Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Meyve Fly Yetiştirme Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

Aksenik ve gnotobiyotik koşullarda Drosophila melanogaster yetiştirme için bir yöntem sunulmuştur. Fly embriyolar, sodyum hipoklorit dechorionated steril diyet aseptik transfer ve kapalı kaplarda yetiştirilir. Bakteri ile diyet ve embriyolar aşılamak gnotobiyotik dernekler yol açar ve bakteriyel varlığı tüm vücut Drosophila homojenatları kaplama ile teyit edilir.

Introduction

Çoğu hayvan yakından ölüme 1 doğumdan bakterilerin ( 'Mikrobiyota') ile ilişkilidir. Mikroorganizma içermeyen ( 'aksenik') ve mikroorganizma ilişkili (konvansiyonel) hayvanların karşılaştırılması mikropların metabolik, besinsel, vasküler, hepatik, solunum, immünolojik, endokrin ve nörolojik fonksiyon 2 olmak üzere hayvan sağlığı çeşitli yönlerini, etkilediği gösterilmiştir. Meyve Drosophila melanogaster mikrop 3,4 mevcudiyetinde Bu yöntemlerin pek çoğu anlaşılması için ve hayvan sağlığı 5,6 ilgili Mikrobiyota etkisini incelemek için önemli bir modeldir uç. Hiçbir bakteri türleri her birey ( 'çekirdek') mevcuttur, ancak Asetobakter ve Lactobacillus türlerinin sayısal hem laboratuvar yetiştirilen ve vahşi yakalanmış D. Mikrobiyota hakim melanogaster. Acetobacteraceae, Firmi (Komagataeibacter ve Gluconobacter dahil)ve Enterobacteriaceae (örneğin Enterococcus ve Leuconostoc gibi) cutes ya yüksek bolluk 7-12 düşük bolluk Drosophila bireylerde sıklıkla mevcut ya da düzensiz mevcuttur.

Drosophila ve memelilerin Mikrobiyota içinde ve nesiller 14,19 karşısında kararsız olduğunu. Mikrobiyota bağımlı özellikler ölçerken Mikrobiyota değişkenlik fenotipik gürültüye neden olabilir. Örneğin, Drosophila 15-18 Acetobacteraceae etkisi lipid (trigliserid) depolama. Acetobacteraceae başka 19'unda birden flakonun sinekler daha bol iseniz, izogenik sinekler farklı fenotipleri 20 olabilir. Farelerde 14 Mikrobiyota inconstancy sorununa yönelik bir çözüm, fare yavrular (Schaedler florası değiştirilmiş) her yeni nesil 8 baskın mikrobiyal türlerin tanımlanmış bir topluluk getirerek, 1960'lı yıllardan bu yana uygulamada olmuşturHer yavru fare Mikrobiyota aynı anahtar üyelerine maruz sağlamak. Mikrobiyota çalışmanın 32 birincil hedefi değildir ve deneysel koşullar, çeşitli önemli mikrop varlığını sağlamak için bir örnek teşkil bile Bu uygulama Mikrobiyota bileşimi için kontrol eder.

Drosophila beslenme mikropların etkisini tanımlamak için, aksenik sinek hatları türetmek için çeşitli protokoller embriyoların hipoklorit dechorionation (ya türetilmiş de novo her nesil veya steril diyetler transferi ile generationally tutulan) ve antibiyotik tedavisi 13 de dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Bu tür antibiyotikler tedavi ve seri transferi, de novo dechorionation ile karıştırıcı değişkenler (örneğin, yumurta yoğunluğu, artık kirletici mikrop, hedef dışı antibiyotik etkiler) karşı daha fazla kontrol her ikisi için de kolaylık ve hızlılık gibi farklı yaklaşımlar faydaları vardır. Ne olursa olsun yöntemininEmbriyoların aksenik belirtilen mikrobiyal türlerin hazırlama, tanıtım tanımlı ( 'gnotobiyotik') toplulukları ile Drosophila kültürü izin verir. Alternatif olarak, Schaedler florasının kullanımı taklit bu topluluk her flakon sürekli-etkileyen mikropların varlığını sağlamak ve Mikrobiyota inconstancy komplikasyonlarını önlemek için (sadece birkaç adım 6-7 takiben) geleneksel-koydu yumurta inoküle edilebilir. Burada embriyoların de novo dechorionation tarafından aksenik ve gnotobiyotik Drosophila yükseltmek için protokol tarif ve tanıttı veya kontamine mikrobiyal takson varlığını teyit için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kültür Bakteriler (Başlat ~ 1 Hafta Yumurta Toplama önce)

  1. Modifiye MRS 20 (MMRS) plakaları ve suyu boruları (Tablo 1) hazırlayın. Her 100 mm Petri plaka içine agar 20 ml MMRS dökün ve / kuru gecede soğumasını bekleyin, ya da 5 ml MMRS 18 mm test tüpleri içine et suyu.
  2. Streak Asetobakter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, L. agar plakaları MMRS ilgili plantarum. Gece boyunca 30 ° C'de Acetobacter inkübe edin. Kapatmadan önce, karbon dioksit ile hava geçirmez bir kapta ve sel tabak koyarak anaerobik Lactobacillus kuluçkaya yatmaktadır. gece boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
    Not: L. brevis kolonileri 24-48 saat kadar görünür olmayabilir. Plakalar 4 ° C de muhafaza edilebilir ve koloniler 3 hafta için kullanılabilir.
  3. İki üç gün steril diyet (bölüm 5) ile dechorionated yumurta aktarmadan önce, bir test tüpü con içine MMRS plakadan tek bir koloni almakronyum MMRS buyyondan. Her iki 30 ° C'de, çalkalanarak Acetobacter büyümek ve 24 saat boyunca ya da bulanık kadar statik Lactobacillus büyür.

2. Steril Diyet hazırlayın

  1. 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde, steril bir diyet (Tablo 2) hazırlanması. o 3 ardışık kez haşlanmış kadar diyet mikrodalga; Her kaynatın arasında karıştırın.
  2. konik santrifüj tüplerine diyet aktarma sırasında karıştırmaya devam etmek üzere, bir şişeyi çalkalama levhasının üzerine yerleştirin. 50 ml santrifüj tüplerine diyet 7.5 ml aktarın. Gevşek bir kapalı, otoklav polipropilen raf tüpler kap ve yer.
  3. Bir 121 ° C'de otoklav 25 dakika boyunca 15 psi ile uçucu diyet sterilize edin. otoklav gelen rafları çıkarın ve hemen soğuma sırasında ayrı değil diyet sağlamak için yatay olarak her raf sallayın. kapağı veya tüplerin jantlara diyetin transferini önlemek için dikey rafları sallamak için dikkatli olun. Diyet tam 45 dakika boyunca bir karıştırıcıda soğumasına izin verin veYine elle yatay diyet sallayın.
    Not: Diyet bir hafta kadar için 4-15 ° C'de muhafaza edilebilir.
  4. örtülü Otoklavlanabilir raflar kullanmaya alternatif olarak (2.1-2.3 adımlar), veya asit koruyucu içeren diyetler sinekleri yükseltmek için, aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
    1. şişeye bir karıştırma çubuğuna sahip 2 L'lik bir şişede 1 litre sıvı diyet hazırlayın. diyet Otoklav.
    2. Otoklavlamadan sonra, 10 mi koruyucu eklenir ve ısıtılmış bir karıştırma plakası üzerinde sürekli karıştırılır. ağar, 50-60 ° C'ye soğuduktan sonra, 50-60 ° C'de ısıtılarak şişe sıcaklığı biyo-güvenlik kabini ısıtılmış bir karıştırma plakası balon hareket ve bakımı.
    3. biyogüvenlik kabini, ayrı ayrı konik tüpler içine pipet ~ 7.5 ml.

3. Yumurta döşeme Kafesleri Hazırlamak

  1. 100 ml su, 10 gr bira mayası, 10 g glukoz ve agar 1 g mikrodalga tarafından üzüm sulu agar tabakları sağlayın. Adım 1.1 Çıban için 3 kez getirin ve dondurulmuş üzüm suyu co 10 gr ekleyinncentrate Agar plaka üzerine yumurta görünürlüğünü artırmak için.
  2. agar 55 ° C'ye soğuduktan sonra, 100 mm Petri kaplarına 20 ml dökün ve katılaşmaya sağlar.
  3. 15 g su ile 1 gr bira mayası karıştırılarak bir maya macunu ile agar plakaları yüzeyini kaplar. arkasında ince bir maya kalıntısı bırakarak, aşırı kapalı dökün, sonra, yüzey kaplı emin agar plaka üzerine maya macunu dökün. Birden plakaları kullanıldığında, hamur ardışık birden fazla plakalara dökülebilir.
  4. Bir kafesin dibine agar aktarın.
    Not: 32 oz deli konteyner akrilik sinek kafesleri için iyi bir alternatiftir.
    1. üst delik açan ve toksik olmayan bir yapıştırıcı ile delik üzerinde bir hava örgü yapıştırma 32 oz deli kutu kapağı sağlayın. tutkal ise suda çözünen kapaklı su maruziyetini önlemek.
  5. Transferi 200-300 kabın içine uçar ve kapak ile kapatın. PREVEN için boş bir Petri kabı kapağı ile örgü korumalı delik kapağıistenirse agar yüzeyinden t buharlaşma ve kapağın içinde nemli kağıt mendil ekleyin. 16-20 saat boyunca 25 ° C sıcaklıkta gece boyunca sinekler inkübe edin.

4. Yumurta Toplama

  1. plastik kovan içine naylon örgü yerleştirerek yumurta toplama bir elek hazırlayın.
  2. Üzerinde yumurta plaka almak için, boş bir kaba aktarılarak kafes sinekler çıkarın. Aynı sinekler ertesi gün kullanılacaksa, taze mayalı üzüm suyu agar plaka içeren yeni bir kafes hemen aktarın. Sinekler 3-5 ardışık gün için kullanılabilir
  3. agar kırmak için dikkatli olmak, temiz bir fırça ile agar ölü sinekler çıkarın.
  4. yavaşça, damıtılmış su ile agar plaka yıkama agar yüzeyinden yumurta fırçalama ve tel üzerinde bulamacın dökülerek yumurta toplamak. Tüm ya da yumurta en agar plakasından temizleninceye kadar 3-4 kez tekrarlanır.

5. Dechorionate Yumurta ve Steril D TransferiIET

  1. % 70 etanol ile (iki tarafın da dahil) iç püskürtülerek biyogüvenlik kabini hazırlayın. Bir laboratuar dokusu ile alt silin ve ~ 15 dakika boyunca UV ışığı ile kaputu sterilize edin. etanol ile püskürtme ve hemen biyogüvenlik kabini yerleştirerek tüm biyolojik olmayan malzemeleri (örnek bardak, fırça, forseps, çöp konteyneri, 400 ml steril su ve% 0.6 sodyum hipoklorit 100 ml) sterilize edin. 15 dakika boyunca UV ışığı ile sterilize edin.
  2. 120 ml'lik numune fincan ya da diğer steril kap içine yumurta burcunu yerleştirerek 2 sodyum hipoklorit yıkar ilk başlayın. Yavaşça sadece jant altına kadar kovan içine ~% 0.6 sodyum hipoklorit solüsyonu 90 ml dökün.
  3. 2.5 dakika boyunca yumurta durulayın. Periyodik yukarı ve aşağı hipoklorit çözeltisi içinde burcunu taşımak için forseps kullanarak yumurta yeniden askıya.
  4. İkinci örnek kabına doğrudan burcu aktarın, biyogüvenlik kabini içinde, 90 ml çamaşır suyu ile önceden doldurulmuş.
  5. Tekrar etbiyogüvenlik kabini içinde 5.3 adım. ikinci ağartma işleminin sonunda, yumurta burcun kenarlarına bağlı başlamalıdır.
  6. yürütmek biyogüvenlik kabini 5,7-5,8 adımları.
  7. ağartıcı atın ve steril su ile 3 kez burcunu yıkayın. forseps ile burcunu hareket ettirerek yumurta her yıkama sırasında birkaç kez yeniden askıya. Üçüncü yıkama sonunda çoğu yumurta burç tarafına eklenmelidir.
  8. etanol içinde sterilize bir fırça kullanılarak, steril bir diyete burç tarafından yumurta aktarın. tek tek veya küçük gruplar halinde yumurta transferi. flakon başına 30-50 yumurta hedefleyin. Oksijen tüpü girmesine izin gevşek kapakları bırakın. şişeler aksenik kalması ise, bir böcek inkübatör transfer; Aksi takdirde, aşağıdaki gibi bakteri ekleyin.

6. gnotobiyotik 4 Bakteri Türlerinin Kullanımı Sinekler olun

  1. Bakteriler hazırlayın
    1. Gerekli malzemeleri ile sterilize biyogüvenlik kabini hazırlayın (pipettes, pipet kutuları, sterilize santrifüj tüpleri, MRS suyu ve adım 4.1 olarak test tüpü rafları). Etanol-batırılmış laboratuvar test tüpleri dışını silin biyogüvenlik kabini yerleştirmeden önce silin.
    2. İlk steril bir mikro santrifüj tüpüne gece boyunca büyümeye 500 ul aktararak, bakterinin ufalanması. bakteriyel yoğunluk düşükse, her tüpe 1,5 ml kadar ekleyin ya da sırayla süpernatant kaldırmak ve aynı tüp ekstra kültürü ekleyin. 10.000 x g'de 10 dakika süre ile biyo-güvenlik kabini ve santrifüj örnekleri çıkarın. numuneler arasındaki kirlenmesini önlemek için filtre ipuçlarını kullanın.
    3. OD 600 ölçülerek, her kültürünün yoğunluğunu belirler. Çok-çukurlu plaka okuyucusu kullanılarak halinde, 1-, 2-, ve 4- kat seyreltiler halinde 96 oyuklu bir plakaya her bir kültür, 200 ul transfer.
    4. Bir plaka okuma spektrometresi kullanılarak her bir hücre pelletini (5.2.2) ve aşağıdaki denklem sulandırmak için olan MMRS miktarını belirler. & 50 aşılamak için yeterli suyu eklemeyi planlıyoruz# 956; her sinek flakon l.
      1. 1, 1: 2 ve 1: plaka okuma spektrometresi üzerine her bir bakteri kültürü 4 seyreltme OD 1 600 okuma toplayın. 0.1 ve 0.2, bu değer ve 6.1.4.2 ya 6.1.4.3 verilen formüllerde 'O' ve 'D' ve kendi ilgili seyreltme faktörü kullanımı arasında bir OD600 değeri üreten Bakteriyel suşların her biri için seyreltme seçin.
      2. Burada açıklanan 4 tür kullanıyorsanız, (belirlenen önceden CFU dönüşüm 20 OD 600) Bu denklemi kullanarak eşdeğer koloni oluşturan birim hücreleri (CFU) / ml yoğunluklara normalleştirmek:
        E = ((OB) x V x D) / C
        E = hacim (ul) pelet tekrar süspansiyon nerede, O = OD 600 bakteri, B = OD 600 boş medya, D = katlama seyreltme, V = ul bakteri kültürü önce santrifüj, önceden belirlenmiş sabiti C = OD 600. Yan Kod bu denklemler kullanılarak hesaplamalar örnekleri için dosya bakın. spektrofotometre için"OB" yerine "O" otomatik olarak boş kullanın s.
        Not: aşağıdaki gibi önceden belirlenmiş sabitleri (10 7 CFU ml -1 normalize birimler OD 600, 20 yılında elde edilen sabitler): A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L brevis (0.056), L plantarum (0.077).
      3. Diğer bakteri türlerini kullanarak, bu denklemi kullanarak 600 = 0.1 OD yoğunluğu normalleştirmek (hayır CFU / OD 600 sabit mevcuttur):
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Not: üniteleri aşama 6.1.4.2 ile aynıdır. Yan Kod bu denklemler kullanılarak hesaplamalar örnekleri için dosya bakın.
    5. biyogüvenlik kabini, bir pipet ucu ile süpernatant kaldırmak ve adım 6.1.4.2 hesaplanan taze MMRS veya PBS içinde pelletini.
  2. Bakteriler aşılamak
    1. Steril diyet An ile konik tüpler transfer bakterilerin 50 uld biyogüvenlik kabini yumurta dechorionated. şişeleri arasında kirlenmeyi önlemek için yumurta transferinden sonra bakteri ekleyin.
    2. 25 ° C'de bir inkübatör içinde inoküle tüpleri

Sterilite 7. Önlem CFU Yük / Test

  1. Seramik boncuk 125 ul ve MMRS suyu 125 ul içeren bir 1.7 ml mikrofuge'de tüp tüm vücut sinek homojenatlarında transfer 5 sinekler (5-7 gün sonrası eclosion) CFU yükünü ölçmek için. 4.0 m / saniye, 30 saniye boyunca bir doku homojenleştirici kullanılarak homojenize sinekler.
    1. Alternatif olarak, boncuk ve el 1 dakika boyunca plastik havan tokmaklarının ile mikrosantrifüj tüpler homojenize atlayabilirsiniz.
    2. Gut Mikrobiyota miktarının ise eksojen mikropları 22 kaldırmak için sinekler sterilize yüzey. Aktarım homogenizations için yeni bir mikrosantrifüj tüpü 1 dakika, aspirat etanol ve transferi için 100 ul% 70 etanol ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpü gider. bağırsak DNA içeriği ölçülecek olursa, f durulamaveya etanol yıkamadan önce% 0.6 sodyum hipoklorit ile 1 dk.
  2. 875 ul MMRS, 5 saniye boyunca girdap ile Homojenat seyreltilir ve bir mikrotitre plakasının birinci oyuğuna homojenat 120 ul pipetleyin.
  3. 10 ul Homojenat ve önümüzdeki iki kuyu 70 ul MRS kullanarak 8 dilüsyonları: İki ardışık 1 gerçekleştirin.
    1. İlk kuyudan 10 ul çıkarın ve ikinci kuyu içeren 70 ul Marsilya ekleyin. Üçüncü de içeren 70 ul Marsilya transferi, iyice ikinci kuyudan 10 ul ikinci kuyunun içeriğini karıştırın ve iyice karıştırın. inceltilmiş, 1: 8 ve 1:64 bu 3 toplam orijinal 1000 ul homojenat konsantrasyonlarına yol açar.
  4. Transfer MMRS plakasına her seyreltme için 10 ul (arzu edildiği takdirde, bir çok kanallı pipet kullanarak). Biraz agar yüzeyine aşağı seyreltisi birkaç milimetre yaymak ve sıvı plakasını geçmeden önce kurumasını bekleyin çanak eğin. Sıvı th üzerinde kururPlakalar iki komşu damlacıkların karışmasını azaltma, 2 gün eski hızlı, e ​​plakası.
  5. 1-2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin. bir zamanlar farklı, bireysel koloniler görünür inkübatör plakaları çıkarın ve 10-100 izole koloniler ile bir seyreltme saymak.
  6. denklemi E = C x D / P x V sinek başına E = CFU, C = kolonilerin sayısı / K, D = seyreltme, P ul sinek Homojenat, V = hacim kaplama = kullanarak anında başına CFU hesaplayın ve F = homojenize sineklerin sayısı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aksenik sinekler başarılı yetiştirme D. tüm vücut homogenizations hiçbir CFU izolasyonu ile doğrulanır melanogaster yetişkin (Şekil 1). Kaplanmış Homojenat kolonileri verimleri Alternatif olarak, eğer şişeler kontamine ve atılmalıdır. Gnotobiyotik sinekler için, dört bakteriyel izolatların her yetişkin sinekler (Şekil 1) ile ilişkili toplam canlı CFU farklılıkları gösteren, 5 yetişkin erkeklerin havuzları izole edilmiştir. Her bir bakteri türleri farklı bir yapıya sahiptir ve görsel olarak (Şekil 2) ayırt edilebilir. Bir veya daha fazla koloni tipi algılanmazsa bakteriyel inokulum hazırlanmasında edilmiş hata var olabilir (örneğin, yıkama, normalizasyon, karıştırma) ya da karşılık gelen türler kültür koşulları ile uyumlu olmayabilir (örneğin, Drosophila yoğunluğu 23 veya genotip 24). Biz rec teknik hatalar ekarte etmek içinönerirsiniz hemen sinek şişeleri (adım 6.2) aşılamak sonra bakteri karışımı bir kısmını kaplama.

Şekil 1
Şekil 1: Aksenik ve gnotobiyotik Drosophila Bulunan Koloni Oluşturma Birimleri 4 türler gnotobiyotik ve aksenik D'nin tüm vücut homojenatlarında sinek başına koloni oluşturan birim (CFU) sayısı. melanogaster. Aksenik homojenatlarında kolonilerin eksikliği D. doğruladı melanogaster kısırlık. Değerler 24 tekrarlı değerleri ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: bakteri kolonileri Farklılaşan. </ gnotobiyotik D. 4-türlerinin her biri için farklı morfolojik gösteren örnek bir homojenleştirme güçlü> CFU melanogaster. Asetobakter koloniler berrak, açık kahverengi renk ve türlere göre değişen boyutlarda gelir. Kaplama, A. sonrasında ~ 24-36 saat tropicalis kolonileri, opak A. ise zamanla fark daha az belirginleşir olsa pomorum, şeffaftır. L. brevis kolonileri küçük, beyaz ve L. vardır plantarum kolonileri büyük ve sarı. Homojenattan gerekli büyüme kolonisi 20 her türünü ayırt yardımcı olmak için orijinal bakteri plakaları mukayese edilebilir edin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

MMRS Tarif
g miktarı notlar
Arıtılmış su 1000
evrensel Pepton 12.5
Maya Özü 7.5
glikoz 20
dipotasyum Fosfat 2
amonyum Sitrat 2
Sodyum asetat 5
Magnezyum sülfat 0.1
Manganez Sülfat 0.05
ağar 12 buyyondan için katmayın

Tablo 1: MMRS tarifi.

<tr>
Maya-glikoz diyet tarifi
g miktarı
Arıtılmış su 500
Bira mayası 50
glikoz 50
ağar 6

Tablo 2: Maya-glikoz diyet tarifi.

Yan Kod Dosya:. Örnek Hesaplamalar Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada anlatılan yöntem birlikte aksenik yetişkinlerin 18,27 seri devir veya antibiyotik tedavisi 13,18 dahil aksenik sinekler, yetiştirme alternatif yöntemlerle, embriyo dechorionation 8,11,18,25,26,27 birkaç yaklaşımlardan biridir. Diğer dechorionation yöntemleri etanol yıkamaları yer alır ve 11,25,26 azaltmak ya da 8 hipoklorit uzanır. (Etanol yıkar olmadan) burada belirtildiği gibi yetiştirilen zaman 100 Drosophila genotipleri aksenik olan ~ çoğu önceki çalışmada, ancak bazı çizgiler kirlenmiş ve 24 atıldı: Farklı yıkama adımları farklı sinek genotipleri yetiştirme yardımcı olabilir. Etanol yıkar veya daha uzun hipoklorit tedavi ile yetiştirilen eğer Belki bazı kirlenmiş çizgiler aksenik olurdu. Burada özetlenen yöntem belirli bir konakçı genotipleri için aksenik sineklerin izolasyonuna yol vermezse biz sorunu çözmek için etanol durulama veya daha uzun hipoklorit tedavi tavsiye.

ent "> Drosophila seri transferler kullanıldığında, burada anlatıldığı gibi bir ebeveyn aksenik nesil yumurta dechorionation tarafından aksenik yapılır ve sonraki kuşaklar ile veya antibiyotik 18,27 olmayan bir biyogüvenlik kabini içinde aseptik transferi, tarafından muhafaza edilir. Seri transferi daha hızlıdır ve her nesil yeniden aksenik sinekler kaynaklanan daha sinekler birden nesiller için aksenik kalabilir transfer. aksenik sinekler az bir karşılaştırılabilir zaman aralığında yumurta (veri değil bırakmaya meyilli olduğu seri transfer bir komplikasyon gnotobiyotik / geleneksel ve aksenik sinek eşleşti yoğunlukları sürdürmektedir Drosophila yoğunluk sinek diyet 23,28,29 bakteriyel kompozisyon dahil olmak üzere birden özellikleri, etkilediğinden gösterilmiştir). her nesil yeniden yumurta transferi sinek yoğunluğu duyarlı özellikler için üstün bir yaklaşım olabilir. de novo dechorionation da sırasında bakteriyel kontaminasyon olasılığını önler transferler. Böylece, seri transferler zamandan tasarruf olurken, dechorionation komplike değişkenlerin daha fazla kontrol sağlar.

Antibiyotikler, aynı zamanda dechorionation aksine, antibiyotik tedavisi tam mikrop 13 kolonize çıkarmak için genellikle yetersiz olmasına rağmen, aksenik sinekler oluşturmak için de kullanılabilir. Ayrıca, antibiyotikler doğrudan ana etkileyebilir. Örneğin, antibiyotiklerle bir diyet sinekler yetiştirme kendi doğurganlık ve protein içeriği azalır, ancak bu etkiler dechorionated embriyoların 13 kaldırdı sinekler gözlenmemiştir. Biz antibiyotikler dikey iletilir ve bu Wolbachia 33 gibi yüzey sterilizasyon, etkilenmez endosimbioz bakterileri ortadan kaldırmak için gerekli olduğunu unutmayın.

Birkaç adım dechorionated aksenik veya gnotobiyotik sinekler hazırlama başarısı için kritik öneme sahiptir. Birincisi, adımlarda 2.3 olarak sinek diyet sallamak için çok önemlidir. raflar önce ve kesin sonra her biri yaklaşık 15 saniye boyunca elle çalkalanır değilsenizçalkalayıcı üzerinde 45 dk aralığı, maya ve agar maya erişimi sinek azaltılması ve sinek kültürü için agar yüzeyi çok yumuşak hale geçer. İkincisi, maya hamur kalınlığı ve üzüm suyu plakalarının Agar konsantrasyonu yumurta kaldırma (adım 3.3) etkiler. Bir 01:15 maya tarafından üretilen ince bir tabaka: su seyreltme durulama ve gıda plakaları (4.4 adım) sökerken agar gömme yumurta önleyecektir. üzüm suyu plakaları çok yumuşak ve yumurta toplama sırasında break up Üçüncüsü, eğer plakaların sıkılığını plakalarının sonraki toplu az üzüm suyu konsantresi ilave edilerek artırılabilir. sinekler kafes ortamına alışmak için 24 saat varsa dördüncü, yumurta verimleri yüksektir: Bu taze bir agar plaka ile yeni bir koleksiyon kafesine transferi <20 olmak üzere, toplama önceden ~ kafeste 40 saat sinek yerleştirerek ele alınabilir istenilen toplama tarihinden önce saat. Beşinci olarak, yumurta dechorionation (aşama 5.7), rin içinde burcun tarafına bağlı değilseing süresi 15-30 sn ile uzatılmalıdır (Dikkat: yumurta öldürebilir çok uzun durulama süresi uzanan). Ayrıca, sıvı durulama içine yumurta kaybı tam kapatılması için örgü-burç mühür kontrol ve yumurta yeniden süspansiyon sırasında elek dışında dökmeyin doğrulayın önlenebilir. burç iyi mühürlü ise, dökülen yumurtalar yıkama atılır olarak elekten yıkama dökerek elde edilebilir. sineklerin yumurtadan sonra sinekler diyet rengini incelemek aksenik olduğunu eğer Altıncı, bir varsayımsal sınayın. Sinekler aksenik ise, diyetin üst tabaka koyu kahverengi kahve rengi olacak ve herhangi bir hava kabarcıkları diyet boyunca mevcut olacaktır. Hava kabarcıkları ya da üst diyet tabakasının tan rengi bakteriyel varlığını göstermektedir. Bakteriyel varlığı halen homojenleştirme tarafından teyit edilmelidir. Seçenek olarak ise, 16S rRNA geninin PCR amplifikasyonu aynı zamanda Kültüre edilemeyen mikroplar (örneğin, katı anaeroblar) 30 tespit etmek için gerçekleştirilebilir. Son olarak, homojen sonraleştirilmesi, seramik boncuklar (kurutulmasının kolaylaştırılması için)% 100 etanol ile bir defa yıkanır, H2O içinde, 30 dakika boyunca% 2 hipoklorit + 0.05 M bir potasyum hidroksit çözeltisi içinde sallanan cömertçe durulama (10 kat veya daha fazla), yeniden kullanılabilen ve edebilir 65 ° C sıcaklıkta kurutulması. Tüm adımlar dikkatle takip edilirse, aksenik sinekler protokol yapılır her zaman izole edilmelidir.

Bu çalışma yeniden ilişkilendiren bir maya-glikoz diyet kaldırdı laboratuvar sineklerin bakteri toplulukları temsil eden bir 4-tür Mikrobiyota steril Drosophila embriyolar için bir yöntem özetliyor. Önceki çalışma birkaç sinek anketler 9,19 sayısal bol olmuştur burada 4-türler ve Lactobacillus fructivorans dahil olmak üzere 5 tür topluluk kullandı. Biz L. ihmal tavsiye D. o fenotipleri dahil olmak üzere çeşitli nedenlerden dolayı fructivorans, L ile monoassociated melanogaster fructivorans ölçüde aksenik ph ile uyumlu olan31 ve L. enotypes fructivorans diğer sinek izolatlarının daha titiz. L. Eğer L. için tarif edildiği gibi fructivorans dahildir, bu kültür olmalıdır plantarum ve L. brevis: Statik sıvı kültür; ve katı kültürü CO 2 ile sular altında hava geçirmez bir kapta (ikinci aşama Lactobacillus büyümeyi desteklemek için ortam oksijen seviyesini azaltır).

Burada özetlenen yaklaşım kolayca farklı gnotobiyotik koşullarda Drosophila yükseltmek için değiştirilebilir. Örneğin, sineklerin bir anda 15,25,31 az bir mikrobiyal türlerin steril Drosophila embriyolar aşılanması ile yetiştirilen olabilir monoassociated. Çok türler birlikleri eşdeğer oranlar 20,24 birden fazla tür inoküle ile oluşturulmaktadır. Bu normalleşme kolaylaştırmak için 4-türlerin her biri için CFU / OD 600 sabitler mesafede olmasına rağmen, pek çok türleri karışımları için sabit bir türetmek gerekli olmayabilir. bent önceden bakteri başlangıç ​​yoğunluğu büyüklüğü 20 üç emir üzerine değişiyordu zaman 5-7 dpe erişkinlerde mikropların bolluğu belirgin 2-türler dernekler farklı değildi olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, Drosophila bağırsak derece hoşgörülü ve sinek diyet kolayca kültüre birçok türün (örneğin, E. coli, B. subtilis 25) mikroplar tarafından mikrobiyal etkisi genetik diseksiyon sağlayan geniş ile monoassociation yüksek yoğunluklarda Drosophila ile ilişkilendirmek genetik ve genomik kaynaklar. Son olarak, Mikrobiyota etkilenmiştir Drosophila fenotipleri çalışmalar her flakon mikropların belirli bir grup için erişime sahip olması için tanımlanmış bir mikrobiyal topluluk ile doğal koydu geleneksel yumurta aşılamak farelerde Değiştirilmiş Schaedler Flora yaklaşımını adapte olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu protokolün bazı detayları da yazının yararlı yorum sağlanan Dr. Adam Dobson, yardımı ile optimize edilmiştir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (FNIH) hibe sayısı R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD ve AED). FNIH hibe sayısı 1F32GM099374-01 (PDN) ve Brigham Young University başlangıç ​​fonları (JMC, MLK, MV). Yayın maliyetleri Brigham Young University Yaşam Bilimleri Koleji ve Bitki ve Yaban Hayatı Bilimleri Bölümü tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 113 aksenik gnotobiyotik, Mikrobiyomları Mikrobiyota,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Meyve Fly Yetiştirme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter