Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Oppdragelse bananflue Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

En fremgangsmåte for oppdrett Drosophila melanogaster henhold axenic og gnotobiotiske betingelser er presentert. Fly embryoer er dechorionated i natriumhypokloritt, overføres aseptisk til sterilt kosthold, og alet opp i lukkede beholdere. Inoculating kosthold og embryoer med bakterier fører til gnotobiotiske foreninger, og bakteriell tilstedeværelse er bekreftet av plating hele kroppen Drosophila homogenates.

Introduction

De fleste dyr er nært forbundet med bakterier ( 'bakterieflora') fra fødsel til død en. Sammenligninger av mikroorganismer fritt ( 'axenic') og mikro-assosiert ( 'vanlig') dyr har vist mikrober påvirke ulike aspekter av dyrehelse, inkludert metabolske, ernæringsmessige, vaskulær, lever, luftveier, immunologiske, endokrine og nevrologiske funksjon 2. Bananflue Drosophila melanogaster er en nøkkel modell for forståelse av mange av disse prosesser i nærvær av mikrober 3,4 og for å studere floraen innflytelse på dyrehelse 5,6. Ingen bakteriearter er til stede i hver enkelt ( "kjerne"), men Acetobacter og Lactobacillus arter numerisk dominere microbiota av både laboratorie oppdrettet og villfanget D. melanogaster. Andre Acetobacteraceae (inkludert Komagataeibacter og Gluconobacter), Firmicutes (for eksempel Enterococcus og Leuconostoc), og Enterobacteriaceae enten er ofte til stede i Drosophila individer ved lav overflod, eller uregelmessig tilstede ved høy overflod 7-12.

Den bakterieflora av Drosophila og pattedyr er ustadige innenfor og på tvers av generasjoner 14,19. Microbiota inconstancy kan føre til fenotypiske støy ved måling microbiota avhengige egenskaper. For eksempel Acetobacteraceae innflytelse lipid (triglyserider) lagring i Drosophila 15-18. Hvis Acetobacteraceae er mer rik på fluer i ett hetteglass enn i en annen 19, kan isogene fluer ha forskjellige fenotyper 20. En løsning på problemet med microbiota ustadighet i mus 14 har vært i praksis siden 1960-tallet, ved å innføre et definert fellesskap av 8 dominerende mikrobielle arter på museunger hver ny generasjon (endret Schaedler flora),sikre at hver valp er utsatt for de samme sentrale medlemmer av musebakterieflora. Denne praksisen kontroller for bakterieflora sammensetning, selv når den bakterieflora ikke er det primære målet for studium 32, og setter presedens for å sikre tilstedeværelse av nøkkel mikrober i en rekke eksperimentelle betingelser.

For å definere påvirkning av mikrober på Drosophila ernæring, har flere protokoller for å utlede axenic snører blitt utviklet, inkludert hypokloritt dechorionation av embryoer (enten avledet de novo hver generasjon eller vedlikeholdes generationally ved overføring til sterile dietter) og antibiotikabehandling 13. Det er fordeler med å ulike tilnærminger, for eksempel letthet og hurtighet for begge antibiotika behandling og seriell overføring, kontra større kontroll over konfunderende variabler med de novo dechorionation (f.eks egg tetthet, rest forurensende mikrober, off-target antibiotika effekter). Uavhengig av fremgangsmåten ifølgeforberedelse, innføring av spesifiserte mikrobielle arter axenic embryoer tillater kulturen i Drosophila med definerte ( 'gnotobiotiske') samfunn. Alternativt, etterligne bruk av Schaedler flora, dette fellesskapet kan bli vaksinert med konvensjonelt lagt egg (Følgende trinn 6-7) for å sikre tilstedeværelse av egenskap-påvirke mikrober i hvert hetteglass og unngå komplikasjoner av bakterieflora ustadighet. Her beskriver vi protokollen for å heve axenic og gnotobiotiske Drosophila av de novo dechorionation embryoer, og for å bekrefte tilstedeværelse av introduserte eller forurensende mikrobiell taxa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kultur Bakterier (Start ~ 1 uke før Plukke egg)

  1. Forbered endret MRS 20 (mMRS) plater og buljong rør (tabell 1). Hell 20 ml mMRS agar i hver 100 mm Petri plate og avkjøl / tørke over natten, eller 5 ml mMRS kokes i 18 mm prøverør.
  2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropic, Lactobacillus brevis, og L. plantarum på mMRS agarskåler. Inkuber Acetobacter over natten ved 30 ° C. Inkuber Lactobacillus anaerobt ved å plassere platene i en lufttett beholder og oversvømmelse med karbondioksyd før forsegling. Inkuber ved 30 ° C over natten.
    Merk: L. Brevis kolonier kan ikke være synlig før 24-48 timer. Platene kan lagres ved 4 ° C, og kolonier kan anvendes i opp til 3 uker.
  3. To til tre dager før du overfører dechorionated egg til sterilt diett (§ 5), plukke en enkelt koloni fra mMRS platen i et reagensrør conholdende mMRS kjøttkraft. Grow Acetobacter med risting og vokse Lactobacillus statisk i 24 timer eller til grumset, både ved 30 ° C.

2. Forbered Sterile Diet

  1. Fremstille sterile diett (tabell 2) i en 2 liters Erlenmeyer-kolbe. Mikrobølgeovn dietten til den har kokt 3 sekvensielle ganger; bland i mellom hver koke.
  2. Sett flasken på et rør plate for å opprettholde omrøring ved overføring diett til koniske sentrifugerør. Overfør 7,5 ml av kostholdet til 50 ml sentrifugerør. Løst cap rørene, og plasser i en tildekket, kan autoklaveres polypropylen rack.
  3. Steriliser flue diett ved hjelp av en autoklav ved 121 ° C og 15 psi i 25 min. Fjern stativer fra autoklav, og umiddelbart riste hvert rack horisontalt for å sikre kosthold ikke skille under avkjøling. Vær nøye med å ikke riste stativene vertikalt for å hindre overføring av kostholdet til lokket eller felger av rørene. Tillat dietten for å avkjøle på en ristemaskin i nøyaktig 45 min ogigjen rist diett horisontalt for hånd.
    Merk: Diet kan oppbevares ved 4-15 ° C i opp til en uke.
  4. Som et alternativ til å bruke dekket autoklaverbare stativer (trinn 2.1 til 2.3), eller å heve fluer på dietter som inneholder syre konserveringsmiddel, utføre følgende trinn:
    1. Fremstille 1 liter flytende diett i en 2-liters kolbe med en rørestav i kolben. Autoklaveres dietten.
    2. Etter autoklave, tilsett 10 ml konserveringsmiddel og rør kontinuerlig på et oppvarmet rør plate. Når agaren er avkjølt til 50-60 ° C, flytter kolben til en oppvarmet røreplate i et skap biosikkerhet og opprettholde kolbe temperatur ved oppvarming ved 50-60 ° C.
    3. I biosikkerhet kabinett, pipette ~ 7,5 ml individuelt i koniske rør.

3. Forbered Eggleggingen Cages

  1. Gjør drue-juice agarskåler av mikrobølgeovnen 100 ml vann, 10 g ølgjær, 10 g glukose og 1 g agar. Kok opp 3 ganger i trinn 1,1 og tilsett 10 g frossen drue juice concentrate å øke synligheten av egg på agar plate.
  2. Når agaren er avkjølt til 55 ° C, helles 20 ml i 100 mm petriskåler og la den størkne.
  3. Dekke overflaten av agar-platene med en gjærpasta ved å blande 1 g ølgjær med 15 g vann. Hell gjær lime inn på agar plate gjør at overflaten er dekket, og hell av overflødig, og etterlater en tynn gjærrester bak. Dersom flere plater brukes, kan pastaen bli sekvensielt helles til flere plater.
  4. Overfør agarplater inn i bunnen av et bur.
    Merk: En 32 oz deli container er en god erstatning for akryl flue bur.
    1. Gjør lokk for 32 oz deli beholdere ved å skjære et hull i toppen og liming en pustende mesh over hullet med giftfri lim. Hvis limet er vannløselige hindre at vann eksponering til lokket.
  5. Overføring 200-300 flyr inn i beholderen og dekke med lokk. Dekk mesh-beskyttet hullet med en tom petriskål lokket for å foret fordampning fra agar overflaten og legge en fuktig tørkepapir på innsiden av lokket hvis ønskelig. Inkuber fluer ved 25 ° C over natten i 16-20 timer.

4. Samle Egg

  1. Forbered en sil for egg samling ved å plassere nylon mesh i en plasthylse.
  2. For å hente tallerkenen med egg på det, fjerne fluer fra buret ved å overføre til en tom container. Hvis samme fluene skal brukes til neste dag, overføres umiddelbart i et nytt bur inneholdende en nylig yeasted druesaft-agar plate. Fluer kan brukes i 3-5 dager sekvensielle
  3. Fjern døde fluer fra agar med en ren pensel, er forsiktig med å ikke bryte opp agar.
  4. Samle egg ved skylling av agar-plate med destillert vann, forsiktig børsting egg fra agaroverflaten, og helling av oppslemmingen i løpet av nettingen. Gjenta dette 3-4 ganger inntil alle eller de fleste av eggene har blitt fjernet fra agarplaten.

5. Dechorionate Eggs and Transfer til Steril DIET

  1. Forbered biosikkerhet kabinettet ved sprøyting innsiden (inkludert sider) med 70% etanol. Tørk av bunnen med en lab vev, og sterilisere hette med UV-lys for ~ 15 min. Steriliser alle ikke-biologiske forsyninger (prøve kopper, pensel, tang, avfall container, 400 ml sterilisert vann og 100 ml 0,6% natriumhypokloritt) ved sprøyting med etanol og umiddelbart plassere i biosikkerhet kabinettet. Steriliser med UV-lys i 15 minutter.
  2. Starte den første av 2 natriumhypoklorit vasker ved å plassere foringen med eggene i en 120 ml prøvekopp eller annen steril beholder. Hell sakte ~ 90 ml av 0,6% natrium-hypokloritt-oppløsning inn i bøssingen inntil like under kanten.
  3. Skyll egg til 2,5 min. Periodisk re-suspen eggene ved hjelp av pinsett til å bevege bøssingen opp og ned i hypokloritt-oppløsning.
  4. Overfør bøssingen direkte inn i en andre prøvekopp, pre-fylt med 90 ml blekemiddel inne i biosikkerhet skapet.
  5. Gjentasteg 5,3 inne i biosikkerhet kabinettet. Ved slutten av det andre blekemiddel behandling, bør eggene begynne å følge sidene av bøssingen.
  6. Utfør trinn 05.07 til 05.08 i biosikkerhet kabinettet.
  7. Kast blekemiddel og vaske fôring med sterilt vann 3 ganger. Re-suspendere egg flere ganger i løpet av hver vask ved å flytte foringen med pinsett. Ved utgangen av tredje vask fleste eggene skal være festet til siden av foringen.
  8. Ved hjelp av en pensel sterilisert i etanol, overfører egg fra siden av foringen til det sterile diett. Overfør egg enkeltvis eller i små grupper. Målet for 30-50 egg per hetteglass. La caps løs for å tillate oksygen å gå inn i røret. Hvis hetteglass er å forbli axenic, overføring til et insekt kuvøse; ellers legge til bakterier som nedenfor.

6. Gjør gnotobiotiske Flies Bruke 4 bakteriearter

  1. Forbered Bakterier
    1. Forbered en sterilisert biosikkerhet kabinett med nødvendige forsyninger (pipettes, pipette tips bokser, steriliserte sentrifugerør, MRS buljong og Testrørstativer) som i trinn 4.1. Tørk utsiden av reagensrør med etanol-gjennomvåt laboratorium tørke før de legges i biosikkerhet skap.
    2. Pelletere bakteriene ved først å overføre 500 ul av vekst over natten i et sterilt mikrosentrifugerør. Hvis bakterietettheten er lav, legger opp til 1,5 ml til hvert rør eller sekvensielt fjerne supernatanten og legge til ekstra kultur til samme rør. Fjerne prøver fra biosikkerhet skapet og sentrifuger i 10 minutter ved 10 000 x g. Bruk filter tips for å unngå forurensning mellom prøvene.
    3. Bestemme tettheten av hver kultur ved måling av OD 600. Hvis ved anvendelse av en multi-brønn plate-leser, overføre 200 ul av hver kultur til en 96-brønners plate i 1-, 2-, 4- og gangers fortynninger.
    4. Bestemme mengden av mMRS der å fortynne hver cellepellet (5.2.2) ved hjelp av en plate lesning spektrofotometer og de følgende ligninger. Planlegger å legge nok buljong til vaksinere 50 &# 956; l til hver flue hetteglass.
      1. Samle OD 600 avlesninger for et 1: 1, 1: 2 og 1: 4 fortynning av hver bakteriekultur på en plate-leser spektrofotometer. Velge den fortynning for hver bakteriestamme som produserer en OD 600-verdi mellom 0,1 og 0,2, og bruker denne verdi og den tilsvarende fortynningsfaktor som "O" og "D" i formlene som er gitt i 6.1.4.2 eller 6.1.4.3.
      2. Hvis du bruker de 4 artene er beskrevet her, normalceller til tilsvarende kolonidannende enhet (CFU) / ml tettheter (OD 600 til CFU konvertering bestemt tidligere 20) ved hjelp av denne ligningen:
        E = ((OB) x V x D) / C
        hvor E = volum for å resuspendere pelleten i (il), O = OD 600 bakterier, B = OD 600 blank media, D = gangers fortynning, V = pl bakteriekultur før sentrifugering, C = OD 600 av forutbestemt konstant. Se Supplemental kodefilen for eksempler på beregninger ved hjelp av disse ligningene. for spektrofotometers som automatisk blank, bruk "O" i stedet for "OB".
        Merk: De forutbestemte konstanter (enheter OD 600, normalisert til 7 10 ml CFU -1, konstanter utledes i 20) er som følger: A. tropic (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Hvis du bruker andre bakteriearter (ingen CFU / OD 600 konstant er tilgjengelig), normal tetthet til OD 600 = 0,1 ved hjelp av denne ligningen:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD600
        Merk: Enhetene er de samme som i trinn 6.1.4.2. Se Supplemental kodefilen for eksempler på beregninger ved hjelp av disse ligningene.
    5. I biosikkerhet kabinett, fjerne supernatanten med en pipettespiss og resuspender pelleten i friske mMRS eller PBS som beregnet i trinn 6.1.4.2.
  2. vaksinere bakterier
    1. Overføre 50 ul av bakteriene til de koniske rør med sterilt diett end dechorionated egg i biosikkerhet skap. Legg bakterier etter egg overføring for å hindre forurensning mellom hetteglass.
    2. Plasser inokulerte rør i en inkubator ved 25 ° C.

7. Mål CFU Load / Test for sterilitet

  1. For å måle CFU belastningen i hele kroppen flue homogenates, overføre 5 fluer (5-7 dager etter eklosjonshormon) til en 1,7 ml microfuge rør som inneholder 125 mL av keramiske kuler og 125 mL av mMRS buljong. Homogenfluer ved anvendelse av en vevshomogenisator i 30 sekunder ved 4,0 m / sek.
    1. Alternativt utelate perler og hånd homogen i Mikrosentrifugerør med plast pestles for 1 min.
    2. Hvis kvantifisere gut microbiota, overflate sterilisere fluene å fjerne eksogene mikrober 22. Overføring flyr til et mikro-sentrifugerør inneholdende 100 ul 70% etanol i 1 minutt, aspirer etanol, og overføring til et nytt mikrosentrifugerør for homogenizations. Dersom DNA-innhold i tarmen vil bli målt, skyll feller 1 min med 0,6% natriumhypokloritt før etanolvask.
  2. Fortynn med 875 pl homogenat mMRS, vortex i 5 sekunder, og pipettér 120 ul av homogenat inn i den første brønn i en mikrotiterplate.
  3. Utfør to sekvensielle 1: 8 fortynninger bruker 10 mL homogenate og 70 mL MRS i de neste to brønnene.
    1. Fjern 10 ul fra den første brønnen og legge den til den andre brønnen som inneholder 70 mikroliter MRS. Bland innholdet i den andre brønnen grundig, overføre 10 mL fra den andre brønnen som den tredje brønnen som inneholder 70 mikroliter MRS, og bland godt. Dette fører til 3 total konsentrasjon av de opprinnelige 1000 ul homogenat: ufortynnet, 1: 8 og 1:64.
  4. Overføre 10 ul av hver fortynning til en mMRS plate (ved hjelp av en multikanal pipette hvis ønskelig). Litt stigning fatet å spre fortynning flere millimeter ned agar overflaten og la væsken tørke før du flytter plate. Væsken tørker på the plate raskt dersom platene er 2 dager gamle, noe som reduserer blanding av to nabodråper.
  5. Inkuber ved 30 ° C i 1-2 dager. Fjern platene fra inkubatoren gang forskjellige, individuelle kolonier er synlige, og telle fra en fortynning med 10-100 isolerte kolonier.
  6. Beregn CFU per fly ved hjelp av ligningen E = C x D / P x V / F, der E = CFU per fly, C = antall kolonier telles, D = utvanning, P = ul belagt, V = volumet av fly homogenat, og F = antall fluer homogenis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket oppdrett av axenic fluer bekreftes av isolering av ingen CFU fra hele kroppen homogenizations av D. melanogaster voksne (figur 1). Alternativt, hvis belagt homogenate gir kolonier, blir ampullene forurenset og bør kastes. For gnotobiotiske fluer, ble hver av de fire bakterieisolater isolert fra bassenger av 5 voksne menn, viser forskjeller i totale levedyktige CFU assosiert med voksne fluer (figur 1). Hver bakteriearter har en distinkt morfologi og kan skilles visuelt (figur 2). Dersom en eller flere kolonityper ikke registreres det kan ha vært feil i utarbeidelsen av bakteriell podestoff (for eksempel vasking, normalisering, miksing) eller tilsvarende arter er kanskje ikke kompatible med dyrkningsforhold (f.eks Drosophila tetthet 23 eller genotype 24). For å utelukke tekniske feil vi RECommend plettering av et parti av bakterieblandingen umiddelbart etter inokulering flue ampuller (trinn 6.2).

Figur 1
Figur 1: Colony Forming Units Funnet i Axenic og gnotobiotiske Drosophila Antallet kolonidannende enheter (CFU) per fly i hele kroppen homogenates av 4-arter gnotobiotiske og axenic D.. melanogaster. Mangel på kolonier i axenic homogenates bekrefter D. melanogaster sterilitet. Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av 24 replikere verdier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Skille bakteriekolonier. </ strong> CFU fra en prøve homogenisering som viser forskjellige morfologi for hver av de 4-artene i gnotobiotiske D. melanogaster. Acetobacter Koloniene er en klar, lys brun farge og kommer i varierende størrelse avhengig av arten. ~ 24-36 timer etter plating, A. Tropic kolonier er ugjennomsiktig, mens A. pomorum er gjennomsiktig, men over tid forskjellen blir mindre uttalt. L. Brevis kolonier er små og hvite og L. plantarum kolonier er store og gul. Om nødvendig vekst fra homogenat kan sammenlignes med de originale bakterier platene til å skille hver type koloni 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

mMRS Oppskrift
Beløp i g Merknader
Destillert vann 1000
Universal Pepton 12,5
Gjærekstrakt 7.5
glukose 20
Dipotassium fosfat 2
ammoniumsitrat 2
Natriumacetat 5
magnesium Sulfate 0.1
Mangan sulfat 0,05
agar 12 Ikke legg til kjøttkraft

Tabell 1: mMRS oppskrift.

<tr>
Gjær-glukose diett oppskrift
Beløp i g
Destillert vann 500
Ølgjær 50
glukose 50
agar 6

Tabell 2: Gjær-glukose diett oppskrift.

Supplemental arkivkode. Eksempel Beregninger Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som beskrives her er en av flere tilnærminger for embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, sammen med alternative metoder for oppdrett av axenic fluer, inkludert seriell overføring av axenic voksne 18,27 eller antibiotikabehandling 13,18. Andre dechorionation metoder omfatter etanol vasker og redusere 11,25,26 eller forlenge 8 hypokloritt behandling. Ulike vasketrinn kan hjelpe oppdragelse forskjellige flue genotyper: I en tidligere studie fleste av ~ 100 Drosophila genotyper var axenic når oppdratt som beskrevet her (uten etanol vasker), men noen linjer ble forurenset og forkastet 24. Kanskje noen forurensede linjer ville ha vært axenic hvis oppdratt med etanol vasker eller lenger hypokloritt behandling. Dersom metoden skissert her ikke fører til isolasjon av axenic fluer for bestemte verts genotyper anbefaler vi etanol skyllinger eller lenger hypokloritt behandling for å avhjelpe problemet.

ent "> Når serie overføringer av Drosophila er brukt, er en foreldre axenic generasjon gjort axenic av egg dechorionation som beskrevet her, og senere generasjoner blir vedlikeholdt av aseptisk overføring i en biosikkerhet kabinett, med eller uten antibiotika 18,27. Seriell overføring er raskere enn å utlede axenic fluer på nytt hver generasjon, og overføres fluer kan forbli axenic for flere generasjoner. en komplikasjon av serie overføringer er å opprettholde matchet tettheter av konvensjonelle / gnotobiotiske og axenic fluer siden axenic fluer pleier å legge færre egg enn en sammenlignbar tidsintervall (data ikke vist). Ettersom Drosophila tetthet påvirker flere egenskaper, inkludert bakterielle preparat i flue diett 23,28,29, overføring av egg på nytt hver generasjon kan være en overlegen metode for tetthets-sensitive egenskaper flue. de novo dechorionation unngår også muligheten for bakterieangrep i ​​løpet overføringer. Således, mens serie overføringer kan spare tid, dechorionation gir mer kontroll over kompliserende variabler.

Antibiotika kan også brukes til å lage axenic fluer, men i motsetning til dechorionation, vanligvis ikke er tilstrekkelig for fullstendig å fjerne kolon mikrober 13 antibiotikabehandling. I tillegg kan antibiotika påvirke verten direkte. For eksempel øker fluer på en diett med antibiotika reduserer deres fruktbarhet og proteininnhold, men disse effektene ble ikke observert i fluer hevet fra dechorionated embryoer 13. Vi merker oss at antibiotika er nødvendig å eliminere endosymbiotic bakterier som overføres vertikalt og ikke påvirkes av overflaten sterilisering, for eksempel Wolbachia 33.

Flere trinn er avgjørende for å lykkes med å utarbeide dechorionated axenic eller gnotobiotiske fluer. Først er det viktig å riste fly diett som i trinn 2.3. Dersom kurvene ikke blir ristet for hånd i omtrent 15 sekunder hver før og etter en eksakt45 min intervall på shaker, vil gjær og agar bosette, redusere fly tilgang til gjær og gjør agaroverflaten for myk for fly kultur. For det andre, tykkelsen av gjærpasta og agar konsentrasjonen av druesaft platene påvirker egg fjerning (trinn 3.3). Et tynt lag produsert av en 01:15 gjær: vann fortynning vil hindre egg fra innebygging i agar når skylling og fjerning fra mat plater (trinn 4.4). For det tredje, hvis grape juice platene er for myk og brytes opp i løpet av egg samling, fasthet av platene kan økes ved å tilsette mindre druesaftkonsentrat til den neste batch av platene. Fjerde, egg avkastning er høyere hvis fluer har 24 hr å akklimatisere til buret miljøet: Dette kan løses ved å plassere fluer i buret ~ 40 timer i forkant av samlingen, inkludert overføring til en ny samling bur med en frisk agar plate <20 time før den ønskede samlingen dato. Femte, hvis eggene ikke holder seg til den side av foringen under dechorionation (trinn 5.7), idet rinsing perioden bør utvides med 15-30 sek (OBS: utvide skylle gang for lenge kan drepe eggene). Dessuten kan egg tap i væsken skyller forebygges ved å sjekke mesh-foring segl for fullstendig lukking og kontrollere at egg ikke søler utenfor sikten under re-suspensjon. Dersom foringen er godt isolert, kan søles egg gjenvinnes ved å helle vaske gjennom sikten som vaske kastes. Sjette, etter fluene har klekket, en presumptiv test for å fastslå om fluene er axenic er å undersøke fargen på diett. Hvis fluene er axenic, vil det øverste laget av kostholdet være en mørkebrun kaffe farge og ingen luftbobler vil være tilstede under hele dietten. Luftbobler eller tan fargen på toppen diett laget indikerer bakteriell tilstedeværelse. Bakteriell nærvær bør fortsatt være bekreftet av homogenisering. Alternativt kan PCR-amplifikasjon av 16S rRNA-genet også bli utført for å påvise unculturable mikrober (f.eks strenge anaerobe) 30. Endelig, etter homogenjonsbetingelser, keramiske perler kan gjenbrukes ved gynge i en oppløsning av 2% hypokloritt + 0,05 M kaliumhydroksyd i 30 minutter, skylling generøst (10 ganger eller mer) i H2O, vasket en gang med 100% etanol (for å lette tørkingen), og tørking ved 65 ° C. Dersom alle trinn følges nøye, bør axenic fluer isoleres hver gang protokollen er utført.

Dette arbeidet skisserer en metode for re-assosiere sterile Drosophila embryoer med en 4-arter microbiota som er representativ for de bakterielle samfunn av laboratorie fluer reist på en gjær-glukose kosthold. Tidligere arbeid har brukt en 5-arter samfunnet, inkludert de 4-arter her og Lactobacillus fructivorans, som har vært numerisk tallrike i flere flue undersøkelser 9,19. Vi anbefaler å utelate L. fructivorans av flere grunner, blant annet at fenotyper i D. melanogaster monoassociated med L. fructivorans er i stor grad sammenfallende med axenic phenotypes 31 og L. fructivorans er mer kresen enn andre fly isolater. Hvis L. fructivorans er inkludert, er det dyrkes som beskrevet for L. plantarum og L. brevis: statisk væske kultur; og i en lufttett beholder oversvømmet med CO 2 for solid kultur (sistnevnte trinnet reduserer omgivelsesoksygennivå for å støtte Lactobacillus vekst).

Metodene som beskrives her, kan lett varieres for å skaffe Drosophila under forskjellige gnotobiotiske betingelser. For eksempel monoassociated fluer kan bli oppdratt ved inokulering sterile Drosophila embryoer med ett mikrobielle arter gangen 15,25,31. Flerbestands foreninger dannes ved inokulering flere arter i tilsvarende forholdstall 20,24. Selv om vi tilgjengelig CFU / OD 600 konstantene for hver av de 4-arter for å lette normalisering, kan det ikke være nødvendig å utlede en konstant for de fleste arter blandinger. jegt ble tidligere vist at overflod av mikrober i 5-7 DPE voksne var ikke signifikant forskjellig i 2-arter forbindelser når start tettheten av bakterier ble variert over tre størrelsesordener 20. Dessuten er det Drosophila tarmen meget ettergivende, og mange arter som er lett dyrkes på utlegger diett kan assosiere med Drosophila ved høye tettheter i monoassociation (for eksempel E. coli, B. subtilis 25) som muliggjør genetisk disseksjon av mikrobiell påvirkning av mikrober med omfattende genetiske og genomiske ressurser. Til slutt, studier av Drosophila fenotyper som er påvirket av bakterieflora kan tilpasse tilnærming av Altered Schaedler Flora hos mus ved inokulering naturligvis lagt konvensjonelle egg med en definert mikrobiell fellesskap for å sikre at hver ampulle har tilgang til et bestemt sett av mikrober.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Noen detaljer om denne protokollen ble optimalisert med hjelp av Dr. Adam Dobson, som også gitt nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av stiftelsen for National Institutes of Health (FNIH) stipend nummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, ajd, og AED). FNIH tilskuddet antallet 1F32GM099374-01 (PDN) og Brigham Young University oppstartsfond (JMC, MLK, MV). Publiseringskostnadene ble støttet av Brigham Young University College of Life Sciences og Institutt for plante- og dyre Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Developmental Biology axenic gnotobiotiske, Mikrobiomer microbiota,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Oppdragelse bananflue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under Axenic og gnotobiotiske betingelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter