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Developmental Biology

La cría de la mosca de la fruta Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

Se presenta un método para la cría de Drosophila melanogaster en condiciones axénicas y gnotobióticos. Volar embriones se dechorionated en hipoclorito de sodio, de manera aséptica a la dieta estéril, y se ha criado en contenedores cerrados. La inoculación de la dieta y los embriones con bacterias conduce a asociaciones gnotobióticos, y la presencia bacteriana se confirmó mediante siembra de todo el cuerpo homogeneizados de Drosophila.

Introduction

La mayoría de los animales están íntimamente asociados con las bacterias ( 'microbiota') desde el nacimiento hasta la muerte 1. Las comparaciones de los animales libres de microorganismos ( 'axénicos') y de microorganismos-asociado ( "convencional") han demostrado microbios influyen en diversos aspectos de la salud de los animales, incluyendo metabólico, nutricional, vascular, hepático, respiratorio, inmunológico, endocrino y la función neurológica 2. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es un modelo clave para la comprensión de muchos de estos procesos en la presencia de microbios y 3,4 para el estudio de la influencia de la microbiota 5,6 salud de los animales. Ninguna de las especies bacterianas están presentes en cada individuo ( "núcleo"), pero Acetobacter y Lactobacillus especies numéricamente dominan la microbiota de ambos D. criados en laboratorio y capturados en la naturaleza melanogaster. Otros Acetobacteraceae (incluyendo Komagataeibacter y Gluconobacter), Firmicutis (tales como Enterococcus y Leuconostoc), y enterobacterias son o bien presentes con frecuencia en individuos de Drosophila en baja abundancia, o irregularmente presentes en gran abundancia 7-12.

La microbiota de Drosophila y mamíferos no es constante dentro ya través de las generaciones 14,19. inconstancia microbiota puede conducir al ruido en la medición de rasgos fenotípicos microbiota-dependiente. Por ejemplo, el almacenamiento Acetobacteraceae influencia de los lípidos (triglicéridos) en Drosophila 15-18. Si Acetobacteraceae son más abundantes en las moscas de un vial que en otro 19, moscas isogénicas pueden tener diferentes fenotipos 20. Una solución para el problema de la inconstancia de la microbiota en ratones 14 ha sido en la práctica desde la década de 1960, mediante la introducción de una comunidad definida de 8 especies microbianas dominantes de crías de ratón cada nueva generación (SCHAEDLER alterado la flora),asegurando que cada cachorro está expuesto a los mismos miembros clave de la microbiota del ratón. Esta práctica controla para la composición de la microbiota incluso cuando la microbiota no es el objetivo principal de estudio 32, y establece precedente para garantizar la presencia de microbios clave en una variedad de condiciones experimentales.

Para definir la influencia de microbios en la nutrición Drosophila, varios protocolos para derivar líneas de vuelo axénicos se han desarrollado, incluyendo dechorionation hipoclorito de embriones (ya sea derivados de novo cada generación o mantenido generacionalmente por transferencia a las dietas estériles) y el tratamiento con antibióticos 13. Hay beneficios para diferentes enfoques, tales como la facilidad y rapidez, tanto para el tratamiento de antibióticos y la transferencia en serie, en comparación con un mayor control de las variables de confusión de novo dechorionation (por ejemplo, densidad de huevos, microbios contaminantes residuales, fuera de objetivo efectos antibióticos). Independientemente del método depreparación, introducción de especies microbianas especificados para los embriones permite axénicos cultura de Drosophila con las comunidades ( 'gnotobióticos') definidas. Alternativamente, imitando el uso de la flora SCHAEDLER, esta comunidad podría ser inoculado a los huevos puestos convencionalmente siguientes pasos (6-7 solamente) para garantizar la presencia de microbios de rasgos que influyen en cada vial y evitar las complicaciones de la inconstancia microbiota. A continuación se describe el protocolo para la cría de Drosophila axénicos y gnotobiótico de novo dechorionation de embriones, y para confirmar la presencia de taxones microbianos introducido o contaminantes.

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Protocol

1. cultivo de bacterias (inicio ~ 1 semana antes de recoger los huevos)

  1. Preparar MRS modificado (20) mmrs placas y tubos de caldo (Tabla 1). Verter 20 ml de agar mmrs en cada placa de Petri de 100 mm y se deja enfriar / secar durante la noche, o 5 ml mmrs caldo en tubos de ensayo de 18 mm.
  2. Racha de Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis y L. plantarum en mmrs placas de agar. Incubar Acetobacter la noche a 30 ° C. Incubar Lactobacillus anaeróbicamente mediante la colocación de las placas en un recipiente hermético y la inundación con dióxido de carbono antes de sellar. Incubar a 30 ° C durante la noche.
    Nota: L. brevis colonias pueden no ser visibles hasta 24-48 h. Las placas se pueden almacenar a 4 ° C y las colonias se pueden utilizar para un máximo de 3 semanas.
  3. Dos o tres días antes de transferir los huevos a la dieta dechorionated estéril (sección 5), elegir una sola colonia de la placa mmrs en un tubo de ensayo conmmrs Taining caldo. Acetobacter crecer con agitación y crecer Lactobacillus estáticamente durante 24 horas o hasta que esté turbia, tanto a 30 ° C.

2. Preparar estéril Dieta

  1. Preparar dieta estéril (Tabla 2) en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Microondas la dieta hasta que haya hervido 3 veces secuenciales; mezclar entre cada punto de ebullición.
  2. Colocar el matraz en una placa de agitación para mantener la agitación durante la transferencia de dieta para tubos de centrífuga cónicos. Transferir 7,5 ml de dieta para tubos de 50 ml de centrífuga. Sin apretar tapan los tubos, y colocar en un estante de polipropileno autoclavable cubierta.
  3. Esterilizar dieta marcha utilizando un autoclave a 121 ° C y 15 psi durante 25 min. Retire bastidores del autoclave, y agitar inmediatamente cada bastidor horizontal para asegurar la dieta no se separa durante el enfriamiento. Tenga cuidado de no agitar los bastidores verticalmente para evitar la transferencia de la dieta en la tapa o bordes de los tubos. Deje que se enfríe la dieta en un agitador durante exactamente 45 minutos y seagitar de nuevo la dieta horizontal con la mano.
    Nota: La dieta puede ser almacenado a 4-15 ° C durante un máximo de una semana.
  4. Como alternativa al uso de bastidores autoclavables cubiertos (pasos 2.1-2.3), o para elevar las moscas con dietas que contienen conservante ácido, realice los siguientes pasos:
    1. Preparar dieta líquida 1 L en un matraz de 2 L con una barra de agitación en el matraz. Autoclave la dieta.
    2. Después del autoclave, añadir 10 ml conservante y revolver continuamente sobre una placa de agitación con calefacción. Cuando el agar se ha enfriado a 50-60 ° C, mueva el matraz a una placa de agitación se calienta en un gabinete de seguridad biológica y mantener la temperatura del matraz por calentamiento a 50-60 ° C.
    3. En la cabina de bioseguridad, pipeta ~ 7,5 ml individualmente en tubos cónicos.

3. Preparar las jaulas de ponedoras

  1. Hacer placas de agar de zumo de uva por el horno de microondas 100 ml de agua, levadura 10 g de cerveza, 10 g de glucosa, y 1 g de agar. Llevar a ebullición 3 veces en el paso 1.1 y añadir 10 g de zumo de uva congelada concentrate para aumentar la visibilidad de los huevos en la placa de agar.
  2. Cuando agar se ha enfriado a 55 ° C, se vierte 20 ml en 100 mm placas de Petri y dejar solidificar.
  3. Cubrir la superficie de las placas de agar con una pasta de levadura mediante la mezcla de levadura 1 g de cerveza con 15 g de agua. Verter la pasta de levadura sobre la placa de agar asegurándose de que la superficie está cubierta, y luego verter el exceso, dejando un residuo de levadura fina atrás. Si se utilizan varias placas, la pasta se puede verter secuencialmente a placas múltiples.
  4. Transferir las placas de agar en la parte inferior de una jaula.
    Nota: Un contenedor de 32 oz deli es un buen sustituto para las jaulas de acrílico de la mosca.
    1. Hacer tapas para envases deli 32 oz cortando un agujero en la parte superior y pegando una malla transpirable sobre el agujero con pegamento no tóxico. Si el pegamento es soluble en agua impiden la exposición al agua a la tapa.
  5. Transferencia 200-300 vuela en el recipiente y cubrir con una tapa. Cubrir el agujero protegido por malla con una tapa de caja de Petri vacía para PREVENt evaporación desde la superficie del agar y añadir un pañuelo de papel humedecido dentro de la tapa, si se desea. Incubar las moscas a 25 ° C durante la noche para 16-20 horas.

4. Recoger los huevos

  1. Preparar un tamiz para la recolección de huevos mediante la colocación de malla de nylon en un casquillo de plástico.
  2. Para recuperar la placa con los huevos en ella, eliminar las moscas de la jaula mediante la transferencia a un contenedor vacío. Si moscas mismos serán utilizados al día siguiente, transferir inmediatamente a una nueva jaula que contiene una placa de agar jugo de uva recién yeasted. Las moscas pueden ser utilizados durante 3-5 días secuenciales
  3. Retire las moscas muertas del agar con una brocha limpia, con cuidado de no romper el agar.
  4. Recoger los huevos enjuagando la placa de agar con agua destilada, suavemente cepillado huevos de la superficie de agar, y el vertido de la suspensión sobre la malla. Repita 3-4 veces hasta que todos o la mayoría de los huevos se han retirado de la placa de agar.

5. Dechorionate huevos y transferencia de Estéril DIET

  1. Preparar la cabina de bioseguridad rociando el interior (incluyendo los lados) con 70% de etanol. Limpie la parte inferior con un pañuelo de papel de laboratorio, y esterilizar la campana con luz ultravioleta durante ~ 15 min. Esterilizar todos los suministros no biológicos (muestra tazas, brocha, fórceps, de contenedores de residuos, a 400 ml de agua esterilizada, y 100 ml de hipoclorito de sodio 0,6%) mediante pulverización con etanol y colocar inmediatamente en la cabina de bioseguridad. Esterilizar con luz UV durante 15 minutos.
  2. Iniciar el primero de 2 lavados de hipoclorito de sodio al colocar el casquillo con los huevos en una taza 120 ml de muestras u otro recipiente estéril. Verter lentamente ~ 90 ml de solución de hipoclorito de sodio 0,6% en el casquillo hasta justo debajo del borde.
  3. Enjuague los huevos durante 2,5 minutos. Periódicamente volver a suspender los huevos mediante el uso de pinzas para mover el casquillo hacia arriba y abajo en la solución de hipoclorito.
  4. Transferir el buje directamente en una segunda copa de muestras, precargada con 90 ml de lejía, en el interior de la cabina de bioseguridad.
  5. Repetir5.3 paso dentro de la cabina de bioseguridad. Al final de la segunda tratamiento blanqueador, los huevos deben comenzar a adherirse a los lados de la boquilla.
  6. Llevar a cabo los pasos 5.7 a 5.8 en la cabina de bioseguridad.
  7. Desechar la lejía y lavar el casquillo con agua estéril 3 veces. Vuelva a suspender los huevos varias veces durante cada lavado moviendo el casquillo con fórceps. Al final de la tercera lavado la mayoría de los huevos deben estar unidos al lado del buje.
  8. El uso de un pincel esterilizados en etanol, transferir los huevos desde el lado del buje a la dieta estéril. Transferencia huevos individualmente o en pequeños lotes. Apunta a 30-50 huevos por vial. Deje las tapas flojas para permitir que el oxígeno entre en el tubo. Si viales deben permanecer axénicos, transferir a una incubadora de insectos; de lo contrario, añadir bacterias como a continuación.

6. Hacer gnotobióticos Moscas El uso de 4 especies bacterianas

  1. preparar las bacterias
    1. Preparar una cabina de bioseguridad esterilizada con los suministros necesarios (pipettes, cajas de puntas de pipeta, tubos de centrífuga estériles, caldo MRS y Tubos de ensayo) como en el paso 4.1. Limpiar el exterior de los tubos de ensayo de laboratorio con una toallita empapada con etanol antes de colocar en el gabinete de seguridad biológica.
    2. Sedimentar las bacterias mediante la transferencia de primera 500 l de una noche de crecimiento a un tubo de microcentrífuga estéril. Si la densidad bacteriana es baja, añadir hasta 1,5 ml a cada tubo o secuencialmente eliminar el sobrenadante y añadir la cultura extra para el mismo tubo. Extraer muestras de la cabina de bioseguridad y centrifugar durante 10 min a 10.000 x g. Use puntas con filtro para evitar la contaminación entre muestras.
    3. Determinar la densidad de cada cultivo mediante la medición de OD 600. Si está usando un lector de placas de múltiples pocillos, transferir 200 l de cada cultivo a una placa de 96 pocillos en 1-, 2-, 4- y diluciones.
    4. Determinar la cantidad de mmrs en el que para diluir cada sedimento celular (5.2.2) usando un espectrofotómetro de lectura de placas y las siguientes ecuaciones. Plan para añadir caldo suficiente para inocular 50 y# 956; l a cada vial mosca.
      1. Recoger OD 600 lecturas de un 1: 1, 1: 2, y 1: dilución de cada cultivo bacteriano en un espectrofotómetro de placas de lectura 4. Seleccione la dilución para cada cepa bacteriana que produce un valor de OD 600 entre 0,1 y 0,2, y utilizar este valor y su correspondiente factor de dilución como 'O' y 'D' en las fórmulas dadas en 6.1.4.2 o 6.1.4.3.
      2. Si el uso de las 4 especies descritas aquí, normalizar las células a unidades formadoras de colonias (UFC) equivalentes / ml densidades (OD 600 CFU a la conversión determinado previamente 20) usando la siguiente ecuación:
        E = ((OB) x V x F) / C
        donde E = volumen de sedimento para volver a suspender en (l), O = OD 600 bacterias, B = DO 600 medios de comunicación en blanco, D = plegable dilución, V = l cultivo bacteriano antes de la centrifugación, C = OD 600 de constante predeterminado. Ver Código Suplementario archivo para ejemplos de cálculos utilizando estas ecuaciones. para espectrofotómetros que de forma automática en blanco, utilice "O" en lugar de "OB".
        Nota: Las constantes predeterminadas (unidades de OD 600, normalizados a 10 7 CFU ml -1, constantes derivados en 20) son los siguientes: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
      3. Si se utilizan otras especies bacterianas (sin UFC / 600 OD constante está disponible), a normalizar la densidad de DO600 = 0,1 usando esta ecuación:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 600 OD
        Nota: Las unidades son las mismas que en la etapa 6.1.4.2. Ver Código Suplementario archivo para ejemplos de cálculos utilizando estas ecuaciones.
    5. En la cabina de bioseguridad, eliminar el sobrenadante con una punta de pipeta y resuspender el precipitado en mmrs frescas o PBS según lo calculado en el paso 6.1.4.2.
  2. inocular bacterias
    1. Transferencia de 50 l de las bacterias a los tubos cónicos con una dieta estérild dechorionated huevos en cabina de bioseguridad. Añadir las bacterias después de la transferencia de huevos para evitar la contaminación entre los viales.
    2. Colocar tubos inoculados en una incubadora a 25 ° C.

7. Medir CFU carga / prueba de esterilidad

  1. Para medir la carga de UFC en homogeneizado de moscas enteras cuerpo, la transferencia de 5 moscas (5-7 días después de la eclosión) a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml que contiene 125 l de cuentas de cerámica y 125 l de caldo de RMM. Homogeneizar las moscas utilizando un homogeneizador de tejidos durante 30 segundos a 4.0 m / seg.
    1. Alternativamente, omiten los granos y homogeneizar la mano en tubos de microcentrífuga con manos de mortero de plástico durante 1 min.
    2. Si la cuantificación de la microbiota intestinal, la superficie esterilizar las moscas para eliminar microbios exógenos 22. Transferencia vuela a un tubo de microcentrífuga que contiene 100 l de etanol al 70% durante 1 min, etanol aspirado, y la transferencia a un nuevo tubo de microcentrífuga de homogeneizaciones. Si se mide el contenido de ADN de la tripa, enjuague fo 1 min con hipoclorito de sodio 0,6% antes del lavado de etanol.
  2. Diluir el homogeneizado con 875 mmrs mu l, de vórtice durante 5 segundos, y pipetear 120 l de homogeneizado en el primer pocillo de una placa de microtitulación.
  3. Realice dos secuenciales 1: 8 diluciones utilizando 10 l de homogeneizado y 70 l MRS en los próximos dos pozos.
    1. Retire 10 l desde el primer pozo y añadirlo al segundo pocillo que contiene 70 l MRS. Mezclar el contenido de la segunda bien a fondo, la transferencia de 10 l de la segunda y a la tercera pocillo que contiene 70 l MRS, y mezclar bien. Esto conduce a 3 concentraciones totales del original homogeneizado 1000 l: sin diluir, 1: 8 y 1:64.
  4. Transferencia de 10 l de cada dilución a una placa mmrs (usando una pipeta multicanal si se desea). Ligeramente inclinar el plato para difundir la dilución de varios milímetros abajo de la superficie del agar y permitir que el líquido se seque antes de mover el plato. El líquido se seca en el the placa rápidamente si las placas son 2 días de edad, lo que reduce las gotas de la mezcla de dos vecinos.
  5. Se incuba a 30 ° C durante 1-2 días. Retire las placas de la incubadora una vez diferenciadas, las colonias individuales son visibles, y contar a partir de una dilución con 10-100 colonias aisladas.
  6. Calcula UFC por marcha utilizando la ecuación E = C x D / P x V / F, donde E = UFC por mosca, C = número de colonias contadas, D = dilución, P = plateado l, V = volumen de homogeneizado mosca, y F = número de moscas homogeneizadas.

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Representative Results

El éxito de la cría de moscas axénicos se confirma mediante el aislamiento de ningún UFC de homogeneizaciones de todo el cuerpo de D. adultos melanogaster (Figura 1). Alternativamente, si el homogeneizado chapado produce colonias, los viales están contaminados y deben desecharse. Para moscas gnotobióticos, cada una de las cuatro cepas bacterianas se aislaron a partir de grupos de 5 machos adultos, lo que demuestra las diferencias en las UFC viables totales asociados a las moscas adultas (Figura 1). Cada especie bacteriana tiene una morfología distinta y se pueden distinguir visualmente (Figura 2). Si no se detectan uno o más tipos de colonias puede haber habido errores en la preparación del inóculo bacteriano (por ejemplo, el lavado, la normalización, mezcla) o las especies correspondientes pueden no ser compatibles con las condiciones de cultivo (por ejemplo, la densidad de Drosophila 23 o genotipo 24). Para descartar errores técnicos que recmendamos siembra de una porción de la mezcla bacteriana inmediatamente después de la inoculación de los viales de la mosca (paso 6.2).

Figura 1
Figura 1: Unidades Formadoras de Colonias encontrados en axénicas y gnotobióticos Drosophila El número de unidades formadoras de colonias (UFC) por mosca en homogeneizados de todo el cuerpo de 4-especies gnotobiótico y D. axénicos. melanogaster. La falta de colonias en los homogeneizados axénicos confirma D. esterilidad melanogaster. Los valores se presentan como media ± SEM de 24 valores replicados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Diferenciación bacteriana Colonias. </ strong> UFC de una homogeneización de la muestra que muestra diferentes morfologías para cada una de las 4-especies en el gnotobiotic D. melanogaster. Acetobacter colonias son de color marrón claro una, luz y vienen en diferentes tamaños dependiendo de la especie. ~ 24-36 horas después de la siembra, A. colonias tropicalis son opacos, mientras que A. pomorum es transparente, aunque con el tiempo la diferencia se vuelve menos pronunciada. L. brevis colonias son pequeñas y blancas y L. plantarum colonias son grandes y de color amarillo. Si es necesario, el crecimiento de la homogeneizado se puede comparar con las placas de las bacterias originales para ayudar a distinguir cada tipo de colonia 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Receta mmrs
Cantidad en g notas
Agua destilada 1000
peptona universal 12.5
Extracto de levadura 7.5
Glucosa 20
fosfato dipotásico 2
citrato de amonio 2
Acetato de sodio 5
Sulfato de magnesio 0,1
Sulfato de manganeso 0.05
agar 12 No añadir al caldo

Tabla 1: mmrs receta.

<tr>
Receta de la dieta de levadura-glucosa
Cantidad en g
Agua destilada 500
Levadura 50
Glucosa 50
agar 6

Tabla 2: La levadura-glucosa receta de la dieta.

Código Suplementario Archivo:. Ejemplos de cálculos Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El método descrito aquí es uno de los varios enfoques para dechorionation embrión 8,11,18,25,26,27, junto con otros métodos de crianza de moscas axénicos, incluyendo la transferencia en serie de los adultos axénicos 18,27 o 13,18 tratamiento con antibióticos. Otros métodos incluyen dechorionation lavados de etanol y reducir 11,25,26 o se extienden 8 tratamiento con hipoclorito. Las diferentes etapas de lavado pueden ayudar a la cría de diferentes genotipos de la mosca: en un estudio anterior la mayor parte de ~ 100 genotipos de Drosophila fueron axénicos cuando son criados como se describe aquí (sin lavados de etanol), pero algunas líneas fueron contaminados y descartado 24. Tal vez algunas líneas contaminados habrían sido criados con axénicos si lavados con etanol o tratamiento con hipoclorito más tiempo. Si el método descrito aquí no conduce al aislamiento de las moscas axénicos de genotipos particulares de acogida recomendamos enjuagues etanol o tratamiento de hipoclorito de más tiempo para remediar el problema.

ent "> Cuando se utilizan transferencias en serie de Drosophila, una generación parental axénicos se hace axénicos por dechorionation huevo como se describe aquí, y las generaciones posteriores se mantuvo por transferencia aséptica en una cabina de bioseguridad, con o sin antibióticos 18,27. transferencia de serie es más rápido de derivar moscas axénicos nuevo cada generación, y se transfieren las moscas pueden permanecer axénicos para múltiples generaciones. una de las complicaciones de las transferencias de serie es el mantenimiento de densidades emparejados de moscas convencionales / gnotobiótico y axénicos desde moscas axénicos tienden a poner menos huevos durante un intervalo de tiempo comparables (datos no se muestra). Dado que la densidad Drosophila influye en múltiples rasgos, incluyendo la composición bacteriana en la dieta mosca 23,28,29, la transferencia de los huevos de nuevo cada generación puede ser un enfoque superior para los rasgos de densidad sensible a la mosca. de novo dechorionation también evita la posibilidad de contaminación bacteriana durante transferencias. Por lo tanto, mientras que las transferencias de serie pueden ahorrar tiempo, dechorionation permite un mayor control de las variables que complican.

Los antibióticos también se pueden utilizar para crear moscas axénicos, aunque en contraste con dechorionation, el tratamiento con antibióticos es generalmente insuficiente para eliminar completamente la colonización de microbios 13. Además, los antibióticos pueden influir en el host directamente. Por ejemplo, elevando las moscas en una dieta con antibióticos disminuye su contenido de fecundidad y proteínas, pero estos efectos no se observaron en las moscas planteadas a partir de embriones dechorionated 13. Observamos que los antibióticos son necesarios para eliminar las bacterias endosimbiontes que se transmiten verticalmente y no se ven afectados por la esterilización de superficie, tales como Wolbachia 33.

Varios pasos son críticos para el éxito de la preparación de las moscas axénicos o gnotobióticos dechorionated. En primer lugar, es crucial para sacudir la dieta mosca como en los pasos 2.3. Si los bastidores no son sacudidos por la mano durante unos 15 segundos cada uno antes y después de una exacta45 min de intervalo en el agitador, la levadura y agar se asentará, lo que reduce el acceso de moscas levadura y haciendo que la superficie de agar demasiado blando para el cultivo de la mosca. En segundo lugar, el espesor de la pasta de levadura y la concentración de agar de las placas de jugo de uva influye en la eliminación de huevos (paso 3.3). Una capa delgada producida por una levadura una y cuarto: la dilución en agua evitará que los huevos de empotrar en el agar al enjuagar y eliminar de las placas de los alimentos (paso 4.4). En tercer lugar, si las placas de jugo de uva son demasiado suaves y se rompen durante la recolección de huevos, la firmeza de las placas se puede aumentar mediante la adición de menos concentrado de jugo de uva para el siguiente lote de placas. En cuarto lugar, los rendimientos de huevo son más altas si las moscas tienen 24 horas para aclimatarse al ambiente jaula: esto puede resolverse mediante la colocación de las moscas en la jaula ~ 40 horas antes de la recolección, incluida la transferencia a una nueva jaula de colección con una placa de agar fresco <20 h antes de la fecha de recogida deseada. En quinto lugar, si los huevos no se adhieren a un lado del casquillo durante dechorionation (etapa 5.7), los rinsing período debería ampliarse en 15-30 seg (Precaución: la ampliación del tiempo de enjuague durante demasiado tiempo puede matar a los huevos). Además, la pérdida de huevos en los enjuagues líquidos se puede prevenir mediante la comprobación de la junta de manguito de malla para el cierre completo y verificar que los huevos no se derrame fuera del tamiz durante la re-suspensión. Si el casquillo está bien sellado, huevos derramados se pueden recuperar mediante el vertido de la colada a través del tamiz como el lavado se descarta. En sexto lugar, después de las moscas han eclosionado, una prueba de presunción para determinar si las moscas son axénicos es examinar el color de la dieta. Si las moscas son axénicos, la capa superior de la dieta será de un color café marrón oscuro y no hay burbujas de aire estará presente a lo largo de la dieta. Las burbujas de aire o de color cuero de la capa superior dieta indican la presencia de bacterias. presencia de bacterias aún debe ser confirmado por homogeneización. Alternativamente, la amplificación por PCR del gen 16S rRNA también se puede realizar para detectar microbios unculturable (por ejemplo, anaerobios estrictos) 30. Finalmente, después de homogenzación, cuentas de cerámica pueden reutilizados por balanceo en una solución de hipoclorito + hidróxido de potasio 2% 0,05 M durante 30 minutos, enjuague generosamente (10 veces o más) en H 2 O, de lavar una vez con etanol al 100% (para facilitar el secado), y secado a 65 ° C. Si todos los pasos se siguen cuidadosamente, moscas axénicos deben aislarse cada vez que se realiza el protocolo.

Este trabajo describe un método para volver a asociar embriones de Drosophila estériles con una microbiota 4-especie que es representativa de las comunidades bacterianas de las moscas de laboratorio criados con una dieta de levadura-glucosa. El trabajo previo ha utilizado una comunidad 5-especies, incluyendo las 4 especies de Lactobacillus aquí y fructivorans, que ha sido numéricamente abundante en varias encuestas de moscas de 9,19. Recomendamos omitiendo L. fructivorans por varias razones, entre ellas que los fenotipos en D. melanogaster monoassociated con L. fructivorans son congruentes en gran medida con ph axénicosenotypes 31 y L. fructivorans es más exigente que otra mosca aísla. Si L. fructivorans está incluido, debe ser cultivado como se describe para L. plantarum y L. brevis: cultivo líquido estático; y en un recipiente hermético inundado con CO2 para cultivo sólido (este último paso reduce los niveles de oxígeno del ambiente para apoyar el crecimiento de Lactobacillus).

Los enfoques descritos aquí se pueden variar fácilmente para elevar Drosophila bajo diversas condiciones gnotobióticos. Por ejemplo, monoassociated moscas pueden ser criados por inoculación de embriones de Drosophila estériles con una especie microbiana en un momento 15,25,31. Asociaciones de especies múltiples se forman mediante la inoculación de múltiples especies en proporciones equivalentes 20,24. Aunque hemos proporcionado CFU / OD 600 constantes para cada una de las 4 especies de facilitar la normalización, puede no ser necesario para obtener una constante para la mayoría de las mezclas de especies. yot se había demostrado que la abundancia de microbios en 5-7 adultos DPE no fue significativamente diferente en las asociaciones 2-especies cuando la densidad de partida de las bacterias se varió más de tres órdenes de magnitud 20. Además, el intestino Drosophila es altamente permisiva, y muchas especies que son fácilmente cultivadas en dieta mosca puede asociar con Drosophila a altas densidades en monoassociation (por ejemplo, E. coli, B. subtilis 25) que permiten la disección genética de influencia microbiana por los microbios con amplia recursos genéticos y genómicos. Por último, los estudios de fenotipos de Drosophila que son influenciados por la microbiota podría adaptar el enfoque de una alteración en la flora Schaedler en ratones mediante la inoculación de los huevos convencionales establecidos de forma natural con una comunidad microbiana definido para asegurar que cada vial tiene acceso a un conjunto específico de los microbios.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Algunos detalles de este protocolo se han optimizado con la ayuda del Dr. Adam Dobson, quien también proporcionó útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación para los Institutos Nacionales de Salud (FNIH) el número de concesión R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, y AED). FNIH número de concesión 1F32GM099374-01 (PDN), y Brigham Young University capital inicial (JMC, MLK, MV). gastos de publicación fueron apoyados por el Colegio Brigham Young University of Life Sciences y el Departamento de Ciencias de la flora y la fauna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
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Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
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50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

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References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Biología del Desarrollo No. 113 axénicos gnotobiótico, Microbioma la microbiota,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

La cría de la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bajo axénicos y Condiciones gnotobióticos
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Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

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