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Developmental Biology

L'élevage du Fruit Fly Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

Une méthode pour l' élevage Drosophila melanogaster dans des conditions axéniques et gnotobiotiques est présenté. Fly embryons sont dechorionated dans l'hypochlorite de sodium, transférés de manière aseptique à l'alimentation stérile, et élevés dans des récipients fermés. Inoculant régime alimentaire et les embryons avec des bactéries conduit à des associations gnotobiotiques, et la présence bactérienne est confirmée par plaquage du corps entier homogénats drosophile.

Introduction

La plupart des animaux sont intimement associés à des bactéries ( «microbiote») de la naissance à la mort 1. Les comparaisons de ( «classique») des animaux exempts de micro - organismes ( 'axénique') et un micro-organisme associé ont montré microbes influencent divers aspects de la santé animale, y compris métabolique, nutritionnel, vasculaire, hépatique, respiratoire, immunologique, endocrinien, et la fonction neurologique 2. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est un modèle clé pour comprendre un grand nombre de ces processus dans la présence de microbes 3,4 et pour l' étude microbiote influence sur 5,6 de la santé animale. Aucune espèce bactérienne est présente dans chaque individu ( «noyau»), mais les espèces Acetobacter et Lactobacillus dominent numériquement le microbiote des deux élevés en laboratoire et sauvages capturés D. melanogaster. Acetobacteraceae autres (y compris Komagataeibacter et Gluconobacter) Firmicutes (comme Enterococcus et Leuconostoc), et entérobactéries sont soit souvent présent chez les individus de drosophile à faible abondance, ou irrégulièrement présent à forte abondance 7-12.

Le microbiote de la drosophile et les mammifères est inconstante au sein et à travers les générations 14,19. Microbiota inconsistance peut conduire à un bruit phénotypique lors de la mesure des traits de microbiote-dépendants. Par exemple, le stockage Acetobacteraceae influence lipides (triglycérides) chez la drosophile 15-18. Si Acetobacteraceae sont plus abondants dans les mouches d'un flacon que dans un autre 19, les mouches isogéniques peuvent avoir différents phénotypes 20. Une solution pour le problème de microbiote inconsistance chez la souris 14 a été dans la pratique depuis les années 1960, par l' introduction d' une communauté définie de 8 espèces microbiennes dominantes souriceaux chaque nouvelle génération (modifié la flore SCHAEDLER),veiller à ce que chaque chiot est exposé aux mêmes membres clés de la microflore de la souris. Cette pratique contrôle de la composition du microbiote même lorsque le microbiote est pas la cible principale de l' étude 32, et crée un précédent pour assurer la présence de microbes clés dans une variété de conditions expérimentales.

Pour définir l'influence des microbes sur la drosophile nutrition, plusieurs protocoles pour dériver des lignes de mouche axéniques ont été mis au point, y compris l' hypochlorite dechorionation d'embryons (soit dérivée de novo chaque génération ou maintenu generations par transfert à des régimes alimentaires stériles) et un traitement antibiotique 13. Il y a des avantages à différentes approches, telles que la facilité et la rapidité à la fois du traitement aux antibiotiques et transfert en série, par rapport à un plus grand contrôle des variables confondantes avec de novo dechorionation (par exemple, la densité des oeufs, des microbes contaminants résiduels, les effets hors-cible d' antibiotiques). Indépendamment de la méthode dela préparation, l' introduction d'espèces microbiennes spécifiées aux axéniques embryons permet la culture de Drosophila avec les communautés ( 'gnotobiotiques') définis. Alternativement, imitant l'utilisation de la flore SCHAEDLER, cette communauté pourrait être inoculé aux œufs conventionnellement fixées (en suivant les étapes 6-7 seulement) pour assurer la présence de microbes de traits influençant dans chaque flacon et éviter les complications de microbiote inconsistance. Nous décrivons ici le protocole pour élever axénique et gnotobiotique Drosophila par de novo dechorionation d'embryons, et pour confirmer la présence de taxons microbien introduit ou contaminant.

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Protocol

1. Les bactéries Culture (Début ~ 1 semaine avant cueillette des oeufs)

  1. Préparer MRS modifié 20 (TMM) plaques et tubes de bouillon (tableau 1). Verser 20 ml de gélose mmrs dans chaque plaque 100 mm de Pétri et laisser refroidir / sécher pendant la nuit, ou 5 ml mmrs bouillon dans 18 tubes à essai en mm.
  2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis et L. plantarum sur mmrs plaques d' agar. Incuber Acetobacter nuit à 30 ° C. Incuber dans des conditions anaérobies Lactobacillus en plaçant les plaques dans un récipient étanche à l' air et l' inondation avec du dioxyde de carbone avant le scellement. Incuber à 30 ° C pendant une nuit.
    Note: L. colonies brevis peuvent ne pas être visible jusqu'à 24-48 heures. Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C et les colonies peuvent être utilisées pour 3 semaines.
  3. Deux à trois jours avant de transférer les œufs dechorionated à l'alimentation stérile (section 5), choisir une seule colonie de la plaque de TMM dans un tube à essai conmmrs de Taining bouillon. Cultivez Acetobacter avec agitation et grandir Lactobacillus statiquement pendant 24 heures ou jusqu'à ce trouble, à la fois à 30 ° C.

2. Préparer stérile Diet

  1. Préparer régime alimentaire stérile (tableau 2) dans un ballon Erlenmeyer de 2 litres. Micro-ondes le régime jusqu'à ce qu'il ait bouilli 3 fois séquentielles; mélanger entre chaque ébullition.
  2. Placer le ballon sur une plaque d'agitation pour maintenir l'agitation tout en transférant l'alimentation à tubes à centrifuger coniques. Transfert de 7,5 ml de l'alimentation à tubes de 50 ml de centrifugeuse. plafonner légèrement les tubes, et le placer dans un rack de polypropylène autoclavable couverte.
  3. Stériliser à l'alimentation de la mouche à l'aide d'un autoclave à 121 ° C et 15 psi pendant 25 min. Retirer les grilles de l'autoclave, et agiter immédiatement chaque rack horizontalement pour assurer l'alimentation ne se sépare pas pendant le refroidissement. Attention à ne pas secouer les grilles verticalement pour empêcher le transfert de l'alimentation sur le couvercle ou rebords des tubes. Laissez l'alimentation refroidir sur un agitateur pendant exactement 45 minutes etagiter de nouveau le régime à l'horizontale à la main.
    Note: Le régime alimentaire peut être conservé à 4-15 ° C pendant jusqu'à une semaine.
  4. Comme une alternative à l'utilisation de racks autoclavables couverts (étapes 2.1-2.3), ou pour élever des mouches sur les régimes alimentaires contenant conservateur acide, procédez comme suit:
    1. Préparer 1 L diète liquide dans un flacon de 2 litres avec un barreau d'agitation dans le ballon. Autoclave le régime alimentaire.
    2. Après autoclavage, ajouter 10 ml de conservation et mélanger en continu sur une plaque d'agitation chauffée. Lorsque la gélose a refroidi à 50-60 ° C, déplacer le ballon à une plaque d'agitation chauffée dans une enceinte de sécurité biologique et de maintenir la température du flacon par chauffage à 50-60 ° C.
    3. Dans le cabinet de biosécurité, pipette ~ 7,5 ml individuellement dans des tubes coniques.

3. Préparer Cages pondeuses

  1. Fabriquer des plaques d'agar-jus de raisin par micro-ondes 100 ml d'eau, de la levure de bière 10 g, 10 g de glucose et 1 g d'agar-agar. Porter à ébullition 3 fois à l'étape 1.1 et ajouter 10 g de raisins congelés jus concentrate pour augmenter la visibilité des oeufs sur la plaque de gélose.
  2. Lors de l'agar a refroidi à 55 ° C, verser 20 ml dans des boîtes de Petri de 100 mm et laisser se solidifier.
  3. Recouvrir la surface des plaques d'agar-agar avec une pâte de levure en mélangeant la levure de bière 1 g à 15 g d'eau. Verser la pâte de levure sur la plaque de gélose assurant que la surface est recouverte, puis verser l'excès, laissant un résidu de levure mince derrière. Si plusieurs plaques sont utilisées, la pâte peut être versé de manière séquentielle à plusieurs plaques.
  4. Transférer des plaques d'agar dans le fond d'une cage.
    Remarque: Un conteneur de charcuterie 32 oz est un bon substitut pour les cages à mouches acryliques.
    1. Faire des couvercles pour conteneurs de charcuterie 32 oz en perçant un trou dans le haut et le collage d'une maille respirante sur le trou avec de la colle non toxique. Si la colle est soluble dans l'eau d'empêcher l'exposition de l'eau au couvercle.
  5. Transfert 200-300 vole dans le récipient et le couvercle avec couvercle. Couvrez le trou de maille protégée avec une boîte de Pétri couvercle vide prévent l'évaporation de la surface de la gélose et ajouter un papier de soie humide à l'intérieur du couvercle, si désiré. Incuber mouches à 25 ° C pendant la nuit pour 16-20 h.

4. Recueillir des oeufs

  1. Préparer un tamis pour la collecte des œufs en plaçant filet de nylon dans une douille en plastique.
  2. Pour récupérer la plaque avec des oeufs sur elle, retirez les mouches de la cage en transférant à un conteneur vide. Si même les mouches seront utilisées le jour suivant, transférer immédiatement à une nouvelle cage contenant une plaque de gélose jus de raisin fraîchement yeasted. Les mouches peuvent être utilisées pendant 3-5 jours consécutifs
  3. Retirer les mouches mortes de l'agar-agar avec un pinceau propre, en faisant attention de ne pas briser l'agar-agar.
  4. Collecter des oeufs en rinçant la plaque de gélose avec de l'eau distillée, le brossage en douceur des œufs de la surface de la gélose, et en versant la suspension sur le maillage. Répéter 3-4 fois jusqu'à ce que la totalité ou la plupart des oeufs ont été enlevés de la plaque de gélose.

5. Dechorionate Oeufs et Transfert à Stérile Diet

  1. Préparer l'enceinte de sécurité biologique par pulvérisation à l'intérieur (y compris les côtés) avec 70% d'éthanol. Essuyez le fond avec un tissu de laboratoire, et stériliser le capot avec une lumière UV pendant environ 15 min. Stériliser toutes les fournitures non-biologiques (spécimens tasses, pinceau, pinces, conteneurs de déchets, 400 ml d'eau stérilisée, et 100 ml d'hypochlorite de sodium à 0,6%) par pulvérisation avec de l'éthanol et de placer immédiatement dans l'armoire de biosécurité. Stériliser à la lumière UV pendant 15 min.
  2. Commencez la première de 2 lavages d'hypochlorite de sodium en plaçant la douille avec les oeufs dans un ml spécimen tasse 120 ou un autre récipient stérile. ~ Verser lentement 90 ml d'une solution d'hypochlorite de sodium à 0,6% dans la douille jusqu'à ce que juste au-dessous de la jante.
  3. Rincer les œufs pendant 2,5 minutes. Périodiquement remettre en suspension les oeufs à l'aide d'une pince pour déplacer la douille vers le haut et vers le bas dans la solution d'hypochlorite.
  4. Transférer la douille directement dans une seconde tasse de spécimen, pré-rempli avec 90 ml eau de Javel, dans l'armoire de biosécurité.
  5. Répéterl'étape 5.3 dans l'armoire de biosécurité. A la fin du deuxième traitement de blanchiment, les œufs devraient commencer à adhérer aux parois de la filière.
  6. Effectuer les étapes 5.7-5.8 dans l'armoire de biosécurité.
  7. Jeter l'eau de Javel et laver la douille avec de l'eau stérile 3 fois. Resuspendre les oeufs plusieurs fois au cours de chaque lavage par déplacement de la douille avec une pince. À la fin du troisième lavage la plupart des œufs doivent être fixés sur le côté de la douille.
  8. Stérilisé à l'aide d'un pinceau dans l'éthanol, le transfert des œufs à partir du côté de la douille à l'alimentation stérile. Transfert des œufs individuellement ou en petits lots. Visez 30-50 œufs par flacon. Laissez les bouchons en vrac pour permettre à l'oxygène d'entrer dans le tube. Si les flacons doivent rester axénique, transfert à un incubateur d'insectes; sinon, ajouter des bactéries comme ci-dessous.

6. Faire Gnotobiotic Flies Utilisation de 4 espèces bactériennes

  1. préparer des bactéries
    1. Préparer une enceinte de biosécurité stérilisée avec les fournitures nécessaires (pipettes, boîtes de pointes de pipettes, tubes à centrifuger stérilisés, bouillon de MRS et supports de tube à essai) comme à l'étape 4.1. Essuyez l'extérieur de tubes à essai avec un laboratoire d'éthanol imbibé lingette avant de placer dans l'armoire de biosécurité.
    2. Sédimenter les bactéries en transférant d'abord 500 pi de croissance pendant une nuit dans un tube de microcentrifugation stérile. Si la densité bactérienne est faible, ajouter jusqu'à 1,5 ml dans chaque tube ou séquentiellement retirer le surnageant et ajouter la culture supplémentaire dans le même tube. Retirer les échantillons de l'enceinte de sécurité biologique et centrifuger pendant 10 min à 10000 x g. Utilisez des conseils de filtre pour éviter la contamination entre les échantillons.
    3. Déterminer la densité de chaque culture par mesure de la DO 600. Si vous utilisez un lecteur de plaque multi-puits, transférer 200 ul de chaque culture à une plaque de 96 puits dans 1-, 2- et 4- dilutions.
    4. Déterminer la quantité de TMM dans lequel diluent chaque culot cellulaire (5.2.2) à l'aide d'un spectrophotomètre de lecture de plaque et les équations suivantes. Prévoyez d'ajouter assez de bouillon pour ensemencer 50 &# 956; l à chaque flacon de mouche.
      1. Collecter des lectures de DO à 600 pour un rapport 1: 1, 1: 2 et 1: 4 dilutions de chaque culture bactérienne sur un spectrophotomètre de plaque de lecture. Sélectionnez la dilution pour chaque souche bactérienne qui produit une valeur de 600 OD entre 0,1 et 0,2 et utiliser cette valeur et son facteur de dilution correspondant comme «O» et «D» dans les formules données dans 6.1.4.2 ou 6.1.4.3.
      2. Si vous utilisez les 4 espèces décrites ici, normaliser les cellules à la colonie équivalente unité de formation (UFC) / ml densités (DO 600 à la conversion CFU précédemment déterminé 20) en utilisant cette équation:
        E = ((OB) x V x D) / C
        où E = volume à remettre en suspension le culot dans (ul), O = OD 600 bactéries, B = OD 600 supports vierges, D = pli-dilution, V = culture bactérienne ul avant centrifugation, C = DO 600 de constante prédéterminée. Voir code supplémentaire Fichier des exemples de calculs en utilisant ces équations. Pour spectrophotomètres qu'automatiquement vide, utiliser "O" à la place de "OB".
        Remarque: Les constantes prédéterminées (unités DO 600, normalisée à 10 7 ufc ml - 1, les constantes dérivées en 20) sont les suivantes: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Si vous utilisez d' autres espèces bactériennes (pas CFU / OD 600 constante est disponible), normaliser la densité de DO 600 = 0,1 en utilisant cette équation:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Note: Les unités sont les mêmes que dans l'étape 6.1.4.2. Voir code supplémentaire Fichier des exemples de calculs en utilisant ces équations.
    5. Dans le cabinet de biosécurité, retirer le surnageant avec une pipette et resuspendre le culot dans mmrs frais ou PBS tel que calculé à l'étape 6.1.4.2.
  2. Inoculer bactéries
    1. Transférer 50 pl des bactéries aux tubes coniques avec une alimentation stériled dechorionated oeufs dans l'armoire de biosécurité. Ajouter des bactéries après le transfert d'oeufs pour éviter la contamination entre les flacons.
    2. Placer les tubes inoculés dans un incubateur à 25 ° C

7. Mesurer CFU Load / Test de Stérilité

  1. Pour mesurer la charge CFU dans les homogénats entiers de mouche du corps, transfert 5 mouches (5-7 jours après Eclosion) à un tube de 1,7 ml de microcentrifugation contenant 125 pi de billes de céramique et 125 pi de bouillon TMM. Homogénéiser les mouches à l'aide d'un homogénéiseur tissulaire pendant 30 s à 4,0 m / s.
    1. Alternativement, omettent des perles et de la main homogénéisent dans des tubes à centrifuger avec pilons en plastique pour 1 min.
    2. Si la quantification du microbiote intestinal, surface stériliser les mouches pour éliminer les microbes exogènes 22. Transfert vole à un tube de microcentrifugation contenant 100 ul de 70% d'éthanol pendant 1 min, aspirer l'éthanol, et le transfert à un nouveau tube pour homogénéisations. Si la teneur en ADN de l'intestin est mesurée, rincer fou 1 min avec de l'hypochlorite de sodium à 0,6% avant le lavage à l'éthanol.
  2. Diluer le broyat avec 875 mmrs ul, vortex pendant 5 secondes, et pipeter 120 pi d'homogénat dans le premier puits d'une plaque de microtitrage.
  3. Effectuer deux séquentielles 1: 8 dilutions en utilisant 10 homogénat pi et 70 pi de MRS dans les deux prochains puits.
    1. Retirer 10 ul du premier puits et l'ajouter à la deuxième puits contenant 70 ul MRS. Mélanger le contenu du deuxième puits à fond, le transfert de 10 ul du second puits au troisième puits contenant 70 ul MRS, et bien mélanger. Cela conduit à des 3 concentrations totales de l'homogénat initial 1000 pi: non dilué 1: 8 et 1:64.
  4. Transfert de 10 pi de chaque dilution à une plaque mmrs (en utilisant une pipette à canaux multiples si désiré). Inclinez légèrement le plat pour répandre la dilution de plusieurs millimètres en bas de la surface de la gélose et permettre au liquide de sécher avant de déplacer la plaque. Le liquide sèche sur the plaque rapidement si les plaques sont âgés de 2 jours, ce qui réduit le mélange des deux gouttelettes voisines.
  5. Incuber à 30 ° C pendant 1-2 jours. Retirer les plaques de l'incubateur, une fois distinctes, des colonies individuelles sont visibles, et compter à partir d'une dilution avec 10-100 colonies isolées.
  6. Calculer CFU par volée en utilisant l'équation E = C x D / P x V / F, où E = CFU par mouche, C = nombre de colonies comptées, D = dilution, P = plaqué ul, V = volume de la mouche homogénat, et F = nombre de mouches homogénéisés.

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Representative Results

Élevage réussie de mouches axéniques est confirmé par l' isolement d'aucune CFU de homogénéisations corps entier de D. adultes melanogaster (Figure 1). Alternativement, si le broyat plaqué donne des colonies, les flacons sont contaminés et doivent être jetés. Pour les mouches gnotobiotiques, chacun des quatre isolats bactériens ont été isolés à partir de pools de 5 mâles adultes, ce qui démontre les différences de CFU viables totaux associés à mouches adultes (figure 1). Chaque espèce bactérienne présente une morphologie distincte et on peut distinguer visuellement (figure 2). Si un ou plusieurs types de colonies ne sont pas détectés il peut y avoir eu des erreurs dans la préparation de l'inoculum bactérien (par exemple, le lavage, la normalisation, le mélange) ou les espèces correspondantes peuvent ne pas être compatibles avec les conditions de culture (par exemple, la densité de Drosophila 23 ou génotype 24). Pour exclure les erreurs techniques que nous recmander le placage d'une partie du mélange bactérien immédiatement après l'inoculation de braguette flacons (étape 6.2).

Figure 1
Figure 1: unités formant des colonies Trouvé dans axéniques et Gnotobiotic Drosophila Le nombre de unités formant colonie (UFC) par mouche dans homogénats corps entier de 4 espèces gnotobiotique et axénique D.. melanogaster. Le manque de colonies dans les homogénats axéniques confirme D. melanogaster stérilité. Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± SEM de 24 valeurs réplicats. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Différenciation colonies bactériennes. </ strong> CFU à partir d' un échantillon d' homogénéisation montrant des morphologies différentes pour chacune des 4 espèces dans le D. gnotobiotique colonies melanogaster. Acetobacter sont, une couleur brun clair clair et viennent dans différentes tailles en fonction des espèces. ~ 24-36 heures après placage, A. colonies tropicalis sont opaques, alors que A. pomorum est transparent, mais au fil du temps la différence devient moins prononcée. L. colonies brevis sont petites et blanches et L. colonies plantarum sont grandes et jaune. Si nécessaire, la croissance de l'homogénat peut être comparé aux plaques de bactéries d' origine pour aider à distinguer chaque type de colonie 20. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

mmrs Recette
Montant en g Remarques
Eau distillée 1000
Universal Peptone 12.5
Extrait de levure 7.5
Glucose 20
phosphate dipotassique 2
ammonium Citrate 2
L'acétate de sodium 5
Sulfate de magnésium 0,1
manganeux Sulfate 0,05
Gélose 12 Ne pas ajouter au bouillon

Tableau 1: TMM recette.

<tr>
Levure-glucose régime alimentaire recette
Montant en g
Eau distillée 500
La levure de bière 50
Glucose 50
Gélose 6

Tableau 2: levure-glucose régime alimentaire recette.

Fichier de code supplémentaire. Exemples de calculs S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La méthode décrite ici est l' une de plusieurs approches pour l' embryon dechorionation 8,11,18,25,26,27, ainsi que d' autres méthodes d'élevage des mouches axéniques, y compris le transfert série des adultes axéniques 18,27 ou un traitement antibiotique 13,18. D' autres méthodes de dechorionation comprennent des lavages à l'éthanol et à réduire les 11,25,26 ou étendent 8 traitement hypochlorite. Étapes de lavage différentes peuvent aider l' élevage différents génotypes de mouche: dans une étude précédente la plupart des ~ 100 génotypes de drosophile ont été axénique lorsqu'ils sont élevés , comme indiqué ici (sans lavages à l'éthanol), mais certaines lignes ont été contaminées et rejetées 24. Peut-être quelques lignes contaminées auraient été axénique si élevés avec des lavages à l'éthanol ou un traitement plus long hypochlorite. Si la méthode décrite ici ne conduit pas à l'isolement de mouches axéniques pour certains génotypes hôtes nous recommandons rinçages d'éthanol ou un traitement plus long de l'hypochlorite pour remédier au problème.

ent "> Lorsque les transferts série de Drosophila sont utilisés, une génération axénique parentale est faite axénique par dechorionation d'œuf comme décrit ici, et les générations suivantes sont maintenues par transfert aseptique dans une enceinte de sécurité biologique, avec ou sans antibiotiques 18,27. transfert de série est plus rapide que de dériver les mouches axéniques nouveau chaque génération, et transférés mouches peuvent rester axénique pour plusieurs générations. une complication des transferts en série est de maintenir des densités appariées de mouches classiques / gnotobiotique et axéniques depuis mouches axéniques ont tendance à pondre moins d'oeufs sur un intervalle de temps comparable (données non montré). comme la densité Drosophila influence plusieurs traits, y compris la composition bactérienne dans la mouche alimentation 23,28,29, le transfert des œufs à nouveau chaque génération peut être une meilleure approche pour les caractères de densité sensible à la mouche. de novo dechorionation évite également la possibilité de contamination bactérienne pendant transferts. Ainsi, alors que les transferts en série peuvent gagner du temps, dechorionation permet plus de contrôle des variables qui compliquent.

Des antibiotiques peuvent également être utilisés pour créer des mouches axéniques, mais contrairement à dechorionation, un traitement antibiotique est généralement insuffisante pour éliminer complètement les microbes colonisant 13. En outre, les antibiotiques peuvent influer directement sur l'hôte. Par exemple, élever des mouches sur un régime alimentaire avec des antibiotiques diminue leur fécondité et la teneur en protéines, mais ces effets ont pas été observés chez des mouches soulevées à partir d' embryons dechorionated 13. Nous notons que les antibiotiques sont nécessaires pour éliminer les bactéries symbiotiques qui sont transmises verticalement et ne sont pas affectés par la stérilisation de surface, tels que Wolbachia 33.

Plusieurs étapes sont essentielles à la réussite de la préparation des mouches axéniques ou gnotobiotiques dechorionated. Tout d'abord, il est crucial de secouer le régime alimentaire de la mouche comme dans les étapes 2.3. Si les grilles ne sont pas ébranlés par la main pendant environ 15 secondes chacun avant et après une exacte45 min d'intervalle sur l'agitateur, la levure et l'agar réglera, réduisant l'accès des mouches à la levure et rendant la surface agar trop mou pour la culture de la mouche. En second lieu, l'épaisseur de la pâte de levure et la concentration de plaques d'agar à base de jus de raisin influe sur l'enlèvement des oeufs (étape 3.3). Une couche mince produite par une levure 1:15 dilution de l'eau empêche les oeufs d'enrobage dans la gélose lors du rinçage et le retrait des plaques d'alimentation (étape 4.4). En troisième lieu, si les plaques à base de jus de raisin sont trop mous et se brisent lors de la collecte des œufs, la fermeté des plaques peut être augmentée en ajoutant moins de concentré de jus de raisin pour le prochain lot de plaques. Quatrièmement, les rendements d'œufs sont plus élevés si les mouches ont 24 heures pour s'acclimater à l'environnement de la cage: cela peut être résolu en plaçant des mouches dans la cage ~ 40 heures à l'avance de la collecte, y compris le transfert à une nouvelle collection cage avec une plaque de gélose fraîche <20 h avant la date de collecte souhaitée. Cinquièmement, si les oeufs ne respectent pas le côté de la douille pendant dechorionation (étape 5.7), les rinspériode ing devrait être prolongée par 15-30 sec (Attention: l'extension de la durée de rinçage trop long peut tuer les œufs). En outre, la perte d'oeufs dans les liquides de rinçage peut être évitée en contrôlant le joint d'étanchéité de type à maille traversée par une fermeture complète et à vérifier que les œufs ne débordent pas à l'extérieur du tamis au cours de la remise en suspension. Si la douille est bien scellé, les œufs renversés peuvent être récupérés en versant le lavage à travers le tamis que le lavage est éliminé. Sixièmement, après les mouches ont éclos, un test présomptif de déterminer si les mouches sont axénique est d'examiner la couleur du régime. Si les mouches sont axénique, la couche supérieure de régime alimentaire sera une couleur café brun foncé et sans bulles d'air sera présent tout au long du régime. Les bulles d'air ou de couleur tan de la couche d'alimentation haut indiquent la présence de bactéries. présence bactérienne doit encore être confirmée par homogénéisation. En variante, l' amplification par PCR du gène de l' ARNr 16S peut également être effectuée pour détecter les micro - organismes non cultivables (par exemple) 30 anaérobies stricts. Enfin, après homogensation, des billes en céramique peuvent réutilisée par basculement dans une solution de 2% d' hypochlorite + 0,05 M d' hydroxyde de potassium pendant 30 minutes, rincer généreusement (10 fois ou plus) , dans H 2 O, lavage une fois avec 100% d' éthanol (pour faciliter le séchage), et séchage à 65 ° C. Si toutes les étapes sont suivies attentivement, les mouches axéniques doivent être isolés chaque fois que le protocole est effectué.

Ce travail présente une méthode pour ré-associer des embryons de drosophile stériles avec un microbiote 4 espèces qui est représentatif des communautés bactériennes de mouches de laboratoire soulevées sur un régime de levure-glucose. Des travaux antérieurs ont utilisé une communauté de 5 espèces , y compris les 4 espèces ici et fructivorans Lactobacillus, qui a été numériquement abondante dans plusieurs enquêtes de mouches 9,19. Nous vous recommandons d' omettre L. fructivorans pour plusieurs raisons, notamment que les phénotypes en D. monoassociated melanogaster avec L. fructivorans sont largement en harmonie avec ph axéniqueenotypes 31 et L. fructivorans est plus fastidieux que d' autres mouche isole. Si L. fructivorans est inclus, il doit être mis en culture comme décrit pour L. plantarum et L. brevis: culture liquide statique; et dans un récipient hermétique inondé de CO 2 pour la culture solide (la dernière étape permet de réduire les niveaux d'oxygène ambiant pour soutenir la croissance de Lactobacillus).

Les approches décrites ici peuvent être facilement modifiées pour élever la drosophile dans diverses conditions gnotobiotiques. Par exemple, monoassociated mouches peuvent être élevés en inoculant embryons de drosophile stériles avec une espèce microbienne à un moment 15,25,31. Associations multi-espèces sont constituées en inoculant plusieurs espèces dans des proportions équivalentes 20,24. Bien que nous avons fourni des UFC / DO600 constantes pour chacune des 4 espèces de faciliter la normalisation, il peut ne pas être nécessaire pour obtenir une constante pour la plupart des mélanges d'espèces. jet a déjà été démontré que l'abondance des microbes dans 5-7 adultes dpe n'a pas été significativement différente dans les associations 2-espèces lorsque la densité de départ de bactéries a été modifiée sur trois ordres de grandeur 20. En outre, l'intestin drosophile est très permissive, et de nombreuses espèces qui sont facilement cultivées sur le régime alimentaire de la mouche peut associer à la drosophile à des densités élevées en monoassociation (par exemple, E. coli, B. subtilis 25) permettant la dissection génétique d'influence microbienne par des microbes avec une vaste ressources génétiques et génomiques. Enfin, des études de phénotypes Drosophila qui sont influencés par le microbiote pourraient adapter l'approche de Altered Schaedler Flora chez les souris en inoculant des œufs classiques naturellement posés avec une communauté microbienne définie pour assurer chaque flacon a accès à un ensemble spécifique de microbes.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Certains détails de ce protocole ont été optimisés avec l'aide du Dr Adam Dobson, qui a également fourni des commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation pour les National Institutes of Health (SPNI) numéro de subvention R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD et AED). SPNI numéro de subvention 1F32GM099374-01 (PDN), et Brigham Young University démarrage des fonds (JMC, MLK, MV). Les frais de publication ont été soutenus par le Collège universitaire Brigham Young Life Sciences et du ministère des plantes et de la faune Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

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Tags

Developmental Biology numéro 113 axénique gnotobiotique, Microbiome microbiote,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

L&#39;élevage du Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sous axéniques et gnotobiotique Conditions
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Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

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