Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Uppfödning bananfluga Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54219
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,4, 2,5, 2,3, 1,2
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

ERRATUM NOTICE

Summary

En metod för uppfödning Drosophila melanogaster enligt axenisk och gnotobiotiska villkor presenteras. Fly embryon dechorionated natriumhypoklorit, överfördes aseptiskt till sterila diet, och föds upp i slutna behållare. Ympning kost och embryon med bakterier leder till gnotobiotiska föreningar, och bakteriell närvaro bekräftas genom plätering hela kroppen Drosophila homogen.

Introduction

De flesta djur är intimt förknippade med bakterier (mikroorganismer) från födseln till döden 1. Jämförelser av mikroorganismer fria (axenisk ") och mikroorganismassocierade (" konventionella ") djur har visat mikrober påverkar olika aspekter av djurhälsa, inklusive metaboliska, näringsmässiga, vaskulär, lever-, respiratoriska, immunologiska, endokrina och neurologisk funktion 2. Bananflugan Drosophila melanogaster är en viktig modell för att förstå många av dessa processer i närvaro av mikrober 3,4 och för att studera mikrobiota inverkan på djurhälsa 5,6. Inga bakteriearter finns i varje individ ( "kärna"), men Acetobacter och Lactobacillus arter dominerar numeriskt mikrobiota av både laboratorie uppfödda och vildfångad D. melanogaster. Andra Acetobacteraceae (inklusive Komagataeibacter och Gluconobacter), Firmicutes (t.ex. Enterococcus och Leuconostoc), och Enterobacteriaceae är antingen ofta förekommer i Drosophila individer med låg förekomst, eller oregelbundet närvarande vid hög förekomst 7-12.

Mikrobiota av Drosophila och däggdjur obeständig inom och mellan generationer 14,19. Mikrobiota förgänglighet kan leda till fenotypisk buller vid mätning mikrobiota beroende egenskaper. Till exempel Acetobacteraceae inflytande lipid (triglycerider) lagring i Drosophila 15-18. Om Acetobacteraceae är mer rikligt i flugor i en flaska än i en annan 19, kan isogena flugor ha olika fenotyper 20. En lösning på problemet med mikrobiota förgänglighet i möss 14 har i praktiken sedan 1960-talet, genom att införa en definierad gemenskap av 8 dominerande mikrobiella arter mus valpar varje ny generation (förändrad Schaedler flora),se till att varje valp utsätts för samma nyckelpersoner i musen mikroorganismer. Denna praxis kontroller för mikrobiota sammansättningen även när mikrobiota är inte det primära målet för studien 32, och sätter prejudikat för att säkerställa förekomsten av viktiga mikrober i en mängd olika experimentella betingelser.

För att definiera påverkan av mikrober på Drosophila näring har flera protokoll för att härleda axenisk fluglinor utvecklats, bland annat hypoklorit dechorionation av embryon (antingen härrör de novo varje generation eller underhålls generationally genom överföring till sterila dieter) och antibiotikabehandling 13. Det finns fördelar för olika metoder, såsom lätthet och snabbhet för både av antibiotika behandling och seriell överföring, jämfört med större kontroll över störande variabler med de novo dechorionation (t.ex. ägg densitet, restkontaminerande mikrober, off-target antibiotika effekter). Oberoende av metoden förberedning, införandet av specificerade mikrobiella arter axenisk embryon tillåter odling av Drosophila med definierade ( "gnotobiotiska) samhällen. Alternativt imitera användningen av Schaedler flora, denna gemenskap kan ympas till konventionellt som ägg (efter steg 6-7) för att säkerställa närvaron av egenskapspåverkande mikrober i varje flaska och undvika komplikationer av mikrobiota förgänglighet. Här beskriver vi protokoll för att höja axenisk och gnotobiotisk Drosophila av de novo dechorionation av embryon, och för att bekräfta närvaron av infört eller kontaminerande mikrobiella taxa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kultur Bakterier (Start ~ 1 vecka innan plocka ägg)

  1. Förbered modifierad MRS 20 (mMRS) plattor och buljong rör (Tabell 1). Häll 20 ml mMRS agar i varje 100 mm petriplatta och låt svalna / torka över natten, eller 5 ml mMRS buljong i 18 mm provrör.
  2. Strimma Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, och L. plantarum på mMRS agarplattor. Inkubera Acetobacter natten vid 30 ° C. Inkubera Lactobacillus anaerobt genom att placera plattorna i en lufttät behållare och översvämningar med koldioxid före försegling. Inkubera vid 30 ° C över natten.
    Obs: L. brevis kolonier syns inte förrän 24-48 timmar. Plattorna kan lagras vid 4 ° C och kolonier kan användas i upp till 3 veckor.
  3. Två till tre dagar innan överföring dechorionated ägg till steril diet (avsnitt 5), plocka en enda koloni från mMRS plattan i ett provrör conTaining mMRS buljong. Väx Acetobacter med skakning och växa Lactobacillus statiskt under 24 timmar eller tills grumlig, både vid 30 ° C.

2. Förbered Steril Diet

  1. Förbereda steril diet (tabell 2) i en 2 L Erlenmeyer-kolv. Mikrovågsugn dieten tills den har kokat 3 sekventiella gånger; blanda i mellan varje koka.
  2. Placera kolven på en omrörningsplatta för att upprätthålla omröring samtidigt överföra diet till koniska centrifugrör. Överför 7,5 ml av dieten till 50 ml centrifugrör. Löst lock rören, och plats i en täckt, autoklaverbar polypropylen rack.
  3. Sterilisera fluga diet med användning av en autoklav vid 121 ° C och 15 psi under 25 min. Ta bort rack från autoklav, och omedelbart skaka varje rack horisontellt för att säkerställa diet separerar inte under kylning. Var noga med att inte skaka rack vertikalt för att förhindra överföring av diet på locket eller fälgar av rören. Tillåt kosten svalna på en skakanordning under exakt 45 min ochåterigen skaka diet horisontellt för hand.
    Obs: Diet kan förvaras vid 4-15 ° C i upp till en vecka.
  4. Som ett alternativ till att använda omfattas autoklaver rack (steg från 2,1 till 2,3), eller att höja flugor på dieter som innehåller syra konserveringsmedel, utföra följande steg:
    1. Förbereda ett L flytande diet i en 2 L kolv med en omrörarstav i kolven. Autoklavera dieten.
    2. Efter autoklavering, tillsätt 10 ml konserveringsmedel och rör om kontinuerligt på en uppvärmd omrörarplatta. När agar har kylts till 50-60 ° C, flytta kolven till en uppvärmd omrörarplatta i en biosäkerhet skåp och bibehålla kolvtemperaturen genom upphettning vid 50-60 ° C.
    3. I biosäkerhet skåp, pipett ~ 7,5 ml individuellt i koniska rör.

3. Förbered äggläggning Burar

  1. Gör druvsaft agarplattor genom mikrovågsugnen 100 ml vatten, 10 g öljäst, 10 g glukos och 1 g agar. Koka upp 3 gånger i steg 1,1 och 10 g fryst druvsaft concentrate att öka synligheten av ägg på agarplattan.
  2. När agar har svalnat till 55 ° C, häll 20 ml i 100 mm petriskålar och låt stelna.
  3. Täcka ytan av agarplattorna med en jäst pasta genom att blanda 1 g bryggerijäst med 15 g vatten. Häll jäst pasta på agarplattan och se till att ytan är täckt, häll sedan bort överskottet, vilket ger en tunn jäst rester efter sig. Om flera plattor används, kan pastan sekventiellt hälldes till flera plattor.
  4. Överföra agarplattor in i bottnen av en bur.
    Obs: En 32 oz deli behållare är ett bra substitut för akryl flyga burar.
    1. Gör lock för 32 oz deli behållare genom att skära ett hål i toppen och limma en ventilerande mesh över hålet med giftfri lim. Om limmet är vattenlösliga förhindra att vatten exponering för locket.
  5. Transfer 200-300 flyger in i behållaren och täck med lock. Täck mesh-skyddade hål med en tom petriskål lock för att Prevent avdunstning från agarytan och lägg en fuktig mjukpapper på insidan av locket om så önskas. Inkubera flugor vid 25 ° C över natten för 16-20 timmar.

4. Samla Ägg

  1. Förbered en sil för insamling av ägg genom att placera nylonnät i en plastbussning.
  2. Att hämta plattan med ägg på den, ta bort flugor från buren genom överföring till en tom behållare. Om samma flugor kommer att användas nästa dag, omedelbart överföra till en ny bur som innehåller en nyligen yeasted druvsaft agarplatta. Flugor kan användas för 3-5 sekventiella dagar
  3. Ta bort döda flugor från agar med en ren pensel, var noga med att inte bryta upp agar.
  4. Samla in ägg genom att skölja agarplatta med destillerat vatten, försiktigt borsta ägg från agarytan och hälla slammet över nätet. Upprepa 3-4 gånger tills alla eller de flesta av äggen har tagits bort från agarplattan.

5. Dechorionate ägg och överföring till sterila Diet

  1. Förbereda biosäkerhet skåpet genom sprutning insidan (inklusive sidor) med 70% etanol. Torka av botten med en lab vävnad och sterilisera huva med UV-ljus under ~ 15 min. Sterilisera alla icke-biologiska leveranser (provkoppar, pensel, tång, avfallsbehållare, 400 ml sterilt vatten och 100 ml 0,6% natriumhypoklorit) genom besprutning med etanol och omedelbart placeras i biosäkerhet skåpet. Sterilisera med UV-ljus under 15 min.
  2. Starta första av 2 natriumhypoklorit tvättar genom att placera bussningen med äggen i en 120 ml provbägaren eller annan steril behållare. Häll långsamt ~ 90 ml 0,6% natriumhypokloritlösning in i bussningen tills strax under kanten.
  3. Skölj ägg för 2,5 minuter. Periodvis återsuspendera ägg genom att använda pincett för att flytta bussningen uppåt och nedåt i hypokloritlösning.
  4. Överför bussningen direkt till en andra provbägaren, förfylld med 90 ml blekmedel, inuti biosäkerhet skåpet.
  5. Upprepasteg 5,3 inuti biosäkerhet skåpet. Vid slutet av den andra blekmedel behandling bör äggen börja följa sidorna av genomföringen.
  6. Utför steg 5,7-5,8 i biosäkerhet skåpet.
  7. Kasta blekmedel och tvätta bussningen med sterilt vatten 3 gånger. Återsuspendera äggen flera gånger under varje tvätt genom att flytta bussningen med pincett. Vid utgången av det tredje tvätt flesta ägg bör fästas vid sidan av bussningen.
  8. Med användning av en pensel steriliseras i etanol, överföra ägg från sidan av bussningen till den sterila dieten. Överföra individuellt eller i små serier ägg. Sikta på 30-50 ägg per flaska. Låt locken löst för att tillåta syre att komma in i röret. Om flaskor ska förbli axenisk, överföring till en insekt inkubator; annars, lägga bakterier enligt nedan.

6. Gör gnotobiotiska Flugor Använda 4 bakterieart

  1. förbereda Bakterier
    1. Förbered en steriliserad biosäkerhet skåp med nödvändiga förnödenheter (pipettes, pipettspetsar lådor, steriliserade centrifugrör, MRS-buljong och provrörsställ) som i steg 4,1. Torka utsidan av provrör med en etanolindränkt laboratorium torka innan de placeras i biosäkerhet skåp.
    2. Pelle bakterierna genom att först överföra 500 pl odling över natten till ett sterilt mikrofugrör. Om bakteriell densitet är låg, lägga till upp till 1,5 ml till varje rör eller sekventiellt avlägsna supernatanten och lägga till extra kulturen till samma rör. Ta prover från biosäkerhet skåpet och centrifugera i 10 min vid 10000 x g. Använd filter tips för att undvika kontaminering mellan prover.
    3. Bestämma densiteten av varje kultur genom att mäta OD 600. Vid användning av en platta med flera brunnar läsare, överföra 200 fil av varje kultur till en 96-brunnars platta i 1-, 2-, och 4- faldiga spädningar.
    4. Bestämma mängden mMRS där att späda varje cell pellet (5.2.2) med användning av en plattläsande spektrofotometer och följande ekvationer. Planerar att lägga tillräckligt med buljong för att ympa 50 &# 956; l till varje fluga flaskan.
      1. Samla in OD 600 avläsningar för en 1: 1, 1: 2, och 1: 4 spädning av varje bakteriekultur på en plåt-läsning spektrofotometer. Välj utspädning för varje bakteriestam som producerar ett OD 600 värde mellan 0,1 och 0,2 och använda detta värde och dess motsvarande utspädningsfaktor "O" och "D" i formlerna i 6.1.4.2 eller 6.1.4.3.
      2. Om du använder de 4 arter som beskrivs här, normalisera celler till motsvarande kolonibildande enhet (CFU) / ml densitet (OD 600 till CFU konvertering bestäms tidigare 20) med hjälp av denna ekvation:
        E = ((OB) x V x D) / C
        där E ​​= volym för att resuspendera pelleten i (l), O = OD 600 bakterier, B = OD 600 tomma media, D = faldig utspädning, V = il bakteriekultur före centrifugering, C = OD 600 av förutbestämd konstant. Se Kompletterande kodfil för exempel på beräkningar med dessa ekvationer. för spektrofotometers som automatiskt tom, använder "O" i stället för "OB".
        Obs: De förutbestämda konstanter (enheter OD 600, normaliserat till 10 7 CFU ml -1, konstanter härrör i 20) är följande: A. tropic (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Om du använder andra bakteriearter (ingen CFU / OD 600 konstant är tillgänglig), normalisera densitet OD600 = 0,1 med hjälp av denna ekvation:
        E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600
        Obs: Enheterna är densamma som i steg 6.1.4.2. Se Kompletterande kodfil för exempel på beräkningar med dessa ekvationer.
    5. I biosäkerhet skåp, ta bort supernatanten med en pipett spets och suspendera pelleten i färskt mMRS eller PBS som beräknats i steg 6.1.4.2.
  2. inokulera Bakterier
    1. Överför 50 ul av bakterierna till koniska rör med steril diet end dechorionated ägg i biosäkerhet skåp. Lägg bakterier efter ägg överföring för att förhindra kontaminering mellan flaskor.
    2. Placera inokulerade rören i en inkubator vid 25 ° C.

7. Mät CFU Load / test för sterilitet

  1. För att mäta CFU belastning i hela kroppen flyga homogenat, överföring 5 flugor (5-7 dagar efter eclosion) och en 1,7 ml mikrofugrör innehållande 125 ul av keramiska kulor och 125 pl mMRS buljong. Homogenisera flugor med användning av en vävnadshomogenisator under 30 sekunder vid 4,0 m / sek.
    1. Alternativt utelämna pärlor och handhomogenisera i mikrocentrifugrör med plast pestles för en minut.
    2. Om kvantifiera tarmfloran, yta sterilisera flugorna att avlägsna exogena mikrober 22. Transfer flyger till ett mikrocentrifugrör innehållande 100 pl 70% etanol under 1 minut, aspirera etanol, och förflyttas till en ny mikrocentrifugrör för homogenizations. Om DNA-innehållet i tarmen kommer att mätas, skölj feller en min med 0,6% natriumhypoklorit före etanoltvätt.
  2. Späd homogenatet med 875 pl mMRS, virvel i 5 sekunder, och pipettera 120 l av homogenatet i den första brunnen i en mikrotiterplatta.
  3. Utför två sekventiella 1: 8 utspädningar med hjälp av 10 pl homogenat och 70 pl MRS under de närmaste två brunnar.
    1. Ta bort 10 pl från den första brunnen och lägg till den andra brunnen innehållande 70 pl MRS. Blanda innehållet i den andra brunnen noggrant, överföring 10 pl från den andra brunnen till den tredje brunn innehållande 70 pl MRS, och blanda väl. Detta leder till 3 totalt koncentrationer av den ursprungliga 1000 il homogenat: outspädda, 1: 8 och 1:64.
  4. Överföring 10 fil av varje spädning till en mMRS platta (med användning av en flerkanalig pipett om så önskas). Något luta skålen att sprida utspädning flera millimeter ner agarytan och tillåta vätska att torka innan du flyttar plattan. Vätskan torkar på the platta snabbt om plattorna är 2 dagar gamla, minska blandning av två angränsande droppar.
  5. Inkubera vid 30 ° C under 1-2 dagar. Ta plattor från inkubatorn gång distinkta, individuella kolonier är synliga, och räkna från en utspädning med 10-100 isolerade kolonier.
  6. Beräkna CFU per farten med hjälp av ekvationen E = C x D / P x V / F, där E = CFU per fluga, C = antal räknade kolonier, D = utspädnings, P = l pläterade, V = volymen av flyg homogenatet, och F = antalet flugor homogeniserats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Framgångsrik uppfödning av axenisk flugor bekräftas genom isolering av någon CFU från hela kroppen homogenizations av D. melanogaster vuxna (Figur 1). Alternativt, om det pläterade homogenatet ger kolonier, är flaskorna förorenade och måste kasseras. För gnotobiotiska flugor, var och en av de fyra bakterieisolat isolerades från pooler av 5 vuxna hannar, vilket visar skillnader i totala viabla CFUs associerade med vuxna flugor (Figur 1). Varje bakteriearter har en distinkt morfologi och kan urskiljas visuellt (Figur 2). Om en eller flera kolonityper som inte upptäcks kan det ha varit fel att förbereda den bakteriella inokulatet (t.ex. tvättning, normalisering, blandning) eller motsvarande arter kanske inte är kompatibla med odlingsbetingelser (t.ex. Drosophila densitet 23 eller genotyp 24). För att utesluta tekniska fel vi recderar plätering av ett parti av den bakteriella blandningen omedelbart efter inokulering flyga vialer (steg 6,2).

Figur 1
Figur 1: kolonibildande enheter hittades i axenisk och gnotobiotiska Drosophila Antalet kolonibildande enheter (CFU) per fluga i hela kroppen homogenat av 4 arter gnotobiotisk och axenisk D.. melanogaster. Brist på kolonier i axenisk homogen bekräftar D. melanogaster sterilitet. Värden presenteras som medelvärde ± SEM av 24 likadana värden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Skilja kolonier. </ strong> CFU från en prov homogenisering visar olika morfologier för var och en av de 4-arterna i gnotobiotisk D. melanogaster. Acetobacter kolonier är en klar, ljusbrun färg och finns i olika storlekar beroende på art. ~ 24-36 timmar efter plätering, A. tropic kolonier är ogenomskinliga, medan A. pomorum är transparent, men med tiden skillnaden blir mindre uttalad. L. brevis kolonier är små och vita och L. plantarum kolonier är stora och gula. Om det behövs, tillväxt från homogenatet kan jämföras med de ursprungliga bakterieplattorna för att skilja varje typ av koloni 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

mMRS Recept
Belopp i g Anmärkningar
Destillerat vatten 1000
Universal Pepton 12,5
Jästextrakt 7,5
Glukos 20
dikaliumfosfat 2
aMMONIUMCITRAT 2
Natriumacetat 5
magnesiumsulfat 0,1
mangan~~POS=TRUNC 0,05
agar 12 Inte lägga till buljong

Tabell 1: mMRS recept.

<tr>
Jäst-glukos diet recept
Belopp i g
Destillerat vatten 500
Bryggarens jäst 50
Glukos 50
agar 6

Tabell 2: Jäst-glukos diet recept.

Kompletterande kodfil. Beräkningsexempel Klicka här för att ladda ner filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metod som beskrivs här är en av flera metoder för embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, tillsammans med alternativa metoder för uppfödning axenisk flugor, inklusive seriell överföring av axenisk vuxna 18,27 eller antibiotikabehandling 13,18. Andra dechorionation metoder inkluderar etanol tvättar och minska 11,25,26 eller förlänga 8 hypoklorit behandling. Olika tvättsteg kan underlätta uppfödning olika flyga genotyper: i en tidigare studie flesta av ~ 100 Drosophila genotyper var axenisk när uppfödda som beskrivs här (utan etanol tvättar), men vissa linjer förorenat och kasseras 24. Kanske några förorenade linjer skulle ha varit axenisk om uppfödda med etanol tvättar eller längre hypoklorit behandling. Om metoden som beskrivs här inte leder till isolering av axenisk flugor för särskilda värd genotyper rekommenderar vi etanolsköljningar eller längre hypoklorit behandling för att åtgärda problemet.

ent "> När seriella överföringar av Drosophila används är en föräldra axenisk generation gjort axenisk av ägg dechorionation som beskrivs här, och senare generationer upprätthålls genom aseptisk överföring i en biosäkerhet skåp, med eller utan antibiotika 18,27. Seriell överföring är snabbare än att härleda axenisk flugor nytt varje generation, och överfördes flugor kan förbli axenisk för flera generationer. en komplikation av serieöverföringar är att upprätthålla matchade densiteter av konventionella / gnotobiotisk och axenisk flugor sedan axenisk flugor tenderar att lägga färre ägg än en jämförbar tidsintervall (data inte visad). Sedan Drosophila densitet påverkar flera egenskaper, inklusive bakteriella kompositionen in fly diet 23,28,29, överföra äggen på nytt varje generation kan vara en överlägsen metod för gylfdensitetskänsliga egenskaper. de novo dechorionation undviker också risken för bakteriell kontaminering under överföringar. medan serieöverföringar kan spara tid, dechorionation tillåter mer kontroll över komplicerande variabler.

Antibiotika kan också användas för att skapa axenisk flugor, men i motsats till dechorionation, är vanligen otillräcklig för att helt ta bort koloniserande mikrober 13 antibiotikabehandling. Dessutom kan antibiotika påverka värden direkt. Till exempel, höja flugor på en diet med antibiotika minskar deras fruktsamhet och proteininnehåll, men dessa effekter observerades inte i flugor som kommer från dechorionated embryon 13. Vi noterar att antibiotika är nödvändiga för att eliminera endosymbiotiska bakterier som överförs vertikalt och inte påverkas av ytan sterilisering, såsom Wolbachia 33.

Flera steg är avgörande för framgång för framställning dechorionated axenisk eller gnotobiotiska flugor. För det första är det viktigt att skaka flugan kosten som i steg 2.3. Om gallren inte skakas för hand under ca 15 sekunder vardera före och efter en exakt45 minuters intervall på shaker, kommer jäst och agar reglera, minska flyga tillgång till jäst och göra agarytan för mjuk för att flyga kultur. För det andra, tjockleken av jäst pasta och agar koncentrationen av druvjuice plattor påverkar ägg bort (steg 3,3). Ett tunt lager produceras av en 01:15 jäst: vatten utspädning förhindrar ägg från inbäddning i agar vid sköljning och ta bort från livsmedel plattor (steg 4,4). För det tredje, om druvjuice plattorna är alltför mjuk och bryta upp under insamling av ägg, kan ökad fasthet av plattor genom att lägga mindre druvjuicekoncentrat till nästa omgång av plattor. Fjärde, ägg avkastningen är högre om flugor har 24 timmar för att vänja sig vid buren miljö: detta kan lösas genom att placera flugor i buren ~ 40 timmar i förväg för insamling, inklusive transfer till en ny kollektion bur med en ny agarplatta <20 h före önskat hämtningsdatum. Femte, om äggen inte håller sig till den sida av bussningen under dechorionation (steg 5,7), de Rinsing period bör förlängas med 15-30 sek (Varning: förlängning av sköljtiden för lång kan döda ägg). Dessutom kan ägg förlust till de flytande sköljningar förhindras genom att kontrollera mask bussning tätning för fullständig stängning och kontrollera att äggen inte spilla utanför sikten under resuspension. Om bussningen är väl tillsluten, kan spilld ägg återvinnas genom att hälla tvätt genom sikten som tvätt kastas. Sjätte, efter flugor har kläckts, en presumtiv test för att avgöra om flugorna är axenisk är att undersöka färgen på diet. Om flugorna är axenisk, kommer det översta lagret av kosten vara en mörkbrun kaffe färg och inga luftbubblor kommer att vara närvarande under hela dieten. Luftbubblor eller ljusbrun färg på den övre kost skiktet indikerar bakteriell närvaro. Bakteriell närvaro bör ändå bekräftas genom homogenisering. Alternativt, kan också utföras PCR-amplifiering av 16S rRNA-genen för att detektera unculturable mikrober (t.ex. strikta anaerober) 30. Slutligen, efter homogensering, keramiska pärlor kan återanvändas genom att gunga i en lösning av 2% hypoklorit + 0,05 M kaliumhydroxid under 30 min, sköljning generöst (10 gånger eller mer) i H2O, tvättning en gång med 100% etanol (för att underlätta torkning), och torkning vid 65 ° C. Om alla steg följs noggrant, bör axenisk flugor isoleras varje gång protokollet utförs.

Detta arbete beskriver en metod för åter associera sterila Drosophila embryon med en 4-art mikrobiota som är representativ för de bakteriella samhällen laboratorie flugor upp på en jäst-glukos diet. Tidigare arbete har använt en 5-art gemenskap inklusive 4-arter här och Lactobacillus fructivorans, som har varit numerärt rikligt i flera flyga undersökningar 9,19. Vi rekommenderar att utelämna L. fructivorans av flera skäl, bland annat att fenotyper i D. melanogaster monoassociated med L. fructivorans är till stor del kongruenta med axenisk phenotypes 31 och L. fructivorans är mer kräsna än andra fluga isolat. Om L. fructivorans ingår, bör det odlas såsom beskrivits för L. plantarum och L. brevis: statisk vätskekultur; och i en lufttät behållare översvämmad med CO2 för fast kultur (det senare steget minskar omgivande syrenivåer för att stödja Lactobacillus tillväxt).

Tillvägagångssätten som beskrivs här kan lätt varieras för att höja Drosophila enligt olika gnotobiotiska betingelser. Till exempel, monoassociated flugor kan födas upp genom ympning sterila Drosophila embryon med en mikrobiella arter i taget 15,25,31. Föreningar med flera arter bildas genom ympning flera arter i motsvarande förhållanden 20,24. Även om vi tillgänglig CFU / OD 600 konstanterna för var och en av de 4-arter för att underlätta normalisering, kan det inte vara nödvändigt att härleda en konstant för de flesta arter blandningar. jagt har tidigare visat att förekomsten av mikrober i 5-7 DPE vuxna var inte signifikant annorlunda i föreningar 2-arter när starttäthet av bakterier varierades över tre storleksordningar 20. Dessutom är mycket tillåtande Drosophila tarmen, och många arter som är lätt odlas på fluga kost kan associera med Drosophila vid höga tätheter i monoassociation (t.ex. E. coli, B. subtilis 25) som möjliggör genetisk dissektion av mikrobiell påverkan av mikrober med omfattande genetiska och iska resurser. Slutligen, studier av Drosophila fenotyper som påverkas av mikrobiota kan anpassa tillvägagångssätt Förändrad Schaedler Flora i möss genom inokulering naturligt som konventionella ägg med en definierad mikrobiell samfundet att varje flaska har tillgång till en specifik uppsättning av mikrober.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vissa detaljer i detta protokoll har optimerats med hjälp av Dr Adam Dobson, som också värdefulla kommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöddes av Stiftelsen för National Institutes of Health (FNIH) licensnummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD och AED). FNIH licensnummer 1F32GM099374-01 (PDN), och Brigham Young University startmedel (JMC, MLK, MV). Kostnader för publicering stöddes av Brigham Young University College of Life Sciences och Institutionen för växt- och djurliv Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002 http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0&mode=match%20partialmax&lang=
en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match
%20partialmax&lang=en&region
=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Utvecklingsbiologi axenisk gnotobiotisk, mikroorganismer,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 08/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Uppfödning bananfluga<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under axenisk och gnotobiotiska Villkor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A.… More

Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C. N., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter