Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Elevando a mosca da fruta Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

Um método para a criação de Drosophila melanogaster sob condições axénicas e gnotobióticos é apresentada. embriões voam são dechorionated em hipoclorito de sódio, transferidos assepticamente à dieta estéril, e criados em recipientes fechados. Inoculando dieta e embriões com bactérias leva a associações gnotobióticos e presença de bactérias é confirmada por plaqueamento de corpo inteiro de Drosophila homogeneizados.

Introduction

A maioria dos animais estão intimamente associados com bactérias ( 'microbiota') desde o nascimento até a morte 1. Comparações de ( "convencional") animais livres de microrganismos ( 'axênico') e associada a microorganismos têm demonstrado micróbios influenciar diversos aspectos da saúde animal, incluindo metabólica, nutricional, vascular, hepática, respiratória, imunológicos, endócrino e função neurológica 2. A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um modelo fundamental para a compreensão de muitos desses processos na presença de micróbios 3,4 e para o estudo da influência microbiota em 5,6 a saúde animal. Nenhuma espécie bacteriana está presente em cada indivíduo ( 'core'), mas Acetobacter e Lactobacillus espécies numericamente dominar a microbiota de ambos D. pego wild-criados em laboratório e melanogaster. Outros Acetobacteraceae (incluindo Komagataeibacter e Gluconobacter), Firmicútis (tais como Enterococcus e Leuconostoc) e Enterobacteriaceae ou são frequentemente presentes em indivíduos de Drosophila em baixa abundância, ou irregularmente presente em grande abundância 7-12.

A microbiota de Drosophila e mamíferos é inconstante dentro e entre gerações 14,19. Microbiota inconstância pode levar ao ruído fenotípica ao medir traços dependente da microbiota. Por exemplo, o armazenamento Acetobacteraceae influência lipídico (triglicéridos) em Drosophila 15-18. Se Acetobacteraceae são mais abundantes em moscas de um frasco do que nos outros 19, moscas isogênicos podem ter diferentes fenótipos 20. Uma solução para o problema da inconstância microbiota em camundongos 14 tem sido na prática desde 1960, através da introdução de uma comunidade definida de 8 espécies microbianas dominantes para filhotes de rato cada nova geração (alterada SCHAEDLER flora),garantindo que cada filhote está exposto aos mesmos membros-chave da microbiota mouse. Esta prática controla a composição da microbiota, mesmo quando a microbiota não é o alvo primário do estudo 32, e define precedente para assegurar a presença de micróbios chave numa variedade de condições experimentais.

Para definir a influência de micróbios em Drosophila nutrição, vários protocolos para derivar linhas mosca axênicas têm sido desenvolvidos, incluindo dechorionation hipoclorito de embriões (derivada quer de novo cada geração ou mantida generationally por transferência para uma alimentação esterilizada) e 13 tratamento com antibióticos. Há benefícios para diferentes abordagens, tais como a facilidade e rapidez para os dois tratamentos antibióticos e transferência de série, contra um maior controle de variáveis ​​de confusão com de novo dechorionation (por exemplo, densidade de ovos, micróbios contaminantes residuais, longe do alvo efeitos antibióticos). Independentemente do método depreparação, a introdução de espécies microbianas especificados para axênicas embriões permite cultura de Drosophila com as comunidades ( 'gnotobióticos') definidas. Alternativamente, imitando o uso de flora SCHAEDLER, esta comunidade poderia ser inoculado aos ovos convencionalmente-estabelecidas (seguindo os passos 6-7 somente) para assegurar a presença de micróbios que influenciam a característica em cada frasco e evitar complicações da inconstância microbiota. Aqui descrevemos o protocolo para elevar e gnotobiótico axénica de Drosophila por dechorionation de novo de embriões e para a confirmação da presença dos taxa microbiana introduzido ou contaminantes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultura das bactérias (Start ~ 1 semana antes da colheita dos ovos)

  1. Prepare MRS modificado 20 (RMM) placas e tubos de caldo (Tabela 1). Introduzir 20 ml de agar RMM em cada placa de Petri de 100 mm e deixe esfriar / secar durante a noite, ou 5 ml Mmrs caldo para 18 tubos de ensaio mm.
  2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, e L. plantarum na RMM placas de agar. Incubar durante a noite a Acetobacter 30 ° C. Incubar Lactobacillus anaeróbia, colocando as placas em um recipiente hermético e inundações com dióxido de carbono antes de selar. Incubar a 30 ° C durante a noite.
    Nota: L. colónias brevis pode não ser visível até 24-48 h. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C e as colónias pode ser usado durante até 3 semanas.
  3. Dois ou três dias antes de transferir os ovos dechorionated à dieta estéril (seção 5), escolher uma única colónia da placa RMM em um con tubo de ensaioRMM Taining caldo. Acetobacter crescer com agitação e crescer Lactobacillus estaticamente durante 24 horas ou até turva, tanto a 30 ° C.

2. Prepare estéril Diet

  1. Prepare dieta estéril (Tabela 2) num balão Erlenmeyer de 2 L. Microondas A dieta até que tenha fervido 3 vezes sequenciais; misturar entre cada fervura.
  2. Colocar o balão sobre uma placa de agitação para manter a agitação durante a transferência de dieta para tubos de centrífuga cónicos. Transferir 7,5 ml de dieta para 50 ml tubos de centrífuga. Vagamente tampar os tubos, e coloque em uma cremalheira de polipropileno coberto, autoclave.
  3. Esterilizar dieta mosca utilizando um autoclave a 121 ° C e 15 psi durante 25 min. Retire prateleiras de autoclave, e agitar imediatamente cada rack horizontal para garantir a dieta não separar durante o resfriamento. Tenha cuidado para não apertar as prateleiras verticalmente para evitar a transferência de dieta para a tampa ou bordas dos tubos. Permitir que a dieta arrefecer num agitador durante exactamente 45 min enovamente agitar a dieta horizontalmente com a mão.
    Nota: A dieta pode ser armazenada a 4-15 ° C durante até uma semana.
  4. Como uma alternativa ao uso de racks de autoclaváveis ​​cobertos (passos 2,1-2,3), ou para levantar as moscas com dietas contendo conservante ácido, execute os seguintes passos:
    1. Prepare 1 L dieta líquida num frasco de 2 L com uma barra de agitação no frasco. Autoclave a dieta.
    2. Após autoclavagem, adicione 10 ml conservante e mexa continuamente numa placa de agitação aquecida. Quando o agar foi arrefecida a 50-60 ° C, mover o balão para uma placa de agitação aquecida numa cabine de segurança biológica e manter a temperatura do balão de aquecimento a 50-60 ° C.
    3. Na cabine de segurança biológica, pipeta ~ 7,5 ml individualmente em tubos cônicos.

3. Prepare gaiolas de postura

  1. Fazer placas de agar de sumo de uva por microondas a 100 ml de água, 10 g de levedura de cerveja, 10 g de glucose, e 1 g de ágar. Leve para ferver 3 vezes no passo 1.1 e adicione 10 g de uvas congeladas suco de concentrate para aumentar a visibilidade dos ovos na placa de agar.
  2. Quando agar foi arrefecida a 55 ° C, verter em 20 ml de 100 mm de placas de Petri e deixa-se solidificar.
  3. Cobrir a superfície das placas de agar com uma pasta de levedura por mistura de 1 g de levedura de cerveja com 15 g de água. Pour pasta de levedura sobre a placa de agar para garantir que a superfície é coberta, em seguida, deitar fora o excesso, deixando um resíduo de levedura fina atrás. Se forem utilizadas múltiplas placas, a pasta pode ser sequencialmente vertida para múltiplas placas.
  4. Transferir placas de agar na parte inferior de uma gaiola.
    Nota: Um recipiente deli 32 oz é um bom substituto para gaiolas mosca acrílico.
    1. Faça tampas para recipientes deli 32 oz cortando um furo na parte superior e colando uma malha respirável sobre o buraco com cola não tóxica. Se a cola é solúvel em água prevenir a exposição a água para a tampa.
  5. Transferência 200-300 voa dentro do recipiente e cobrir com tampa. Cobrir o buraco protegido de malha com uma tampa vazio placa de Petri para Prevent evaporação a partir da superfície do agar e adicionar um papel de tecido húmido no interior da tampa, se desejado. Incubar as moscas a 25 ° C durante a noite durante 16-20 horas.

4. recolher ovos

  1. Prepara-se uma peneira para a recolha de ovos, colocando uma malha de nylon para o casquilho de plástico.
  2. Para recuperar o prato com ovos nele, remova moscas da gaiola, transferindo para um recipiente vazio. Se mesmas moscas será utilizado no dia seguinte, transferir imediatamente para uma nova gaiola contendo uma placa de agar de uva recém-sumo fermentado. As moscas podem ser utilizadas para 3-5 dias sequenciais
  3. Remover moscas mortas do agar com um pincel limpo, tomando cuidado para não quebrar o agar.
  4. Recolhe ovos por lavagem da placa de agar com água destilada, escovando levemente os ovos a partir da superfície do agar, e vertendo a suspensão sobre a malha. Repetir 3-4 vezes até que todo ou a maioria dos ovos foram retirados da placa de agar.

5. Dechorionate Ovos e Transferência para estéril Diet

  1. Prepara-se o cabine de segurança biológica por pulverização do interior (incluindo os lados) com 70% de etanol. Limpe o fundo com um tecido laboratório, e esterilizar o capô com luz UV para ~ 15 min. Esterilizar todos os suprimentos não-biológicos (copos de amostra, pincel, fórceps, recipiente de resíduos, a 400 ml de água esterilizada, e 100 ml de 0,6% de hipoclorito de sódio) por pulverização com etanol e imediatamente colocar na cabine de segurança biológica. Esterilizar com luz UV durante 15 min.
  2. Inicie o primeiro de 2 lavagens de hipoclorito de sódio, colocando a bucha com os ovos em um copo de 120 ml de amostra ou outro recipiente estéril. Lentamente, deitar ~ 90 ml de solução de hipoclorito de sódio a 0,6% para o casquilho até pouco abaixo do rebordo.
  3. Lavar ovos para 2,5 min. Periodicamente re-suspender os ovos utilizando uma pinça para mover o casquilho cima e para baixo na solução de hipoclorito.
  4. Transfira a bucha diretamente em um segundo copo espécime, pré-carregada com 90 ml de lixívia, no interior da cabine de segurança biológica.
  5. RepetirPasso 5.3 dentro da cabine de segurança biológica. No final do segundo tratamento de branqueamento, os ovos devem começar a aderir aos lados da bucha.
  6. Realizar os passos 5,7-5,8 na cabine de segurança biológica.
  7. Descarte a lixívia e lavar a bucha com água estéril 3 vezes. Re-suspender os ovos várias vezes durante cada lavagem, movendo a bucha com uma pinça. No final da terceira lavagem mais ovos devem ser ligado ao lado da bucha.
  8. Usando um pincel esterilizado em etanol, transferir os ovos a partir do lado da bucha para a dieta estéril. Transferir os ovos individualmente ou em pequenos lotes. Objectivo para 30-50 ovos por frasco. Deixar as tampas soltas para permitir que o oxigênio para entrar no tubo. Se frascos devem permanecer axênico, transferir para uma incubadora de insetos; de outra forma, adicionar bactérias como abaixo.

6. Faça gnotobióticos Moscas Usando 4 espécies bacterianas

  1. Prepare bactérias
    1. Prepare uma cabine de segurança biológica esterilizados com suprimentos necessários (pipettes, caixas de ponta da pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS, e racks tubo de ensaio) como no passo 4.1. Limpe a parte externa de tubos de ensaio com um laboratório encharcada de etanol limpe antes de colocar no gabinete de biossegurança.
    2. Sedimentar as bactérias, em primeiro lugar a transferência de 500 ul de crescimento durante a noite para um tubo de microcentrífuga estéril. Se a densidade bacteriana é baixa, adiciona-se 1,5 ml a cada tubo sequencialmente ou remover o sobrenadante e adicionar cultura extra para o mesmo tubo. Retirar amostras a partir da cabine de segurança biológica e centrifugar durante 10 min a 10.000 x g. Use pontas com filtro para evitar a contaminação entre amostras.
    3. Determinar a densidade de cada cultura por medição OD 600. Se utilizando um leitor de placa de multi-poços, transferir 200 ul de cada cultura para uma placa de 96 poços em 1-, 2-, 4- e diluições.
    4. Determinar a quantidade de RMM em que para diluir cada sedimento celular (5.2.2) utilizando um espectrofotómetro de leitura de placas e as seguintes equações. Planejamos adicionar caldo suficiente para inocular 50 &# 956; l a cada frasco mosca.
      1. Recolhe OD 600 leituras para uma mistura 1: 1, 1: 2 e 1: 4 de diluição de cada cultura bacteriana num espectrofotómetro de leitura de placas. Selecione a diluição para cada estirpe bacteriana que produz um 600 valor OD entre 0,1 e 0,2 e usar esse valor e seu fator de diluição correspondente como 'O' e 'D' na fórmula indicada no 6.1.4.2 ou 6.1.4.3.
      2. Se estiver usando as 4 espécies descritas aqui, normalizar as células a colónia equivalente unidade de formação (UFC) / ml densidades (OD 600 a conversão CFU previamente determinado 20) usando esta equação:
        E = ((OB) x V x D) / C
        onde E = volume para ressuspender sedimento em (l), O = OD 600 bactérias, B = OD 600 mídia em branco, D = fold-diluição, V = cultura bacteriana ul antes da centrifugação, C = OD 600 de constante predeterminado. Veja arquivo de código suplementar para exemplos de cálculos usando estas equações. para espectrofotômetros que automaticamente em branco, use "O" no lugar de "OB".
        Nota: As constantes predeterminadas (600 unidades OD, normalizadas para 10 7 UFC ml-1, constantes derivadas em 20) são como se segue: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Se utilizar outras espécies de bactérias (sem CFU / OD 600 constante está disponível), normalizar a densidade de DO600 = 0,1 usando esta equação:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Nota: As unidades são as mesmas como no passo 6.1.4.2. Veja arquivo de código suplementar para exemplos de cálculos usando estas equações.
    5. Na cabine de segurança biológica, remover o sobrenadante com uma ponta de pipeta e ressuspender o sedimento em Mmrs frescas ou PBS como calculado no passo 6.1.4.2.
  2. inocular bactérias
    1. Transferir 50 uL das bactérias aos tubos cónicos com uma dieta estérild dechorionated ovos em cabine de segurança biológica. Adicionar bactérias após a transferência de ovos para evitar a contaminação entre frascos.
    2. Colocar os tubos inoculados numa incubadora a 25 ° C.

7. Medida CFU Load / controlo de esterilidade

  1. Para medir a carga de CFU em homogeneizados de todo o corpo da mosca, transferência de 5 moscas (5-7 dias após a eclosão) para um tubo de 1,7 ml de microcentrífuga contendo 125 ul de contas de cerâmica e 125 mL de caldo de RMM. Homogeneizar moscas usando um homogeneizador de tecidos durante 30 segundos a 4,0 m / seg.
    1. Como alternativa, omitir contas e mão homogeneizar em microtubos com pilões plástico para 1 min.
    2. Se a quantificação da microbiota intestinal, a superfície esterilizar as moscas para remover micróbios exógenos 22. Transferência de moscas para um tubo de microcentrifugadora contendo 100 ul de etanol a 70% durante 1 minuto, aspirar o etanol, e transferir para um novo tubo de microcentrífuga para homogeneizações. Se o teor de ADN do intestino irá ser medido, lavar fou 1 min com 0,6% de hipoclorito de sódio antes da lavagem com etanol.
  2. Dilui-se o homogeneizado com 875 ul, RMM vortex durante 5 segundos, e pipetar com 120 ul de homogeneizado para a primeira cavidade de uma placa de microtitulação.
  3. Realizar dois seqüenciais 1: 8 diluições utilizando 10 homogeneizado ul e 70 ul MRS nos próximos dois poços.
    1. Retirar 10 jul do primeiro poço e adicioná-lo para o segundo poço contendo 70 ul MRS. Misturar os conteúdos do segundo poço completamente, a transferência de 10 uL de o segundo poço para os terceiros poços contendo 70 ul MRS, e homogeneiza-se. Isto leva a 3 concentrações totais do original homogenato 1000 ul: não diluído, 1: 8 e 1:64.
  4. Transferir 10 uL de cada diluição a uma placa de RMM (utilizando uma pipeta multi-canal, se desejado). Ligeiramente inclinar o prato de diluição para espalhar a alguns milímetros abaixo da superfície de agar e permitir que o líquido a secar antes de mover a placa. O líquido seca sobre the rapidamente placa se as placas a 2 dias de idade, reduzir a mistura de duas gotas de vizinhos.
  5. Incubar a 30 ° C durante 1-2 dias. Remover as placas da incubadora, uma vez distintos, colónias individuais são visíveis, e contar a partir de uma diluição com 10-100 colônias isoladas.
  6. Calcular CFU por mosca, utilizando a equação E = C x D / P x V / F, em que E = CFU por mosca, C = número de colónias contadas, D = diluição, P = ul chapeado, V = volume do homogenato de mosca, e F = número de moscas homogeneizados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Criação bem-sucedida de moscas axênicas é confirmado pelo isolamento de não UFCs de homogeneizações todo o corpo de D. adultos melanogaster (figura 1). Alternativamente, se o homogeneizado chapeado produz colónias, os frascos são contaminada e deve ser descartado. Para gnotobióticos moscas, cada um dos quatro isolados bacterianos foram isolados a partir de misturas de 5 adultos do sexo masculino, demonstrando diferenças em CFUs totais viáveis ​​associados com moscas adultas (Figura 1). Cada espécie bacteriana tem uma morfologia distinta e pode ser distinguido visualmente (Figura 2). Se um ou mais tipos de colónias não são detectados pode ter havido erros na preparação do inoculo bacteriano (por exemplo, de lavagem, de normalização, de mistura) ou da espécie correspondente pode não ser compatível com as condições de cultura (por exemplo, Drosophila densidade 23 ou genótipo 24). Para descartar erros técnicos que recmendar plaqueamento uma porção da mistura bacteriana imediatamente após a inoculação de frascos de mosca (Passo 6.2).

figura 1
Figura 1: unidades formadoras de colónias Encontrados em Axenic e gnotobióticos Drosophila O número de unidades formadoras de colónias (CFU) por mosca em homogeneizados de todo o corpo de D. 4-espécies gnotobiótico e axênico. melanogaster. Falta de colônias nos homogeneizados axênicas confirma D. esterilidade melanogaster. Os valores são apresentados como médias ± SEM de 24 valores em duplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Diferenciar Colônias bacterianas. </ forte> CFU homogeneização de uma amostra que apresentou diferentes morfologias para cada um dos 4-espécies no D. gnotobiótico melanogaster. colônias Acetobacter são uma cor marrom claro, luz e vêm em tamanhos variados, dependendo da espécie. ~ 24-36 h após o plaqueamento, A. colónias tropicalis são opacas, enquanto A. pomorum é transparente, embora ao longo do tempo a diferença torna-se menos pronunciado. L. colónias brevis são pequenas e brancas e L. colónias plantarum são grandes e amarelo. Se necessário, o crescimento do homogeneizado pode ser comparado com as placas de bactérias originais para ajudar a distinguir cada tipo de colónia 20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

RMM Receita
Valor em g notas
Água destilada 1.000
universal Peptona 12,5
Extracto de levedura 7,5
Glicose 20
fosfato dipotássico 2
amónio Citrato 2
Acetato de sódio 5
Sulfato de magnésio 0,1
manganês Sulfato 0,05
agar 12 Não adicione caldo

Tabela 1: MMRS receita.

<tr>
Receita da dieta de levedura-glucose
Valor em g
Água destilada 500
Levedura de Cerveja 50
Glicose 50
agar 6

Tabela 2: Fermento-glucose receita da dieta.

Suplementar arquivo de código:. Cálculos de exemplo Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O método descrito aqui é uma das várias abordagens para embrião dechorionation 8,11,18,25,26,27, juntamente com métodos alternativos de criação de moscas axênicas, incluindo a transferência de série dos adultos axênicas 18,27 ou tratamento antibiótico 13,18. Outros métodos incluem dechorionation lavagens de etanol e reduzir ou estender 11,25,26 8 tratamento de hipoclorito. Diferentes etapas de lavagem pode auxiliar criação de diferentes genótipos mosca: em um estudo anterior mais de ~ 100 genótipos de Drosophila foram axênico quando criadas como descrito aqui (sem lavagens de etanol), mas algumas linhas foram contaminadas e descartados 24. Talvez algumas linhas contaminados teria sido axênico se criados com lavagens de etanol ou tratamento hipoclorito de mais tempo. Se o método descrito aqui não levar ao isolamento de moscas axênicas para determinados genótipos do hospedeiro recomendamos lavagens de etanol ou tratamento hipoclorito de mais tempo para resolver o problema.

ent "> Quando se utilizam transferências de série de Drosophila, um dos pais geração axênico é feita axênico por dechorionation ovo como descrito aqui, e as gerações seguintes são mantidas pela transferência asséptica em uma cabine de segurança biológica, com ou sem antibióticos 18,27. transferência de série é mais rápido de derivar moscas axênicas de novo a cada geração, e transferido moscas podem permanecer axênico para múltiplas gerações. uma complicação das transferências de série é a manutenção de densidades correspondentes de moscas convencionais / gnotobiótico e axênicas desde moscas axênicas tendem a põem menos ovos sobre um intervalo de tempo comparável (dados não mostrado). uma vez que a Drosophila densidade influencia várias características, incluindo a composição bacteriana na mosca dieta 23,28,29, transferindo os ovos de novo a cada geração pode ser uma abordagem superior para características sensíveis à densidade da mosca. de novo dechorionation também evita a possibilidade de contaminação bacteriana durante transferências. Assim, enquanto as transferências de série pode economizar tempo, dechorionation permite mais controle de variáveis ​​complicadores.

Os antibióticos também podem ser usadas para criar moscas axênicas, embora, em contraste com dechorionation, o tratamento com antibióticos é geralmente insuficiente para remover completamente colonizar micróbios 13. Além disso, os antibióticos podem influenciar directamente o hospedeiro. Por exemplo, elevando moscas em uma dieta com antibióticos diminui o seu conteúdo fecundidade e proteínas, mas estes efeitos não foram observados nas moscas levantadas a partir de embriões dechorionated 13. Notamos que os antibióticos são necessários para eliminar as bactérias endosymbiotic que são transmitidos verticalmente e não são afetados pela esterilização da superfície, tais como Wolbachia 33.

Vários passos são fundamentais para o sucesso de preparar moscas axênicas ou gnotobióticos dechorionated. Em primeiro lugar, é crucial para agitar a dieta mosca como nos passos 2.3. Se as prateleiras não são agitado à mão por cerca de 15 segundos cada um antes e depois de uma exata45 min de intervalo no agitador, o fermento e agar vai resolver, reduzindo voar acesso a levedura e tornando a superfície do ágar muito mole para a cultura mosca. Em segundo lugar, a espessura da pasta de levedura e de agar à concentração de sumo de uva placas influencia a remoção do ovo (passo 3.3). Uma fina camada produzida por uma levedura 01:15: diluição da água irá evitar que os ovos de incorporação no agar quando enxaguar e remover as placas a partir de alimentos (passo 4.4). Em terceiro lugar, se placas de sumo de uva é muito mole e quebrar-se durante a recolha de ovos, firmeza de placas pode ser aumentada pela adição de menos concentrado de sumo de uva para o próximo lote de placas. Em quarto lugar, os rendimentos de ovo são maiores se moscas têm 24 h a aclimatar ao ambiente gaiola: isto pode ser abordado através da colocação moscas na gaiola ~ 40 horas antes da recolha, incluindo a transferência para uma nova gaiola de recolha com uma placa de ágar fresco <20 hr antes da data colecção pretendida. Em quinto lugar, se os ovos não aderem ao lado do casquilho durante dechorionation (passo 5.7), os rinsperíodo ing deve ser prorrogado por 15-30 seg (Cuidado: estendendo o tempo de lavagem muito tempo pode matar os ovos). Além disso, a perda de ovos para as lavagens de líquidos pode ser impedida por controle da vedação do casquilho da malha para o encerramento completo e verificar que os ovos não derrame do lado de fora do crivo durante a re-suspensão. Se a bucha é bem selada, ovos derramado pode ser recuperado por vazamento da lavagem através do peneiro quanto a lavagem é descartada. Em sexto lugar, depois de moscas eclodiram, um teste presuntivo para determinar se as moscas são axénico é examinar a cor da dieta. Se as moscas são axênico, a camada superior da dieta será uma cor café escuro-marrom e não há bolhas de ar estará presente em toda a dieta. bolhas de ar ou cor bronzeada da camada de dieta top indicar a presença de bactérias. presença bacteriana ainda deve ser confirmada por homogeneização. Em alternativa, a amplificação por PCR do gene de rRNA 16S, também pode ser realizado para detectar micróbios unculturable (por exemplo, anaeróbios estritos) 30. Finalmente, após Homogenzação, de contas de cerâmica pode reutilizado por balanço de uma solução de hidróxido de potássio a 2% de hipoclorito de + 0,05 M durante 30 min, lavando generosamente (10 vezes ou mais) em H 2 O, lavar uma vez com etanol a 100% (para facilitar a secagem), e secagem a 65 ° C. Se todas as etapas forem seguidas cuidadosamente, moscas axênicas devem ser isolados cada vez que o protocolo é realizada.

Este trabalho descreve um método para re-associar embriões de Drosophila estéreis com uma microbiota 4-espécies, que é representativa das comunidades bacterianas de moscas de laboratório criados com uma dieta de levedura-glucose. Trabalho anterior tem usado uma comunidade 5-espécies, incluindo as 4-espécies aqui e Lactobacillus fructivorans, que tenha sido numericamente abundante em vários estudos mosca 9,19. Recomendamos omitindo L. fructivorans por várias razões, incluindo a fenótipos em D. melanogaster monoassociated com L. fructivorans são amplamente congruente com ph axênicoenotypes 31 e L. fructivorans é mais exigente que outro mosca isolados. Se L. fructivorans está incluído, ele deve ser cultivadas como descrito por L. plantarum e L. brevis: cultura líquida estática; e em um recipiente hermético inundado com CO 2 para a cultura sólida (a última etapa reduz os níveis de oxigênio ambiente para apoiar o crescimento Lactobacillus).

As abordagens descritas aqui pode ser facilmente alterada para aumentar a Drosophila sob diversas condições gnotobióticos. Por exemplo, monoassociated moscas podem ser criados através da inoculação de embriões de Drosophila estéreis com uma espécie microbiana de cada vez 15,25,31. Associações multi-espécies são formadas através da inoculação de múltiplas espécies em proporções equivalentes 20,24. Embora nós fornecida CFU / OD 600 constantes para cada uma das 4-espécies para facilitar a normalização, que pode não ser necessária para obter uma constante para a maioria das misturas de espécies. EuT foi demonstrado anteriormente que a abundância de micróbios em 5-7 adultos PED não foi significativamente diferente em associações de 2-espécies, quando a densidade de partida de bactérias foi variada ao longo de três ordens de grandeza de 20. Além disso, o intestino de Drosophila é altamente permissiva, e muitas espécies que são facilmente cultivadas em dieta mosca Drosophila pode associar com a altas densidades em monoassociation (por exemplo, E. coli, B. subtilis 25), permitindo a análise genética de influência microbiana por micróbios com grande recursos genéticos e genômicos. Finalmente, estudos de fenótipos de Drosophila que são influenciados por microbiota poderia adaptar-se a abordagem de Altered Schaedler Flora em ratinhos por inoculação de ovos convencionais naturalmente previstas com uma comunidade microbiana definido para assegurar que cada frasco tem acesso a um conjunto específico de micróbios.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Alguns detalhes deste protocolo foram otimizados com a assistência do Dr. Adam Dobson, que também forneceram comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Fundação para o National Institutes of Health (FNIH) número de concessão R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, e AED). FNIH número de concessão 1F32GM099374-01 (PDN) e da Universidade Brigham Young fundos de inicialização (JMC, MLK, MV). Os custos de publicação foram apoiadas pela Academia Brigham Young University de Ciências da Vida e do Departamento de plantas e animais selvagens Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Biologia do Desenvolvimento Edição 113 axênico gnotobiótico, Microbioma microbiota,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter