereid de bioveiligheid kast door het sproeien van de binnenkant (inclusief zijkanten) met 70% ethanol. Veeg de bodem met een lab weefsel en steriliseer de kap met UV licht gedurende ~ 15 minuten. Steriliseren alle niet-biologische materialen (specimen kopjes, penseel, tang, afvalcontainer, 400 ml gesteriliseerd water en 100 ml van 0,6% natriumhypochloriet) door te besproeien met ethanol en onmiddellijk te plaatsen in de bioveiligheid kast. Steriliseren met UV-licht gedurende 15 minuten.
  2. Start de eerste 2 natriumhypochloriet wassen door het plaatsen van de bus met de eieren in een 120 ml specimenkop of andere steriele houder. Giet langzaam ~ 90 ml 0,6% natriumhypochlorietoplossing in de bus tot net onder de rand.
  3. Spoel eieren gedurende 2,5 min. Periodiek opnieuw schort de eieren met behulp van een tang om de bus op en neer in de hypochlorietoplossing te verplaatsen.
  4. Breng de bus direct in een tweede monster cup, pre-gevuld met 90 ml bleekmiddel, in de bioveiligheid kast.
  5. Herhalingstap 5.3 in de bioveiligheid kast. Aan het einde van de tweede bleekmiddel behandeling dient de eieren beginnen te hechten aan de wanden van de doorvoer.
  6. Voer stap 5,7-5,8 in de bioveiligheid kast.
  7. Gooi het bleekmiddel en was de bus met steriel water 3 keer. meerdere keren tijdens elke wasbeurt Resuspendeer de eieren door het bewegen van de bus met een tang. Tegen het einde van de derde wassen zouden de meeste eieren aan de zijkant van de bus worden verbonden.
  8. Met behulp van een penseel gesteriliseerd in ethanol, overdragen eieren vanaf de zijkant van de bus aan de steriele voeding. Transfer eieren individueel of in kleine batches. Doel voor 30-50 eieren per flacon. Laat de doppen los om zuurstof aan de buis te voeren. Als flacons zijn axenic te blijven, over te dragen aan een insect incubator; Anders bacteriën toevoegen hieronder.

6. Zorg gnotobiotische Flies Met behulp van 4 bacteriesoorten

  1. Bereid Bacteriën
    1. Bereid een gesteriliseerde bioveiligheid kast met de nodige voorraden (pipettes, pipetpunt dozen, gesteriliseerd centrifugebuizen, MRS bouillon, en reageerbuis racks) als in stap 4.1. Veeg de buitenkant van reageerbuizen met een-ethanol doordrenkte laboratorium af te vegen voordat u het in bioveiligheid kast.
    2. Pellet de bacteriën door eerst de overdracht van 500 pi van groei gedurende de nacht in een steriele microfugebuis. Als bacteriële dichtheid laag is, oplopen tot 1,5 ml aan elk buisje of achtereenvolgens verwijderen supernatant en voeg extra cultuur aan dezelfde buis. Verwijder monsters van de bioveiligheid kast en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 10.000 x g. Gebruik filter tips om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen.
    3. Bepaal de dichtheid van elke cultuur door het meten van OD 600. Als een multi-well plaatlezer, overdracht 200 pi van elke cultuur een 96-putjesplaat in 1-, 2- en 4-voudige verdunningen.
    4. Bepaal de hoeveelheid Mmrs waarin elke celpellet (5.2.2) met een plaat lezing spectrofotometer en de volgende vergelijkingen verdunnen. Plan om voldoende bouillon toe te voegen aan het enten van 50 &# 956; l voor elke vlieg flacon.
      1. Verzamel OD 600 metingen van een 1: 1, 1: 2 en 1: 4 verdunning van elk bacteriecultuur op een plaat lezen spectrofotometer. Selecteer de verwatering voor elke bacteriële stam die een OD 600-waarde tussen 0,1 en 0,2 en het gebruik van deze waarde en de bijbehorende verdunningsfactor als 'O' en 'D' in de formules gegeven in 6.1.4.2 en 6.1.4.3 produceert.
      2. Bij gebruik van de 4 soorten beschreven, normaliseren cellen gelijkwaardige kolonievormende eenheid (CFU) / ml dichtheden (OD 600 CFU conversie bepaald voorheen 20) met deze vergelijking:
        E = ((OB) x V x D) / C
        waarbij E = volume pellet in (pl) mengen, O = OD 600 bacteriën, B = OD 600 blanco media, D = fold-verdunning, V = ul bacteriecultuur voorafgaand aan centrifugeren, C = OD 600 van de vooraf bepaalde constante. Zie Aanvullende Code bestand voor voorbeelden van berekeningen met deze vergelijkingen. voor spectrofotometers die automatisch leeg is, gebruikt "O" in plaats van "OB".
        Opmerking: De vooraf bepaalde constanten (eenheden OD 600, genormaliseerd naar 10 7 CFU ml -1, constanten afgeleid 20) zijn als volgt: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Bij gebruik van andere bacteriële species (geen CFU / OD 600 constant beschikbaar is), normaliseren dichtheid OD 600 = 0,1 met deze vergelijking:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Opmerking: Eenheden zijn dezelfde als in stap 6.1.4.2. Zie Aanvullende Code bestand voor voorbeelden van berekeningen met deze vergelijkingen.
    5. In de bioveiligheid kast, verwijder supernatant met een pipet tip en resuspendeer de pellet in verse Mmrs of PBS zoals berekend in stap 6.1.4.2.
  2. Inoculeer Bacteriën
    1. Breng 50 pl van de bacteriën aan de conische buizen met een steriele voedingd dechorionated eieren in bioveiligheid kast. bacteriën toe te voegen na het ei transfer naar besmetting tussen flesjes te voorkomen.
    2. Plaats geïnoculeerd buizen in een incubator bij 25 ° C

7. Meet CFU Load / test voor steriliteit

  1. Om de CFU lading in het hele lichaam fly homogenaten, overdracht 5 vliegen (5-7 dagen na verpopping) naar een 1,7 ml microfugebuis die 125 ul van keramiek kralen en 125 pl Mmrs bouillon te meten. Homogeniseren vliegen met een tissue homogenisator gedurende 30 seconden bij 4,0 M / sec.
    1. Als alternatief weglaten kralen en met de hand te homogeniseren in microcentrifugebuizen met plastic stampers gedurende 1 minuut.
    2. Als het kwantificeren van de darmflora, oppervlakte steriliseren de vliegen om exogene microben 22 te verwijderen. Transfer vliegt een microcentrifugebuis met 100 pl 70% ethanol gedurende 1 minuut, aspireren ethanol, overgebracht in een nieuwe microcentrifugebuis voor homogenisaties. Als de DNA-inhoud van de darm wordt gemeten spoelen fof 1 min met 0,6% natriumhypochloriet voor de ethanolwassing.
  2. Verdun het homogenaat met 875 gl Mmrs, vortex gedurende 5 seconden de pipet 120 ul homogenaat in het eerste putje van een microtiterplaat.
  3. Voer twee opeenvolgende 1: 8 verdunningen gebruikt 10 ul homogenaat en 70 pl MRS in de volgende twee putten.
    1. Verwijder 10 ul uit het eerste putje en voeg deze toe aan de tweede put die 70 pi MRS. Meng de inhoud van de tweede put grondig, overdracht 10 ul van de tweede goed aan de derde putje met 70 ul MRS, en meng goed. Dit leidt tot 3 totale concentraties van de oorspronkelijke 1000 ul homogenaat: onverdund, 1: 8 en 1:64.
  4. Breng 10 pl van elke verdunning een Mmrs plaat (een multi-channel pipet indien gewenst). Iets neig de schotel naar de verwatering enkele millimeters langs de agar oppervlak verspreid en laat vloeistof drogen voordat het verplaatsen van de plaat. De vloeistof droogt op The plaat sneller als de platen zijn 2 dagen oud, het verminderen van het mengen van twee naburige druppeltjes.
  5. Incubeer bij 30 ° C gedurende 1-2 dagen. Verwijder platen uit de incubator eenmaal onderscheiden, individuele kolonies zichtbaar zijn, en tellen vanaf een verdunning met 10-100 geïsoleerde kolonies.
  6. Bereken CFU per vliegen met behulp van de formule E = C x D / P x V / F, waarbij E = de CFU per fly, C = aantal getelde kolonies, D = verdunning, P = ui verguld, V = volume van de fly homogenaat, en F = aantal vliegen gehomogeniseerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Succesvolle opfok van axenic vliegen wordt bevestigd door isolatie van geen CFU's uit het hele lichaam homogenisaties van D. melanogaster volwassenen (figuur 1). Als alternatief, als de vergulde homogenaat levert kolonies, de flesjes zijn vervuild en moet worden weggegooid. Voor gnotobiotische vliegen, elk van de vier bacteriële isolaten werden geïsoleerd uit pools van 5 volwassen mannen, waaruit verschillen in de totale levensvatbare CFU's geassocieerd met volwassen vliegen (figuur 1). Elke bacteriële soort heeft een uitgesproken morfologie en kan visueel worden onderscheiden (figuur 2). Indien één of meer kolonie typen niet gedetecteerd er zijn fouten kan hebben in het bereiden van de bacteriële inoculum (bijvoorbeeld wassen, normaliseren, mengen) of de overeenkomstige soorten niet compatibel met kweekomstandigheden (bijvoorbeeld Drosophila dichtheid 23 of genotype 24). Om uit te sluiten technische fouten we recseren plating een gedeelte van de bacteriële mengsel direct na enten fly flacons (stap 6,2).

Figuur 1
Figuur 1: kolonievormende eenheden Gevonden in Axenische en gnotobiotische Drosophila Het aantal kolonievormende eenheden (CFU) per fly geheel-lichaam homogenaten van 4-species gnotobiotische en D. axenische. melanogaster. Gebrek aan kolonies in de axenic homogenaten bevestigt D. melanogaster steriliteit. Waarden worden voorgesteld als gemiddelde ± SEM van 24 repliceren waarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Differentiatie bacteriekolonies. </ strong> CFU's uit een monster gehomogeniseerd met verschillende morfologieën voor elk van de 4-species in gnotobiotische D. melanogaster. Acetobacter kolonies zijn een duidelijke, lichtbruine kleur en zijn er in verschillende maten, afhankelijk van de soort. ~ 24-36 uur na plateren, A. tropicalis kolonies zijn ondoorzichtig, terwijl A. pomorum transparant, maar na verloop van tijd het verschil minder uitgesproken. L. brevis kolonies zijn klein en wit en L. plantarum kolonies zijn groot en geel. Indien nodig, de groei van het homogenaat kan worden vergeleken met de oorspronkelijke bacteriën platen om te helpen onderscheiden elke soort kolonie 20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Mmrs Recept
Bedrag in g Notes
Gedistilleerd water 1000
Universal Peptone 12.5
Gist extract 7.5
Glucose 20
Dipotassium Fosfaat 2
ammoniumcitraat 2
Natriumacetaat 5
Magnesiumsulfaat 0.1
Mangaan sulfaat 0.05
agar-agar 12 Niet toevoegen aan bouillon

Tabel 1: Mmrs recept.

<tr>
Gist-glucose dieet recept
Bedrag in g
Gedistilleerd water 500
Biergist 50
Glucose 50
agar-agar 6

Tabel 2: gist-glucose dieet recept.

Aanvullende Code Bestand:. Sample Berekeningen Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methode is een van de verschillende benaderingen voor het embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, samen met alternatieve houderijsystemen axenic vliegen, met inbegrip van seriële overdracht van axenic volwassenen 18,27 of een behandeling met antibiotica 13,18. Andere dechorionation methoden omvatten ethanol wast en verminderen 11,25,26 of uit te breiden 8 hypochloriet behandeling. Verschillende wasstappen kunnen helpen grootbrengen verschillende fly genotypes: in een eerdere studie de meeste van ~ 100 Drosophila genotypen waren axenic toen gehouden zoals hier beschreven (zonder ethanol wasbeurten), maar sommige lijnen werden besmet en weggegooid 24. Misschien dat sommige vervuilde lijnen zou axenic zijn geweest als grootgebracht met ethanol wasbeurten of langer hypochloriet behandeling. Als de hier geschetste methode niet leidt tot isolatie van axenic vliegen voor bepaalde host genotypes raden wij ethanol spoelingen of langere behandeling hypochloriet om het probleem te verhelpen.

ent "> Wanneer serial transfers van Drosophila worden gebruikt, wordt een ouderlijke axenic generatie gemaakt axenic door ei dechorionation zoals hier beschreven, en de volgende generaties worden onderhouden door middel van aseptische overdracht in een bioveiligheid kast, met of zonder antibiotica 18,27. Seriële overdracht is sneller dan afleiden axenic vliegt opnieuw elke generatie, en overgebracht vliegen kan axenic blijven voor meerdere generaties. een complicatie van seriële transfers is het handhaven geëvenaard dichtheden van conventionele / gnotobiotische en axenic vliegt sinds axenic vliegen de neiging om minder eieren dan een vergelijkbaar tijdsinterval (gegevens niet leggen weergegeven). Aangezien Drosophila dichtheid beïnvloedt verschillende eigenschappen, waaronder bacteriële samenstelling in vlieg voeding 23,28,29, overbrengen eieren opnieuw elke generatie kan een superieure benadering voor vlieg dichtheid-gevoelige kenmerken zijn. de novo dechorionation vermijdt ook de mogelijkheid van bacteriële besmetting tijdens transfers. dus, terwijl seriële transfers tijd besparen, dechorionation maakt meer controle compliceren variabelen.

Antibiotica kunnen ook worden gebruikt om axenic vliegen maken, maar in tegenstelling tot dechorionation antibiotische behandeling doorgaans onvoldoende voor het verwijderen van microben koloniseren 13. Bovendien kunnen antibiotica de gastheer direct beïnvloeden. Bijvoorbeeld, het verhogen van vliegen op een dieet met antibiotica vermindert de vruchtbaarheid en het eiwitgehalte, maar deze effecten werden niet waargenomen in vliegen verhoogd van dechorionated embryo 13. We merken dat antibiotica nodig zijn om endosymbiotic bacteriën die verticaal worden verzonden en worden niet beïnvloed door oppervlakte sterilisatie, zoals Wolbachia 33 elimineren.

Verschillende stappen zijn cruciaal voor het succes van de voorbereiding dechorionated axenic of gnotobiotische vliegen. Ten eerste is het van cruciaal belang om de vlieg voeding schudden, want in de stappen 2.3. Als de rekken niet met de hand geschud voor ongeveer 15 sec elk vóór en na een exacte45 min interval op de shaker, zal de gist en de agar te regelen, waardoor de toegang tot gist vliegen en het maken van de agar oppervlak te zacht voor fly cultuur. Ten tweede, de dikte van gistpasta en agar concentratie druivensap platen beïnvloedt egg verwijderen (stap 3,3). Een dunne laag geproduceerd door een 01:15 gist: water verwatering zal voorkomen dat de eieren aan het inbedden in de agar bij het spoelen en het verwijderen van het voedsel platen (stap 4.4). Ten derde, als druivensap platen te zacht en breken tijdens eieren ophalen, stevigheid platen kan verhoogd worden met minder druivensapconcentraat de volgende reeks platen. Ten vierde, ei opbrengsten zijn hoger als vliegen hebben 24 uur om te acclimatiseren aan de kooi milieu: dit kan door het plaatsen van vliegen in de kooi ~ 40 uur van tevoren van de collectie, waaronder overplaatsing naar een nieuwe collectie kooi met een frisse agarplaat <20 worden aangepakt hr vóór de gewenste ophaaldag. Ten vijfde, indien de eieren zich niet aan de kant van de bus tijdens dechorionation (stap 5,7), de rinsing termijn moet worden verlengd met 15-30 sec (Let op: de verlenging van de spoeling te lang mogen de eieren te doden). Ook kan ei verlies in de vloeistof spoelingen worden voorkomen door het controleren van de mesh-bus afdichting voor volledige afsluiting en controleer of de eieren niet buiten de zeef niet morst tijdens de re-ophanging. Als de bus goed is afgedicht, kan gemorste eieren worden teruggewonnen door het gieten van het wassen door de zeef als de was wordt weggegooid. Zesde na uitgekomen vliegen, een oriënterende proef om te bepalen of de vliegen axenic is de kleur van het dieet te onderzoeken. Als de vliegen axenic, zal de bovenlaag van het dieet van een donkerbruine kleur koffie en geen luchtbellen zullen door de voeding aanwezig zijn. Luchtbellen of bruine kleur van de top dieet laag aan te geven bacteriële aanwezigheid. Bacteriële aanwezigheid moet nog worden bevestigd door homogenisatie. Alternatief PCR amplificatie van het 16S rRNA-gen kan ook worden uitgevoerd om cultiveerbare microben (bijvoorbeeld strikt anaerobe) 30 te detecteren. Uiteindelijk, na homogenordening, keramiek kralen kunnen hergebruikt door tuimelen in een oplossing van 2% hypochloriet + 0,05 M kaliumhydroxide gedurende 30 min, spoelen ruim (10 maal of meer) in H2O, eenmaal wassen met 100% ethanol (het drogen te vergemakkelijken), en drogen bij 65 ° C. Als al deze stappen zorgvuldig worden gevolgd, moet axenic vliegen geïsoleerd worden elke keer het protocol wordt uitgevoerd.

Dit werk beschrijft een werkwijze voor het opnieuw associëren steriele Drosophila embryo's met een 4-species microbiota dat representatief is voor de bacteriële laboratorium vliegen gerezen over een gist-glucose dieet. Eerder werk heeft een 5-species gemeenschap gebruikt, met inbegrip van de 4-soorten hier en Lactobacillus Fructivorans, die numeriek overvloedig is geweest in diverse fly enquêtes 9,19. We raden u aan het weglaten van L. fructivorans om verschillende redenen, waaronder die in fenotypes D. melanogaster monoassociated met L. fructivorans zijn grotendeels congruent met axenic phenotypes 31 en L. fructivorans is meer veeleisend dan andere vlieg isoleert. Als L. fructivorans opgenomen moet worden gekweekt zoals is beschreven voor L. plantarum en L. brevis: statische vloeistof cultuur; en in een luchtdichte verpakking overspoeld met CO 2 voor vaste cultuur (de laatste stap vermindert ambient zuurstof niveaus Lactobacillus groei te ondersteunen).

De hier geschetste aanpak kan gemakkelijk worden gevarieerd om Drosophila verhogen onder diverse gnotobiotische omstandigheden. Bijvoorbeeld monoassociated vliegt kan worden gehouden door het enten steriele Drosophila embryo's met een microbiële soort tegelijk 15,25,31. Multi-soorten verenigingen worden gevormd door het enten van meerdere soorten in gelijke verhoudingen 20,24. Hoewel we ontvangen CFU / OD 600 constanten voor elk van de 4-species normalisatie vergemakkelijken, kan het niet nodig zijn om een constante voor de meeste soorten mengsels leiden. ikt is eerder aangetoond dat de overvloed van microben 5-7 dpe volwassenen was niet significant verschillend in 2-soorten combinaties bij het ​​begin dichtheid van bacteriën dan drie ordes van grootte 20 werd gevarieerd. Ook de Drosophila darmen zeer tolerant en veel soorten die gemakkelijk gekweekt op fly dieet kan associëren met Drosophila bij hoge dichtheden in monoassociation (bijvoorbeeld, E. coli, B. subtilis 25) waardoor genetische dissectie van de microbiële beïnvloeding door microben met uitgebreide genetische en genomische hulpbronnen. Tot slot, studies van Drosophila fenotypes die worden beïnvloed door de microbiota zou de aanpak van Altered Schaedler Flora in muizen aan te passen door het enten van nature gelegd conventionele eieren met een bepaalde microbiële gemeenschap om ervoor te zorgen elke flacon heeft toegang tot een specifieke set van microben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Sommige details van dit protocol werden geoptimaliseerd met de hulp van Dr. Adam Dobson, die ook voorzien van nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Stichting voor de National Institutes of Health (FNIH) subsidie ​​nummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, en AED). FNIH subsidie ​​nummer 1F32GM099374-01 (PDN), en Brigham Young University opstarten fondsen (JMC, MLK, MV). Publicatiekosten werden gesteund door de Brigham Young University College van Life Sciences en het ministerie van Plant and Wildlife Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Developmental Biology axenic gnotobiotische, Microbiome microbiota,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Het grootbrengen de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Onder Axenische en gnotobiotische voorwaarden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter