Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Opdræt bananfluen Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

En metode til opdræt Drosophila melanogaster under Axeniske og gnotobiotiske betingelser præsenteres. Fly embryoner dechorionated i natriumhypochlorit, overføres aseptisk til sterilt kost, og opdrættet i lukkede beholdere. Pode kost og embryoner med bakterier fører til gnotobiotiske foreninger, og bakteriel tilstedeværelse bekræftes ved plating hele kroppen Drosophila homogenater.

Introduction

De fleste dyr er intimt forbundet med bakterier (mikrobiota «) fra fødsel til død 1. Sammenligninger af mikroorganismer-fri ( 'axenisk «) og mikroorganisme-associerede (' konventionelle ') dyr har vist mikrober påvirke forskellige aspekter af dyrs sundhed, herunder metaboliske, ernæringsmæssige, vaskulær, lever-, respiratorisk, immunologiske, endokrine og neurologiske funktion 2. Frugten flyve Drosophila melanogaster er en vigtig model til forståelse mange af disse processer i tilstedeværelse af mikrober 3,4 og for at studere mikrobiota indflydelse på dyresundhed 5,6. Ingen bakteriearter er til stede i hver enkelt ( "kerne"), men Acetobacter og Lactobacillus arter numerisk dominere mikrobiota af både laboratorie-opdrættet og vild-fanget D. melanogaster. Andre Acetobacteraceae (herunder Komagataeibacter og Gluconobacter), Firmicutes (såsom Enterococcus og Leuconostoc), og enterobakterier er enten ofte til stede i Drosophila enkeltpersoner på lav tæthed, eller uregelmæssigt til stede ved høj overflod 7-12.

Den mikrobiota af Drosophila og pattedyr er ustadig inden for og på tværs af generationer 14,19. Mikrobiota ustadighed kan føre til fænotypisk støj ved måling mikrobiota-afhængige egenskaber. For eksempel Acetobacteraceae indflydelse lipid (triglycerid) opbevaring i Drosophila 15-18. Hvis Acetobacteraceae er mere rigelige i fluer med et hætteglas end i et andet 19, kan isogene fluer har forskellige fænotyper 20. En løsning på problemet med mikrobiota ustadighed i mus 14 har været i praksis siden 1960'erne, ved at indføre et defineret fællesskab af 8 dominerende mikrobielle arter til muse unger hver ny generation (ændret Schaedler flora),sikre, at hver hvalp er udsat for de samme centrale medlemmer af musen mikrobiota. Denne praksis kontrollerer for mikrobiota sammensætning, selv når mikrobiota er ikke det primære mål for studiet 32, og satte præcedens for at sikre tilstedeværelsen af centrale mikrober i forskellige eksperimentelle betingelser.

At definere indflydelse mikrober på Drosophila ernæring, har flere protokoller til at udlede Axeniske flueliner blevet udviklet, herunder hypochlorit dechorionation af embryoner (enten afledt de novo hver generation eller vedligeholdes generationally ved overførsel til sterile diæter) og antibiotisk behandling 13. Der er fordele for forskellige tilgange, såsom lethed og hurtighed for både af antibiotika behandling og seriel overførsel, versus større kontrol med forstyrrende variabler med de novo dechorionation (fx æg tæthed, resterende kontaminerende mikrober, off-target antibiotiske virkninger). Uanset fremgangsmåden tilforberedelse, indførelse af bestemte mikrobielle arter Axeniske embryoner tillader kultur af Drosophila med definerede ( 'gnotobiotiske «) samfund. Alternativt efterligner brugen af ​​Schaedler flora, dette samfund kunne podes til konventionelt lagt æg (følgende trin 6-7 kun) for at sikre tilstedeværelsen af ​​egenskab-påvirke mikrober i hvert hætteglas og undgå komplikationer af mikrobiota ustadighed. Her beskriver vi protokollen for at hæve axenisk og gnotobiotiske Drosophila ved de novo dechorionation af embryoner, og til bekræftelse af tilstedeværelsen af indførte eller kontaminerende mikrobiel taxa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kultur Bakterier (Start ~ 1 uge før Picking æg)

  1. Forbered modificeret MRS 20 (mMRS) plader og bouillon rør (tabel 1). Hæld 20 ml mMRS agar i hver 100 mm Petri plade og lad den køle / tørre natten, eller 5 ml mMRS bouillon i 18 mm reagensglas.
  2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, og L. plantarum på mMRS agarplader. Inkuber Acetobacter natten over ved 30 ° C. Inkuber Lactobacillus anaerobt ved at placere pladerne i en lufttæt beholder og oversvømmelser med carbondioxid før forsegling. Inkuber ved 30 ° C natten over.
    Bemærk: L. brevis kolonier kan ikke være synlige, indtil 24-48 timer. Plader kan lagres ved 4 ° C, og kolonier kan anvendes i op til 3 uger.
  3. To til tre dage før overførsel dechorionated æg til steril kost (afsnit 5), vælge en enkelt koloni fra mMRS pladen i et reagensglas conTaining mMRS bouillon. Grow Acetobacter under omrystning og vokse Lactobacillus statisk i 24 timer eller indtil uklar, både ved 30 ° C.

2. Forbered Steril Diet

  1. Forbered sterile kost (tabel 2) i en 2 L Erlenmeyer-kolbe. Mikroovn kosten, indtil den har kogt 3 sekventielle tidspunkter; blandes i mellem hver kog.
  2. Kolben anbringes på en røre plade til at opretholde omrøring mens overførsel kost til koniske centrifugerør. Overfør 7,5 ml diæt til 50 ml centrifugerør. Løst cap rørene, og sted i en overdækket, autoklaverbar polypropylen rack.
  3. Sterilisere flyve kost under anvendelse af en autoklave ved 121 ° C og 15 psi i 25 min. Fjern stativer fra autoklaven, og straks ryste hver rack vandret for at sikre kost separerer ikke under afkøling. Vær omhyggelig med at ikke ryste stativerne lodret for at forhindre overførsel af kost til låget eller fælge af rørene. Tillad kost afkøle på en ryster i nøjagtigt 45 minutter ogigen ryste kosten vandret med hånden.
    Bemærk: Kost kan opbevares ved 4-15 ° C i op til en uge.
  4. Som et alternativ til at bruge dækket autoklaverbare racks (trin 2,1-2,3), eller til at hæve fluer på kost, der indeholder syre konserveringsmiddel, udføre følgende trin:
    1. Forbered en L flydende kost i en 2 L kolbe med en omrører i kolben. Autoklaver kosten.
    2. Efter autoklavering tilsættes 10 ml konserveringsmiddel og kontinuerligt omrør på en opvarmet omrøringsplade. Når agaren er afkølet til 50-60 ° C, kolben flytte til en opvarmet omrøringsplade i et bio kabinet og opretholde kolbe temperaturen ved opvarmning ved 50-60 ° C.
    3. I biosikkerhed kabinet, pipette ~ 7,5 ml individuelt i koniske rør.

3. Forbered Æglæggende Bure

  1. Gør drue-saft agarplader ved microwaving 100 ml vand, 10 g ølgær, 10 g glucose og 1 g agar. Bring i kog 3 gange i trin 1.1 og tilsættes 10 g frosne druesaft concentrate at øge synligheden af ​​æg på agarpladen.
  2. Når agar er afkølet til 55 ° C, hæld 20 ml i 100 mm petriskåle og lad det størkne.
  3. Dække overfladen af ​​agarpladerne med en gær pasta ved at blande 1 g ølgær med 15 g vand. Hæld gær pasta på agarpladen og sørg overfladen er dækket, så hæld det overskydende, efterlader en tynd gær rester bag. Hvis der anvendes flere plader, kan pastaen sekventielt hældt til flere plader.
  4. Overfør agarplader ind i bunden af ​​et bur.
    Bemærk: En 32 ounce deli beholderen er en god erstatning for akryl flyve bure.
    1. Foretag låg til 32 oz deli beholdere ved at skære et hul i toppen og limning en åndbar mesh over hullet med giftfri lim. Hvis limen er vandopløselig forhindre vand eksponering til låget.
  5. Overførsel 200-300 flyver ind i beholderen og dækkes med låg. Dæk mesh-beskyttede hul med en tom petriskål låget til forebygt fordampning fra agaroverfladen og tilføje en fugtigt filtrerpapir i låget, hvis det ønskes. Inkuber fluer ved 25 ° C natten over i 16-20 timer.

4. Saml Æg

  1. Forbered en sigte for ægudtagning ved at placere nylonnet i en plastik bøsning.
  2. For at hente pladen med æg på det, fjerne fluer fra buret ved at overføre til en tom beholder. Hvis samme fluer vil blive brugt næste dag, overdrage til en ny bur indeholder en frisk yeasted drue-juice agarplade. Fluer kan anvendes i 3-5 sekventielle dage
  3. Fjern døde fluer fra agar med en ren pensel, være omhyggelig med at ikke bryde op agar.
  4. Saml æggene ved at skylle agarpladen med destilleret vand, forsigtigt børste æg fra agaroverfladen, og hælde gyllen over masken. Gentag 3-4 gange, indtil alle eller de fleste af æggene er blevet fjernet fra agarpladen.

5. Dechorionate Æg og Overførsel til Sterile DIET

  1. Forbered biosikkerhed kabinet ved at sprøjte indersiden (herunder sider) med 70% ethanol. Tørre bunden med en lab væv, og sterilisere hætte med UV-lys i ~ 15 min. Sterilisere alle ikke-biologiske forsyninger (specimen kopper, paintbrush, pincet, affaldsbeholder, 400 ml steriliseret vand og 100 ml 0,6% natriumhypochlorit) ved sprøjtning med ethanol og straks placere i biosikkerhed kabinet. Sterilisere med UV-lys i 15 min.
  2. Starte den første af 2 natriumhypochlorit vasker ved at placere bøsningen med æggene i en 120 ml Prøvebæger eller anden steril beholder. Hældes langsomt ~ 90 ml 0,6% natriumhypochloritopløsning i bøsningen indtil lige under kanten.
  3. Skyl æg til 2,5 min. Periodisk re-suspendere æggene ved at bruge pincet til at flytte bøsningen op og ned i hypochloritopløsning.
  4. Overfør bøsningen direkte ind i en anden Prøvebæger, fyldt med 90 ml blegemiddel, inde i biosikkerhed kabinet.
  5. Gentagetrin 5.3 inde i biosikkerhed kabinet. Ved slutningen af ​​det andet blegemiddel behandling, bør æggene begynde at klæbe til siderne af bøsningen.
  6. Udfør trin 5,7-5,8 i biosikkerhed kabinet.
  7. Kassér blegemiddel og vask bøsningen med sterilt vand 3 gange. Re-suspendere æggene flere gange i løbet hver vask ved at flytte bøsning med pincet. Ved udgangen af ​​den tredje vask skal vedlægges fleste æg til siden af ​​bøsningen.
  8. Ved hjælp af en pensel steriliseret i ethanol, overføre æg fra siden af ​​bøsningen til det sterile kost. Overfør æg enkeltvis eller i små partier. Målet for 30-50 æg pr hætteglas. Lad hætterne løs for at tillade ilt at komme ind i røret. Hvis hætteglas skal forblive axenisk, overførsel til et insekt rugemaskine ellers tilføj bakterier som nedenfor.

6. Foretag gnotobiotiske Flies Brug 4 bakteriearter

  1. Forbered Bakterier
    1. Forbered en steriliseret biosikkerhed kabinet med nødvendige forsyninger (pipettes, pipette tip kasser, steriliserede centrifugerør, MRS bouillon og reagensglas stativer) som i trin 4.1. Tør reagensglas med en ethanol-gennemblødt laboratorium tørre før du placerer i biosikkerhed kabinet.
    2. Pelletere bakterierne ved først at overføre 500 pi natten vækst til et sterilt mikrofugerør. Hvis bakteriel massefylde er lav, tilsættes op til 1,5 ml til hvert rør eller sekventielt fjerne supernatanten og tilføje ekstra kultur til det samme rør. Fjern prøver fra biosikkerhed kabinet og centrifugeres i 10 minutter ved 10.000 x g. Brug filter tips til at undgå kontaminering mellem prøverne.
    3. Bestemme densiteten af hver kultur ved at måle OD600. Hvis der anvendes en multi-brønd pladelæser, overføre 200 pi af hver kultur til en 96-brønds plade i 1-, 2- og 4- fold fortyndinger.
    4. Bestem mængden af ​​mMRS til at fortynde hver cellepellet (5.2.2) under anvendelse af en pladeaflæsningsspektrofotometer og de følgende ligninger. Plan om at tilføje nok bouillon til at pode 50 &# 956; l til hver flue hætteglas.
      1. Indsamle OD 600 aflæsninger for en 1: 1, 1: 2 og 1: 4 fortynding af hver bakteriekultur på en plade-læser spektrofotometer. Vælg fortyndingen for hver bakteriestamme, der producerer en OD 600 værdi mellem 0,1 og 0,2 og bruge denne værdi og dens tilsvarende fortyndingsfaktor som 'O «og» D «i formlen i 6.1.4.2 eller 6.1.4.3.
      2. Hvis du bruger de 4 arter, der er beskrevet her, normalisere celler til tilsvarende kolonidannende enhed (CFU) / ml tætheder (OD 600 til CFU konvertering bestemt tidligere 20) ved hjælp af denne ligning:
        E = ((OB) x V x D) / C
        hvor E = volumen for at resuspendere pellet i (pi), O = OD 600 bakterier, B = OD600 tomme medier, D = fold-fortynding, V = pi bakteriekultur inden centrifugering, C = OD600 af forudbestemt konstant. Se supplerende kode fil for eksempler på beregninger ved hjælp af disse ligninger. For spektrofotometers, der automatisk blank, brug "O" i stedet for "OB".
        Bemærk: De forudbestemte konstanter (enheder OD 600, normaliseret til 10 7 CFU ml -1, konstanter afledt i 20) er som følger: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Hvis du bruger andre bakteriearter (ingen CFU / OD 600 konstant er til rådighed), normalisere tæthed til OD600 = 0,1 ved hjælp af denne ligning:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Bemærk: Enheder er de samme som i trin 6.1.4.2. Se supplerende kode fil for eksempler på beregninger ved hjælp af disse ligninger.
    5. I biosikkerhed kabinet, fjerne supernatanten med en pipette spids og pellet resuspenderes i friske mMRS eller PBS som beregnet i trin 6.1.4.2.
  2. podes Bakterier
    1. Transfer 50 pi bakterierne til de koniske rør med steril kost end dechorionated æg i biosikkerhed kabinet. Tilføj bakterier efter ægoplægningen at forhindre forurening mellem hætteglas.
    2. Placer inokulerede rør i en inkubator ved 25 ° C.

7. Mål CFU Load / Test for Sterilitet

  1. For at måle CFU belastning i hele kroppen flyve homogenater, overførsel 5 fluer (5-7 dage efter eclosion) til et 1,7 ml mikrocentrifugerør indeholdende 125 pi af keramiske perler og 125 pi mMRS bouillon. Homogenisere fluer bruger vævshomogenisator i 30 sekunder ved 4,0 m / sek.
    1. Alternativt udelade perler og hånd homogeniseres i mikrocentrifugerør med plast pestles i 1 min.
    2. Hvis kvantificering tarmen mikrobiota, overfladeaktive sterilisere fluerne at fjerne eksogene mikrober 22. Overførsel flyver til et mikrocentrifugerør indeholdende 100 pi 70% ethanol i 1 min, aspireres ethanol, og overføres til en ny mikrocentrifugerør for homogenizations. Hvis DNA-indholdet i tarmen vil blive målt, skylles feller 1 min med 0,6% natriumhypochlorit før ethanol vask.
  2. Fortynd homogenatet med 875 pi mMRS, vortex i 5 sekunder, og pipetteres 120 pi homogenat i den første brønd i en mikrotiterplade.
  3. Udfør to sekventielle 1: 8 fortyndinger bruger 10 pi homogenat og 70 pi MRS i de næste to brønde.
    1. Fjern 10 pi fra den første brønd og føje den til den anden brønd indeholdende 70 pi MRS. Blande indholdet af den anden brønd grundigt, overførsel 10 pi fra den anden brønd til den tredje brønd indeholdende 70 pi MRS, og blandes. Dette fører til 3 af total koncentrationer af den oprindelige 1.000 pi homogenat: ufortyndet 1: 8, og 1:64.
  4. Overfør 10 pi af hver fortynding til en mMRS plade (ved hjælp af en multi-kanal pipette, hvis det ønskes). Lidt hælde fadet for at sprede fortynding flere millimeter ned agaroverfladen og lad væsken tørre, inden du flytter pladen. Væsken tørrer på the plade hurtigt, hvis pladerne er 2 dage gamle, reducerende blanding af to tilstødende dråber.
  5. Inkuber ved 30 ° C i 1-2 dage. Fjern pladerne fra inkubatoren engang adskilte, individuelle kolonier er synlige, og tælle fra en fortynding med 10-100 isolerede kolonier.
  6. Beregn CFU per flue ved hjælp af ligningen E = C x D / P x V / F, hvor E = CFU pr flue, C = antal kolonier talt, D = fortynding, P = pl forgyldt, V = volumen af ​​flyve homogenatet, og F = antal fluer homogeniserede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket opdræt af Axeniske fluer bekræftes af isolering af nogen CFU'erne fra hele kroppen homogenizations af D. melanogaster voksne (figur 1). Alternativt, hvis belagte homogenatet giver kolonier, er hætteglassene kontamineret og skal kasseres. For gnotobiotiske fluer, blev hver af de fire bakterielle isolater isoleret fra puljer af 5 voksne mænd, hvilket viser forskelle i de samlede levedygtige CFU'er forbundet med voksne fluer (figur 1). Hver bakterieart har en særskilt morfologi og kan skelnes visuelt (figur 2). Hvis der ikke registreres en eller flere koloni typer kan der have været fejl i forberedelsen af bakterielle inokulum (fx vask, normaliserende, blanding) eller de respektive dyrearter er muligvis ikke kompatible med dyrkningsbetingelser (fx Drosophila tæthed 23 eller genotype 24). For at udelukke tekniske fejl, vi Recbefales udpladning en del af det bakterielle blanding umiddelbart efter inokulering flyve hætteglas (trin 6.2).

figur 1
Figur 1: kolonidannende enheder Fundet i Axeniske og gnotobiotiske Drosophila Antallet af kolonidannende enheder (CFU) pr flue i hele kroppen homogenater af 4-arter gnotobiotiske og axenisk D.. melanogaster. Manglende kolonier i axeniske homogenater bekræfter D. melanogaster sterilitet. Værdier er præsenteret som gennemsnit ± SEM af 24 replikat værdier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Differentiering bakteriekolonier. </ strong> CFU'er fra en prøve homogenisering viser forskellige morfologier for hver af de 4-arter i gnotobiotiske D. melanogaster. Acetobacter kolonier er en klar, lys brun farve og kommer i forskellige størrelser afhængigt af arten. ~ 24-36 timer efter plating, A. tropicalis kolonier er uigennemsigtige, mens A. pomorum er gennemsigtig, men over tid er forskellen bliver mindre udtalt. L. brevis kolonier er små og hvide og L. plantarum kolonier er store og gule. Hvis det er nødvendigt, vækst fra homogenatet kan sammenlignes med de oprindelige bakterier plader til at skelne hver type koloni 20. Klik her for at se en større version af dette tal.

mMRS opskrift
Beløb i g Noter
Destilleret vand 1.000
Universal Peptone 12.5
gærekstrakt 7.5
Glucose 20
dIKALIUMPHOSPHAT 2
ammoniumcitrat 2
Natriumacetat 5
magnesium Sulfate 0,1
mangansulfat 0.05
Agar 12 Tilføj ikke at bouillon

Tabel 1: mMRS opskrift.

<tr>
Gær-glucose kost opskrift
Beløb i g
Destilleret vand 500
Ølgær 50
Glucose 50
Agar 6

Tabel 2: Gær-glucose kost opskrift.

Supplerende Kode Fil:. Sample Beregninger Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den her beskrevne metode er en af flere metoder til embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, sammen med alternative metoder til opdræt Axeniske fluer, herunder seriel overførsel af Axeniske voksne 18,27 eller antibiotikabehandling 13,18. Andre dechorionation metoder omfatter ethanol vaske og reducere 11,25,26 eller forlænge 8 hypochlorit behandling. Forskellige vasketrin kan støtte opdræt forskellige flyve genotyper: i en tidligere undersøgelse meste af ~ 100 Drosophila genotyper var axenisk når opdrættet som skitseret her (uden ethanol vasker), men nogle linjer var forurenet og kasseret 24. Måske nogle forurenede linjer ville have været axenisk hvis opdrættet med ethanol vasker eller længere hypochlorit behandling. Hvis metoden her ikke fører til isolation af Axeniske fluer for bestemte vært genotyper anbefaler vi ethanol skylninger eller længere hypochlorit behandling for at afhjælpe problemet.

ent "> Når der anvendes seriel overførsel af Drosophila, er en forældrekontrol axenisk generation gjort axenisk af æg dechorionation som beskrevet her, og efterfølgende generationer vedligeholdes af aseptisk overførsel i en biosikkerhed kabinet, med eller uden antibiotika 18,27. Seriel overførsel er hurtigere end udlede Axeniske fluer på ny hver generation, og overført fluer kan forblive axenisk for flere generationer. en komplikation af serielle overførsler opretholder matchede tætheder af konventionelle / gnotobiotiske og Axeniske fluer siden Axeniske fluer tendens til at lægge færre æg over en sammenlignelig tidsinterval (data ikke vist). Da Drosophila tæthed påvirker flere træk, herunder bakterielle sammensætning in fly kost 23,28,29, overføre æg på ny hver generation kan være en overlegen metode til flyve density-sensitive træk. de novo dechorionation undgår også muligheden for bakteriel kontaminering under overførsler. medens serielle overførsler kan spare tid, dechorionation tillader mere kontrol med komplicerende variabler.

Antibiotika kan også anvendes til at skabe axeniske fluer, men i modsætning til dechorionation, antibiotisk behandling er normalt utilstrækkelig til helt at fjerne koloniserer mikrober 13. Endvidere kan antibiotika påvirke værten direkte. For eksempel, hæve fluer på en diæt med antibiotika nedsætter deres frugtbarhed og proteinindhold, men disse effekter blev ikke observeret i fluer rejst fra dechorionated embryoner 13. Vi bemærker, at der er behov for at fjerne endosymbiotic bakterier, der overføres vertikalt og er ikke berørt af overfladen sterilisering, såsom Wolbachia 33 antibiotika.

Flere trin er afgørende for succes med at forberede dechorionated Axeniske eller gnotobiotiske fluer. Det første er det afgørende at ryste fluen kost som i trin 2.3. Hvis stativerne ikke rystes med hånden i ca. 15 sek hver før og efter en nøjagtig45 min interval på rysteapparatet, vil gæren og agar afregne, reducere flyve adgang til gær og gøre agaroverfladen for blød til flue kultur. For det andet er tykkelsen af ​​gær pasta og agar koncentration af druesaft plader påvirker æg fjernelse (trin 3.3). Et tyndt lag fremstillet af en 1:15 gær: vand fortynding vil forhindre æg fra indlejring i agaren når skylning og fjernelse fra fødevarer plader (trin 4.4). Tredje, hvis druesaft plader er for bløde og bryde op i løbet ægudtagning, pladernes fasthed kan forøges ved tilsætning af mindre druesaft koncentrat til næste batch af plader. For det fjerde æg udbytter er højere, hvis fluer har 24 timers at akklimatisere til buret miljø: Dette kan løses ved at placere fluer i buret ~ 40 timer forud for indsamling, herunder overførsel til en ny kollektion bur med en frisk agarplade <20 hr før den ønskede samling dato. Femte, hvis æggene ikke klæber til den side af bøsningen under dechorionation (trin 5.7), de rinsing periode skal forlænges med 15-30 sek (Advarsel: udvide skylning tid også længe kan dræbe æggene). Desuden kan æg tab i de flydende skylninger forebygges ved at kontrollere mesh-bøsning tætning til fuldstændig lukning og kontrollere, at æggene ikke spildes uden for sigten under re-suspension. Hvis bøsningen er godt forseglet, kan spildte æg udvindes ved at hælde vask gennem sigten som vasken kasseres. Sjette, efter fluer er klækket, en formodet test for at afgøre, om de fluer er axenisk er at undersøge farven af ​​kosten. Hvis fluerne er axenisk, vil det øverste lag af kosten være en mørkebrun kaffe farve og ingen luftbobler vil være til stede i hele kosten. Luftbobler eller gulbrun farve af det øverste kost lag indikerer bakteriel tilstedeværelse. Bakteriel tilstedeværelse skal stadig bekræftes ved homogenisering. Alternativt kan også udføres PCR amplifikation af 16S rRNA-genet for at detektere unculturable mikrober (f.eks strenge Anaerober) 30. Endelig efter homogeneization, keramiske perler kan genbruges af vuggende i en opløsning af 2% hypochlorit + 0,05 M kaliumhydroxid i 30 minutter, skylning generøst (10 gange eller mere) i H2O, vaskning én gang med 100% ethanol (for at lette tørring), og tørring ved 65 ° C. Hvis alle trin er fulgt nøje, bør Axeniske fluer isoleres hver gang protokollen udføres.

Dette arbejde skitserer en metode til re-associerende sterile Drosophila embryoner med en 4-arter mikrobiota som er repræsentativ for de bakterielle samfund af laboratorie fluer opdrættet på en gær-glucose kost. Tidligere arbejde har brugt en 5-art samfund, herunder de 4 arter her og Lactobacillus fructivorans, som har været numerisk rigelige i flere flyve undersøgelser 9,19. Vi anbefaler at udelade L. fructivorans af flere grunde, herunder fænotyper i D. melanogaster monoassociated med L. fructivorans er stort set sammenfaldende med axenisk phenotypes 31 og L. fructivorans er mere kræsne end andre flue isolater. Hvis L. fructivorans er inkluderet, skal det dyrket som beskrevet for L. plantarum og L. brevis: statisk flydende kultur; og i en lufttæt beholder oversvømmet med CO2 i fast kultur (sidstnævnte trin reducerer omgivende iltindhold til støtte Lactobacillus vækst).

De tilgange skitseret her, kan let varieres for at hæve Drosophila under forskellige gnotobiotiske betingelser. For eksempel monoassociated fluer kan opdrættes ved at pode sterile Drosophila embryoner med en mikrobielle arter ad gangen 15,25,31. Multi-arter foreninger dannes ved at pode flere arter, i tilsvarende nøgletal 20,24. Selvom vi billede CFU / OD 600 konstanter for hver af de 4 arter for at lette normalisering, kan det ikke være nødvendigt at udlede en konstant for de fleste arter blandinger. jegt er tidligere vist, at den overflod af mikrober i 5-7 DPE voksne ikke var signifikant forskellig i 2-arter foreninger, når start tæthed af bakterier blev varieret over tre størrelsesordener 20. Også den Drosophila gut er meget eftergivende, og mange arter, der er let dyrket på flue kost kan associere med Drosophila ved høje tætheder i monoassociation (fx E. coli, B. subtilis 25) gør det muligt genetisk dissektion af mikrobiel påvirkning af mikrober med omfattende genetiske og genomiske ressourcer. Endelig kunne undersøgelser af Drosophila fænotyper der er påvirket af mikrobiota tilpasse tilgangen i Altered Schaedler Flora i mus ved podning naturligt fastsatte konventionelle æg med en defineret mikrobielle samfund til at sikre hvert hætteglas har adgang til et bestemt sæt af mikrober.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Nogle oplysninger om denne protokol blev optimeret med hjælp fra Dr. Adam Dobson, der også nyttige bemærkninger til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Fonden for National Institutes of Health (FNIH) tilskud nummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, og ​​AED). FNIH tilskud nummer 1F32GM099374-01 (PDN), og Brigham Young University startup midler (JMC, MLK, MV). Offentliggørelse omkostninger blev støttet af Brigham Young University College of Life Sciences og Institut for Plantebiologi og Wildlife Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Developmental Biology axenisk gnotobiotiske, Microbiome mikrobiota,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Opdræt bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under Axeniske og gnotobiotiske Betingelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter