Introduction
Alimentatori sospensione bentonici giocano un ruolo essenziale nel funzionamento degli ecosistemi marini 1. Filtrando grandi volumi di acqua 2,3, rimuovono e espellono particolato (plancton e detriti) e composti disciolti 1 (e riferimenti) e sono un importante agente di bentonica-pelagica accoppiamento 4,5 e il ciclo dei nutrienti 6,7. Misurare accuratamente la presenza di particelle e composti disciolti rimossi ed escreto dal alimentatori sospensione bentonici (come spugne, ascidie, policheti, e bivalvi) è fondamentale per capire la loro fisiologia, metabolismo, e l'ecologia alimentazione. Insieme con pompaggio misurazione della frequenza, ma consente anche una quantificazione dei flussi di nutrienti mediate da questi organismi e il loro impatto ecologico sulla qualità delle acque, nonché sui processi scala ecosistema.
La scelta del metodo appropriato di misurazione di rimozione e di produzione tassi di particolato e com discioltochili di sospensione filtratori è fondamentale per ottenere dati affidabili relativi alla loro attività di alimentazione 8. Come sottolineato da Riisgård e altri, non appropriate metodologie di polarizzazione risultati, falsare le condizioni sperimentali, la produzione di stime errate di ingestione ed escrezione di determinate sostanze, e può portare a quantificazione errata dei flussi di nutrienti elaborati da questi organismi.
I due metodi più frequentemente utilizzati per misurare le particelle e flussi di nutrienti disciolti in filtratori coinvolgere sia incubazione (tecniche indirette) o la raccolta simultanea di ambiente e acqua espirata (tecniche dirette). Tecniche di incubazione si basano sulla misura della velocità di variazione della concentrazione di particelle e nutrienti disciolti nell'acqua incubate, e stima dei tassi di produzione o rimozione rispetto ai controlli adeguati 8. Tuttavia, allegando un organismo in una camera di incubazione può modificare la sua Feeding e pompaggio comportamento a causa di cambiamenti nel regime di flusso naturale, a causa di un calo di ossigeno e / o della concentrazione di cibo, o a causa di accumulo di composti di escrezione del 7,9 acqua incubazione (e riferimenti). Oltre agli effetti di isolamento e fornitura di acqua modificato, una grande polarizzazione di tecniche di incubazione deriva da effetti ri-filtrazione (vedi ad esempio 10). Sebbene alcuni di questi problemi metodologici sono stati superati utilizzando il giusto volume e la forma del recipiente di incubazione 11 o con l'introduzione di un sistema di campana ricircolo in situ 12, questa tecnica spesso sottostima asportazione e di produzione. Quantificare il metabolismo dei composti disciolti quali azoto organico disciolto (DON) e carbonio (DOC) o nutritivi inorganici, ha dimostrato di essere particolarmente inclini a distorsioni causate da tecniche di incubazione 13.
Alla fine degli anni '60 e primi anni '70, Henry Reiswig9,14,15 aperto la strada all'applicazione di tecniche dirette per quantificare la rimozione di particelle da giganti spugne caraibiche, campionando separatamente l'acqua inspirato ed espirato dagli organismi in situ. A causa della difficoltà di applicare la tecnica di Reiswig su sospensivori piccole e in condizioni subacquee più impegnative, la maggior parte della ricerca in questo campo è stata limitata al laboratorio (in vitro) impiegando lo più tecniche di incubazione indirette 16. Yahel e colleghi rimontati Reiswig di diretta in situ tecnica di lavorare in condizioni di minori dimensioni. Il loro metodo, chiamato Inex 16, si basa sul campionamento simultaneo subacquea dell'acqua per via inalatoria (In) e esalato (Ex) da organismi indisturbati. La diversa concentrazione di una sostanza (ad esempio, batteri) tra una coppia di campioni (INEX) fornisce una misura della ritenzione (o produzione) della sostanza da parte dell'animale. La tecnica Inex impiega tubi aperti esi basa sul jet excurrent prodotte dall'attività di pompaggio dell'organismo studiata per sostituire passivamente all'acqua ambiente nel tubo di raccolta. Mentre Yahel e colleghi hanno applicato con successo questa tecnica per lo studio di oltre 15 sospensione di diversi alimentatori taxa (ad esempio, 17), il metodo è vincolato per l'elevato livello di pratica e l'esperienza necessarie, dalla dimensione minuscola di alcuni orifizi excurrent, e condizioni del mare.
Per superare questi ostacoli, abbiamo sviluppato una tecnica alternativa basata su aspirazione controllata dell'acqua campionato attraverso tubi minute (diametro esterno <1,6 mm). Il nostro scopo era quello di creare un dispositivo semplice, affidabile ed economico che consenta pulita e controllata in campionamento dell'acqua situ da un punto molto specifico, come l'orifizio excurrent di alimentatori sospensione bentonici. Per essere efficace, il metodo deve essere non-intrusivo in modo da non influenzare il regime di flusso ambiente o modificare il behavior degli organismi studiati. Il dispositivo presentato qui è chiamato VacuSIP. È una semplificazione del sistema SIP sviluppato da Yahel et al. (2007) 18 per il campionamento punto ROV-based nel mare profondo. Il VacuSIP è notevolmente più conveniente che il SIP originale ed è stato adattato per il lavoro SCUBA-based. Il sistema è stato progettato secondo i principi presentati e testati da Wright e Stephens (1978) 19 e Møhlenberg e Riisgård (1978) 20 per le impostazioni di laboratorio.
Sebbene il sistema VacuSIP stato progettato per studi situ del metabolismo di alimentatori sospensione bentonici, può essere utilizzato anche per studi di laboratorio e ovunque sia richiesto un campione di acqua da sorgente puntiforme controllata e pulita. Il sistema è particolarmente utile quando è richiesto l'integrazione per periodi prolungati (min-ore) o in filtrazioni situ. Il VacuSIP è stato utilizzato con successo presso il laboratorio Yahel a partire dal 2011, e ha anchestato impiegato in due recenti studi dei flussi di nutrienti mediati da specie di spugne caraibiche e mediterranee 21 (Morganti et al. submitted).
L'utilizzo di campionatori specifici, la durata di campionamento prolungato, e le condizioni del campo, in cui si applica VacuSIP, comporta alcune differenze rispetto a protocolli standard di oceanografici per la raccolta, il filtraggio e la conservazione dei campioni per analiti sensibili. Per ridurre il rischio di contaminazione da parte del sistema VacuSIP o il rischio di modificazione dell'acqua campionata dall'attività batterica dopo la raccolta, abbiamo testato varie procedure di filtrazione e stoccaggio situ. Diversi dispositivi di filtraggio, recipienti di raccolta e procedure memorizzazione sono stati esaminati per conseguire la tecnica più adatta per l'analisi dei disciolto inorganico (PO 4 3-, NO x -, NH 4 +, SiO 4) ed organici (DOC + DON) composti, e ultra-plancton (<1081; m) e il particolato organico (POC + campionamento PON). Per ridurre ulteriormente il rischio di contaminazione, in particolare in condizioni di campo, il numero di fasi di manipolazione è stato ridotto al minimo. Il formato visivo in cui è presentato il metodo è orientato per facilitare riproducibilità e per ridurre il tempo necessario per applicare efficacemente la tecnica.
Panoramica del sistema
Per campionare in situ pompata acqua sospensivori con orifizi exhalant piccole 2 mm, l'attività di pompaggio di ciascun campione viene prima visualizzata rilasciando filtrata fluoresceina tinti acqua di mare accanto all'orifizio inalante (s) e osservando il suo flusso dall'apertura excurrent 16 (vedi anche figura 2B in 18). L'acqua inalato ed espirato dal campione di studio (incurrent e excurrent) vengono quindi simultaneamente campionati con l'impiego di una coppia di tubi minute installati sul manipolatore fuoriserie o due dei "arms "di un treppiede portatile flessibile capovolta (Figura 1 e complementare Video 1). L'acqua inalata dall'organismo studio viene raccolto posizionando accuratamente l'estremità prossimale di un tubo all'interno o vicino all'apertura inalazione dell'organismo studio. Un identico tubo viene quindi posizionato all'interno dell'orifizio excurrent. Questa operazione richiede cura per evitare il contatto o disturbo dell'animale, per esempio, mediante risospensione dei sedimenti. per iniziare il campionamento, un subacqueo perfora un setto nel recipiente di raccolta con una siringa attaccata alla estremità distale di ciascun tubo, consentendo la pressione dell'acqua esterna di forzare l'acqua campionata nel vaso attraverso il tubo di campionamento. l'aspirazione viene iniziata dal vuoto creato in precedenza nei flaconi e dalla differenza di pressione tra l'acqua esterna e il contenitore del campione evacuato .
Per garantire una raccolta di acqua pulita espirata e per evitare l'aspirazione accidentale di ambiacqua ent 16, la frequenza di campionamento dell'acqua deve essere mantenuto a un tasso significativamente più basso (<10%) rispetto alla portata excurrent. Il tasso di aspirazione è controllata dalla lunghezza del tubo e il diametro interno (ID). Il piccolo diametro interno garantisce inoltre un volume morto trascurabile (<200 ml per metro di tubo). Campionamento per periodi prolungati (minuti a ore) permette di integrare il patchiness intrinseca della maggior parte delle sostanze di interesse. Per assicurare che i campioni siano adeguatamente conservati in sessioni di campionamento subacqueo prolungati nonché per il trasporto al laboratorio, una in situ filtrazione è raccomandato per analiti sensibili. La selezione di vasi di campionamento, il montaggio di filtraggio, e tubi sono dettate dagli organismi di studio e la domanda di ricerca specifica. Il protocollo descritto di seguito presuppone che un profilo metabolico completo è di interesse (per una panoramica si veda la Figura 2). Tuttavia, la natura modulare del protocollo consente fo facile modifica per accogliere i metodi di campionamento più semplici o anche molto diverse. Per un profilo metabolico completo, il protocollo di campionamento dovrebbe comprendere le seguenti fasi: (1) la visualizzazione di flusso; (2) l'alimentazione di campionamento ultra-plancton (plancton <10 micron); (3) Il campionamento nutrienti inorganici assorbimento e l'escrezione (usando filtri in linea); (4) Campionamento disciolto assorbimento organico e l'escrezione (usando filtri in linea); (5) di alimentazione particolato e l'escrezione (usando filtri in linea); (6) Ripetere il punto 2 (ultra-plancton alimentazione come controllo della qualità); (7) Portata visualizzazione.
Quando logisticamente fattibile, si raccomanda che le misurazioni profilo metabolico sono combinati con pompaggio rate (ad esempio, il metodo a velocità fronte del colorante, in 16), nonché con le misurazioni respirazione. Queste misure devono essere prese all'inizio e alla fine della sessione di campionamento. Per la misurazione della respirazione, optodes subacquee o micro-elettrodi sono preferibili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Operazioni preliminari e per la bonifica Procedure
- Soluzione detergente
- Indossare indumenti protettivi, un camice da laboratorio e guanti in ogni momento. Effettuare queste fasi preparatorie in uno spazio pulito privo di polvere e fumo.
- Preparare una soluzione al 5-10% di acido cloridrico (HCl) con fresco, di alta qualità, acqua bidistillata.
- Preparare un 5% altamente solubile mix di base della soluzione di tensioattivi anionici e tensioattivi non ionici (vedi elenco dei materiali) con fresco, di alta qualità, acqua bidistillata.
- Conservare tutte le soluzioni in pulita, lavata con acidi contenitori.
- Operazioni preliminari e le procedure di pulizia (in laboratorio)
NOTA: Se composti di fosforo non sono di interesse, il lavaggio HCl può essere sostituita da acido fosforico di alta qualità (H 3 PO 4) di lavaggio (8% H 3 PO 4 concentrazione finale).- Indossare indumenti protettivi, un camice da laboratorio e guanti in ogni momento.
- lavaggiol'apparato di campionamento (escluso il supporto in acciaio inox filtro in linea Swinney) con ampia quantità di acqua ad elevata purezza. Lasciare l'apparecchiatura in ammollo 5-10% soluzione di HCl durante la notte. Risciacquare di nuovo l'apparato con grande quantità di acqua distillata doppio di alta qualità.
- Lavare i acciaio inox portafiltri Swinney in linea con la grande quantità di acqua ad elevata purezza. Lasciare i portafiltri ammollo nel 5% altamente solubile mix di base di tensioattivi anionici e tensioattivi non ionici soluzione durante la notte. Risciacquare di nuovo con acqua ampio doppio di alta qualità distillata.
- Asciugare tutto l'apparato di campionamento, avvolgerli in un foglio di alluminio e conservare in una scatola pulita fino al momento dell'uso.
- Controllo della frequenza di aspirazione
- Controllare la frequenza di campionamento regolando la lunghezza e il diametro interno del tubo di aspirazione in funzione della profondità di lavoro programmato e temperatura dell'acqua. Utilizzare la seguente equazione (derivato dalla Legge di Poiseuille usato per completamente develpato tubo di flusso laminare) come guida:
dove F = portata (cm 3 min -1), Dp = pressione differenziale (bar), r = ingresso tubi raggio interno (cm), K = 2.417 x 10 -9 (sec -2), L = lunghezza del tubo (cm ), V = viscosità dell'acqua (g cm-1 sec -1). Vedi Tabella 1 per maggiori dettagli. - Mantenere frequenza di campionamento inferiore all'1% della velocità di pompaggio dell'animale studiata.
NOTA: l'uso di contenitori evacuati, a volte con sconosciuto vuoto pone ulteriori complicazioni. Pertanto, un test sul campo è altamente raccomandato. A 10 m di profondità e ~ 22 ° C con acqua di mare (40 PSU), un tubo di 50 cm di aspirazione con un diametro interno di 254 micron fornisce un tasso medio di aspirazione del ~ 26 microlitri sec -1 (1,56 ml min -1).
- Controllare la frequenza di campionamento regolando la lunghezza e il diametro interno del tubo di aspirazione in funzione della profondità di lavoro programmato e temperatura dell'acqua. Utilizzare la seguente equazione (derivato dalla Legge di Poiseuille usato per completamente develpato tubo di flusso laminare) come guida:
- vasi di campionamento
- Per piccoli campioni di volume (3-20 ml, ad esempio, ultra-plancton per CYT flussoometry) utilizzare tubi in plastica sterili pre-aspirato.
NOTA: Pre-aspirato tubi in plastica sterili sono regolarmente impiegati per le analisi del sangue normali in esseri umani; assicurarsi di utilizzare le provette sterili senza aggiunta di additivi. Questi tubi di plastica sterili sottovuoto sono meglio campionati con l'uso di sterili, portatubo monouso con fuori centro Luer. Mentre questo è l'apparato di campionamento più sicuro ed efficace, ha un po 'più grande volume morto rispetto ad un ago semplice. - Per i campioni di acqua più grandi, come i nutrienti e sostanze organiche disciolte, utilizzare 40 o 60 ml fiale di vetro che soddisfano i criteri Environmental Protection Agency (EPA) per le analisi organici volatili. Queste fiale includono tappo in polipropilene con un setto in silicone PTFE affrontato.
- Per i volumi ancora più grandi, usare bottiglie di penicillina con tappi di gomma o thermos.
- Utilizzare fiale di polietilene ad alta densità (HDPE) fiale per i campioni di silice.
- Per aumentare il volume del campione e per ridurre il rischio di sloggiare stopperdurante la risalita, evacuare articoli (vuoto) 1.4.2-1.4.4 prima dell'immersione con una pompa a vuoto. Vacuum manualmente utilizzando una pompa a vuoto mano o anche aspirando l'aria con una siringa. Tuttavia, per ottenere i migliori risultati, si consiglia una pompa a buon vuoto. liofilizzatori standard fornisce alto vuoto.
NOTA: Prestare particolare attenzione quando si utilizzano grandi palloni aspirato a garantire che il tasso di aspirazione più veloce iniziale non avrebbe contaminato i campioni di acqua espirata.
- Per piccoli campioni di volume (3-20 ml, ad esempio, ultra-plancton per CYT flussoometry) utilizzare tubi in plastica sterili pre-aspirato.
- Procedure di pulizia Vessel
- Per organici dissolti e NH 4 + analisi, utilizzare le nuove fiale pre-puliti EPA.
- Risciacquare i flaconi (vetro e HDPE) per l'analisi di altri nutrienti come segue:
- Sciacquare i flaconi (vetro e HDPE) e tappi in polipropilene con acqua distillata doppio di alta qualità. Installare un nuovo setto silicio.
- Mettere a bagno i flaconi (vetro e HDPE) nel 10% di HCl per almeno 3 giorni e risciacquare con acqua ampio doppio di alta qualità distillata.
- Combust i flaconi di vetro a 450 ° C per 4 ore e si lascia raffreddare in forno. Installare il tappo, e avvolgerlo in un foglio di alluminio fino al momento dell'uso.
- filtri
- Utilizzare i filtri in fibra di vetro privo di legante per la filtrazione di tutti i campioni organici disciolti (ad esempio, DOC, DON) e per la raccolta di organici di particolato (ad esempio, POC, PON). Confezione ciascun filtro di vetro in una busta di alluminio separata. Bruciano a 400 ° C per 2 ore a volatilizzare residui organici e conservare in un recipiente pulito e asciutto fino al momento dell'uso.
- Utilizzare un filtro in fibra di vetro privo di legante come sopra, o membrane di policarbonato 0,2 micron per il campionamento di nutrienti inorganici (ad esempio, PO 4 3-, NO x -, NH 4 +). Pulire quest'ultimo una volta installato nel supporto del filtro come spiegato di seguito (1.7.3).
- Utilizzare 0,2 micron in policarbonato filtri membrane per il campionamento di silice. pulirle una volta installed nel porta filtro come spiegato di seguito (1.7.3).
- Preparazione del gruppo filtrante
- Filtrare la miscela base altamente solubile di tensioattivi anionici e soluzione di tensioattivo non ionico e l'acqua distillata doppia alta qualità attraverso un filtro da 0,2 micron prima di usarli per pulire il gruppo filtrante.
- assemblaggio di filtrazione per i nutrienti e sostanze organiche disciolte diverse da silice:
- Mettere un combusti filtri in fibra di vetro privo di legante all'interno del supporto in acciaio inox filtro pulito in linea Swinney.
- Utilizzare una siringa acido puliti per eseguire 100 ml di 5% altamente solubile mix base di tensioattivi anionici e soluzione tensioattivo non ionico e poi 100 ml di acqua distillata doppia alta qualità attraverso l'intero assieme.
- Assemblaggio di filtrazione per SiO 4:
- Posizionare il filtro di policarbonato all'interno del supporto del filtro di policarbonato pulito (portafiltri PC).
- Utilizzare una siringa acido-pulito per Run 30 ml di 5% di HCl e 30 ml di acqua distillata doppia alta qualità attraverso l'intero assieme.
- il montaggio del sistema
- Assemblare il sistema per lavori subacquei utilizzando PEEK (polietere etere chetone) tubi con un diametro esterno (OD) di 1,6 mm ed un diametro interno (ID) di 254 micron o 177 micron.
- Di un coltello o PEEK taglierina affilato per tagliare i tubi alla lunghezza desiderata.
- Alla sua estremità distale (campione laterale del contenitore), misura ogni tubo con un connettore Luer maschio attaccato ad una siringa. Assicuratevi di seguire le istruzioni del produttore e allineare il lato piatto blu senza flangia puntale con l'estremità del tubo prima di serrare il dado verde.
- Collegare il tubo PEEK al treppiede "braccia" o manipolatore su misura utilizzando un nastro isolante.
- Attaccare un ago siringa monouso al connettore maschio Luer. Tenere l'ago con il suo cappuccio di protezione per prevenire gli infortuni. Chiaramente etichettare il codice del cambio di campionamento e il colore di tutti i componenti inalati ed esalati (ad esempio, verde = In, rosso = Ex).
- Allo stesso codice di colore i vasi di campionamento con set di vasi di campionamento accoppiati in sequenza numerata.
dove F = portata (cm 3 min -1), Dp = pressione differenziale (bar), r = ingresso tubi raggio interno (cm), K = 2.417 x 10 -9 (sec -2), L = lunghezza del tubo (cm ), V = viscosità dell'acqua (g cm-1 sec -1). Vedi Tabella 1 per maggiori dettagli. 2. subacquea di lavoro
- Preparazione del sito Work
- Indagine preliminare e la selezione dei campioni
NOTA: A causa della natura complessa del protocollo di campionamento subacquea, dedicando il tempo necessario per la preparazione garantirà un efficiente immersioni di campionamento.- Indagine del cantiere e fare i preparativi necessari prima del tempo.
- Selezionare e marcare idonei organismi bersaglio cui si può accedere in modo relativamente facile. Dal momento che non tutti i microrganismi possono essere necessariamente attivo al momento dell'immersione campionamento, preparare più stazioni di lavoro che ci si aspetta di campione.
- Installazione di supporti di base
- When lavorando su substrato livellato:
- Montare la clip originale sgancio rapido del treppiede flessibile su 1 pesi kg di immersione e semplicemente posizionarlo vicino al bersaglio animali.
- Quando si lavora su pareti verticali:
- piastre di montaggio di supporto di base per il sistema VacuSIP, ganci per attrezzi accessorio, e grucce per il recipiente di raccolta portando vassoio durante la fase di preparazione del sito di lavoro (2.1.1).
- Quando si utilizzano treppiedi flessibile portatile, utilizzare viti o resina epossidica bicomponente per fissare lastre 10x10 cm PVC accanto ad ogni animale bersaglio. Ogni piatto ha bisogno di avere un buco per fissare le clip di rilascio rapido del treppiede flessibile portatile.
- Quando la resina è indurita e le piastre di base sono solidali alla parete, avvitare le clip sgancio rapido, che serve come punto fermo attaccamento per il treppiede portatile flessibile per il sistema VacuSIP.
- When lavorando su substrato livellato:
- Indagine preliminare e la selezione dei campioni
- Installazione del VaCUSIP
- Controllare se il campione è di pompaggio rilasciando filtrata fluoresceina accanto all'orifizio inalanti e confermare che il colorante sta emergendo attraverso l'orifizio exhalent come descritto in Yahel et al. (2005) 16.
- Installare il dispositivo VacuSIP e posizionare il tubo di inalazione (IN) campionamento entro l'orifizio inalanti o semplicemente accanto ad esso (entro ~ 5 mm). Assicurarsi che il tubo inalante non è in prossimità di un altro orifizio esalante.
- Dirigere con cura il tubo di campionamento esalante (EX) verso il osculum / sifone esalante ed inserire molto delicatamente dentro, fino a quando non si posiziona 1-5 mm all'interno del osculum / sifone esalante (vedi Figura 1 e supplementare Video 1). Fare molta attenzione a non entrare in contatto con o comunque disturbare l'organismo campionato.
- Prima e durante il campionamento doppio controllare la posizione di entrambi i tubi.
- Dopo il controllo di campionamento se il campione è ancora pompando come described sopra (2.2.1).
NOTA: A causa del movimento di un braccio del tripode durante la manipolazione l'altro potrebbe accadere, assicuratevi di mettere in primo luogo il tubo di campionamento inalanti e in secondo luogo il tubo esalante, che richiede la manipolazione più precisa. Seguendo questo ordine, anche se la manipolazione del tubo di campionamento exhalant potrebbe provocare il movimento del tubo inalante, non influenzerà il campionamento.
- Procedura di campionamento subacqueo modulare
NOTA: In attesa sulla domanda di ricerca, ciascuna delle fasi sperimentali sotto possono essere eseguite come un esperimento stand-alone. Il profilo completo metabolico protocollo di campionamento descritto è un processo lungo, che richiede fino a 8 ore al campione (per una panoramica si veda la Figura 2 e Tabella 2). Poichè le condizioni e regolamenti di immersione differiscono tra i siti di campionamento, regioni e istituzioni, i piani di immersione non sono incluse in questo protocollo. Tuttavia, dedicare estrema cura e metipianificazione minuziose al piano di immersione. Prestare particolare attenzione per evitare la saturazione e yoyo profili di immersione. Quando possibile, si consiglia di condurre questi esperimenti in profondità (<10 m). rebreather a circuito chiuso può essere molto utile per tali sistemi di campionamento prolungati.- Prima dell'inizio di campionamento attuale, assicurarsi che non tracce visibili di residui fluoresceina rimangono e che i sedimenti in sospensione sono state risolte o sono diffondeva via.
- Ultra-plancton, (nessun filtro è installato in questa fase!)
- Utilizzare l'ago per perforare il IN (per via inalatoria) e EX (espirata) aspirato tubi in plastica sterili setti. Verificare che l'acqua gocciola in al tasso programmato e raccogliere campioni di acqua 2-6 ml.
- Sul recupero, mantenere i campioni in una scatola di freddo sul ghiaccio. Nel laboratorio, conservare con 1% paraformaldeide + 0,05% EM grado glutaraldeide (concentrazione finale), o 0,2% EM grado glutaraldeide. Congelare cryovials in azoto liquido e conservare a -80 &# 176; C fino al momento dell'analisi.
- Campionamento silicato e stoccaggio
- Installare il portafiltro PC acciaio pre-puliti in linea contenente una membrana di policarbonato 0,2 micron tra l'ago e il connettore Luer maschio all'estremità distale del tubo.
- Pierce il tappo setto delle fiale in polietilene ad alta densità pre-puliti (flaconi HDPE) per iniziare il campionamento. Verificare che entrambi i campionatori grondano e raccogliere 15 ml d'acqua in ogni fiala.
- Conservare i campioni refrigerati (4 ° C) fino al momento dell'analisi. Se l'analisi non può iniziare entro due settimane, conservare a -20 ° C. Per l'analisi, assicurarsi che i campioni vengono scongelati a 50 ° C per almeno 50 min a dissolversi gel di silice.
NOTA: La membrana può essere conservato per la microscopia o l'analisi del DNA, se necessario.
- Inorganiche disciolte (PO 4 3-, NO x -, NH 4 +)
- Sostituire tegli gruppo filtro PC con un portafiltro pre-pulito in linea acciaio che contiene un filtro di vetro pre-combusto.
- Prima campionamento, assicurano che almeno 20 ml di campioni di acqua marina sono stati fatti passare attraverso l'intero sistema di filtrazione utilizzando EPA, flaconi HDPE o altro recipiente vuoto per iniziare l'aspirazione. Misurare il volume dell'acqua raccolta prima di essere eliminati.
- Pierce il tappo setto delle appropriate fiale di vetro EPA per iniziare il campionamento, verificare che entrambi i campionatori sono grondanti, e raccogliere 25-30 ml per nitrati e fosfati analisi.
- Conversione a nuove fiale di vetro EPA per l'analisi di ammoniaca, verificare che entrambi i campionatori sono grondanti, e raccogliere 20 ml di ciascun flacone.
- Mantenere i campioni in una scatola fredda su ghiaccio e conservare a -20 ° C fino all'analisi.
NOTA: Se solo il filtrato è di interesse, filtri per siringa usa e getta possono essere utilizzati per misure 2.3.3 e 2.3.4.
- Organici disciolto (DOC + DON) campionamento e storing
NOTA: Mantenere i campioni il più possibile verticale per tutta la gestione in modo che l'acqua campione non venga a contatto con setti in silicone.- Continuare utilizzando il gruppo filtro in acciaio inossidabile e raccogliere 20 ml di campioni di acqua marina in nuove fiale di vetro EPA, come descritto sopra.
- Dopo il recupero, mantenere i campioni in una scatola fredda su ghiaccio. Nel laboratorio, usare una pipetta di pre-combusto Pasteur di vetro per fissare i campioni con acido fosforico (aggiungere 5-6 gocce di acido grado metalli in tracce il 25% in un campione di 20 ml, concentrazione finale 0,04%) o acido cloridrico (aggiungere 2 gocce di metalli in tracce grado concentrato acido in un campione di 20 ml, concentrazione finale 0,1%) e conservare in frigorifero.
- Conservare i campioni refrigerati (4 ° C) fino al momento dell'analisi. Se i campioni non sono analizzati entro una settimana di raccolta, conservare a -20 ° C fino all'analisi.
- Particolato materia organica (POC, PON, POP)
- Continuare a utilizzare la stainless gruppo filtro in acciaio e filtro almeno 500 ml di acqua di mare in una beuta da vuoto 250 ml evacuato. Sostituire fiaschi, se necessario.
- Sul recupero, usare una siringa piena d'aria per evacuare tutti i restanti dell'acqua di mare dalla porta-filtro, avvolgerla in un foglio di alluminio, e conservare in una scatola di freddo sul ghiaccio. In laboratorio, rimuovere i filtri dai portafiltri e conservare a -20 ° C fino al momento dell'analisi.
- Prima dell'inizio di campionamento attuale, assicurarsi che non tracce visibili di residui fluoresceina rimangono e che i sedimenti in sospensione sono state risolte o sono diffondeva via.
Figura 1. Un esempio di corrette installazioni del VacuSIP: (a) Campionamento l'ascidia Polycarpa mytiligera (Golfo di Aqaba, Mar Rosso) con un manipolatore custom-built con il codice colore utilizzato verde per via inalatoria e giallo per campioni di acqua espirata (foto da Tom Shelizenger e Yuval Yacobi); (B) il campionamento dei oroides spugna Agelas (NW MediterraneoMare) con una larghezza osculum di 3 mm, utilizzando il dispositivo VacuSIP. Il codice colore utilizzato è giallo per inalazione e rosso per campioni di acqua espirata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Descrizione generale della tecnica VacuSIP descritto nella sezione del protocollo. Il lavoro di laboratorio è rappresentato in scatole gialle, il lavoro sul campo in scatole blu. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Le frequenze di campionamento medi complessivi (ml min -1) ottenuti con diversi contenitoriutilizzati per le raccolte d'acqua e diversi gradi di vuoto: i palloni non erano stati spazzati (nessuno); fiale di vetro EPA e fiale HDPE erano stati spazzati metà del loro volume (½ volume); tubi di plastica sterili sono stati già aspirato dal produttore. Lavorare a 5-8 m di profondità, temperatura dell'acqua di 18-22 ° C, l'uso di tubi in PEEK di lunghezza 79 centimetri e di 25 micron di diametro interno.
Tabella 2. Panoramica della nave campionamento, gruppo filtro fissativo, in linea, lo stoccaggio e metodi analitici descritti nella sezione del protocollo. I composti analizzati sono: ultra-plankton abbondanza (plancton <10 micron), silicati (SiO 4), fosfato (PO 4 3-), nitriti + nitrati (NO 2 - + NO 3 -), sostanza organica disciolta (DOM), ammonio (NH 4 +) e materiale organico particolato(POM). Tutti i vasi di campionamento devono tappo setto silicio e vengono aspirati prima del campionamento. I fissativi sono: paraformaldeide + glutaraldeide (Glut + Parafor), acido fosforico (H 3 PO 4) e acido cloridrico (HCl). Le assemblee in linea di filtro usati sono: portafiltri in policarbonato e policarbonato a membrana 0,2 micron filtri (portafiltro PC + membrana PC) e portafiltri in acciaio inox e fibra di vetro senza leganti Filtri GFF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'ottimizzazione dei metodi di raccolta di acqua di mare
Selezione di fiale da collezione e la procedura di pulizia
recipienti di raccolta compatibili VacuSIP dovrebbero avere un setto che permette di campionamento venga avviata forando con una siringa. Essi dovrebbero resistere alla pressione sottomarina elevata (2-3 bar di immersioni tipici profondità di lavoro), e dovrebbe tenere un vuoto. Molti (ma non tutti i marchi) di fiale approvati dalla EPA per l'analisi di composti organici volatili soddisfano questi criteri. fiale pre-puliti approvati per DOC e analisi DON sono inoltre disponibili. Per verificare l'idoneità di queste fiale per la raccolta e l'analisi delle sostanze nutritive e per ottimizzare le procedure di pulizia, acqua distillata doppio di alta qualità è stato raccolto in tubi di polipropilene acido-pulito (tubi PP), appena acquistato, in unfiale di polietilene ad alta densità CID-puliti (flaconi HDPE), in fiale di vetro EPA, tutte dotate di un cappuccio setto politetrafluoroetilene (PTFE). I flaconi HDPE e tubi di polipropilene sono stati puliti come descritto nella sezione 1.5.2 sopra, ed i flaconi di vetro EPA venivano pulite dal produttore.
La quantità di NH 4 + found in flaconcini di vetro EPA era relativamente minima (≤ 0,1 mmol L -1) e dipende dalla doppia distillata qualità standard di acqua di alta qualità. Al contrario, NH 4 + concentrazioni significativamente aumentati (fino a 3 e 7 volte, rispettivamente) e mostrano una maggiore variabilità in tubi di polipropilene acido puliti e in fiale di polietilene ad alta densità (ANOVA F (5,53) = 7.183, p < 0,001, Figura 3). Non c'era alcun effetto di alta qualità doppio contatto acqua distillata con il setto di silicio sull'analisi ammonio.
Paragone di nuovi flaconi di vetro contro puliti fiale di vetro riciclato / together.within-page keep-
Per verificare se fiale di vetro EPA potrebbero essere utilizzati per l'analisi dei nutrienti più di una volta, l'NO x -, PO 4 3-, e NH 4 + concentrazioni in campioni di acqua di mare raccolti in nuovi flaconi di vetro EPA sono stati confrontati con quelli raccolti in occasione fiale di vetro EPA. I nuovi flaconi di vetro EPA sono stati pre-pulite dal costruttore, mentre i flaconi di vetro riciclato vengono pulite come descritto sopra (1.5.2). Fiale riciclati avevano significativamente più alta concentrazione NH 4 +, fino a 1,5 volte il livello si trovano in nuovi flaconi di vetro (t test, p <0,001, n = 5). Nessuna differenza significativa è stata trovata in NO x - e PO 4 3- contenuto tra i campioni raccolti in fiale riciclati e campioni raccolti nel nuovo vetroflaconi (Figura 4).
Raccolta silicato e le procedure di memorizzazione
Per determinare la migliore recipiente di campionamento per l'analisi di silicati, acqua distillata doppia alta qualità è stato raccolto in (flaconi HDPE) non puliti e in tubi di polipropilene acido puliti (tubi PP), in flaconi di polietilene ad alta densità acido-pulito, e in fiale di vetro EPA. La concentrazione di silicato previsto era vicino allo zero, in modo da valori che hanno deviato dalla concentrazione previsto sono stati considerati contaminati. La concentrazione di silicato significativamente diversa tra i campioni raccolti nelle diverse fiale (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0.001), che mostra la più bassa concentrazione SiO 4 nelle fiale HDPE acido-pulito. Fiale di vetro borosilicato contaminati i campioni, con la concentrazione finale SiO 4 in aumento di fino a 7 mmolL -1 (Figura 5).
Selezione di apparecchi di filtraggio per la materia organica disciolta (DOM) e analisi dei nutrienti
Per determinare quale apparecchiatura filtro produce il vuoto basso nell'analisi di organico disciolto (DOC e DON) e nutrienti inorganici (NO x -, NH 4 +, PO 4 3-), acciaio inossidabile portafiltri sono stati confrontati con policarbonato in linea Swinney portafiltri. Con ogni tipo di supporto del filtro abbiamo testato sia membrana in policarbonato e filtro in fibra di vetro pre-combusto. La combinazione di supporto del filtro in acciaio inox e filtro in fibra di vetro bruciato fornito gli spazi vuoti più bassi, mentre il supporto del filtro Swinney in policarbonato dotato di membrana in policarbonato chiaramente contaminato i campioni fino a 9 volte. L'aumento dei volumi di lavaggio fatto Non risolvere questo problema (Figura 6).
Figura 3. concentrazione di ammonio (mmol L -1, media ± SD) raccolti con diverse fiale: (1) HDPE flacone non puliti; (2) flacone HDPE puliti; (3) HDPE Puliti flacone + Parafilm; (4) flacone di vetro EPA; (5) flacone di vetro EPA + Parafilm; (6) Pulito tubo PP. Il Parafilm è stato posto per verificare se il setto di silicio può contaminare i campioni di acqua. Per ogni trattamento sono stati analizzati 9 campioni di acqua distillata doppia alta qualità. I campioni sono stati analizzati fresco. Differenze significative sono state trovate tra le quattro navi di campionamento (ANOVA, F (5,53) = 7,183, p <0,001, test di potenza = 0.992). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. ammonio (NH 4 +), nitriti + nitrati (NOx -), e fosfato (PO 4 3-) concentrazioni (micromol L -1, media ± SD) di campioni di acqua di mare raccolti nel nuovo (scuro) e riciclati / puliti fiale di vetro (bianco) EPA. L'acqua di mare è stato raccolto presso l'Area Sperimentale Aquaria zona dell'Istituto di Scienze Marine ed è stato filtrato con supporto del filtro in acciaio inox e filtro di vetro. I campioni di acqua sono stati analizzati fresco. L'asterisco (*) indica che la differenza è significativa (t test, p <0,001, n = 5, prova di potenza = 1). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
.jpg "/>
Figura 5. concentrazione del silicato (mmol L -1, media ± DS) in alta qualità acqua bidistillata raccolta in diverse fiale: tubi PP acido-puliti, tubi in PP, HDPE fiale di acido-puliti, nuove fiale di vetro EPA. Differenze significative sono state trovate tra i quattro materiali campionatore (ANOVA, F (3,19) = 210,047, p <0.001, prova di potenza = 1). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Esaminando l'effetto di diversi gruppi di filtrazione e lavare i volumi sui nitriti + nitrati (NO x - micromol L -1). I campioni per NO x - sono stati ottenuti filtrando i campioni di acqua di mare con acciaio inossidabile (SS FIlter titolare) o policarbonato in linea portafiltri Swinney (portafiltro PC) dotati sia con una membrana di policarbonato (filtro PC) o un filtro in fibra di vetro pre-combusto. Per i filtri PC, volumi diversi (10, 30, 60, 90 e 120 ml) di 5% di acqua distillata HCl e di alta qualità doppia stati usati per il lavaggio del gruppo del filtro, il volume di lavaggio è dato tra parentesi nella figura legenda. I valori sono espressi come media ± deviazione standard (n = 5). L'acqua di mare è stato raccolto presso l'Area Sperimentale Aquaria zona dell'Istituto di Scienze Marine ed i campioni sono stati analizzati fresca dopo la filtrazione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Esempio di risultati sperimentali: per via inalatoria (IN, nerocerchio) ed esalati (EX, triangolo rosso) accoppiato concentrazioni del campione di acqua (mmol L -1) di diverse sostanze elaborate dalla spugna Chondrosia reniformis nel Mar Mediterraneo: (A) di ammonio (NH 4 +); (B) nitriti + nitrati (NOx -); (C) fosfato (PO 4 3-); (D) silicato (SiO 4); (E) carbonio organico disciolto (DOC); (F) sciolto azoto organico (DON); (G) carbonio organico planctonici (LPOC); (H) planctonici azoto organico (LPON). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. Un esempio di un flusso cytomanalisi metria dei campioni di acqua accoppiati prelevate dall'acqua inalato (A, C, E, G) e espirata (B, D, F, H) dalla spugna Chondrosia reniformis: (A, B, C, D) le popolazioni di fitoplancton; (E, F, G, H) batteri eterotrofi. In AB e EF il campionamento era pulito e preciso (tutti i gruppi planctonici sono stati mantenuti in modo efficiente). CD e GH sono esempi di contaminazione dell'acqua espirata, mostrando bassa la rimozione di tutti i gruppi planctonici. Syn:. Synechococcus sp, pico: picoeukariotes autotrofi, nano: nanoeukaryotes autotrofi, alta: batteri eterotrofi con alto contenuto di DNA, basso:. Batteri eterotrofi con basso contenuto di DNA Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figur supplementaree 1. cellule efficienza di ritenzione delle diverse prede planctonici dal mollusco Chama Pacifica: Prochlorococcus sp. (Pro), Synechococcus sp. (Syn), pico-eucarioti (Pico EUK), nano-eucarioti (Nano EUK). Le barre di errore = 95% CI. Cliccate qui per scaricare questo file.
Supplementare Video 1. Il campionamento del ascidia Polycarpa mytiligera utilizzando un manipolatore custom-built con il codice colore utilizzato verde per via inalatoria e giallo per campioni di acqua espirata. tubi di campionamento (PEEK, ID 54 micron, lungo 75 cm) sono accuratamente posizionati nelle exhalant e inalanti sifoni del ascidia. L'acqua è di coinvolto in tubi sottovuoto ad una velocità di circa 1 ml min -1. In questa dimostrazione fluoresceina viene utilizzato per visualizzare il getto esalante. Si noti che il tubo di campionamento esalante è posto ben wisottile getto esalante. Cliccate qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
operazioni preliminari
Fiale Collector per Dom e analisi dei nutrienti
Dal momento che i vasi da collezione possono interagire con micro-costituenti disciolti e le pareti campionatore può essere un substrato per i batteri crescita 30-34, sono stati testati diversi fiale per DOM e la raccolta dei nutrienti. Borosilicato non è raccomandato per la quantificazione silice 33,35, dal momento che le bottiglie di vetro possono aumentare la concentrazione iniziale di silice fino a due volte se i campioni non sono rapidamente congelati 30. I nostri risultati dimostrano che l'uso di fiale pre-puliti EPA si traduce in spazi vuoti a bassa concentrazione di DOC, DON, e nutrienti inorganici, in particolare per l'ammonio.
Filtrazione DOC e stoccaggio
La filtrazione è un necessario e, in molti casi, è il primo passo di analisi in chimica marina emicrobiologia. Mentre è possibile filtrare i campioni dopo la raccolta in laboratorio, questa procedura non è consigliata per in situ lavoro, in cui i campioni vengono raccolti sott'acqua, spesso in località remote, ore o giorni di distanza da adeguate strutture di laboratorio. L'uso di in-line, in filtrazione situ minimizza manipolazione del campione e quindi riduce il rischio di contaminazione. Nella filtrazione situ elimina anche la maggior parte dei batteri e riduce il rischio che la composizione campione verrà alterato dal metabolismo batterico durante il campionamento prolungato e trasporti tempo. Il gruppo filtrante aumenta il volume morto dell'apparecchio campionamento e può anche essere una fonte di contaminazione. Una lista dei più piccoli supporti possibili filtri (ad esempio, in linea Swinney portafiltro 13 mm) e il tubo PEEK minuti (per esempio 254 micron ID) riduce il volume morto e il rischio di contaminazione da acqua ambientale.
Se il filtro non è correttautilizzati o se non viene lavato accuratamente, manufatti e la contaminazione dei campioni di acqua sono suscettibili di verificarsi 32,36-39. Studi di analisi DOC hanno dimostrato che i filtri e portafiltri fatte di composti organici (policarbonato e PFA-PTFE) possono causare gravi contaminazioni DOC 32,37, soprattutto quando non accuratamente lavata con acqua distillata doppio di alta qualità 38. Il presente protocollo ed i risultati seguire queste linee guida e indicano anche che portafiltri in policarbonato dovrebbero essere evitati.
Nel lavoro in situ e l'interoperabilità
Il sistema VacuSIP è una tecnica di campionamento diretta che facilita lo studio del metabolismo di alimentatori sospensione inalterate nel loro ambiente naturale e la quantificazione del loro ruolo ecologico nel sistema. Per i subacquei esperti e attrezzati, l'applicazione del metodo VacuSIP è semplice e richiede solo pochi trAining. Esperimenti Inex VacuSIP sono progettati per un 'analisi statistica within'-design (ad esempio, l'analisi misura in coppia o ripetuta), quindi il controllo per la maggior parte dei manufatti di analisi, compresi alti spazi. L'uso di aspirazione controllata assicura frequenze di campionamento lenti e regolabili, impedendo così la contaminazione accidentale delle acque espirata con acqua ambientale. Ove possibile, la scelta dei siti di lavoro con bassa torbidità corrente e bassa è raccomandato e garantirà risultati più puliti e più accurati. Il tempo di campionamento prolungato (minuti a ore) consente di integrare l'alta patchiness che caratterizza lo strato limite bentonici. Tutte queste caratteristiche assicurano che, quando applicato correttamente il metodo VacuSIP sia molto robusto, fornendo risultati affidabili e riproducibili anche quando si lavora con un piccolo numero di repliche. Un esempio dei risultati tipici ottenuti da una spugna mediterranea e di specie di vongola Indo-Pacifico è mostrato in Figura 7 e supplementary Figura 1.
Come con qualsiasi tecnica, il VacuSIP non è priva di potenziali insidie. Il problema più comune è la contaminazione del campione di acqua espirata con acqua ambientale. Motivi per questi manufatti sono alto tasso di aspirazione, dislodgments tubo, e il comportamento degli animali. La corretta scelta della frequenza di campionamento corretta dipende stime precedenti della portata excurrent. Tali stime possono essere ottenuti utilizzando il metodo a velocità fronte del colorante 16. Idealmente, il tasso di aspirazione deve essere mantenuta al di sotto dell'1% della velocità di pompaggio (ad esempio, 1 ml min -1 per un'ora 6 L -1 tasso di pompaggio). Per evitare la contaminazione con acqua ambient, frequenza di campionamento non dovrebbe mai essere maggiore del 10% della velocità di pompaggio.
Per il controllo per la frequenza di campionamento, la lunghezza e il diametro interno del tubo di ingresso devono essere regolati in funzione della profondità di lavoro previsto e la temperatura dell'acqua. La Legge di Poiseuille (vedere la sezione 1.3.1) può essere utilizzato come guida. Tuttavia, questa equazione dovrebbe essere considerato come un primo ordine dal Ap e diminuzione frequenza di campionamento con tempo di campionamento e in linea filtrazione aggiunge incertezze. L'utilizzo di contenitori evacuati, talvolta con pressioni di vuoto sconosciuti, introduce ulteriori complicazioni. Un esempio di come frequenze di campionamento varia in funzione di diversi contenitori evacuati con differenti vuoto, è riportata nella Tabella 1.
La riduzione del tasso di campionamento è facilmente ottenibile regolando la lunghezza del tubo e ID, senza limitazioni tecniche di questa riduzione (frequenze di campionamento di pochi microlitri per ora sono fattibili). Tuttavia, gli sperimentatori devono essere consapevoli della frequenza di campionamento lento dettata da questa limitazione per gli animali con velocità di pompaggio lento e per piccoli organismi o campioni. L'implicazione immediata della frequenza di campionamento lento è il volume limitato di acqua che può essere raccolto durante una singola Sessi campionamentosopra. Questo volume basso limiterà il numero di analisi e replica che possono essere eseguiti con questi campioni, e sarà quindi anche limitare le informazioni che possono essere ottenute da queste popolazioni.
Tubo dislocazione può essere facilmente individuato e campionamento può essere interrotta o riavviata, a condizione che un subacqueo sta mantenendo costante vigilanza. Al contrario, cessazione di pompaggio durante il campionamento non è sempre facile da rilevare. Questo è vero non solo per spugne, ma anche per i tunicati, bivalvi, e policheti. Infatti, contrariamente alla credenza comune, gli eventi in cui un ascidia o un bivalve smesso di pompaggio sono state documentate con alcun cambiamento visibile nella geometria del sifone (Yahel, dati non pubblicati). Inoltre, in alcuni casi, tunicati possono mantenere pompaggio attivo senza secrezione mesh (cioè, nessuna filtrazione si svolge).
Il controllo della frequenza di campionamento è critica. A questo proposito il VacuSIP è migliore rispetto ad altri metodi, in particolare quando gli animali dello studio sono relatively piccola o quando pompa lentamente. Siringhe sono particolarmente difficili da controllare 2. Per esempio, Perea-Blázquez e colleghi (2012a) 40 usato una siringa per assaggiare l'acqua esalato da numerose specie temperate spugna e sorprendentemente non hanno trovato un modello generale di ingestione / escrezione di particolari sostanze nutritive (NO 2 -, NO 3 -, NH 4 +, PO 4 3-, SiO 4). La mancanza di un chiaro modello è probabilmente il risultato di una contaminazione dei campioni esalato con acqua ambiente dovute a uso siringa. La contaminazione è evidente dalla bassissima efficienza di ritenzione di plancton pico riportato da Perea-Blázquez e colleghi (2012b) 41 per la spugna: 40 ± 14% dei batteri eterotrofi e 54 ± 18% del Synechococcus sp. Per confronto, utilizzando il VacuSIP, Mueller et al. (2014) 21 hanno riportato una efficienza di rimozione dei batteri eterotrofi di72 ± 15% in Siphonodictyon sp. e 87 ± 10% in Cliona delitrix.
Per verificare la qualità del campione e assicurarsi che nessuna contaminazione dell'acqua ambiente si verifica, si consiglia vivamente di analizzare i campioni prima pico e nano plancton citometria a flusso. Questa analisi veloce, affidabile, a basso costo e fornirà informazioni immediate di qualità del campione. E 'molto comune per qualche preda taxa come Synechococcus sp. di essere rimosso da vicino al 90% di efficienza 14,42 da spugne e ascidie. Scostamenti significativi da questo punto di riferimento indicano che la contaminazione potrebbe essersi verificato (Figura 8).
Per il campionamento affidabile e pulita, assicurarsi che l'esperimento di progettazione soddisfa sette semplici regole: (1) effettuare una indagine preliminare (compreso il pompaggio variazioni del tasso) e preparare bene il cantiere; (2) conoscere gli animali studiati; (3) verificare che il campione in esame ha un diaframma excurrent ben definito unND posizione accessibile; (4) verificare che il campione studiato è pompando prima e dopo ogni raccolta dei campioni; (5) porre la provetta per la raccolta dell'acqua espirata leggermente all'interno dell'apertura excurrent (figura 1); (6) utilizzare frequenza di campionamento <10% della portata excurrent, 1% è altamente raccomandato; (7) definire un criterio di qualità e omettere sospetti coppie Inex.
Seguendo queste semplici regole, il sistema VacuSIP offre un metodo pratico e affidabile di misurare quanto sia attivo antiparticolato alimentatori sospensione del processo e composti disciolti in condizioni naturali, consentendo stime accurate e comparabili che possono essere utilizzati per valutare il ruolo funzionale dei filtratori in diversi ecosistemi intorno il mondo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ringraziamo Manel Bolivar per la sua assistenza nel lavoro sul campo. Siamo grati al "Parco Naturale del Montgrí, les Illes Medes i el Baix Ter" per il loro supporto ai nostri permessi di ricerca e di campionamento. Il manipolatore subacqueo è stato progettato da Ayelet Dadon-Pilosof e fabbricato dal Sig Pilosof. Questo lavoro è stato supportato dal progetto governo spagnolo CSI-Corallo [codice di autorizzazione CGL2013-43106-R per RC e MR] e da una borsa di FPU da "Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" a TM. Si tratta di un contributo della biogeochimica marina e il gruppo di ricerca Cambiamento Globale finanziato dal Governo Catalano [concessione numero 2014SGR1029] e ISF concessione 1280-1213 e BSF concessione 2.012.089 a G. Yahel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
References
- Gili, J. M., Coma, R. Benthic suspension feeders: their paramount role in littoral marine food webs. Trends. Ecol. Evol. 13 (8), 316-321 (1998).
- Reiswig, H. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Bio. 9, 38-50 (1971).
- McMurray, S., Pawlik, J., Finelli, C. Trait-mediated ecosystem impacts: how morphology and size affect pumping rates of the Caribbean giant barrel sponge. Aquat. Bio. 23 (1), 1-13 (2014).
- Pile, A. J., Young, C. M. The natural diet of a hexactinellid sponge: benthic-pelagic coupling in a deep-sea microbial food web. Deep-Sea Res. Pt. I. 53 (7), 1148-1156 (2006).
- Nielsen, T., Maar, M. Effects of a blue mussel Mytilus edulis bed on vertical distribution and composition of the pelagic food web. Mar. Ecol. Prog. Ser. 339, 185-198 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Surviving in a marine desert: the sponge loop retains resources within coral reefs. Science. 342, 108-110 (2013).
- Maldonado, M., Ribes, M., van Duyl, F. C. Nutrient Fluxes Through Sponges. Biology, Budgets, and Ecological Implications. Advances in Marine Biology. 62, (2012).
- Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 211, 275-291 (2001).
- Reiswig, H. M. Water transport, respiration and energetics of three tropical marine sponges. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 14, 231-249 (1974).
- Jiménez, E., Ribes, M. Sponges as a source of dissolved inorganic nitrogen: nitrification mediated by temperate sponges. Limnol. Oceanogr. 52 (3), 948-958 (2007).
- Diaz, M. C., Ward, B. Sponge-mediated nitrification in tropical benthic communities. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156, 97-107 (1997).
- Ribes, M., Coma, R., Gili, J. Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Mar. Ecol. Prog. Ser. 176, 179-190 (1999).
- Jiménez, E. Nutrient fluxes in marine sponges: methodology, geographical variability and the role of associated microorganisms. , Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. PhD thesis (2011).
- Reiswig, H. M. Particle feeding in natural populations of three marine demosponges. Biol. Bull. 141 (3), 568-591 (1971).
- Reiswig, H. M. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Biol. 9 (1), 38-50 (1971).
- Yahel, G., Marie, D., Genin, A. InEx - a direct in situ method to measure filtration rates, nutrition, and metabolism of active suspension feeders. Limnol. Oceanogr-meth. 3, 46-58 (2005).
- Genin, A., Monismith, S. S. G., Reidenbach, M. A., Yahel, G., Koseff, J. R. Intense benthic grazing of phytoplankton in a coral reef. Limnol. Oceanogr. 54 (2), 938-951 (2009).
- Yahel, G., Whitney, F., Reiswig, H. M., Leys, S. P. In situ feeding and metabolism of glass sponges (Hexactinellida , Porifera) studied in a deep temperate fjord with a remotely operated submersible. Limnol. Oceanogr. 52 (1), 428-440 (2007).
- Wright, S. H., Stephens, G. C. Removal of amino acid during a single passage of water across the gill of marine mussels. J. Exp. Zool. 205, 337-352 (1978).
- Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17 (2), 239-246 (1978).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), e90152 (2014).
- Gasol, J. M., Moran, X. A. G. Effects of filtration on bacterial activity and picoplankton community structure as assessed by flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol. 16 (3), 251-264 (1999).
- Koroleff, F. Determination of reactive silicate. New Baltic Manual, Cooperative Research Report Series A. 29, 87-90 (1972).
- Murphy, J., Riley, J. P. A. Modified single solution method for the determination of phosphate in in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Shin, M. B. Colorimetric method for determination of nitrite. Ind.Eng.Chem. 13 (1), 33-35 (1941).
- Wood, E. D., Armstrong, F. A. J., Richards, F. A. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 47 (1), 23-31 (1967).
- Sharp, J. H., et al. A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater. Mar. Chem. 78 (4), 171-184 (2002).
- Sharp, J. H. Marine dissolved organic carbon: Are the older values correct. Mar. Chem. 56 (3-4), 265-277 (1997).
- Holmes, R. M., Aminot, A., Kerouel, R., Hooker, B. A., Peterson, B. J. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56 (10), 1801-1808 (1999).
- Degobbis, D. On the storage of seawater samples for ammonia determination. Limnol. Oceanogr. 18 (1), 146-150 (1973).
- Tupas, L. M., Popp, B. N., Karl, D. M. Dissolved organic carbon in oligotrophic waters: experiments on sample preservation, storage and analysis. Mar. Chem. 45, 207-216 (1994).
- Yoro, S. C., Panagiotopoulos, C., Sempéré, R. Dissolved organic carbon contamination induced by filters and storage bottles. Water Res. 33 (8), 1956-1959 (1999).
- Zhang, J. Z., Fischer, C. J., Ortner, P. B. Laboratory glassware as a contaminant in silicate analysis of natural water samples. Water Res. 33 (12), 2879-2883 (1999).
- Yoshimura, T. Appropriate bottles for storing seawater samples for dissolved organic phosphorus (DOP) analysis: a step toward the development of DOP reference materials. Limnol. Oceanogr-meth. 11 (4), 239-246 (2013).
- Strickland, J. D. H., Parsons, T. R. A practical handbook of seawater analysis. , Fisheries Research Board of Canada. Ottawa. (1968).
- Eaton, A. D., Grant, V. Freshwater sorption of ammonium by glass frits and filters: implications for analyses of brackish and freshwater. Limnol. Oceanogr. 24 (2), 397-399 (1979).
- Norrman, B. Filtration of water samples for DOC studies. Mar. Chem. 41 (1-3), 239-242 (1993).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W. Growth of bacterioplankton and consumption of dissolved organic carbon in the Sargasso Sea. Aquat. Microb. Ecol. 10 (1), 69-85 (1996).
- Grasshoff, K., Ehrhardt, M., Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Second, Revised and Extended Edition. , (1999).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Nutrient utilisation by shallow water temperate sponges in New Zealand. Hydrobiologia. 687 (1), 237-250 (2012).
- Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Estimates of particulate organic carbon flowing from the pelagic environment to the benthos through sponge assemblages. PLoS ONE. 7 (1), e29569 (2012).
- Pile, A. J., Patterson, M. R., Witman, J. D. In situ grazing on plankton <10 µm by the boreal sponge Mycale lingua. Mar. Ecol. Prog. Ser. 141, 95-102 (1996).
