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Developmental Biology

Aufzucht der Fruit Fly Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

Verfahren zur Aufzucht von Drosophila melanogaster unter axenic und gnotobiotischer Bedingungen vorgestellt. Fly Embryonen werden in Natriumhypochlorit, aseptisch in sterile Ernährung dechorionated und aufgezogen in geschlossenen Behältern. Impfen Ernährung und Embryonen mit Bakterien führt zu gnotobiotischer Verbänden und bakterielle Präsenz wird durch Plattierung Ganzkörper- Drosophila Homogenate bestätigt.

Introduction

Die meisten Tiere sind eng mit Bakterien ( 'Mikrobiota') von der Geburt bis zum Tod 1 verbunden. Vergleiche von Mikroorganismen frei ( 'axenic') und Mikroorganismen verbunden sind ( "konventionelle") Tiere haben Mikroben verschiedene Aspekte der Tiergesundheit beeinflussen gezeigt, einschließlich Stoffwechsel, Ernährung, Kreislauf-, Leber-, Atemwegserkrankungen, immunologische, endokrine und neurologische Funktion 2. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein Schlüsselmodell für 3,4 in Gegenwart von Mikroben viele dieser Prozesse verstehen und Mikrobiota Einfluss auf die Tiergesundheit 5,6 für das Studium. Keine Bakterienarten ist in jedem einzelnen ( "Core"), aber Acetobacter und Lactobacillus - Arten , die Mikrobiota sowohl im Labor aufgezogen und wild gefangenen D. numerisch dominieren melanogaster. Andere Acetobacteraceae (einschließlich Komagataeibacter und Gluconobacter), Firmicutes (wie Enterococcus und Leuconostoc) und Enterobacteriaceae sind häufig entweder in Drosophila Individuen in geringer Menge vorhanden, oder unregelmäßig in hohen Fülle 12.07.

Die Mikrobiota von Drosophila und Säugetieren 14,19 innerhalb und zwischen den Generationen inkonstant. Mikrobiota Unbeständigkeit kann zu phänotypischen Rauschen führen, wenn Mikrobiota abhängigen Merkmale zu messen. Zum Beispiel kann der Acetobacteraceae Einfluss Lipid (Triglycerid) Lagerung in Drosophila 15-18. Wenn Acetobacteraceae häufiger in Fliegen eines Fläschchens sind als in einem anderen 19 kann isogenen Fliegen unterschiedlichen Phänotypen 20 haben. Eine Lösung für das Problem der Mikrobiota Unbeständigkeit bei Mäusen 14 hat sich seit den 1960er Jahren in der Praxis gewesen, indem eine definierte Gemeinschaft von 8 dominanten mikrobiellen Spezies Maus Welpen jede neue Generation (veränderte Schädler Flora) die Einführung,sicherzustellen, dass jeder Welpe den gleichen Schlüssel Mitglieder der Maus Mikrobiota ausgesetzt ist. Diese Praxis steuert für microbiota Zusammensetzung selbst wenn der Mikrobioten nicht das primäre Ziel der Studie 32 und setzt Präzedenzfall das Vorhandensein von Schlüssel Mikroben in einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu gewährleisten.

Um den Einfluss von Mikroben auf Drosophila Ernährung, verschiedene Protokolle zur Ableitung axenic Fliegenlinien definieren , wurden entwickelt, einschließlich Hypochlorit dechorionation von Embryonen (entweder abgeleitet de novo jeder Generation oder generations durch Übertragung auf sterile Nahrung gehalten) und Antibiotika - Behandlung 13. Es gibt Vorteile für unterschiedliche Ansätze, wie die Leichtigkeit und die Schnelligkeit für die beiden Antibiotika - Behandlung und eine serielle Übertragung, im Vergleich zu mehr Kontrolle über Störvariablen mit de novo dechorionation (zB Eierdichte, Rest kontaminierenden Mikroben, off-target antibiotische Wirkung). Unabhängig von der Methode derVorbereitung, Einführung bestimmter Mikrobenarten Embryonen Axenische erlaubt Kultur von Drosophila mit definierten ( 'gnotobiotischer') Gemeinden. Alternativ imitiert die Verwendung von Schädler Flora könnte diese Gemeinschaft zu konventionell gelegte Eier (entsprechend den Schritten 6-7 nur) geimpft werden, um die Anwesenheit von Charakterzug beeinflussenden Mikroben in jedem Fläschchen und vermeiden Komplikationen der Mikrobiota Unbeständigkeit zu gewährleisten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die durch de novo dechorionation von Embryonen axenischen und gnotobiotischen Drosophila Anheben und zur Bestätigung der Anwesenheit von eingeführt oder kontaminierende mikrobiellen Taxa.

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Protocol

1. Kultur Bakterien (Start ~ 1 Woche vor der Eier Picking)

  1. Bereiten modifizierten MRS 20 (MMRs) -Platten und Brühe Rohre (Tabelle 1). Gießen Sie 20 ml MMRS Agar in jede 100 mm Petrischale und erlauben / trocken über Nacht abkühlen, oder 5 ml MMRS Brühe in 18 mm-Teströhrchen.
  2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis und L. plantarum auf MMRS Agarplatten. Inkubieren Acetobacter über Nacht bei 30 ° C. Inkubieren Lactobacillus anaerob durch die Platten in einem luftdichten Behälter und Flutung mit Kohlendioxid Platzierung vor dem Versiegeln. über Nacht bei 30 ° C inkubieren.
    Anmerkung: L. brevis Kolonien kann bis 24-48 h nicht sichtbar sein. Platten können bei 4 ° C gelagert werden, und Kolonien können für bis zu 3 Wochen verwendet werden.
  3. Zwei bis drei Tage vor dechorionated Eier sterile Ernährung (Abschnitt 5) zu übertragen, wählen Sie eine einzelne Kolonie von der MMRS Platte in ein Reagenzglas conTaining MMRS Brühe. Wachsen Acetobacter unter Schütteln und wachsen Lactobacillus statisch für 24 Stunden oder bis zur Trübung, die beide bei 30 ° C.

2. Bereiten Sie Sterile Diät

  1. Bereiten sterile Diät (Tabelle 2) in einem 2 l Erlenmeyerkolben. Mikrowellen die Diät, bis er drei aufeinanderfolgende mal gekocht hat; mischen zwischen jedem Kochen in.
  2. Der Kolben wird auf einer Rührplatte unter Rühren zu halten, während Ernährung konischen Zentrifugenröhrchen übertragen. Übertragen 7,5 ml Diät zu 50 ml Zentrifugenröhrchen. Kappe lose die Rohre, und in einem überdachten, autoklavierbar Polypropylen-Rack.
  3. Sterilisieren Fliegendiät einem Autoklaven bei 121 ° C und 15 psi für 25 min verwendet wird. Entfernen Sie Racks von Autoklaven und sofort jedes Rack horizontal schütteln Diät, um sicherzustellen, nicht trennen während der Abkühlung. Seien Sie vorsichtig, um nicht die Racks schütteln vertikal Übertragung der Ernährung auf den Deckel oder Ränder der Rohre zu verhindern. Lassen Sie die Diät auf einem Schüttler abkühlen für genau 45 Minuten undschütteln wieder die Diät horizontal von Hand.
    Note: Diät für bis zu einer Woche bei 4-15 ° C gelagert werden.
  4. Als Alternative zur Verwendung abgedeckt autoklavierbar Racks (Schritte 2.1-2.3) oder Fliegen auf Diäten Konservierungsmittel enthalten, Säure zu erhöhen, führen Sie die folgenden Schritte aus:
    1. Bereiten Sie 1 L flüssige Nahrung in einem 2-Liter-Kolben mit einem Rührstab in den Kolben. Autoclave die Diät.
    2. Nach dem Autoklavieren wurden 10 ml Konservierungsmittel hinzufügen und kontinuierlich auf einem beheizten Rührplatte rühren. Wenn der Agar auf 50-60 ° C abgekühlt ist, in einem Bio-Sicherheitsschrank den Kolben mit einem beheizten Rührplatte bewegen und Kolbentemperatur durch Erhitzen auf 50 bis 60 ° C halten.
    3. Im Biosicherheitsschrank, pipettieren ~ 7,5 ml einzeln in konische Röhrchen.

3. Bereiten Sie Eiablage Cages

  1. Machen Sie Traubensaftes Agarplatten durch microwaving 100 ml Wasser, 10 g Bierhefe, 10 g Glucose und 1 g Agar-Agar. Zum Kochen bringen 3 mal in Schritt 1.1 und fügen Sie 10 g gefrorene Traubensaft concentrate, um die Sichtbarkeit der Eier auf der Agarplatte erhöhen.
  2. Wenn Agar auf 55 ° C abgekühlt ist, gieße 20 ml in 100 mm Petrischalen und Erstarren lassen.
  3. Decken Sie die Oberfläche der Agarplatten mit einer Hefe-Paste durch Mischen von 1 g Bierhefe mit 15 g Wasser. Gießen Sie Hefe Paste auf die Agar-Platte machen, dass die Oberfläche bedeckt ist, dann das überschüssige abgießen, einen dünnen Hefe Rückstände zu hinterlassen hinter. Wenn mehrere Platten verwendet werden, kann die Paste der Reihe nach auf mehrere Platten gegossen werden.
  4. Übertragen Agarplatten in den Boden eines Käfigs.
    Hinweis: Ein 32 Unzen deli Behälter ein guter Ersatz für Acrylfliegenkäfigen ist.
    1. Machen Deckel für 32 Unzen deli Behälter durch ein Loch in der oberen Schneide- und eine atmungsaktive Mesh über das Loch mit ungiftigen Leim geklebt wird. Wenn der Kleber auf den Deckel der Einwirkung von Wasser wasserlöslich verhindern.
  5. Transfer 200-300 fliegt in den Behälter und Deckel mit Deckel. Decken Sie die Mesh-geschützten Loch mit einer leeren Petrischale Deckel Prevent Verdampfung von der Agar-Oberfläche und fügen Sie ein feuchtes Tissue-Papier im Inneren des Deckels, falls gewünscht. Inkubieren Fliegen bei 25 ° C über Nacht für 16-20 Std.

4. Sammeln Eier

  1. Bereiten Sie ein Sieb für Eiersammlung von Nylon-Mesh in eine Kunststoffbuchse platzieren.
  2. Um die Platte mit Eiern auf sie abrufen, entfernen Sie fliegt aus dem Käfig durch in einen leeren Behälter zu übertragen. Wenn gleiche Fliegen wird am nächsten Tag verwendet werden, unverzüglich in einen neuen Käfig ein frisch yeasted Traubensaftes Agar-Platte enthält. Fliegen können für 3-5 aufeinander folgenden Tagen verwendet werden
  3. Entfernen Sie tote Fliegen aus dem Agar mit einem sauberen Pinsel, achten Sie darauf, das Agar nicht zerbrechen.
  4. Sammeln Sie Eier durch die Agar-Platte mit destilliertem Wasser gespült, sanft Eier von der Agar-Oberfläche, und Gießen des Schlamms über die Maschen zu bürsten. Wiederholen 3-4 mal, bis alle oder die meisten der Eier von der Agarplatte entfernt wurden.

5. Dechorionate Eier und Transfer zum Sterile DIET

  1. Bereiten Sie die Biosicherheitsschrank durch das Innere Spritzen (einschließlich Seiten) mit 70% Ethanol. Wischen Sie den Boden mit einem Labor Gewebe und sterilisieren Sie die Haube mit UV-Licht für ~ 15 min. Sterilisieren alle nicht-biologische Vorräte (Probenbecher, Pinsel, Pinzetten, Abfallbehälter, 400 ml sterilisiertem Wasser und 100 ml 0,6% Natriumhypochlorit) durch mit Ethanol Spritzen und sofort in der Biosicherheitsschrank platzieren. Sterilisieren mit UV-Licht für 15 min.
  2. Starten Sie das erste von 2 Natriumhypochlorit wäscht durch die Buchse mit den Eiern Platzierung in ein 120 ml Probenbecher oder einem anderen sterilen Behälter. gießen langsam ~ 90 ml 0,6% iger Natriumhypochloritlösung in die Hülse bis kurz unterhalb des Randes.
  3. Spülen Sie Eier für 2,5 min. resuspendieren Sie regelmäßig die Eier mit einer Zange mit der Hülse nach oben und unten in der Hypochlorit-Lösung zu bewegen.
  4. Übertragen Sie die Buchse direkt in eine zweite Probenbecher, vorgefüllt mit 90 ml Bleichmittel, im Inneren des Biosicherheitsschrank.
  5. WiederholenSchritt 5.3 innerhalb des Biosicherheitsschrank. Am Ende des zweiten Bleichbehandlung sollten die Eier beginnen an den Seiten der Buchse zu halten.
  6. Führen Sie die Schritte 5,7-5,8 im Biosicherheitsschrank.
  7. Entsorgen Sie das Bleichmittel und waschen Sie die Buchse mit sterilem Wasser 3 mal. Re-suspend die Eier mehrmals während jeder Wäsche durch die Buchse mit einer Pinzette zu bewegen. Bis zum Ende der dritten Wasch meisten Eier sollte an der Seite der Buchse angebracht werden.
  8. Mit einem Pinsel in Ethanol sterilisiert, übertragen Eier von der Seite der Buchse in die sterile Ernährung. Übertragen Eier einzeln oder in kleinen Chargen. Ziel ist es für 30 bis 50 Eier pro Fläschchen. Lassen Sie die Kappen lose, damit Sauerstoff in das Rohr einzutreten. Wenn Fläschchen bleiben axenic sind, übertragen auf einen Insekten Inkubator; Andernfalls fügen Sie wie unten Bakterien.

6. Stellen Sie gnotobiotische Fliegen Unter Verwendung von 4 Bakterienart

  1. bereiten Bakterien
    1. Bereiten Sie eine sterilisierte Biosicherheitsschrank mit notwendigen Materialien (pipettes, Pipettenspitze Boxen, sterilisierte Zentrifugenröhrchen, MRS-Brühe und Reagenzglasständer), wie in Schritt 4.1. Wischen Sie die Außenseite der Reagenzgläser mit einem Ethanol-getränkten Labor wischen, bevor in Biosicherheitswerkbank platzieren.
    2. Pellet die Bakterien, indem zunächst 500 ul Wachstum über Nacht in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Wenn Bakteriendichte niedrig ist, zu jedem Röhrchen auf 1,5 ml oder sequenziell Überstand entfernen und zusätzliche Kultur das gleiche Rohr hinzuzufügen. Entfernen Proben aus der Biosicherheitsschrank und Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g. Verwenden Filterspitzen Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
    3. Bestimmen Sie die Dichte jeder Kultur von OD 600 gemessen wird . Wenn eine Multi-Well-Platten-Lesegerät verwenden, übertragen 200 ul jeder Kultur auf eine 96-Well-Platte in 1-, 2- und 4-fach-Verdünnungen.
    4. Bestimmung der Menge an MMRS in dem jede Zellpellet (5.2.2) mit einem Plattenlese-Spektralphotometer und die folgenden Gleichungen zu verdünnen. Planen Sie genug Brühe hinzufügen 50 & zu impfen# 956; l zu jedem Fliegen Fläschchen.
      1. Sammeln OD 600 Ablesungen für ein 1: 1, 1: 2 und 1: 4 - Verdünnung jeder Bakterienkultur auf einem Plattenlese - Spektralphotometer. Wählen Sie die Verdünnung für jeden Bakterienstamm, der einen OD 600 - Wert zwischen 0,1 und 0,2 und verwenden diesen Wert und den entsprechenden Verdünnungsfaktor als "O" produziert und 'D' in den angegebenen Formeln in 6.1.4.2 oder 6.1.4.3.
      2. Wenn hier beschrieben mit den 4 Arten, normalisieren Zellen in äquivalente koloniebildende Einheit (CFU) / ml Dichte (OD 600 bis CFU Umwandlung bestimmt vorher 20) mit Hilfe dieser Gleichung:
        E = ((OB) x V x D) / C
        wobei E = Volumen Pellet in (ul) zu suspendieren, O = OD 600 Bakterien, B = OD 600 leere Medien, D = fach-Verdünnung, V = & mgr; l Bakterienkultur vor der Zentrifugation, C = OD 600 von vorgegebenen konstant. Siehe Ergänzenden Code Beispiele für Berechnungen Datei diese Gleichungen. Für Spektrophotometers, die automatisch leer, "O" anstelle von "OB" zu verwenden.
        Anmerkung: Die vorbestimmten Konstanten (units OD 600, normiert auf 10 7 CFU ml -1, abgeleitete Konstanten in 20) sind wie folgt: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Wenn andere Bakterienarten verwenden (keine CFU / OD 600 konstant zur Verfügung steht), Dichte normalisieren 600 = 0,1 unter Verwendung dieser Gleichung OD:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Anmerkung: Einheiten sind die gleichen wie in Schritt 6.1.4.2. Siehe Ergänzenden Code Beispiele für Berechnungen Datei diese Gleichungen.
    5. Im Biosicherheitsschrank entfernen Überstand mit einer Pipettenspitze und das Pellet in frischem MMRS oder PBS, wie in Schritt 6.1.4.2 berechnet.
  2. Impfen Bakterien
    1. Transfer 50 & mgr; l der Bakterien an die konische Röhrchen mit sterilem Diät eined dechorionated Eier in Biosicherheitsschrank. In Bakterien nach Eitransfer Kontamination zwischen den Fläschchen zu verhindern.
    2. Platzieren inokulierten Röhrchen in einem Inkubator bei 25 ° C

7. Messen CFU Last / Test für Sterilitäts

  1. Zur Messung der CFU Belastung in ganzen Körper fliegen Homogenate, Transfer 5 Fliegen (5-7 Tage nach dem Schlüpfen) zu einem 1,7-ml-Mikroröhrchen mit 125 ul Keramikperlen und 125 & mgr; l MMRS Brühe. Homogenisieren fliegt ein Gewebe-Homogenisator für 30 Sekunden bei 4,0 m / s verwendet wird.
    1. Alternativ auslassen Perlen und Hand in Mikrozentrifugenröhrchen mit Kunststoff Stampfen für 1 min homogenisieren.
    2. Wenn die Darmflora zu quantifizieren, die Oberfläche , die Fliegen zu sterilisieren , um exogene Mikroben 22 zu entfernen. Transfer fliegt in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 100 & mgr; l 70% Ethanol für 1 min, absaugen Ethanol und Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen für Homogenisierungen. Wenn der DNA-Gehalt des Darms werden gemessen wird, spülen foder 1 min mit 0,6% Natriumhypochlorit vor dem Ethanol waschen.
  2. Verdünnen Sie das Homogenat mit 875 & mgr; l MMRS, Wirbel für 5 Sekunden, und pipettieren 120 ul Homogenat in die erste Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
  3. Führen Sie zwei aufeinanderfolgenden 1: 8 Verdünnungen unter Verwendung von 10 & mgr; l Homogenat und 70 & mgr; l MRS in den nächsten zwei Brunnen.
    1. Entfernen Sie 10 ul aus der ersten Vertiefung und fügen Sie ihn in die zweite Vertiefung mit 70 & mgr; l MRS. Mischen Sie den Inhalt des zweiten und gründlich, Transfer 10 ul aus dem zweiten und dem dritten Vertiefung mit 70 & mgr; l MRS und gründlich mischen. Dies führt zu 3 Gesamtkonzentrationen der ursprünglichen 1000 ul Homogenat: unverdünnt, 1: 8 und 1:64.
  4. Transfer 10 ul jeder Verdünnung auf eine MMRS Platte (ein Mehrkanal-Pipette, wenn gewünscht). Etwas das Gericht neigen die Verdünnung mehrere Millimeter auf der Agar-Oberfläche zu verteilen und Flüssigkeit, bevor die Platte trocknen lassen. Die Flüssigkeit trocknet auf the Platte schnell, wenn die Platten 2 Tage alt sind, von zwei benachbarten Tröpfchen reduziert Mischung.
  5. Inkubieren bei 30 ° C für 1-2 Tage. Entfernen Platten aus dem Inkubator einmal deutlich, einzelne Kolonien sichtbar sind, und zählen von einer Verdünnung mit 10-100 isolierte Kolonien.
  6. Berechnen CFU pro Fliege unter Verwendung der Gleichung E = C x D / P x V / F, wobei E = CFU pro Fliege, C = Anzahl der Kolonien gezählt, D = Verdünnungs, P = & mgr; l ausplattiert, V = Volumen des Fliegen Homogenat und F = Anzahl der Fliegen homogenisiert.

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Representative Results

Erfolgreiche Aufzucht von axenic Fliegen wird durch Isolierung ohne KBE von Ganzkörper - Homogenisierungen von D. bestätigt melanogaster Erwachsenen (Abbildung 1). Alternativ, wenn das plattierte Homogenat Kolonien ergibt, werden die Vials kontaminiert und muss entsorgt werden. Für gnotobiotischen Fliegen wurden jeden der vier Bakterien Isolate aus Pools von 5 erwachsenen Männchen getrennt, Unterschiede in Gesamtkeim CFUs demonstrieren mit erwachsenen Fliegen ASSOCIATED (Abbildung 1). Jede Bakterienart hat eine unterschiedliche Morphologie und kann visuell unterschieden werden (Abbildung 2). Wenn eine oder mehrere Kolonietypen nicht erfasst werden kann es wurden Fehler haben in das bakterielle Inokulum Herstellung (beispielsweise Waschen, Normalisieren, Mischen) oder die entsprechenden Spezies nicht mit Kulturbedingungen (zB Drosophila Dichte 23 oder Genotyp 24) kompatibel sein. Um auszuschließen, technische Fehler, die wir recfohlen Plattieren eines Teils des Bakteriengemisch unmittelbar nach fly Vials (Schritt 6.2) Animpfen.

Abbildung 1
Abbildung 1: Koloniebildende Einheiten Gefunden in Axenic und gnotobiotische Drosophila Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Fliege in Ganzkörper - Homogenaten von 4-Spezies gnotobiotischer und axenic D.. melanogaster. Mangel an Kolonien in den axenischen Homogenate bestätigt D. melanogaster Sterilität. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM von 24 Wiederholungs Werte dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Differenzieren Bakterienkolonien. </ strong> KBE aus einer Probe Homogenisierung unterschiedliche Morphologien für jede der 4-Spezies in der gnotobiotischer D. zeigt melanogaster. Acetobacter Kolonien sind eine klare, hellbraune Farbe und kommen in verschiedenen Größen , je nach Spezies. ~ 24-36 Stunden nach der Plattierung, A. tropicalis Kolonien sind opak, während A. pomorum ist transparent, obwohl im Laufe der Zeit wird der Unterschied weniger ausgeprägt. L. brevis Kolonien sind klein und weiß und L. plantarum Kolonien sind groß und gelb. Falls notwendig, Wachstum aus dem Homogenat kann auf die ursprünglichen Bakterien Platten verglichen werden , um jede Art von Kolonie 20 unterscheiden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

MMRS Rezept
Menge in g Notizen
Destilliertes Wasser 1000
universal-Pepton 12.5
Hefeextrakt 7.5
Glucose 20
Dikaliumphosphat 2
ammoniumcitrat 2
Natriumacetat 5
Magnesiumsulfat 0,1
Manganerze Sulfate 0,05
Agar 12 Fügen Sie nicht Brühe

Tabelle 1: MMRS Rezept.

<tr>
Hefe-Glucose Diät Rezept
Menge in g
Destilliertes Wasser 500
Brauhefe 50
Glucose 50
Agar 6

Tabelle 2: Hefe-Glucose Diät Rezept.

Ergänzenden Code Datei:. Beispielberechnungen Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Das hier beschriebene Verfahren ist eines von mehreren Ansätzen für Embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, zusammen mit alternativen Methoden der axenic Fliegen Aufzucht, einschließlich der seriellen Übertragung von axenic Erwachsene 18,27 oder Antibiotika - Behandlung 13,18. Andere dechorionation Methoden schließen Ethanol wäscht und reduzieren 11,25,26 oder 8 Hypochlorit Behandlung verlängern. Verschiedene Waschschritte helfen können verschiedene Fliegen Genotypen Aufzucht: in einer früheren Studie meisten ~ 100 Drosophila Genotypen axenic waren , als aufgezogen wie hier beschrieben (ohne Ethanol Wäschen), aber einige Linien wurden kontaminiert und verworfen 24. Vielleicht einige verunreinigte Linien axenic mit Ethanol wäscht oder mehr Hypochloritbehandlung wenn aufgezogen wäre. Wenn die Methode hier skizzierten nicht zur Isolierung von axenic Fliegen für bestimmte Wirts Genotypen führen empfehlen wir Ethanol Spülungen oder mehr Hypochlorit Behandlung, um das Problem zu beheben.

ent "> Bei der seriellen Übertragung von Drosophila verwendet werden, wird eine elterliche axenic Generation von Ei dechorionation gemacht axenic wie hier beschrieben, und die nachfolgenden Generationen durch aseptische Transfer in einem Biosicherheitsschrank gehalten werden, mit oder ohne Antibiotika 18,27. Serielle Übertragung ist schneller als axenic Fliegen Ableitung in jeder Generation aufs Neue, und übertragen Fliegen für mehrere Generationen axenic bleiben kann. eine Komplikation von seriellen Übertragungen wird dazu neigen, da axenic Fliegen angepasst Dichten von konventionellen / gnotobiotischer und axenic Fliegen Aufrechterhaltung weniger Eier gegenüber einem vergleichbaren Zeitintervall (Daten nicht zu legen gezeigt). Da Drosophila Dichte mehrere Merkmale beeinflusst, einschließlich bakterieller Zusammensetzung in Fliegendiät 23,28,29 kann Eier neu jeder Generation Übertragung für das Fliegendichte empfindlichen Traits eine überlegene Ansatz. De novo dechorionation vermeidet auch die Möglichkeit einer bakteriellen Kontamination während Transfers. während also serielle Transfers Zeit sparen können, dechorionation ermöglicht mehr Kontrolle über komplizieren Variablen.

Antibiotika können auch axenic Fliegen, obwohl im Gegensatz zu dechorionation, Antibiotika - Behandlung ist in der Regel nicht ausreicht , um vollständig zu erstellen verwendet werden entfernen Mikroben 13 kolonisieren. Zusätzlich können Antibiotika den Host direkt beeinflussen. Beispielsweise mit Antibiotika Fliegen auf eine Diät Anhebung verringert sich ihre Fruchtbarkeit und der Proteingehalt, aber diese Effekte wurden nicht in Fliegen aus dechorionated Embryonen angehoben 13 beobachtet. Wir stellen fest , dass Antibiotika notwendig sind endosymbiotic Bakterien zu beseitigen , die vertikal übertragen werden und nicht durch die Oberflächensterilisation, wie Wolbachia 33 beeinflusst.

Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg von dechorionated axenischen oder gnotobiotischen Fliegen vorbereitet. Erstens ist es wichtig, die Fliegendiät wie in den Schritten 2.3 zu schütteln. Wenn die Zahnstangen sind nicht für etwa 15 sec mit der Hand geschüttelt jeweils vor und nach einer genauen45 Minuten-Intervall auf dem Schüttler, der Hefe und Agar wird absetzen, den Zugang zu Hefe fliegen abgemildert und die Agar-Oberfläche für das Fliegen Kultur zu weich. Zweitens beeinflusst die Dicke der Hefe-Paste und die Agar-Konzentration von Traubensaft Platten Ei Entfernung (Schritt 3.3). Eine dünne Schicht erzeugt durch eine 01.15 Hefe: Wasserverdünnung wird Eier verhindern im Agar von der Einbettung, wenn sie von den Nahrungsmittelplatten Spülen und Entfernen (Schritt 4.4). Drittens, wenn Traubensaft Platten zu weich und brechen während Eiersammlung, Festigkeit der Platten kann durch Zugabe von weniger Traubensaftkonzentrat auf die nächste Charge von Platten erhöht werden. Viertens Ei Erträge sind höher, wenn Fliegen 24 Stunden haben, um den Käfig Umgebung zu akklimatisieren: Dies kann durch Fliegen im Käfig ~ 40 Stunden vor der Sammlung angesprochen werden, einschließlich der Übertragung auf eine neue Sammlung Käfig mit einer frischen Agarplatte <20 Stunden vor dem gewünschten Abholtermin. Fünftens, wenn die Eier sich nicht an der Seite der Buchse während dechorionation (Schritt 5.7), die rinsPeriode sollte um 15-30 sec verlängert werden (Achtung: Zu lange die Spülzeit erstreckt, können die Eier zu töten). Auch den Verlust von Eiern in die Flüssigkeit Spülungen kann durch Prüfen der maschenBuchse Dichtung für eine vollständige Schließung verhindert werden, und stellen Sie sicher, dass Eier verschütten nicht außerhalb des Siebes während der erneuten Suspension. Wenn die Buchse gut abgedichtet ist, können verschüttete Eier durch Gießen der Wäsche durch das Sieb zurückgewonnen werden, wenn die Wäsche wird verworfen. Sechstens nach Fliegen geschlüpft sind, um zu bestimmen, eine vermutliche Test, wenn die Fliegen sind axenic ist die Farbe der Diät zu untersuchen. Wenn die Fliegen axenic sind, wird die oberste Schicht der Diät eine dunkelbraune Farbe Kaffee sein und keine Luftblasen werden während der Diät vorhanden sein. Luftblasen oder braune Farbe der oberen Schicht Diät zeigen bakterielle Präsenz. Bakterielle Anwesenheit sollte noch durch Homogenisierung bestätigt werden. Alternativ PCR - Amplifikation der 16S rRNA - Gens kann auch nicht kultivierbarer Mikroorganismen zu detektieren (zB obligate Anaerobier) 30 durchgeführt werden. Schließlich, nach homogenisierung, Keramikperlen kann durch Schaukeln in einer Lösung von 2% Hypochlorit + 0,05 M Kaliumhydroxid für 30 min, Spülen großzügig (10 - mal oder mehr) in H 2 O, Waschen einmal mit 100% Ethanol (zur Erleichterung der Trocknung) wiederverwendet, und bei 65 ° C getrocknet wird. Wenn alle Schritte sorgfältig befolgt werden, sollte axenic Fliegen jedes Mal, isoliert werden das Protokoll durchgeführt wird.

Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Wieder Assoziieren sterile Drosophila - Embryonen mit einem 4-Spezies Mikrobioten , die auf einem Hefe-Glucose - Diät Vertreter der Bakteriengemeinschaften von Laborlinie angehoben ist. Frühere Arbeiten haben eine 5-Artengemeinschaft einschließlich der 4-Arten , die hier und Lactobacillus fructivorans verwendet, die 9,19 numerisch reichlich in mehreren Fliegen Umfragen war. Wir empfehlen , das Weglassen L. fructivorans aus mehreren Gründen, einschließlich der Phänotypen in D. melanogaster monoassociated mit L. fructivorans sind weitgehend mit axenic ph kongruentenotypes 31 und L. fructivorans ist anspruchsvoller als andere Fliege isoliert. Wenn L. fructivorans enthalten ist, sollte sie kultiviert werden , wie für L. beschrieben plantarum und L. brevis: statische Flüssigkultur; und in einem luftdichten Behälter mit CO 2 geflutet für feste Kultur (letztere Schritt reduziert die Umgebungssauerstoffgehalt Lactobacillus Wachstum zu unterstützen).

Die Ansätze hier skizziert werden kann leicht variiert Drosophila unter verschiedenen gnotobiotischer Bedingungen zu erhöhen. Zum Beispiel monoassociated Fliegen durch Impfen sterile Drosophila - Embryos mit einer mikrobiellen Spezies zu einem Zeitpunkt 15,25,31 aufgezogen werden kann. Multi-Spezies - Assoziationen werden durch Impfen mehrere Arten in äquivalenten Verhältnisse 20,24 gebildet. Obwohl wir CFU / OD 600 Konstanten für jede der 4-Spezies bereitgestellt Normalisierung zu erleichtern, kann es nicht notwendig sein , eine Konstante für die meisten Arten Mischungen ableiten. icht wurde zuvor gezeigt , dass die Häufigkeit von Mikroben in 5-7 DPE Erwachsenen in 2-Spezies Verbände nicht signifikant verschieden war , als die Ausgangsdichte der Bakterien über drei Grßenordnungen 20 variiert wurde. Auch ist die Drosophila gut sehr permissive, und viele Arten , die leicht kultiviert auf Fly - Diät sind , können mit Drosophila bei hohen Dichten in monoassociation (zB E. coli, B. subtilis 25) ermöglicht genetische Dissektion von mikrobiellen Einfluss von Mikroben mit umfangreichen assoziieren genetische und genomische Ressourcen. Schließlich Studien von Drosophila Phänotypen, die von der Mikrobiota beeinflusst werden könnte den Ansatz von Altered Schädler Flora in Mäusen anzupassen , indem sie mit einer definierten mikrobiellen Gemeinschaft natürlich gelegt konventionelle Eier Impfen jedes Fläschchen hat Zugriff auf eine bestimmte Gruppe von Mikroben zu gewährleisten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Einige Details dieses Protokoll wurden mit Unterstützung von Dr. Adam Dobson optimiert, der auch hilfreiche Kommentare zum Manuskript zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Stiftung für die National Institutes of Health (FNIH) Gewährungsnummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD und AED) unterstützt wurde. FNIH Gewährungsnummer 1F32GM099374-01 (PDN) und Brigham Young University Startfonds (JMC, MLK, MV). Publikationskosten wurden von der Brigham Young University College of Life Sciences und Department of Plant and Wildlife Sciences unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
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Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
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50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

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Tags

Entwicklungsbiologie Heft 113 axenic gnotobiotischer, Microbiome Mikrobiota,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen
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Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

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