Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Allevamento la mosca della frutta Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

Un metodo per l'allevamento di Drosophila melanogaster in condizioni axeniche e gnotobiotic è presentato. Fly embrioni vengono dechorionated in ipoclorito di sodio, trasferiti asetticamente alla dieta sterili, e allevati in contenitori chiusi. Inoculando dieta ed embrioni con i batteri porta ad associazioni gnotobiotic, e la presenza di batteri è confermata dalla placcatura di tutto il corpo omogenati Drosophila.

Introduction

La maggior parte degli animali sono intimamente associati con i batteri ( 'microbiota') dalla nascita alla morte 1. I confronti di ( 'convenzionale') gli animali privi di microrganismi ( 'axeniche') e di microrganismi-associati hanno dimostrato microbi influenzano diversi aspetti della salute degli animali, tra cui metabolica, nutrizionale, vascolari, epatiche, respiratorio, immunologico, endocrino, e la funzione neurologica 2. La mosca della frutta Drosophila melanogaster è un modello chiave per comprendere molti di questi processi in presenza di microbi 3,4 e per studiare l'influenza microbiota su 5,6 salute degli animali. Nessuna specie batterica è presente in ogni individuo ( 'core'), ma Acetobacter e Lactobacillus specie numericamente dominano il microbiota di entrambi D. laboratorio-allevati e catturati in natura melanogaster. Altro Acetobacteraceae (compresi Komagataeibacter e Gluconobacter), Firmicutes (come Enterococcus e Leuconostoc), e Enterobacteriaceae sono sia spesso presente in individui Drosophila a bassa abbondanza, o irregolarmente presenti in grande abbondanza 7-12.

Il microbiota di Drosophila e mammiferi è incostanti all'interno e attraverso le generazioni 14,19. Microbiota incostanza può portare a rumore fenotipica quando si misurano i tratti microbiota-dipendente. Ad esempio, la memorizzazione Acetobacteraceae influenza lipidi (trigliceridi) in Drosophila 15-18. Se Acetobacteraceae sono più abbondanti nella mosche di una fiala che in un altro 19, mosche isogenici possono avere diversi fenotipi 20. Una soluzione per il problema del microbiota incostanza nei topi 14 è stato in pratica dal 1960, con l'introduzione di una comunità definita di 8 specie microbiche dominanti per cuccioli di topo ogni nuova generazione (alterata Schaedler flora),assicurando che ogni cucciolo è esposto agli stessi membri chiave del microbiota del mouse. Questa pratica controlla per la composizione microbica anche quando il microbiota non è l'obiettivo primario di studio 32, e imposta precedente per assicurare la presenza di microbi chiave in una varietà di condizioni sperimentali.

Per definire l'influenza dei microbi sulla Drosophila nutrizione, diversi protocolli per derivare linee di volo axenici sono state sviluppate, compresa ipoclorito dechorionation di embrioni (sia derivato de novo ogni generazione o mantenuta generationally mediante trasferimento diete sterili) e trattamento antibiotico 13. Ci sono benefici per diversi approcci, come la facilità e rapidità sia per il trattamento di antibiotici e di trasferimento seriale, contro un maggior controllo delle variabili confondenti con de novo dechorionation (ad esempio, la densità d'uovo, i microbi contaminanti residui, fuori bersaglio effetti antibiotici). Indipendentemente dal metodo dipreparazione, introduzione di specie microbiche specificati axeniche embrioni permette cultura della Drosophila con definite le comunità ( 'gnotobiotic'). In alternativa, mimando l'uso di flora Schaedler, questa comunità potrebbe essere inoculato alle uova convenzionalmente stabilite (seguenti passaggi 6-7 solo) per assicurare la presenza di microbi trait-influenzano in ogni flacone ed evitare complicazioni del microbiota incostanza. Qui si descrive il protocollo per l'allevamento axeniche e gnotobiotic Drosophila da de novo dechorionation di embrioni, e per confermare la presenza di introdotto o contaminazione microbica taxa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coltura dei batteri (Inizio ~ 1 settimana prima di prendere le uova)

  1. Preparare MRS modificato (20) mmrs piastre e tubi di brodo (Tabella 1). Versare 20 ml mMRS agar in ogni piatto 100 millimetri di Petri e lasciare raffreddare / asciugare durante la notte, o 5 ml mMRS brodo in provette mm 18.
  2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, e L. plantarum su mMRS piastre di agar. Incubare Acetobacter notte a 30 ° C. Incubare anaerobicamente Lactobacillus posizionando le piastre in un contenitore ermetico e inondazioni con anidride carbonica prima della sigillatura. Incubare a 30 ° C per una notte.
    Nota: L. colonie brevis potrebbero non essere visibili fino 24-48. Le piastre possono essere conservati a 4 ° C e le colonie possono essere usati fino a 3 settimane.
  3. Due o tre giorni prima di trasferire le uova dechorionated alla dieta sterile (sezione 5), scegliere una singola colonia dalla piastra mMRS in una provetta conmMRS tenenti brodo. Crescere Acetobacter con agitazione e crescere Lactobacillus statico per 24 ore o fino a quando torbido, sia a 30 ° C.

2. Preparare sterile dieta

  1. Preparare dieta sterile (Tabella 2) in un pallone da 2 L Erlenmeyer. Microonde la dieta fino a quando non ha bollito per 3 volte consecutive; mix tra ogni ebollizione.
  2. Porre il pallone su un piatto mescolare per mantenere mescolando durante il trasferimento dieta per provette da centrifuga coniche. Trasferire 7,5 ml di dieta per 50 ml provette da centrifuga. Liberamente tappare i tubi, e mettere in un rack in polipropilene autoclavabile coperto.
  3. Sterilizzare dieta volo usando autoclave a 121 ° C e 15 psi per 25 min. Rimuovere rack da autoclave, e scuotere immediatamente ciascun rack orizzontale per garantire la dieta non separarsi durante il raffreddamento. Fare attenzione a non scuotere i rack in verticale per impedire il trasferimento di dieta per il coperchio o bordi dei tubi. Lasciare che la dieta raffreddare su un agitatore per esattamente 45 minuti eancora una volta scuotere la dieta in senso orizzontale a mano.
    Nota: La dieta può essere conservato a 4-15 ° C per un massimo di una settimana.
  4. Come alternativa all'utilizzo di rack autoclavabili coperte (passaggi 2.1-2.3), o ad alzare le mosche sulle diete contenenti conservante acido, effettuare le seguenti operazioni:
    1. Preparare 1 L dieta liquida in un pallone 2 L con un ancoretta nel pallone. Autoclave la dieta.
    2. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 10 ml di conservanti e mescolare continuamente su un piatto mescolare riscaldata. Quando l'agar è raffreddato a 50-60 ° C, spostare il pallone in una piastra di mescolare riscaldata in un armadio biosicurezza e mantenere la temperatura pallone per riscaldamento a 50-60 ° C.
    3. Nel gabinetto biosicurezza, pipetta ~ 7,5 ml individualmente in tubi conici.

3. Preparare Gabbie deposizione delle uova

  1. Fai piastre di agar succo d'uva da microonde 100 ml di acqua, lievito di birra 10 g di birra, 10 g di glucosio, e 1 g di agar. Portare a ebollizione per 3 volte nella fase 1.1 e aggiungere 10 g di uva congelato succo concentrate per aumentare la visibilità delle uova sulla piastra di agar.
  2. Quando agar è raffreddato a 55 ° C, versare 20 ml in 100 mm Petri e lasciare solidificare.
  3. Coprire la superficie delle piastre di agar con una pasta di lievito mescolando lievito 1 g di birra con acqua 15 g. Versare pasta di lievito sulla piastra di agar assicurandosi che la superficie è coperta, quindi versare l'eccesso, lasciando dietro di sé una sottile residuo di lievito. Se si utilizzano più piastre, la pasta può essere sequenziale versato a più piastre.
  4. Trasferire piastre di agar nel fondo di una gabbia.
    Nota: Un contenitore deli 32 oz è un buon sostituto per gabbie Fly acrilici.
    1. Rendere coperchi per contenitori deli 32 oz tagliando un foro nella parte superiore e incollando una mesh traspirante sopra il foro con colla non tossici. Se la colla è idrosolubili impediscono esposizione all'acqua al coperchio.
  5. Trasferimento 200-300 vola nel contenitore e coprire con il coperchio. Coprire il buco rete protetta con un coperchio piatto di Petri vuota Prevent evaporazione dalla superficie agar e aggiungere una carta velina umida all'interno del coperchio se desiderato. Incubare mosche a 25 ° C durante la notte per 16-20 ore.

4. raccogliere le uova

  1. Preparare un setaccio per la raccolta delle uova, ponendo rete di nylon in una boccola in plastica.
  2. Per recuperare la piastra con le uova su di esso, rimuovere mosche dalla gabbia trasferendo in un contenitore vuoto. Se stessi mosche saranno utilizzati il ​​giorno successivo, trasferire immediatamente ad una nuova gabbia contenente una piastra di agar succo d'uva appena yeasted. Le mosche possono essere utilizzati per 3-5 giorni sequenziali
  3. Rimuovere mosche morte dal agar con un pennello pulito, facendo attenzione a non rompere l'agar.
  4. Raccogliere uova sciacquando piastra di agar con acqua distillata, delicatamente spazzolatura uova dalla superficie agar, e versando l'impasto sulla maglia. Ripetere 3-4 volte fino a quando tutti o la maggior parte delle uova sono state rimosse dalla piastra di agar.

5. Dechorionate uova e trasferimento sterile DIET

  1. Preparare la armadio biosicurezza spruzzando l'interno (compresi i lati) con il 70% di etanolo. Pulire il fondo con un tessuto di laboratorio, e sterilizzare il cappuccio con luce UV per ~ 15 min. Sterilizzare tutti i materiali di consumo non-biologici (campioni tazze, pennello, pinze, contenitori di rifiuti, 400 ml di acqua e 100 ml di ipoclorito di sodio allo 0,6%), a spruzzo con etanolo e subito messa in cabinet biosicurezza. Sterilizzare con luce UV per 15 min.
  2. Avviare il primo di 2 lavaggi di ipoclorito di sodio posizionando la bussola con le uova in una tazza 120 ml campione o altro contenitore sterile. Versare lentamente ~ 90 ml di soluzione di ipoclorito di sodio 0,6% nella boccola fino a poco sotto il bordo.
  3. Lavare le uova per 2,5 min. Periodicamente risospendere le uova utilizzando pinze per spostare la boccola su e giù nella soluzione di ipoclorito.
  4. Trasferire la bussola direttamente in una seconda tazza esemplare, pre-riempita con 90 ml di candeggina, all'interno dell'armadio biosicurezza.
  5. Ripeterepasso 5.3 all'interno dell'armadio biosicurezza. Alla fine del secondo trattamento candeggiante, le uova dovrebbero iniziare ad aderire ai lati della boccola.
  6. Effettuare i passaggi 5,7-5,8 nell'armadio biosicurezza.
  7. Eliminare la candeggina e lavare la bussola con acqua sterile per 3 volte. Risospendere le uova più volte durante ogni lavaggio spostando la bussola con una pinza. Alla fine del terzo lavaggio più uova devono essere fissati al lato della boccola.
  8. Utilizzando un pennello sterilizzati in etanolo, trasferire uova dal lato della boccola alla dieta sterile. Trasferire le uova singolarmente o in piccoli lotti. Obiettivo per 30-50 uova per fiala. Lasciare i tappi allentato per permettere l'ossigeno di entrare nel tubo. Se fiale devono rimanere axeniche, trasferimento in un incubatore di insetti; altrimenti, aggiungere batteri come sotto.

6. Fare Gnotobiotic Flies Utilizzando 4 batteriche Specie

  1. preparare batteri
    1. Preparare un armadio biosicurezza sterilizzato con forniture necessarie (pipettes, scatole punta pipette, provette da centrifuga sterilizzati, brodo MRS, e rastrelliere provetta) come al punto 4.1. Pulire l'esterno di provette con un laboratorio di etanolo imbevuto wipe prima di mettere in armadio biosicurezza.
    2. Pellet i batteri in primo luogo il trasferimento di 500 ml di crescita durante la notte per una provetta per microcentrifuga sterile. Se la densità batterica è bassa, aggiungere fino a 1,5 ml a ciascuna provetta o in sequenza rimuovere surnatante e aggiungere la cultura in più per lo stesso tubo. Rimuovere campioni dal cabinet biosicurezza e centrifugare per 10 minuti a 10.000 x g. Utilizzare puntali con filtro per evitare la contaminazione tra i campioni.
    3. Determinare la densità di ciascuna coltura misurando OD 600. Se si utilizza un lettore di piastre multi-bene, trasferire 200 ml di ogni cultura ad una piastra a 96 pozzetti in 1, 2 e 4- diluizioni.
    4. Determinare la quantità di mMRS in cui diluire ciascun pellet cellulare (5.2.2) utilizzando uno spettrofotometro lettura della piastra e le seguenti equazioni. Piano di aggiungere abbastanza brodo per inoculare 50 &# 956; l per ogni flacone mosca.
      1. Raccogliere OD 600 letture di 1: 1, 1: 2 e 1: 4 diluizione ciascuna coltura batterica su uno spettrofotometro piastriforme lettura. Selezionare la diluizione per ogni ceppo batterico che produce un valore di 600 OD sono compresi tra 0,1 e 0,2 e utilizzare questo valore e il suo fattore di diluizione corrispondente come 'O' e 'D' nelle formule indicate in 6.1.4.2 o 6.1.4.3.
      2. Se si utilizza le 4 specie qui descritte, normalizzare le cellule per unità formanti colonia equivalente (CFU) / ml densità (OD 600 alla conversione CFU determinato in precedenza 20) utilizzando questa equazione:
        E = ((OB) x V x D) / C
        dove E = volume di risospendere pellet in (ml), O = OD 600 batteri, B = OD 600 supporti vergini, D = fold-diluizione, V = coltura batterica ml prima della centrifugazione, C = OD 600 di costante predeterminata. Vedere file di codice supplementare per gli esempi di calcoli utilizzando queste equazioni. per spettrofotometros che automaticamente vuoto, usare "O" al posto di "OB".
        Nota: Le costanti predeterminate (unità OD 600, normalizzati a 10 7 CFU ml -1, costanti derivati ​​in 20) sono i seguenti: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Se si utilizzano altre specie batteriche (senza CFU / OD 600 costante è disponibile), normalizzare la densità di OD 600 = 0.1 utilizzando questa equazione:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Nota: Le unità sono le stesse come nel passaggio 6.1.4.2. Vedere file di codice supplementare per gli esempi di calcoli utilizzando queste equazioni.
    5. Nel gabinetto biosicurezza, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere il pellet in mMRS freschi o PBS come calcolato al punto 6.1.4.2.
  2. Seminare batteri
    1. Trasferimento 50 ml di batteri ai tubi conici con sterili dieta und dechorionated uova in armadio biosicurezza. Aggiungere batteri dopo il trasferimento uovo per evitare contaminazione tra fiale.
    2. Posizionare provette inoculate in un incubatore a 25 ° C.

7. Misurare CFU carico / prova di sterilità

  1. Per misurare il carico CFU in tutto omogenati corpo mosca, trasferimento 5 mosche (5-7 giorni dopo Eclosion) in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga contenente 125 ml di sfere di ceramica e 125 ml di brodo mMRS. Omogeneizzare mosche usando un omogeneizzatore tessuto per 30 secondi a 4,0 m / sec.
    1. In alternativa, omettono perline e mano omogeneizzare in provette da microcentrifuga con pestelli in plastica per 1 min.
    2. Se la quantificazione del microbiota intestinale, superficie sterilizzare le mosche per rimuovere i microbi esogeni 22. Trasferimento vola a una provetta contenente 100 ml etanolo al 70% per 1 min, aspirare l'etanolo, e trasferimento in una nuova provetta per homogenizations. Se il contenuto di DNA dell'intestino sarà misurato, sciacquare fo 1 min con ipoclorito di sodio 0,6% prima del lavaggio etanolo.
  2. Diluire l'omogeneizzato con 875 microlitri mMRS, vortex per 5 secondi, e pipetta 120 ml di omogeneizzato nel primo pozzetto di una micropiastra.
  3. Eseguire due sequenziali 1: 8 diluizioni con 10 microlitri omogeneizzato e 70 microlitri MRS nei prossimi due pozzi.
    1. Rimuovere 10 ml dal primo pozzo e aggiungerlo al secondo pozzetto contenente 70 ml MRS. Mescolare il contenuto del secondo pozzo accuratamente, trasferimento 10 microlitri dal secondo pozzo alla terza pozzetto contenente 70 microlitri MRS, e omogeneizzare. Questo porta a 3 le concentrazioni totali di originale omogeneizzato 1.000 ml: Non diluito, 1: 8, e 1:64.
  4. Trasferire 10 ml di ogni diluizione ad una lastra mMRS (utilizzando una pipetta multicanale se desiderato). Leggermente inclinare il piatto per diffondere la diluizione diversi millimetri verso il basso la superficie agar e consentire il liquido si asciughi prima di spostare il piatto. Il liquido si asciuga in The piastra rapidamente se le piastre sono 2 giorni di età, riducendo miscelazione di due goccioline adiacenti.
  5. Incubare a 30 ° C per 1-2 giorni. Rimuovere le piastre dal termostato volta distinti, singole colonie sono visibili, e contare da una diluizione con 10-100 colonie isolate.
  6. Calcola CFU per volare utilizzando l'equazione E = C x D / P x V / F, dove E = CFU per volare, C = numero di colonie contato, D = diluizione, P = ml placcato, V = volume di volare omogenato, e F = numero di mosche omogeneizzati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Allevamento di successo di mosche axeniche è confermata da isolamento di non CFU da homogenizations tutto il corpo di D. adulti melanogaster (figura 1). In alternativa, se l'omogeneizzato placcato produce colonie, i flaconi sono contaminati e devono essere eliminati. Per mosche gnotobiotic, ciascuna delle quattro isolati batterici sono stati isolati da pool di 5 maschi adulti, dimostrando differenze CFU vitali totali associati con mosche adulte (Figura 1). Ogni specie batteriche ha una morfologia distinta e possono distinguere visivamente (Figura 2). Se non vengono rilevati uno o più tipi di colonie ci possono essere stati errori nel preparare l'inoculo batterico (ad esempio, il lavaggio, la normalizzazione, miscelazione) o specie corrispondenti potrebbero non essere compatibili con le condizioni di coltura (ad esempio, Drosophila densità di 23 o genotipo 24). Per escludere errori tecnici ci Recglia placcatura una parte della miscela batterica immediatamente dopo inoculando fiale fly (passo 6.2).

Figura 1
Figura 1: Unità formanti colonia Trovato in axeniche e Gnotobiotic Drosophila Il numero di unità formanti colonie (CFU) per volare in omogenati di tutto il corpo di 4 specie gnotobiotic e axeniche D.. melanogaster. La mancanza di colonie negli omogenati axeniche conferma D. melanogaster sterilità. I valori sono presentati come media ± SEM di 24 valori replicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Differenziare colonie batteriche. </ strong> CFU da una omogeneizzazione campione con morfologie differenti per ciascuno dei 4-specie nella gnotobiotic D. melanogaster. colonie Acetobacter sono un chiaro, di colore marrone chiaro e sono disponibili in varie dimensioni a seconda delle specie. ~ 24-36 ore dopo la placcatura, A. colonie tropicalis sono opachi, mentre A. pomorum è trasparente, anche se nel corso del tempo la differenza diventa meno pronunciata. L. colonie brevis sono piccoli e bianchi e L. colonie plantarum sono grandi e di colore giallo. Se necessario, la crescita dal omogeneizzato può essere paragonato alle piastre batteri originali per aiutare a distinguere ogni tipo di colonia 20. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

mMRS Ricetta
Importo in g Note
Acqua distillata 1.000
universale Peptone 12.5
Estratto di lievito 7.5
Glucosio 20
dipotassico fosfato 2
citrato ammonico 2
Acetato di sodio 5
Solfato di magnesio 0.1
di manganese solfato 0.05
agar 12 Non aggiungere al brodo di

Tabella 1: mMRS ricetta.

<tr>
Dieta ricetta Lievito-glucosio
Importo in g
Acqua distillata 500
Lievito di birra 50
Glucosio 50
agar 6

Tabella 2: Lievito-glucosio dieta ricetta.

Supplementare Codice File:. Esempi di calcolo Fare clic qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il metodo qui descritto è uno dei diversi approcci per embrione dechorionation 8,11,18,25,26,27, insieme con altri metodi di allevamento mosche axeniche, tra cui il trasferimento seriale di adulti axeniche 18,27 o 13,18 trattamento antibiotico. Altri metodi includono dechorionation lavaggi etanolo e ridurre 11,25,26 o estendono 8 Trattamento ipoclorito. Diverse fasi di lavaggio può essere di aiuto l'allevamento di diversi genotipi mosca: in un precedente studio la maggior parte dei circa 100 genotipi di Drosophila sono stati axeniche quando allevati come descritto qui (senza lavaggi etanolo), ma alcune linee sono state contaminate e scartato 24. Forse alcune linee contaminate sarebbero state axeniche se allevati con lavaggi etanolo o più trattamenti ipoclorito. Se il metodo descritto qui non porta all'isolamento di mosche axeniche per particolari genotipi di accoglienza si consiglia risciacqui etanolo o il trattamento di ipoclorito di più tempo per risolvere il problema.

ent "> Quando si utilizzano i trasferimenti seriali di Drosophila, una generazione axeniche dei genitori è fatto axeniche da dechorionation uovo come descritto qui, e le generazioni successive sono mantenuto da trasferimento asettico in un armadio biosicurezza, con o senza antibiotici 18,27. trasferimento seriale è più veloce di derivare mosche axeniche nuovo ogni generazione, e trasferiti mosche possono rimanere axeniche per più generazioni. una complicazione dei trasferimenti seriali mantiene densità abbinati di mosche convenzionali / gnotobiotic e axeniche da mosche axeniche tendono a deporre un minor numero di uova su un intervallo di tempo paragonabile (dati non mostrato). Poiché la densità Drosophila influenza più tratti, con composizione batterica in mosca dieta 23,28,29, trasferendo uova nuovamente ogni generazione può essere un approccio superiore per tratti densità sensibile mosca. De novo dechorionation evita anche la possibilità di contaminazione batterica durante trasferimenti. Così, mentre i trasferimenti seriali possono risparmiare tempo, dechorionation consente un maggiore controllo delle variabili che complicano.

Gli antibiotici possono anche essere usati per creare mosche axenici, anche se in contrasto dechorionation, trattamento antibiotico è di solito sufficiente per rimuovere completamente colonizzare microbi 13. Inoltre, gli antibiotici possono influenzare direttamente l'host. Ad esempio, sollevando le mosche su una dieta con antibiotici riduce il loro contenuto fecondità e proteine, ma questi effetti non sono stati osservati in mosche sollevate da embrioni dechorionated 13. Notiamo che gli antibiotici sono necessari per eliminare i batteri endosimbiontica che vengono trasmessi in verticale e non sono interessate dalla sterilizzazione superficiale, come ad esempio Wolbachia 33.

Diversi passaggi sono fondamentali per il successo di preparazione mosche axeniche o gnotobiotic dechorionated. In primo luogo, è fondamentale per scuotere la dieta volo come nei passi 2.3. Se i rack non vengono agitati manualmente per circa 15 sec ciascuno prima e dopo una esatta45 min intervallo sul shaker, il lievito e agar si depositerà, riducendo volare l'accesso al lievito e rendendo la superficie agar troppo morbido per la cultura mosca. In secondo luogo, lo spessore di pasta di lievito e la concentrazione di agar di piastre succo d'uva influenza rimozione uovo (passo 3.3). Un sottile strato prodotta da un lievito 01:15: diluizione acqua impedirà le uova da incorporare nel agar quando il risciacquo e la rimozione dalle piastre alimentari (punto 4.4). In terzo luogo, se le piastre succo d'uva sono troppo morbidi e si rompono durante la raccolta delle uova, la fermezza delle piastre può essere aumentata con l'aggiunta di meno concentrato di succo d'uva per il prossimo gruppo di piastre. In quarto luogo, i rendimenti a base di uova sono più alti se mosche hanno 24 ore per acclimatarsi all'ambiente gabbia: questo può essere affrontato mettendo mosche nella gabbia ~ 40 ore prima della raccolta, compreso il trasferimento ad una nuova gabbia collezione con un piatto fresco di agar <20 hr prima della data di raccolta desiderata. Quinto, se le uova non aderiscono al lato della boccola durante dechorionation (passo 5.7), i rinsperiodo ing debba essere prorogato per 15-30 sec (Attenzione: estendere il tempo di risciacquo troppo a lungo possono uccidere le uova). Inoltre, la perdita uovo in risciacqui liquido può essere evitata controllando la guarnizione maglia-boccola per la chiusura completa e verificare che le uova non versare di fuori del setaccio durante risospensione. Se la boccola è ben sigillato, uova versato possono essere recuperati versando il lavaggio attraverso il setaccio come il lavaggio viene scartato. Sesto, dopo mosche sono nati, una prova presuntiva per determinare se le mosche sono axeniche è esaminare il colore della dieta. Se le mosche sono axeniche, lo strato superiore della dieta sarà un caffè colore marrone scuro e senza bolle d'aria sarà presente per tutta la dieta. bolle d'aria o di colore marrone dello strato superiore dieta indicano la presenza di batteri. presenza batterica deve ancora essere confermata da omogeneizzazione. In alternativa, l'amplificazione PCR del gene 16S rRNA può essere effettuata anche per rilevare microbi non coltivabili (ad esempio, anaerobi rigorosi) 30. Infine, dopo homogenzazione, sfere di ceramica possono riutilizzato oscillando in una soluzione di ipoclorito + idrossido di potassio 2% 0,05 M per 30 min, risciacquo generosamente (10 volte o più) in H 2 O, lavare una volta con etanolo al 100% (per facilitare l'asciugatura), e essiccazione a 65 ° C. Se tutti i passi sono seguiti con attenzione, mosche axeniche devono essere isolati ogni volta che viene eseguito il protocollo.

Questo lavoro descrive un metodo per ri-associare sterili embrioni di Drosophila con una flora batterica 4 specie che sia rappresentativo delle comunità batteriche di mosche laboratorio allevati con una dieta di lievito-glucosio. Il lavoro precedente ha utilizzato una comunità di 5 specie comprese le 4 specie qui e Lactobacillus Fructivorans, che è stata numericamente abbondante in diverse indagini mosca 9,19. Si consiglia di omettere L. fructivorans per diversi motivi, tra i quali quello fenotipi in D. melanogaster monoassociated con L. fructivorans sono in gran parte congruente con ph axenicheenotypes 31 e L. fructivorans è più fastidioso di altri fly isola. Se L. fructivorans è incluso, dovrebbe essere coltivato come descritto per L. plantarum e L. brevis: coltura liquida statica; e in un contenitore ermetico inondato di CO 2 per la cultura solida (quest'ultimo passo riduce i livelli di ossigeno ambientali per sostenere la crescita Lactobacillus).

Gli approcci descritti qui possono essere variate facilmente per raccogliere Drosophila in diverse condizioni gnotobiotic. Ad esempio, monoassociated mosche possono essere allevati inoculando sterili embrioni di Drosophila con una specie microbiche alla volta 15,25,31. Associazioni multi-specie sono formate inoculando più specie in rapporti equivalenti 20,24. Anche se abbiamo fornito CFU / OD 600 costanti per ciascuna delle 4 specie per facilitare la normalizzazione, può non essere necessario ricavare una costante per la maggior parte delle miscele di specie. iot è stato precedentemente dimostrato che l'abbondanza di microbi in 5-7 adulti DPE non era significativamente differente nelle associazioni 2-specie quando la densità iniziale di batteri è stata variata nel corso di tre ordini di grandezza 20. Inoltre, l'intestino Drosophila è altamente permissiva, e molte specie che sono prontamente colta sulla dieta mosca può associare a Drosophila ad alta densità in monoassociation (ad esempio, E. coli, B. subtilis 25) che permettono la dissezione genetica di influenza microbica da microbi con ampia risorse genetiche e genomica. Infine, gli studi di fenotipi Drosophila che sono influenzati dal microbiota potrebbe adattare l'approccio di Altered Schaedler Flora nei topi inoculando uova convenzionali di cui, naturalmente, con una comunità microbica definito per assicurare ogni fiala ha accesso a un insieme specifico di microbi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Alcuni dettagli di questo protocollo sono state ottimizzate con l'aiuto del Dr. Adam Dobson, che ha anche fornito utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per il National Institutes of Health (FNIH) codice di autorizzazione R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, e AED). FNIH codice di autorizzazione 1F32GM099374-01 (PDN), e Brigham Young University fondi di avvio (JMC, MLK, MV). costi di pubblicazione sono stati sostenuti dalla Brigham Young University College of Life Sciences e del Dipartimento di Scienze della flora e fauna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Biologia dello Sviluppo Numero 113 axeniche gnotobiotic, Microbiome microbiota,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter