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Summary
무균 및 무균 조건에서 초파리 melanogaster의를 양육하는 방법이 제공된다. 플라이 배아는, 차아 염소산 나트륨에 dechorionated 멸균 다이어트에 무균 적으로 전송하고, 밀폐 용기에 양육된다. 박테리아와식이 요법과 배아를 접종은 무균 협회에 이르게하고, 세균의 존재는 전신 초파리 균질 도금에 의해 확인된다.
Introduction
대부분의 동물은 밀접하게 죽음 일에 출생에서 박테리아 ( '미생물')과 연결되어 있습니다. 미생물이없는 ( '무균') 및 미생물 관련 ( '기존') 동물의 비교는 미생물 대사, 영양, 혈관, 간, 호흡기, 면역, 내분비 및 신경 기능이 포함 동물 건강의 다양한 측면을 영향을 보여 주었다. 열매는 초파리 melanogaster의 3,4- 미생물의 존재 하에서 이러한 프로세스의 많은 이해 및 동물 건강에 5,6- 미생물의 영향을 연구하기위한 주요 모델 비행. 어떤 박테리아 종은 모든 개인 ( '코어')에 존재하지 않지만 아세토 및 락토 바실러스 종은 수치 모두 실험실 사육 및 야생 잡은 D.의 미생물을 지배 melanogaster의. Acetobacteraceae, Firmi (Komagataeibacter 및 글루 포함) 기타및 장내 세균 (예 : 엔테로 및 로이코 노 스톡 등) cutes 중 하나 높은 풍부 7-12에서 낮은 풍부에서 초파리 개인에서 자주 본, 또는 불규칙하게 존재한다.
초파리와 포유 동물의 미생물은 내 세대 14,19에 걸쳐 일정하지 않습니다. 미생물에 의존하는 특성을 측정 할 때 미생물의 변덕은 표현형 노이즈가 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 초파리 15-18에서 Acetobacteraceae 영향 지질 (중성 지방) 저장. Acetobacteraceae 다른 19 이상의 유리 병의 파리에서 더 풍부 경우, 동종 파리는 서로 다른 표현형 (20)를 가질 수있다. 쥐 14 미생물의 변덕의 문제에 대한 해결책은 마우스 새끼로 (Schaedler 식물 변경) 각각의 새로운 세대를 8 지배적 인 미생물 종의 정의 사회를 도입하여, 1960 년대 이후 실제로있다각 강아지가 마우스 미생물 동일한 키 부재에 노출되는 것을 보장한다. 미생물이 연구 (32)의 주 대상이 아니며, 실험 조건의 다양한 키 미생물의 존재를 확인하기 위해 전례를 설정하는 경우에도이 방법은 미생물 조성에 대한 제어합니다.
초파리 영양 미생물의 영향을 정의하려면, 무균 플라이 라인을 도출하기위한 여러 가지 프로토콜은 배아의 차아 염소산 dechorionation (중 파생 드 노보 각 세대 또는 멸균 사료로 전송하여 generationally 유지) 및 항생제 치료 (13)를 포함하여 개발되었다. 항생제 처리 및 시리얼 전송, 드 노보 dechorionation와 교란 변수 (예를 들어, 계란 밀도, 잔류 오염 미생물, 오프 - 타겟 항생제 효과)의 대 더 제어 모두 용이성과 신속성 등 다양한 접근 방법에 장점이있다. 상관없이 방법의배아를 무균하는 특정 미생물 종의 준비, 도입은 정의 ( '무균') 사회와 초파리의 문화를 허용한다. 또한, Schaedler 식물의 사용을 모방,이 커뮤니티는 각 유리 병의 특성-에 영향을 미치는 미생물의 존재를 확인하고 미생물의 변덕의 합병증을 피하기 위해 (만 단계 6-7 다음) 종래 누워 계란에 접종 할 수있다. 여기에서 우리는 배아의 드 노보 dechorionation에 의해 무균 및 무균 초파리를 제기하기위한 프로토콜을 설명하고 소개 또는 오염 미생물 분류군의 존재를 확인합니다.
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Protocol
1. 문화 박테리아 (시작 ~ 1 주 달걀을 따기 전)
- 수정 MRS (20) (과 MMR) 접시와 국물 튜브 (표 1)을 준비합니다. 각 100mm 페트리 접시에 한천 20 ㎖의 MMRS을 붓고 / 건조 하룻밤을 냉각 할 수 있도록, 또는 5 ML의 MMRS는 18mm 테스트 튜브로 국물.
- 킬 아세토 pomorum, A. tropicalis, 락토 바실러스 브레비스 및 L. 판 한천과 MMR에 plantarum을. 하룻밤 30 ° C에서 아세토을 품어. 밀봉하기 전에 이산화탄소 밀폐 용기와 홍수에 접시를 배치하여 혐기성 유산균을 품어. 하룻밤 30 ° C에서 품어.
참고 : L.를 브레비스 식민지는 24 ~ 48 시간까지 표시되지 않을 수 있습니다. 플레이트를 4 ℃에서 저장 될 수 콜로니 최대 3 주 동안 사용될 수있다. - 2 ~ 3 일 무균 다이어트 (섹션 5)에 dechorionated 달걀을 전송하기 전에, 테스트 튜브 콘에 MMRS 플레이트에서 하나의 식민지를 선택이닝의 MMRS은 국물. 모두 30 ° C에서, 진탕 아세토 성장과 24 시간 또는 혼탁 할 때까지 정적으로 유산균 성장.
2. 멸균 다이어트를 준비합니다
- 2 L의 삼각 플라스크에 멸균 다이어트 (표 2)를 준비한다. 이 3 연속 번 삶은 때까지 음식을 전자 레인지; 각 종기 사이에 섞는다.
- 원뿔 원심 분리기 튜브에 다이어트를 전송하는 동안 교반 유지하기 위해 볶음 접시에 플라스크를 배치합니다. 50 ㎖ 원심 분리기 튜브에 다이어트의 7.5 ml에 전송합니다. 느슨하게 덮여, 오토 클레이브 폴리 프로필렌 랙에 튜브를 모자, 장소.
- 121 ° C에서 오토 클레이브 25 분 15 PSI를 사용하여 비행 다이어트를 소독. 오토 클레이브에서 랙을 제거하고 즉시 냉각 동안 분리하지 않는 다이어트를 위해 수평으로 각 랙을 흔들어. 뚜껑 또는 튜브의 테두리에 다이어트의 전송을 방지하기 위해 수직 선반을 흔들지에주의하십시오. 다이어트 정확히 45 분 동안 진탕 기에서 냉각 할 수 있도록 허용하고다시 손으로 수평으로 다이어트를 흔들.
참고 : 다이어트는 일주일까지에 대해 4-15 ° C에 저장할 수 있습니다. - 적용 오토 클레이브 랙을 사용하는 대신 (2.1-2.3 단계), 또는 산 방부제를 함유 다이어트에 파리를 높이기 위해 다음 단계를 수행합니다 :
- 플라스크에 교반 막대와 2 L 플라스크 1 L 액체 음식을 준비합니다. 다이어트를 압력솥.
- 고압 증기 멸균 한 후, 10 ml의 방부제를 추가하고 가열 교반 접시에 계속 저어. 한천은 50 ~ 60 ℃로 냉각되면, 50 ~ 60 ℃에서 가열 플라스크 온도를 바이오 안전성 캐비닛에 가열 교반 판에 플라스크를 이동하고 유지한다.
- 바이오 안전성 캐비닛에서 개별적으로 원뿔 튜브에 피펫 ~ 7.5 ml로.
3. 달걀 누워 케이지를 준비합니다
- 100 ml의 물, 10g의 맥주 효모, 10g 포도당, 한천 1 g의은 전자 레인지에 의해 포도 주스 한천 플레이트를 확인합니다. 단계 1.1 종기로 3 회를 가져와 냉동 포도 주스 공동의 10g을 추가ncentrate는 한천 접시에 계란의 가시성을 증가시킵니다.
- 한천은 55 ° C로 냉각되면, 100mm 배양 접시에 20 ㎖를 부어 응고 할 수 있습니다.
- 15g의 물에 1g의 맥주 효모를 혼합하여 효모 페이스트와 한천 플레이트의 표면을 커버. 뒤에 얇은 효모 찌꺼기를 떠나, 초과를 부어 다음, 표면이 덮여 확인하는 한천 접시에 효모 페이스트를 따르십시오. 복수의 판을 사용하는 경우, 페이스트를 순차적으로 복수의 플레이트에 붓고 수있다.
- 케이지의 바닥에 한천 플레이트를 전송합니다.
참고 : 32 온스 델리 컨테이너 아크릴 플라이 케이지를위한 좋은 대용품이다.- 상단에 구멍을 절단하고 무독성 접착제로 구멍을 통해 통기성 메쉬를 접착하여 32온스 델리 용기 뚜껑을합니다. 접착제이면 수용성 뚜껑 물 노출을 방지한다.
- 전송 200-300 컨테이너로 날아와 뚜껑 커버. 을 예방하기 위해 빈 페트리 접시의 뚜껑 메쉬 보호 구멍을 커버원하는 경우 한천 표면에서 t의 증발과 뚜껑 내부에 습기 티슈 페이퍼를 추가합니다. 16 ~ 20 시간 동안 25 ℃로 하룻밤에 파리를 품어.
4. 달걀을 수집
- 플라스틱 부싱에 나일론 메쉬를 배치하여 계란 수집 체를 준비합니다.
- 거기에 계란 판을 검색하려면, 빈 용기에 전송하여 케이지에서 파리를 제거합니다. 같은 파리 다음날을 사용할 경우, 새로 yeasted 포도 주스 한천 플레이트를 포함하는 새로운 케이지에 바로 전송할 수 있습니다. 파리 순차 3-5 일 동안 사용될 수있다
- 한천을 아프게하지주의하면서 깨끗한 페인트 브러시와 한천에서 죽은 파리를 제거합니다.
- 부드럽게, 증류수로 한천 플레이트를 세척 한천 표면에서 계란을 솔질하고, 메쉬를 통해 슬러리를 부어 계란을 수집합니다. 전부 또는 계란의 대부분이 한천 플레이트에서 제거 될 때까지 3 ~ 4 번 반복합니다.
5. Dechorionate 계란과 무균 D로 전송보자구
- 70 % 에탄올 (양쪽 포함) 내부를 분사하여 바이오 안전성 캐비닛을 준비합니다. 실험실 조직과 바닥을 닦아, 그리고 ~ 15 분 동안 자외선과 후드를 소독. 에탄올로 분사 즉시 바이오 안전성 캐비닛에 배치하여 모든 비 생물학적 용품 (표본 컵, 붓, 집게, 폐기물 용기, 400 ml의 멸균, 0.6 %의 차아 염소산 나트륨의 100 ml)에 소독. 15 분 동안 UV 광으로 소독.
- 120 ml의 시료 컵 또는 다른 멸균 용기에 계란 부싱을 배치하여이 차아 염소산 나트륨 세척 첫 시작. 단지 천천히 림 아래까지 상기 부싱으로 ~ 0.6 % 차아 염소산 나트륨 용액 90 ㎖에 붓는다.
- 2.5 분 동안 계란을 씻어. 주기적으로 상하 염소산 용액 부싱을 이동 집게를 사용하여 알을 다시 일시.
- 두 번째 시료 컵에 직접 부싱을 전송, 바이오 안전성 캐비닛 내부에, 90 ml의 표백제 사전이 가득.
- 반복바이오 안전성 캐비닛 내부에 5.3 단계. 제 표백 처리의 끝에서, 계란 부싱의 측면에 부착하기 시작한다.
- 수행은 바이오 안전성 캐비닛 5.7-5.8 단계를 반복합니다.
- 표백제를 취소하고 멸균 수로 3 회 부싱을 씻는다. 집게 부싱 이동하여 달걀 각 세정 중에 수회 다시 중단. 세 번째 세척 말 가장 달걀 부싱의 측면에 부착한다.
- 에탄올 살균 붓을 사용하여 멸균 다이어트 부싱 측으로부터 알 옮긴다. 개별적으로 또는 소량의 계란을 전송합니다. 유리 병 당 30 ~ 50 알을 목표로. 산소 튜브를 입력 할 수 있도록 느슨한 모자를 남겨주세요. 유리 병은 무균 남아있는 경우, 곤충 인큐베이터로 전송; 그렇지 않으면, 다음과 같이 박테리아를 추가합니다.
6. 무균 4 세균 종을 사용하여 파리 확인
- 박테리아 준비
- 필요한 소모품과 살균 바이오 안전성 캐비닛을 준비합니다 (Pipettes, 피펫 팁 상자, 멸균 원심 분리기 튜브, MRS 배지, 단계 4.1에서와 같이 테스트 튜브 랙). 에탄올을 묻힌 연구소와 테스트 튜브의 외부를 닦아은 바이오 안전성 캐비닛에 배치하기 전에 닦아주십시오.
- 제 멸균 미세 원심 분리 튜브로 밤새 성장의 500 μl를 전송하여 세균 펠렛. 세균 밀도가 낮은 경우, 각각의 튜브에 1.5 ml의를 추가 또는 순차적으로 뜨는을 제거하고 동일한 튜브에 여분의 문화를 추가 할 수 있습니다. 10,000 × g으로 10 분 동안 바이오 안전성 캐비닛과 원심 분리기에서 샘플을 제거합니다. 샘플 사이의 오염을 방지하기 위해 필터 팁을 사용합니다.
- OD 600을 측정하여 각 문화의 밀도를 결정합니다. 멀티 - 웰 플레이트 판독기를 사용하는 경우, 1-, 2-, 4- 배 희석 한 96 웰 플레이트에 각 배양 200㎕를 옮긴다.
- 평판 판독 분광기를 사용하여 각 세포 펠렛 (5.2.2) 및 다음 식을 희석 할 수있는 MMRS의 양을 결정한다. & 50을 접종하기에 충분한 국물을 추가 할 계획# 956; 각 플라이 유리 병에 리터.
- 1, 1 : 2, 1 : 판 독서 분광 광도계의 각 세균 배양의 4 희석 OD에게 1 (600) 수치를 수집합니다. 0.1과 0.2이 값과 6.1.4.2 또는 6.1.4.3에 주어진 공식에 'O'와 'D'로 해당 희석 배수를 사용 사이의 OD 600 값을 생성 각 균주의 희석을 선택합니다.
- 여기에 설명 된 4 종을 사용하는 경우, (결정 이전에 CFU 변환에 20 OD 600)이 식을 이용하여 해당하는 집락 형성 단위로 셀 (CFU) / ㎖ 밀도를 정상화 :
E = ((OB) × V의 X 용 D) / C
E = 볼륨 (μL)에 펠렛을 재현 탁하는 경우, O = OD 600 박테리아, B = OD 600 빈 미디어, D = 배 희석, V = ㎕의 세균 배양 전에 원심 분리, 소정의 상수 C = OD 600. 기업 코드는 다음 방정식을 사용하여 계산 예제 파일을 참조하십시오. 분광 광도계를 들어"OB"대신에 "O"를 자동으로 빈 사용의.
참고 : 다음과 같이 소정의 상수 (10 7 CFU ml를 -1로 정규화 단위 OD (600), (20)에서 파생 된 상수)은 다음과 같습니다 A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. 브레비스 (0.056), L. 란타 (0.077). - 다른 박테리아 종을 사용하는 경우,이 방정식을 사용하여 600 = 0.1 중독에 밀도를 정상화 (더 CFU / OD 600 상수는 사용할 수 없습니다)
E = ((OB) × V의 X 용 D) /0.1 OD (600)
주 : 단위 6.1.4.2 단계와 동일하다. 기업 코드는 다음 방정식을 사용하여 계산 예제 파일을 참조하십시오.
- 바이오 안전성 캐비닛에 피펫 팁으로 뜨는을 제거 단계 6.1.4.2에서 계산 된 신선한 MMRS 또는 PBS의 펠렛을 재현 탁.
- 박테리아를 접종
- 멸균 다이어트과 원뿔 튜브로 전송 박테리아의 50 μl를D는 바이오 안전성 캐비닛에 알을 dechorionated. 유리 병 사이의 오염을 방지하기 위해 달걀 전송 후 박테리아를 추가합니다.
- 25 ℃에서 인큐베이터에 접종 튜브를 배치
불임 7. 측정 CFU로드 / 테스트
- 세라믹 구슬 125 μL와 MMRS 국물의 125 μl를 포함하는 1.7 ml의 미세 원심 분리 튜브에 몸 전체 비행 균질, 전송 5 파리 (5-7일 포스트 우화)의 CFU 부하를 측정합니다. 4.0 M / 초에서 30 초 동안 조직 균질를 사용하여 파리를 균질화.
- 또한, 구슬과 손을 1 분 동안 플라스틱 방앗와의 microcentrifuge 튜브에 균질화 생략합니다.
- 장내 미생물을 정량화하는 경우, 외래 미생물 (22)을 제거하기 위해 파리를 소독 표면. 전송 homogenizations위한 새로운 마이크로 원심 튜브에 1 분, 흡 에탄올 및 전송을 위해 100 ㎕의 70 % 에탄올을 함유하는 마이크로 원심 튜브에 날아간다. 소화관의 DNA 함량을 측정 할 경우, F 린스또는 에탄올 세척 전에 0.6 %의 차아 염소산 나트륨 1 분.
- 875 μL의 MMRS 5 초 동안 소용돌이 균질 희석하고, 마이크로 타이 터 플레이트의 제 1 웰에 120 μL의 파쇄를 피펫.
- 10 μl를 균질하고 다음 두 우물에 70 μl의 MRS를 사용하여 8 희석 :이 순차적를 수행합니다.
- 첫 번째 우물에서 10 μl를 제거하고 제 2 웰 포함 70 μl를 MRS에 추가합니다. 세 번째도 포함하는 70 μl를 MRS에 전송, 철저하게 제 2 웰에서 10 μl를 두 번째 우물의 내용을 혼합하고, 철저하게 섞는다. 희석하지, 1 : 8, 및 1:64이 3 총 원래 1000 ㎕를 균질의 농도에 연결됩니다.
- 전송할 MMRS 플레이트 각 희석액 10 ㎕를 (원하는 경우 멀티 채널 피펫을 사용하여). 약간 한천 표면 아래로 희석을 몇 mm를 확산 액체가 판을 이동하기 전에 건조 할 수 있도록 접시를 경사. 액체는 일에 건조플레이트는 이웃하는 두 방울의 혼합을 감소 2 일 오래된 빠르게 경우 전자 판.
- 1~2일 30 ° C에서 품어. 한 번 별개의 개별 식민지 볼 수 있습니다 인큐베이터에서 접시를 제거하고, 10 ~ 100 절연 식민지와 희석에서 계산합니다.
- 방정식 E = C의 X D / P의 X의 V 비행 당 E는 = CFU, C는 = 콜로니의 수를 계산 / F, D = 희석, P는 μL 플라이 균질의, V는 = 볼륨을 도금 = 사용하여 비행 당 CFU를 계산하고, F = 균질화 파리의 수입니다.
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Representative Results
무균 파리의 성공적인 양육은 D.의 전신 homogenizations에서 더 CFUs의 분리에 의해 확인 melanogaster의 성인 (그림 1). 도금 균질가 식민지를 산출하는 경우 또는, 유리 병은 오염 및 폐기해야합니다. 무균 파리를 들어, 네 개의 박테리아 균주의 각은 성인 파리 (그림 1)과 관련된 총 가능한 CFUs의 차이를 보여, 5 성인 남성의 풀에서 분리 하였다. 각 세균 종은 뚜렷한 형태를 가지며, 시각 (도 2)를 구별 할 수있다. 하나 이상의 콜로니 종류가 검출되지 않으면 박테리아 접종원을 준비하고 에러가있을 수있다 (예를 들어, 세정, 정규화 혼합) 또는 대응하는 종 배양 조건과 호환되지 않을 수있다 (예를 들어 초파리 밀도 23 또는 유전자형 24). 우리는 레크 리 에이션 기술적 오류를 배제하려면ommend 즉시 비행 튜브 (단계 6.2)에 접종 한 후 세균 혼합물의 일부를 도금.
그림 1 : 무균 및 무균 초파리에서 발견 콜로니 형성 단위 4 종 무균 및 무균 D.의 전신 균질 비행 당 집락 형성 단위 (CFU)의 수입니다. melanogaster의. 무균 균질 식민지의 부족은 D.을 확인 melanogaster의 불임. 값이 24 복제 값의 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 세균성 식민지 차별화. </를 무균 D.에 4 종의 각각 다른 형태학을 보여주는 샘플 균질화 강한> CFUs melanogaster의. 아세토 식민지 맑은, 밝은 갈색 색깔과 종류에 따라 다양한 크기로 왔습니다. 도금, A. 후 ~ 24 ~ 36 시간 tropicalis의 식민지가 불투명 A. 반면, 시간이 지남에 따라 차이가 있지만 덜 두드러진다 pomorum는 투명하다. L. 브레비스 식민지은 작고 흰색과 L. 있습니다 plantarum을 식민지 크고 노란색이다. 균질에서 필요한 성장이 식민지 (20)의 각 유형을 구별 할 수 있도록하기 위해 원래 박테리아 판에 비교 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| MMRS 레시피 | ||
| g의 양 | 노트 | |
| 증류수 | 1,000 | |
| 유니버설 펩톤 | 12.5 | |
| 효모 추출물 | 7.5 | |
| 포도당 | (20) | |
| 칼륨 인산염 | 이 | |
| 암모늄 시트르산 | 이 | |
| 아세트산 나트륨 | (5) | |
| 마그네슘 황산염 | 0.1 | |
| 망간 황산염 | 0.05 | |
| 한천 | (12) | 국물에 추가하지 마십시오 |
표 1 : MMRS 레시피.
| 효모 포도당 다이어트 레시피 | g의 양 |
| 증류수 | (500) |
| 양 조용 효모 | (50) |
| 포도당 | (50) |
| 한천 | 6 |
표 2 : 효모 포도당 다이어트 레시피.
기업 코드 파일 :. 샘플 계산 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 방법은 함께 무균 성인 18,27의 시리얼 전송 또는 항생제 치료 13,18 포함 무균 파리, 양육의 대체 방법으로, 배아 dechorionation 8,11,18,25,26,27에 대한 몇 가지 방법 중 하나입니다. 다른 dechorionation 방법은 에탄올 세척을 포함 11,25,26를 줄이거 나 8 차아 염소산 치료를 확장합니다. (에탄올 세척하지 않고) 여기에 설명 된대로 사육 할 때 100 초파리 유전자형이 무균했다 ~ 대부분의 이전 연구에서,하지만 일부 라인은 오염 (24)을 폐기했다 : 다른 세척 단계는 서로 다른 비행 유전자형을 양육 도움이 될 수. 에탄올 세척 이상 차아 염소산 치료를 사육하는 경우 아마도 약간의 오염 된 라인은 무균했을 것이다. 여기에 설명 된 방법은 특정 호스트의 유전자형에 대한 무균 파리의 고립으로 이어질하지 않을 경우 우리는 문제를 해결하기 위해 에탄올 린스 이상 차아 염소산 치료를하는 것이 좋습니다.
엔트 "> 초파리의 시리얼 전송이 사용되는 경우, 여기에 설명 된대로 부모의 무균 세대가 계란 dechorionation에 의해 무균 만들어지고, 다음 세대가 또는 항생제 18,27없는 바이오 안전성 캐비닛에 무균 전송에 의해 유지된다. 직렬 전송이 빠르다 그리고, 각 세대를 새롭게 무균 파리를 유도하는 것보다 파리 여러 세대에 걸쳐 무균 상태를 유지할 수 옮겼다. 무균 파리 적은 대등 한 시간 간격 동안 계란 (데이터하지를 마련하는 경향이 있기 때문에 직렬 전송의 한 합병증은 무균 / 기존 및 무균 파리의 일치 밀도를 유지하고있다 초파리 밀도가 비행 다이어트 23,28,29에서 세균 조성 등 다양한 특성을, 영향 때문에 그림 참조). 각 세대 새롭게 계란을 전송하는 플라이 밀도에 민감한 특성에 대한 우수한 방법이 될 수 있습니다. 드 노보가 dechorionation는 동안 세균 오염의 가능성을 방지 전송. 따라서, 시리얼 전송이 시간을 절약 할 수있는 반면, Dechorionation은 복잡한 변수를 더 제어 할 수 있습니다.항생제는 dechorionation 달리 항생제 치료가 완전히 미생물 (13)을 정착하고 제거하는 것이 충분하지 않지만, 무균 파리를 생성하는데 사용될 수있다. 또한, 항생제가 직접 호스트에 영향을 미칠 수있다. 예를 들어, 항생제 다이어트에 파리를 제기하는 것은 자신의 생식력과 단백질 함량을 감소하지만, 이러한 효과는 dechorionated 배아 (13)에서 발생 파리에서 관찰되지 않았다. 우리는 항생제가 수직으로 전송 및 Wolbachia 33 표면 살균에 의해 영향을받지 않습니다 endosymbiotic 박테리아를 제거하는 데 필요한 있습니다.
여러 단계 dechorionated 무균 또는 무균 파리를 준비의 성공에 매우 중요합니다. 첫째, 단계 2.3에서와 같이 비행 다이어트를 흔들 중요하다. 랙은 이전과 정확한 후 각각 약 15 초 동안 손으로 동요하지 않는 경우진탕 기에서 45 분 간격, 효모 및 한천은 효모에 대한 액세스를 비행 줄이고 플라이 문화 한천 표면이 너무 소프트하게 해결됩니다. 둘째, 효모 페이스트의 두께와 포도 주스 판의 한천 농도는 계란 제거 (단계 3.3)에 영향을 미친다. 1:15 효모에 의해 생성 된 얇은 층 : 물 희석 세척 및 식품 판 (4.4 단계)에서 제거 할 때 한천에 포함에서 계란을 방지 할 수 있습니다. 포도 주스 플레이트가 너무 부드럽고와 달걀 수집 중에 어기면 셋째, 판의 탄력이 판의 다음 배치에 작은 포도 주스 농축액을 추가하여 증가 될 수있다. 파리 케이지 환경에 순응하기 위해 24 시간이있는 경우 넷째, 달걀 수익률은 높은 : 이것은 신선한 한천 플레이트 새 컬렉션 케이지로 전송 <20를 포함하여, 수집에 앞서 ~ 케이지에서 40 시간 파리를 배치하여 해결할 수 있습니다 원하는 컬렉션 날짜 이전 시간. 다섯째, 계란 dechorionation (단계 5.7)에 RINS 동안 상기 부싱의 측면에 부착되지 않는다면보내고 기간은 15 ~ 30 초를 확장해야한다 (주의 : 계란을 죽일 수있다 너무 오래 헹굼 시간을 연장). 또한, 린스 액에 알 손실은 완전 폐쇄 메쉬 부싱 시일 검사 계란 재 현탁액 중에 자체의 외부 유출하지 않는 것이 확인함으로써 방지 될 수있다. 부싱 잘 밀봉되면, 유출 된 계란 세척 폐기되는 것과 체로 세척 쏟아지는 의해 회수 될 수있다. 파리가 부화 한 후 파리 다이어트의 색상을 검사하는 무균 인 경우 여섯째,하는 추정 시험 확인합니다. 파리는 무균 경우, 다이어트의 상단 층은 어두운 갈색 커피 색상되며 공기 기포는 다이어트에 걸쳐 존재하지 않습니다. 기포 또는 상단 다이어트 층의 황갈색 색상은 세균의 존재를 나타냅니다. 세균의 존재는 여전히 균질화에 의해 확인되어야한다. 다르게는, 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭은 unculturable 미생물 (예를 들면, 엄격한 혐기성) (30)을 검출하도록 수행 될 수있다. 마지막으로, homogen 후화, 세라믹 비드 (건조를 용이하게하기 위해) 100 % 에탄올로 한 번 세척 H 2 O에서 30 분 동안 2 % 차아 염소산 + 0.05 M 수산화 칼륨의 용액으로 흔들리는 관대 세척하여 (10 회 이상) 재사용 할 수 65 ° C에서 건조. 모든 단계에 신중 하였다 경우 무균 파리 프로토콜이 수행 될 때마다 격리되어야한다.
이 작품은 다시 연결하는 효모 포도당 다이어트에 제기 실험실 파리의 세균 지역 사회를 대표하는 4 종의 미생물과 무균 초파리 배아를하는 방법을 설명합니다. 이전 작업은 여러 플라이 설문 조사 9,19-에 수치 적으로 풍부하고있다 여기에 4 종의 유산균 fructivorans을 포함한 5 종 커뮤니티에 사용하고있다. 우리는 L.를 생략하는 것이 좋습니다 D.에서 그 표현형을 포함한 여러 가지 이유로 fructivorans, L.으로 monoassociated melanogaster의 fructivorans은 주로 무균 산도와 합동(31)와 L.를 enotypes fructivorans 다른 비행 분리보다 더 까다로운 것입니다. L. 경우 L.에 상술 fructivorans 포함하고,이를 배양해야 란타 및 L. 브레비스 : 정적 액체 배양; 고체 문화 CO 2와 홍수 밀폐 용기에 (후자 단계는 유산균의 성장을 지원하기 위해 주변의 산소 수준을 감소).
여기에 설명 된 방법은 쉽게 다양한 무균 조건에서 초파리를 높이기 위해 변화 될 수있다. 예를 들어, 파리 한 번 15,25,31에 하나의 미생물 종의 살균 초파리 배아를 접종에 의해 양육 될 수 monoassociated. 복수 종의 연관은 동등한 비율 20, 24에서 여러 종을 접종함으로써 형성된다. 우리는 정상화를 촉진하기 4 종의 각각에 대한 CFU / OD 600 상수를 제공하지만, 대부분의 종 혼합물 상수를 유도하기 위해 필요하지 않을 수있다. 나는t 이전에 박테리아의 시작 밀도가 크기 (20)의 세 가지 명령을 통해 변경 될 때 5-7 DPE 성인에서 미생물의 풍부 크게 2 종 협회에 차이가 없었다 것으로 나타났다. 또한, 초파리의 장내는 매우 관대하고, 비행 다이어트에 쉽게 배양 많은 종 (예를 들면, 대장균, B. 서브 틸리 25) 미생물에 의해 미생물의 영향 유전 해부을 가능하게 광범위한으로 monoassociation 높은 밀도에서 초파리와 연결할 수 있습니다 유전자와 게놈 자원. 마지막으로, 미생물에 의해 영향을 초파리 표현형의 연구는 각각의 유리 병은 미생물의 특정 세트에 액세스 할 수 있도록 정의 된 미생물 커뮤니티와 자연스럽게 배치 종래의 계란을 접종하여 마우스에서 변경된 Schaedler 식물의 접근 방식을 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 프로토콜의 일부 세부 사항은도 원고에 도움이되는 의견을 제공 박사 아담 돕슨의 도움으로 최적화되었다. 이 작품은 국립 보건원에 대한 재단에 의해 지원되었다 (FNIH) 허가 번호 R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD 및 AED). FNIH 허가 번호 1F32GM099374-01 (PDN), 브리검 영 대학교 시동 기금 (JMC, MLK, MV). 출판 비용은 브리검 영 대학교 생명 과학 대학 식물과 야생 동물 과학 부서에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastic Bushing | Home Depot | 100404002 | http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002 |
| Plastic Bushing Cap | Home Depot | 100153897 | http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Centrifuge Tubes | TrueLine Centrifuge Tubes | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter Pipette Tips, 300 μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All& N=0&mode=match%20partialmax&lang= en®ion=US&focus=product |
| Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N =0&mode=match%20partialmax&lang= en®ion=US&focus=product |
| Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match %20partialmax&lang=en®ion =US&focus=product |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html |
| 1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filter Pipette Tips, 1,000 μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/ |
| Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
References
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발달 생물학 문제 (113) 무균 무균,Erratum
Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).
