Introduction
底生サスペンションフィーダは、海洋生態系1の機能に重要な役割を果たしています。水2,3の大ボリュームをフィルタリングすることにより、それらは削除して、微粒子（プランクトンやデトリタス）及び（およびその中の参考文献）溶解した化合物1を排泄し、底生-遠洋カップリング4,5と栄養循環6,7の重要な薬剤です。正確に微粒子および溶解した化合物を除去し、（そのようなスポンジ、ホヤ、多毛類、および二枚貝など）底生サスペンションフィーダによって排泄を測定することは、その生理機能、代謝および摂食生態を理解することが基本です。一緒に速度測定をポンピングして、それはまた、これらの生物とその生態水質への影響だけでなく、生態系の規模の方法にすることによって媒介される栄養フラックスの定量化を可能にします。
微粒子の除去および生産速度を測定する適切な方法を選択し、溶解コムサスペンション濾過摂食によりポンドは彼らの摂食活動8に関する信頼性の高いデータを得るために重要です。 Riisgårdと他の人が指摘したように、不適切な方法論は、特定の物質の摂取と排泄の不正確な推定値を生成、実験条件を歪める、結果にバイアスをかけると、これらの生物によって処理された栄養フラックスの誤った定量化につながることができます。
二つの最も頻繁に使用される方法は、インキュベーション（間接技術）や周囲の同時収集と吐き出される水（直接技術）のいずれかを伴う濾過摂食中の微粒子や溶解栄養フラックスを測定しました。インキュベーション技術をインキュベート水中の微粒子の濃度と溶解栄養素の変化率を測定し、適切なコントロール8と比較して、製造又は除去の速度を推定に基づいています。しかし、インキュベーションチャンバー内の生物を囲むと、そのfeedinを変更することができますグラム起因および/ または食品の濃度で、またはによる排泄のインキュベーション水7,9中の化合物（およびその中の参考文献）の蓄積への酸素の減少に起因自然流況の変化に行動をポンピング。閉じ込め変性給水の効果に加えて、培養技術の主要なバイアスは、再濾過効果（実施例10を参照のこと）に由来します。これらの方法論的な問題のいくつかは、インキュベーション容器11の右のボリュームや形状を使用するか、 その場 12 における循環鐘システムの導入により克服されてきたが、この技術は、多くの場合、除去し、生産速度を過小評価します。このような溶存有機窒素（DON）と炭素（DOC）または無機栄養素として溶解した化合物の代謝を定量化、インキュベーション技術13によって引き起こされるバイアスに特に傾向があることが証明されています。
60年代後半と70年代初頭、ヘンリーReiswigで9,14,15は、別途その場で生物によって吸入および吐き出さ水をサンプリングすることにより、巨大なカリブ海スポンジによって粒子除去を定量化するために、直接技術の適用を開拓してきました。小さ いサスペンションフィーダー上で、より挑戦的な水中の条件でReiswigの技術を適用する難しさに起因して、この分野の研究の大部分は、主に間接的なインキュベーション手法16を採用した （in vitroでの ）実験室に制限されていました。 Yahelらは、小規模な条件で動作するようにその場技術で Reiswigのダイレクトを改装しました。彼らの方法は、INEX 16と呼ばれる、乱されていない生物によって（例）（中）吸入および吐き出さ水の同時水中サンプリングに基づいています。動物によるその物質のサンプル（INEX）の対の間の物質（ 例えば 、細菌）の異なる濃度が保持（または生産）の尺度を提供します。 INEX技術は、オープンエンドチューブを採用し、受動的に捕集管に周囲の水を交換するために研究生物のポンプ活動によって生成流出するジェットに依存しています。 Yahelや同僚が正常に15以上の異なるサスペンションの研究にこの手法を適用しているが分類群（ 例えば 、17）フィーダ、この方法は、いくつかの突出形のオリフィスの微小サイズによって、およびにより、必要な実践と経験のハイレベルによって制約されます海の状態。
これらの障害を克服するために、我々は、微小管を通るサンプリング水の制御された吸引（外径<1.6ミリメートル）に基づいて、別の技術を開発しました。私たちの目標は、このような底生サスペンションフィーダの流出性のオリフィスとして清潔で、非常に具体的な点から、 その場で採水して制御できるようになり、シンプルで信頼性が高く、安価なデバイスを作成することでした。有効であるために、この方法は、周囲の流動様式に影響を与えるまたはbを変更しないように、非侵入である必要があります研究生物のehavior。ここで提示デバイスがVacuSIPと呼ばれています。これはYahel らによって開発されたSIPシステムの単純化です。深海におけるROVベースのポイント・サンプリングのための（2007）18。 VacuSIPは、元のSIPよりもかなり安価であり、それはSCUBAベースの作業に適応されています。システムは、実験室の設定のためのライトとスティーブンス（1978）19とMøhlenbergとRiisgård（1978）20によって提示され、テストの原則に基づいて設計されました。
VacuSIPシステムは底生サスペンションフィーダの代謝のインサイチュ研究にするために設計されたが、それはまた、実験室での研究のために使用することができ、制御された、きれいな、点源水のサンプルが必要とされる場所。 その場での濾過または長期間（分-時間）にわたって統合が必要とされると、システムは特に便利です。 VacuSIPは2011年以来Yahelラボで正常に使用し、また持っているされていますカリブ海と地中海スポンジ種21によって媒介される栄養フラックスの2の最近の研究で採用されて（Morganti ら提出）。
VacuSIPが適用される特定のサンプラーの使用、長時間のサンプリング期間、およびフィールド条件は、収集、フィルタリング、および敏感な分析物についてサンプルを保存するための標準的な海洋プロトコルからいくつかの偏差を伴います。収集後の細菌活動によってVacuSIPシステムまたはサンプリング水の変形の危険性により、汚染のリスクを低減するために、我々は、in situ濾過および記憶手順で種々の試験しました。異なるフィルタリング装置、収集容器、および保存の手順は、溶存無機（PO 4 3-、NO X - 、NH 4 +、のSiO 4）の分析のために最も適切な技術を達成するために検討した有機（DOC + DON）を化合物は、超プランクトン（<1081; m）および粒子状有機（POC + PON）のサンプリング。さらに、特に野外条件下で、汚染の危険性を低減するために、処理ステップ数は、最小限に減少しました。方法が提示された視覚的なフォーマットは、再現性を促進するために、かつ効率的な技術を適用するのに要する時間を短縮するように配向されています。
システム概観
2ミリメートルほどの小さな出水口付サスペンションフィーダからその場揚水にサンプリングするために、各試験片のポンプ活性は、最初の吸入口（複数可）の横にフィルタリングフルオレセイン染色された海水を放出し、流出する開口部16からその流れを観察することによって可視化されます（18にも図2Bを参照してください）。研究試料（水が流れ込むと流出する）によって吸入および吐き出される水が同時にカスタムビルドのマニピュレータにインストールされている微小管のペアを使用して、または「ARの2でサンプリングされています逆さま柔軟なポータブル三脚のミリ秒」（ 図1及び補足ビデオ1）。研究生物によって吸入水を注意深く研究生物の吸入開口部の中や近く1チューブの近位端を配置することによって収集されます。同一次に、チューブを一本幹のオリフィスの内側に配置されている。この操作では、堆積物の再懸濁によって、 例えば 、動物の接触や外乱を避けるために良いケアを必要とする。サンプリングを開始するには、ダイバーが接続注射針で回収容器内のセプタムを穿刺サンプリングチューブを介して容器内にサンプリングされた水を強制的に外部の水圧を可能にする、各チューブの遠位端は、吸引は、以前のバイアルに生成された真空によって、外部の水と排気試料容器との間の圧力差によって開始されます。
吐き出された水のきれいなコレクションを確保するため、およびアンビの偶然の吸引を避けるために、ENTの水16は 、水のサンプリングレートは、流出する流量よりも有意に低い割合（<10％）に維持する必要があります。吸引速度は、管の長さおよびその内径（ID）によって制御されます。小さな内径も無視できるデッドボリューム（<チューブのメートル当たり200μl）を保証します。長期間（数分から数時間）にわたってサンプリングは、対象のほとんどの物質の固有のパッチ状に統合することができます。サンプルは十分に、ラボへの輸送のためだけでなく、長時間の水中サンプリングセッション中に保存されていることを確認するには、その場のろ過に感度の分析物のために推奨されます。サンプリング容器、濾過アセンブリと、チューブの選択は、試験生物および特定の研究の質問によって決定されます。以下に記載されているプロトコルは、完全な代謝プロファイルは（概要については、 図2を参照）関心があることを前提としています。しかし、プロトコルのモジュール性がfを許可しますまたは単純な、あるいは非常に異なるサンプリング方式に対応するために簡単に修正。完全な代謝プロファイルの場合、サンプリングプロトコルは、次の手順含まれている必要があります（1）フローの可視化を、 （2）サンプリング超プランクトン送り（プランクトン<10ミクロン）。 （3）（インラインフィルターを使用して）無機栄養素の摂取と排泄をサンプリング。 （4）サンプリング有機取り込みと排泄を溶解した（インラインフィルターを使用）。 （5）粒子状供給および排泄（インラインフィルターを使用）。 （6）ステップ2を繰り返し（品質チェックなどの超プランクトン送り）。 （7）流れの可視化。
ロジスティック実現可能な、それは代謝プロファイルの測定は速度をポンプと組み合わされることが推奨されている場合（ 例えば、色素の先端速度方法、16）だけでなく、呼吸測定と。これらの測定は、最高のサンプリング・セッションの開始時と終了時に採取します。呼吸測定のために、水中オプトードまたは微小電極が好ましいです。
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Protocol
1.準備手順とクリーニング手順
- 洗浄液
- すべての回で防護服、白衣、手袋を着用してください。ほこりや煙のない清浄な空間でこれらの準備手順を実行します。
- 新鮮な、高品質で、二重蒸留水で百分の五から十まで塩酸（HCl）溶液を調製します。
- 新鮮な、高品質で、二重蒸留水で（物質一覧を参照してください）アニオン性および非イオン性界面活性剤溶液の5％溶解性の高い基本的なミックスを調製します。
- きれいな、酸にすべてのソリューションを保存する容器を洗浄しました。
- （実験室での）準備段階とクリーニング手順
注：リン化合物に関心がない場合は、塩酸洗浄は、高品質のリン酸（H 3 PO 4）洗浄（8％H 3 PO 4の最終濃度）で置き換えることができます。- すべての回で防護服、白衣、手袋を着用してください。
- ウォッシュサンプリング装置の高純度水の十分な量で（インラインステンレス鋼Swinneyフィルターホルダーを除きます）。一晩5から10パーセントのHCl溶液に浸漬装置を残します。高品質の二重蒸留水の十分な量で、再び装置をすすぎます。
- 高純度水の十分な量で、ラインステンレス鋼Swinneyフィルターホルダーを洗います。一晩5％にアニオン性および非イオン性界面活性剤の溶液の溶解性の高い基本的なミックスを浸漬フィルターホルダーを残します。十分な高品質の二重蒸留水で再びそれらをすすぎます。
- ドライすべてのサンプリング装置、アルミ箔でそれらをラップし、使用するまでクリーンボックス内に保ちます。
- 吸引速度制御
- 計画された作業の深さと水の温度に応じて吸気管の長さ及び内径を調整することにより、サンプリングレートを制御します。完全develのために使用されるハーゲン・ポアズイユ流れから派生し、次の式を（使用してくださいガイドとしてOPED層状パイプ流）：
ここで、F =流量（cm 3で分-1）、ΔPは=差圧（バール）、R =入口内径チューブ（cm）で あり、K = 2.417×10 -9（秒-2）、L =管の長さ（cm ）、V =水の粘度（グラム-1秒-1）。詳細については、 表1を参照してください。 - 研究動物のポンピング速度の1％未満にサンプリングレートを保ちます。
注：不明な真空で時々、避難した容器を使用するには、追加の合併症を引き起こします。したがって、フィールドテストを強くお勧めします。 10メートルの深さと〜22℃の海水（40 PSU）では、254ミクロンの内径50センチメートル入口チューブは〜26μlの秒-1（1.56ミリリットル分-1）の平均吸着率を実現します。
- 計画された作業の深さと水の温度に応じて吸気管の長さ及び内径を調整することにより、サンプリングレートを制御します。完全develのために使用されるハーゲン・ポアズイユ流れから派生し、次の式を（使用してくださいガイドとしてOPED層状パイプ流）：
- サンプリング容器
- 少量のサンプル（3〜20ミリリットル、 例えば、フローCYT用超プランクトンのためにometry）プレバキューム滅菌プラスチックチューブを使用しています。
注：プレバキューム滅菌プラスチックチューブを日常ヒトでの標準的な血液検査のために使用されます。無添加で滅菌チューブを使用してください。これらの真空に滅菌プラスチックチューブは、最高のオフセンタールアー滅菌、使い捨てのチューブホルダーを使用してサンプリングされます。これは、最も安全で効率的なサンプリング装置であるが、それは単純な針に比べてわずかに大きいデッドボリュームを有します。 - このような栄養素や溶存有機物などのより大きな水試料については、揮発性有機分析のための環境保護庁（EPA）の基準を満たす40または60ミリリットルのガラス製バイアルを使用します。これらのバイアルは、PTFE-直面シリコーンセプタムを有するポリプロピレンキャップを含みます。
- さらに大きなボリュームの場合、ゴム栓や魔法瓶とペニシリンボトルを使用しています。
- シリカサンプルについて高密度ポリエチレンバイアル（HDPEバイアル）を使用します。
- 試料容量を増加させるとストッパ脱落の危険性を減らすために上昇中に、真空ポンプでダイビングする前に（真空）の項目を1.4.2-1.4.4避難。ハンド真空ポンプを用いて、あるいはシリンジで空気を吸引することによって手動で真空。しかし、最良の結果を得るために、良好な真空ポンプが推奨されます。標準的な凍結乾燥機は、高真空を提供します。
注：速い初期吸引速度が吐き出さ水試料を汚染しないことを確実にするために大規模な真空吸引フラスコを使用した場合、特別な注意を払ってください。
- 少量のサンプル（3〜20ミリリットル、 例えば、フローCYT用超プランクトンのためにometry）プレバキューム滅菌プラスチックチューブを使用しています。
- 容器のクリーニング手順
- 溶解有機物およびNH 4 +分析のために、新しい予め洗浄EPAバイアルを使用します。
- 次のように他の栄養素を分析するためのバイアル（ガラスとHDPE）をリンス：
- バイアル（ガラスとHDPE）、高品質の二重蒸留水でポリプロピレンキャップをすすぎます。新しいシリコンセプタムを取り付けます。
- 少なくとも3日間のHCl 10％でバイアル（ガラスとHDPE）を浸し、十分な高品質の蒸留水ですすいでください。
- 4時間450℃でガラスバイアルを燃焼し、炉内で冷却させます。キャップをインストールし、使用するまでアルミホイルで包みます。
- フィルター
- すべての溶存有機試料（ 例えば 、DOC、DON）の濾過のためや粒状有機物（ 例えば 、POC、PON）の収集のためにバインダーを含まないガラス繊維フィルターを使用してください。独立したアルミ箔エンベロープ内の各ガラスフィルターを梱包してください。使用するまで清潔で乾燥した容器内の有機残渣や店舗を揮発さ2時間400℃で燃焼します。
- 無機栄養素（ - 、NH 4 + 例えば、PO 4 3-、NO X）をサンプリングするため、上記のようにバインダーを含まないガラス繊維フィルターのいずれかを使用するか、または0.2ミクロンのポリカーボネート膜。 （1.7.3）以下に説明するように、一度フィルターホルダーに設置され、後者を清掃してください。
- シリカサンプリングに0.2μmのポリカーボネート膜フィルターを使用してください。一度installeそれらをきれいにフィルターホルダー中のd（1.7.3）について説明します。
- 濾過アセンブリの調製
- 濾過アセンブリを清掃するためにそれらを使用する前に、0.2μmのフィルターを通してアニオン性及び非イオン性界面活性剤溶液と、高品質の二重蒸留水の溶解性の高い基本的なミックスをフィルター。
- 栄養素とシリカ以外の溶存有機物のための濾過アセンブリ：
- 洗浄のインラインステンレス鋼Swinneyフィルタホルダ内の燃焼バインダーを含まないガラス繊維フィルターを置きます。
- アセンブリ全体を通して再蒸留水をアニオン性及び非イオン性界面活性剤溶液の5％溶解性の高い基本的なミックスの100ミリリットルを実行し、高品質の100ミリリットルを酸洗浄注射器を使用してください。
- SiO 4のための濾過アセンブリ：
- 清掃ポリカーボネートフィルターホルダー（PC用フィルターホルダー）内部のポリカーボネートフィルターを置きます。
- rに酸洗浄注射器を使用してください未5％HClを30mlのアセンブリ全体を通じて、高品質の二重蒸留水30ml。
- システムアセンブリ
- 1.6ミリメートルの外径（OD）と254ミクロンまたは177ミクロンの内径（ID）とPEEK（ポリエーテルエーテルケトン）チューブを用いて、水中作業のためのシステムを組み立てます。
- 必要な長さにチューブをカットする鋭いナイフやPEEKカッターを使用してください。
- その遠位端（試料容器側）に、注射針に取り付けられた雄ルアーコネクターと各チューブに適合する。あなたは、製造元の指示に従ってくださいと緑のナットを締める前に、チューブの端部と青色のフランジレスフェラルの平らな面を揃えていることを確認します。
- 絶縁テープを使って三脚「アーム」またはカスタム構築されたマニピュレータにPEEKチューブを取り付けます。
- 雄型ルアーコネクタに使い捨ての注射針を取り付けます。怪我を防ぐために、その保護キャップと針を保管してください。 明らかに、サンプリングギアとカラーコードにラベルを付け、すべての吸入および呼気成分（ 例えば 、=緑で、赤=例）。
- 連番ペアのサンプリング容器のセットと同様にカラーコードサンプリング容器を。
ここで、F =流量（cm 3で分-1）、ΔPは=差圧（バール）、R =入口内径チューブ（cm）で あり、K = 2.417×10 -9（秒-2）、L =管の長さ（cm ）、V =水の粘度（グラム-1秒-1）。詳細については、 表1を参照してください。 2.ワーキング水中
- 作業現場の準備
- 予備調査と標本の選択
注：これにより水中のサンプリングプロトコルの複雑な性質のために、効率的なサンプリングダイビングを確保する準備のために必要な時間を捧げます。- 作業現場を調査し、事前に必要な準備を行います。
- 比較的容易にアクセスすることができ、適切な標的生物を選択し、マークします。ていないすべての生物が必ずしもサンプリング潜水時にアクティブにできるので、あなたがサンプリングするために予想以上のワークステーションを準備します。
- ベースサポートのインストール
- WHEnは水平に、基板上に取り組んで：
- 1キロダイビング重みにフレキシブル三脚のオリジナルクイックリリースクリップをマウントし、単純に次の目標動物にそれを配置します。
- 垂直の壁に作業する場合：
- マウントベース支持VacuSIPシステム用のプレート、アクセサリーギア用のフック、および作業現場の準備段階中にトレイを運ぶ収集容器用ハンガー（2.1.1）。
- 柔軟なポータブル三脚を使用する場合には、各ターゲット動物の隣に10×10センチメートルPVC板を固定するためのボルトまたは二成分のエポキシ樹脂を使用しています。各プレートは、柔軟なポータブル三脚のクイックリリースクリップを取り付けるための穴を持っている必要があります。
- 樹脂が硬化したとベースプレートがしっかりと壁に取り付けられた後は、VacuSIPシステムのための柔軟なポータブル三脚用の強固な付着点として、クイックリリースクリップにねじ込みます。
- WHEnは水平に、基板上に取り組んで：
- 予備調査と標本の選択
- バージニア州のインストールCUSIP
- 試料が吸入口の横フィルタリングフルオレセイン色素を放出することによってポンピングされているかどうかを確認し、Yahel らに記載されているように色素がexhalentオリフィスを通って浮上していることを確認してください。（2005）16。
- VacuSIPデバイスをインストールして（〜5ミリメートル以内）だけ横に吸入剤（IN）サンプリング吸入オリフィス内チューブまたはを配置します。吸入管は別の出水口に近接していないことを確認してください。
- 慎重に接吻/出水管に向かって出水（EX）サンプリングチューブを指示し、それが接吻/出水管（ 図1及び補足ビデオ1を参照）の内側に1〜5ミリメートルに配置されるまで、非常に軽く、それを挿入します。接触をしないように細心の注意を払うか、そうでなければ、サンプリング生物を乱します。
- サンプリングの前との間に両チューブの位置をダブルチェック。
- サンプリングした後、試料はまだデようポンピングされているかどうかを確認します上記cribed（2.2.1）。
注：他の操作三脚の一方のアームの動きは、発生まず吸入サンプリングチューブを配置することを確認し、第二に、より正確な操作を必要とする出水管、可能性があるため。出水サンプリングチューブの操作は吸入管の運動を引き起こす可能性がある場合であっても、この順に続いて、それがサンプリングに影響を与えません。
- モジュラー水中サンプリング手順
注：調査の質問に保留は、以下の実験の各ステップは、スタンドアロンの実験のように行うことができます。以下で説明する完全な代謝プロファイルのサンプリングプロトコルは、検体あたり8時間まで必要とする、長いプロセスである（概要については、 図2および表2を参照してください）。ダイビング条件や規制はサンプリングサイト、地域、機関間で異なるように、ダイビング計画は、このプロトコルには含まれません。それにもかかわらず、細心の注意と経済産業省をささげますダイビングの計画にculous計画。彩度とヨーヨーダイブプロファイルを避けるために特別な注意を払ってください。可能な場合、浅く（<10メートル）で、これらの実験を実施することをお勧めします。閉回路のリブリーザーは、このような長時間のサンプリングスキームのために非常に便利です。- 実際のサンプリングを開始する前に、フルオレセイン残基の目に見える痕跡が残っていないと、その中断堆積物が決済されているか離れて漂っていることを確認してください。
- 超プランクトン、（何のフィルタは、この段階でインストールされていません！）
- （呼気）IN（吸入）とEX滅菌プラスチックチューブのセプタムを真空引きを貫通する針を使用してください。その水は、計画速度で滴下されていることを確認2~6ミリリットルの水のサンプルを収集します。
- 検索では、氷の上でコールドボックス内のサンプルを保持します。研究室では、1％パラホルムアルデヒド+ 0.05％EMグレードのグルタルアルデヒド（最終濃度）、または0.2％EMグレードのグルタルアルデヒドで保存します。 -80で液体窒素とストア内のクライオバイアルを凍結＃176; C分析まで。
- ケイサンプリングと保存
- チューブの先端に針とルアーオスコネクタとの間に0.2μmのポリカーボネート膜を含む予備洗浄のインラインステンレス製PCのフィルターホルダーを取り付けます。
- ピアスサンプリングを開始する前に洗浄高密度ポリエチレンバイアル（HDPEバイアル）のセプタムキャップ。両方のサンプラーが滴下されていることを確認し、各バイアルに水15mlを集めます。
- 分析まで（4℃）、冷蔵サンプルを保管してください。分析は、-20℃で2週間、店舗内で開始できません。分析のために、サンプルはシリカゲルを溶解するために、少なくとも50分間、50℃で解凍していることを確認してください。
注：必要に応じて膜を顕微鏡やDNA分析のために保存することができます。
- 溶存無機物（PO 4 3-、NO X - 、NH 4 +）
- トンを交換します前燃焼ガラスフィルターが含まれている予備洗浄のインラインステンレスフィルターホルダーを持つ彼は、PCフィルタアセンブリ。
- サンプリングの前に、海水試料の少なくとも20ミリリットルの吸引を開始するために、EPA、HDPEバイアルまたは他の真空容器を使用して、全体の濾過システムを通過したことを確認してください。それらが廃棄される前に集められた水の量を測定します。
- ピアース、サンプリングを開始し、両方のサンプラーが垂れていることを確認し、硝酸塩とリン酸塩の分析のために25〜30ミリリットルを収集するための適切なEPAのガラスバイアルのセプタムキャップ。
- 、アンモニア分析のための新しいEPAのガラスバイアルに切り替え、両方のサンプラーが垂れていることを確認し、各バイアル中の20ミリリットルを集めます。
- 分析まで-20℃で氷と店舗でのコールドボックス内のサンプルを保管してください。
注：唯一の濾液に関心がある場合、使い捨て注射器フィルタは、ステップ2.3.3および2.3.4のために使用することができます。
- 溶存有機物（DOC + DON）サンプリングおよびST論理和
注：その試料水は、シリコンセプタムに接触しないように取り扱いを通じて、できるだけ直立サンプルを保管してください。- ステンレス鋼のフィルタアセンブリの使用を継続し、上記のように、新たなEPAのガラスバイアルに海水サンプル20mlの収集。
- 検索時には、氷の上でコールドボックス内のサンプルを保持します。ラボでは、オルトリン酸の試料を固定するために事前に燃焼ガラスパスツールピペットを使用するか、塩酸（20ミリリットルサンプル、最終濃度0.04％に25％の微量金属グレードの酸の5-6滴を追加します）（2滴を追加微量金属グレードの20ミリリットルのサンプル、最終濃度0.1％）に酸を濃縮し、冷蔵保管してください。
- 分析まで（4℃）、冷蔵サンプルを保管してください。サンプルは分析するまで-20℃で収集、店の一週間以内に分析されていない場合。
- 粒状有機物（POC、PON、POP）
- STを使用し続けますスチールフィルターアセンブリおよびフィルタを排気250ミリリットル真空フラスコへの海水の少なくとも500ミリリットルainless。必要に応じて、フラスコを交換してください。
- 検索では、フィルターホルダーから残りのすべての海水を避難アルミホイルでそれをラップし、氷上でコールドボックスに格納するために空気で満たされた注射器を使用しています。ラボでは、フィルターホルダーからフィルタを削除し、分析まで-20℃で保存します。
- 実際のサンプリングを開始する前に、フルオレセイン残基の目に見える痕跡が残っていないと、その中断堆積物が決済されているか離れて漂っていることを確認してください。
図1. VacuSIPの正しいインストールの例：吸入および吐き出された水サンプルの黄色（写真のための緑の使用カラーコードとカスタムビルドのマニピュレータを使用して、ホヤPolycarpaのmytiligera（アカバ湾、紅海）をサンプリング（A） ）トムShelizengerとのYuval Yacobiによって; （B）スポンジAgelasのoroidesをサンプリング（NW地中海VacuSIPデバイスを使用して3mmの小孔幅、シー）。使用するカラーコードが吐き出された水試料のための吸入や赤、黄色である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
プロトコルセクションで説明VacuSIP技術の2概要図 。ラボの作業は、黄色のボックスに青いボックス内のフィールドワークを表現されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1.全体の平均サンプリングレートは（ミリリットル分-1）異なる容器を用いて得られました水のコレクションとは異なる真空レベルに使用：フラスコを（なし）真空にしませんでした。 EPAのガラスバイアルとHDPEバイアルは、そのボリューム（1/2容量）の半分を真空にしました。滅菌プラスチックチューブは既にメーカーによって真空にしました。 79センチメートルの長さと25μmの内径のPEEKチューブを使用して5〜8メートルの深さ、18〜22℃の水温で働きます。
サンプリング容器、固定液、インラインフィルタアセンブリ、ストレージプロトコルの項に記載の分析方法の概要表2。分析化合物は：超プランクトン豊富（プランクトン<10ミクロン）、ケイ酸（のSiO 4）、リン酸（PO 4 3-）、亜硝酸塩+硝酸塩（NO 2 - + NO 3 - ）、溶存有機物（DOM）、アンモニウム（NH 4 +）および粒子状有機物（POM）。すべてのサンプル容器は、シリコンセプタムキャップを有し、サンプリングの前に真空引きされます。固定剤は、以下のとおりです。パラホルムアルデヒド+グルタルアルデヒド（Glutの+ Parafor）、オルトリン酸（H 3 PO 4）および塩酸（HCl）。使用インラインフィルターアセンブリは、次のとおりです。ポリカーボネートフィルターホルダー及びポリカーボネートメンブレン0.2μmのフィルター（PC用フィルターホルダー+ PC膜）とステンレス製フィルターホルダー、バインダーを含まないガラス繊維GFFをフィルタリングします。
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Representative Results
海水収集方法の最適化
収集バイアルおよび洗浄手順の選択
VacuSIP互換収集容器はサンプリングが注射針で突き刺すことによって開始されることを可能にするセプタムを持つべきです。彼らは上昇し、水中の圧力（典型的なスキューバ作業深さで2-3のバー）に耐える必要があり、真空を保持する必要があります。揮発性有機物の分析のために、EPAによって承認されたバイアルの多くの（すべてではないブランドは）これらの基準を満たしています。 DOCおよびDON分析のために承認された予備洗浄バイアルも用意しています。収集及び分析栄養素のクリーニング手順を最適化するためのこれらのバイアルの適合性をテストするために、高品質の二重蒸留水を酸洗浄ポリプロピレンチューブ（PPチューブ）に回収し、新たに購入CID洗浄高密度ポリエチレンバイアル（HDPEバイアル）、およびEPAのガラスバイアル中、ポリテトラフルオロエチレン（PFTE）セプタムキャップを備えた全。上記のセクション1.5.2に記載したようにHDPEバイアル及びポリプロピレンチューブを洗浄し、そしてEPAガラスバイアルは、製造業者によって洗浄しました。
EPAのガラスバイアルで見つかったNH 4 +の量が相対的に最小であった（≤0.1マイクロモルのL -1）及び高品質蒸留水基準の品質に依存します。対照的に、NH 4 +濃度は、有意に（それぞれ、3,7倍まで）増加し、より高いANOVA F（酸洗浄ポリプロピレンチューブおよび高密度ポリエチレンバイアルの変動（5,53）= 7.183、Pを示し、< 0.001、 図3）。アンモニウム分析上のシリコンセプタムで高品質の二重蒸留水との接触の影響はなかったです。
洗浄/リサイクルガラスバイアル対新しいガラスバイアルのキープtogether.withinページ= "1"> の比較
EPAのガラスバイアルは回以上の栄養分析に利用することができるかどうかをテストするために、NO X - 、PO 4 3-、 そして新しいEPAガラスバイアルに集めた海水試料中のNH 4 +濃度を使用EPAガラスバイアルに集めたものと比較しました。 （1.5.2）上記のようにリサイクルガラスバイアルを洗浄しながら新しいEPAガラスバイアルは、製造者によって予め洗浄しました。リサイクルバイアルを新しいガラスバイアル中に見られるレベル倍1.5まで、有意に高いNH 4 +濃度を有していた（t検定、p <0.001、N = 5）。有意差はNO Xで見つかりませんでした-と新しいガラスに回収リサイクルバイアルに採取したサンプルとサンプルの間のPO 4 3-コンテンツバイアル（ 図4）。
ケイ酸塩の収集と保存手順
ケイ酸塩の分析のための最良のサンプリング容器を決定するために、高品質の二重蒸留水は、非洗浄及び酸洗浄高密度ポリエチレンバイアル（HDPEバイアル）中の酸洗浄ポリプロピレンチューブ（PPチューブ）に回収し、そしてEPAガラスバイアルインチ予測濃度から外れた値が汚染されたと考えられていたので期待ケイ酸濃度が、ゼロに近かったです。ケイ酸濃度が有意に酸洗浄HDPEバイアル中で最低のSiO 4濃度を示す、別のバイアル（ANOVA、F（3,19）= 210.047、p <0.001）で収集されたサンプル間で異なっていました。最終のSiO 4濃度は7マイクロモルまで増加して、サンプルを汚染されたホウケイ酸ガラスバイアルL -1（ 図 5）。
溶存有機物（DOM）および栄養分析のための濾過装置の選択
フィルタ装置は、溶解した有機（DOCおよびDON）と無機養分の分析で最も低いブランク生成するかを決定するために-ステンレスフィルターホルダーは、ポリカーボネートと比較した（NO X、NH 4 +、PO 4 3-）、Swinneyラインでフィルタホルダ。各フィルターホルダータイプで我々は、ポリカーボネート膜とプレ燃焼ガラス繊維フィルターの両方をテストしました。ポリカーボネート膜を装備したポリカーボネートSwinneyフィルタホルダが明らかに最大9倍のサンプルを汚染し、一方、ステンレス製のフィルターホルダーと燃焼ガラス繊維フィルターの組み合わせは、最低のブランクを提供しました。洗浄量を増加させることはなかったですこの問題は（ 図 6）を解決できません。
別のバイアルで収集図3.アンモニウム濃度（マイクロモルのL -1、平均値±SD）：（1）洗浄されていないHDPEバイアル; （2）クリーンHDPEバイアルを、 （3）クリーンHDPEバイアル+パラフィルム。 （4）EPAのガラスバイアル。 （5）EPAのガラスバイアル+パラフィルム。 （6）PPチューブをきれいに。パラフィルムをシリコンセプタムは、水サンプルを汚染し得るかどうかを試験するために置きました。各治療のために、高品質の二重蒸留水の9サンプルを分析しました。サンプルは新鮮な分析しました。有意差は、4つのサンプリング容器（ANOVA、F（5,53）= 7.183、P <0.001、パワーテスト= 0.992）との間で発見された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.アンモニウム（NH 4 +）、亜硝酸塩+硝酸塩（NOxの- ）、およびリン酸（PO 4 3-）濃度新たな（暗い）で収集した海水サンプルの（マイクロモルのL -1、平均値±SD）および清掃/リサイクル（白）EPAのガラスバイアル。海水は、海洋科学研究所の実験水槽区で回収し、ステンレススチール製フィルターホルダー、ガラスフィルターで濾過しました。水試料は、新鮮な分析しました。アスタリスク（*）の差が（t検定、P <0.001、N = 5、= 1パワーテスト）に有意であることを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5.ケイ酸濃度（マイクロモルのL -1、平均値±SD） 酸洗浄PPチューブ、PPチューブ、酸洗浄HDPEバイアル、新しいEPAのガラスバイアル：高品質の二重蒸留水を別のバイアルに回収します。有意差は、4つのサンプラーの材料との間に見出されました （ANOVA、F（3,19）= 210.047、p <0.001、パワーテスト= 1）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6.異なるろ過アセンブリの効果を検証し、亜硝酸塩+硝酸塩のボリュームを洗う（NO X -マイクロモルのL -1）。 NO xのサンプルは- （SS Fステンレス製で海水サンプルを濾過することによって得られましたILTERホルダー）やポリカーボネートのインラインポリカーボネート膜（PCフィルタ）やプレ燃焼ガラス繊維フィルターのいずれかを搭載したSwinneyフィルターホルダー（PC用フィルターホルダー）。 PCのフィルタの場合、5％HClおよび高品質の蒸留水の異なる体積（10、30、60、90、120 ml）をフィルタ組立体を洗浄するために使用した、洗浄体積は、図の凡例に括弧内に与えられています。値は平均±標準偏差として表さ（N = 5）しています。海水は、海洋科学研究所の実験アクアリウムゾーンで収集し、試料を濾過した後、新鮮に分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 実験結果の 7 例：吸入（IN、黒Chondrosiaは地中海にreniformisスポンジによって処理された異なる物質の円）および（EX、赤い三角形）対に吐き出さ水サンプルの濃度（マイクロモルのL -1）：（A）アンモニウム（NH 4 +）; （B）亜硝酸塩+硝酸塩（NOxの- ）; （C）リン酸（PO 4 3-）。 （D）シリケート（SIO 4）。 （E）溶存有機炭素（DOC）; （F）溶存有機窒素（DON）。 （G）浮遊性有機炭素（LPOC）。 （H）浮遊性有機窒素（LPON）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8.フローcytomの例水（A、C、E、G）吸入及びChondrosiaはreniformisスポンジにより（B、D、F、H）の呼気から引き出された対になった水試料のメトリ分析：（A、B、C、D）植物プランクトン集団。 （E、F、G、H）従属栄養細菌。 ABおよびEFでのサンプリングは、（すべてのプランクトンのグループが効率的に保持された）クリーンで正確でした。 CDおよびGHは、すべてのプランクトンのグループの低い除去を示し、吐き出された水の汚染の例です。シン：シ ネココッカス属 、ピコ：独立栄養picoeukariotes、ナノ：独立栄養nanoeukaryotes、高：高DNA含有量の従属栄養細菌、低：低いDNA含有量の従属栄養細菌この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足FigurProchlorococcus属 ：アサリチャマパシフィカによって異なるプランクトン獲物の電子1.セル保持効率。 （プロ）、 シネココッカス・エスピー。 （シン）、ピコ真核生物（ピコEUK）、ナノ真核生物（ナノEUK）。エラーバー= 95％CI。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足ビデオ1.サンプリング吐き出された水試料のための吸入のための緑と黄色の使用カラーコードとカスタムビルドのマニピュレータを使用して、ホヤPolycarpaのmytiligera。サンプリングチューブ（PEEK、ID54μmで75センチ）を注意深くホヤの出水及び吸入剤サイフォンに配置されます。水は分〜1ミリリットルの割合で避難チューブに引き込まよりも-1です。このデモでは、フルオレセイン色素は出水ジェットを視覚化するために使用されます。出水サンプリングチューブがうまくのwiに配置されていることに注意してください出水ジェット薄い。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
準備の手順
DOMおよび栄養分析のためのコレクターバイアル
収集容器は、溶解した微小成分と相互作用し得るとサンプラ壁は30-34成長細菌のための基板であってもよいので、DOMおよび栄養素収集のための別のバイアルを試験しました。サンプルはすぐに30を凍結されていない場合、ガラスびんは、最大2倍のシリカの初期濃度を増加させることができるので、ホウケイ酸は、シリカ定量33,35にはお勧めできません。我々の結果は、予備洗浄EPAバイアルを使用することが最も顕著アンモニウムのため、DOC、DON、及び無機栄養素のための低濃度ブランクになることを示しています。
DOC濾過および保管
濾過は多くの場合、必要とされ、海洋化学における第1の分析ステップであり、微生物学。それはラボで収集した後、サンプルをフィルタリングすることは可能ですが、この手順は、サンプルが離れて適切な研究施設から、多くの場合、遠隔地、数時間または数日で、水中収集され、その場での仕事のために推奨されません。 現場濾過でのインラインの使用は、サンプルの取り扱いを最小限に抑え、したがって、汚染の危険性を低減する。 その場ろ過でも細菌の大部分を除去し、試料組成物は長時間サンプリングおよび輸送中の細菌代謝によって変更されるリスクを低減します時間。濾過アセンブリは、サンプリング装置のデッドボリュームが増大し、また、汚染の源であってもよいです。可能な限り最小のフィルターホルダーの選択（ 例えば 、インラインSwinneyフィルターホルダー13ミ リメートル）と分PEEKチューブ（ 例えば 、254μmのID）がデッドボリュームと周囲の水による汚染のリスクを低減します。
適切なフィルタがない場合には使用するか、またはそれは慎重に洗浄されていない場合、アーチファクトおよび水試料の汚染は32,36-39が発生しやすいです。 DOC分析の研究は十分に高品質の二重蒸留水38でフラッシュされない場合は特に、有機化合物（ポリカーボネートとPFA-PTFE）製のフィルターとフィルターホルダーが厳しいDOC汚染32,37につながる可能性があることを示しました。現在のプロトコルおよび結果は、これらのガイドラインに従うと、またポリカーボネートフィルターホルダーは避けるべきであることを示しています。
現場での 作業との相互運用 では
VacuSIPシステムは、それらの天然の環境で乱されていないサスペンションフィーダの代謝およびシステムにおけるその生態学的役割の定量化の研究を容易に直接サンプリング技術です。経験と装備のダイバーのために、VacuSIP法の適用は簡単で、短いTRを必要としますaining。 INEX VacuSIP実験は高いため、ブランクを含むほとんどの分析のアーティファクトをコントロールし、「within'デザイン統計分析（ すなわち 、ペアリングまたは反復測定分析）のために設計されています。制御吸引の使用は、周囲の水で吐き出された水の事故による汚染を防止し、遅いと調節可能なサンプリング・レートを保証します。可能な場合、低電流および低濁度と作業現場の選択が推奨されており、クリーンで、より正確な結果を保証します。長時間のサンプリング時間（数分から数時間）が底生境界層を特徴づける高いパッチ状の統合が可能になります。これらのすべての機能が正しく適用された場合VacuSIP方法は反復数の少ない作業する場合であっても信頼性が高く、複製可能な結果を提供する、非常に堅牢であることを確認してください。地中海スポンジとインド太平洋の貝の種から得られた典型的な結果の例を図7およびSupplemenに示されていますタリ図1。
任意の技術と同様に、VacuSIPは潜在的な落とし穴の自由ではありません。最も一般的な問題は、周囲の水と呼気試料水の汚染です。これらのアーティファクトの理由は、高い吸着率、チューブdislodgments、および動物の行動が含まれます。正しいサンプリングレートの適切な選択が流出する流量の前の推定値に依存しています。このような推定値は、色素の先端速度法16を用いて得ることができます。理想的には、吸引速度は、ポンピング速度（ 例えば、1ミリリットル分-1 6 Lの時間-1率をポンピング）の1％以下に維持されるべきです。周囲の水の混入を避けるために、サンプリングレートは、ポンピング速度の10％を超えてはいけません。
サンプリング・レートを制御するために、吸気管の長さ及び内径は、計画された作業の深さと水温に応じて調整されるべきです。ハーゲン・ポアズイユ流れ（セクション1を参照してください。上記3.1）のガイドとして使用することができます。しかし、この式はΔP以来、一次近似として考慮し、サンプリング時間と、インラインろ過でレートの低下をサンプリングしなければならない不確定要素が追加されます。避難容器の使用は、時には未知の真空圧で、更なる合併症を紹介します。サンプリングレートが異なる真空で異なる排気コンテナの関数としてどのように変化するかの例は、 表1に示します。
還元は、サンプリングレートは、容易に（時間あたり数マイクロリットルのサンプリングレートが実現可能である）、この減少の技術的な制限が、管の長さおよびIDを調整することによって達成されます。それにもかかわらず、実験者は、遅いポンプ速度を有する動物のためにと小さな生物や標本のために、この制限によって決定遅いサンプリングレートに注意する必要があります。遅いサンプリングレートの即時含意は、単一のサンプリングsessiの間に収集することができ、水の限られた量でありますに。この低ボリュームは、これらのサンプルを使用して実行することが可能な分析と複製の数を制限し、したがってまた、これらの集団から得られる情報を制限します。
チューブの抜けを容易に発見することができ、サンプリングを中断または再開することができ、ダイバーが一定の時計を保っていることを条件とします。対照的に、サンプル中のポンプの停止を常に検出することは容易ではありません。これはスポンジのためだけでなく、ホヤ、二枚貝、および多毛類のためだけではなく、真実です。実際には、共通の信念に反して、ホヤや二枚貝はポンピングを停止するイベントは、サイホンジオメトリ（Yahel、未発表データ）で目に見える変化で記録しました。また、いくつかの場合には、被嚢類（すなわち無濾過が行われていない、である）なしメッシュ分泌とアクティブポンプを維持することができます。
サンプリングレートを制御することが重要です。この点でVacuSIPは、研究動物はする相対的な場合は特に、他の方法より優れていますエリー小さい場合、または、彼らはゆっくりとポンプ。注射器2を制御することが特に困難です。 、NO 3 - - 、NHたとえば、ペレア-Blazquézら（2012A）40は、NO 2（いくつかの温帯スポンジ種によって吐き出さ水をサンプリングするために注射器を使用し、驚くべきことに、特定の栄養素の摂取/排泄の一般的なパターンを見つけることができませんでした4 +、PO 4 3-、のSiO 4）。明確なパターンの欠如はおそらく注射器の使用による周囲の水と呼気サンプルの汚染の結果です。従属栄養細菌の40±14％およびシネココッカスsp。の54±18％：汚染は、彼らのスポンジのためペレア-Blázquezら（2012B）41によって報告されたピコプランクトンの極めて低い保持効率から明らかです。比較のために、VacuSIP、ミュラーらを使用。 （2014）21は、従属栄養細菌の除去効率を報告しSiphonodictyon属で72±15％。そして、Clionaのdelitrixで87±10％。
サンプルの品質を確認し、周囲の水のコンタミネーションが発生しないことを確実にするために、我々は強く最初のフローサイトメトリーを用いて、ピコ・ナノプランクトンのサンプルを分析することをお勧めします。この、高速で信頼性が高く、安価な分析は、サンプル品質の即時情報を提供します。このようなシネココッカス属のようないくつかの獲物分類群のための非常に一般的です。スポンジとホヤで90％の効率14,42の近くにで除去することができます。このベンチマークからの著しい逸脱は、汚染が（ 図8）を発生している可能性があることを示唆しています。
信頼性が高く、きれいなサンプリングのために、7シンプルなルールな実験デザインを満たしていることを確認します：（1）（速度推定値をポンピング含む）予備調査を行い、よく現場を準備します。 （2）研究の動物を知っています。 （3）研究試料は、明確に定義された突出形の開口部Aを有していることを確認しますNDアクセス可能な場所。 （4）研究試料は前に、各サンプル採取後にポンピングされていることを確認。 （5）やや突出形の開口部（ 図1）の内部に吐き出された水を収集するためのチューブを置きます。 （6）を使用するサンプリングレート<流出する流量の10％は、1％を強くお勧めします。 （7）品質基準を定義し、疑いのあるINEXのペアを省略します。
これらの単純なルールに続き、VacuSIPシステムは、周りの異なる生態系における濾過摂食の機能的役割を評価するために使用することができ、正確かつ同等の推定を可能にする、自然条件に微粒子と溶解した化合物を処理する方法をアクティブサスペンションフィーダ測定の実用的かつ信頼性の高い方法を提供しています世界。
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Acknowledgments
私たちは、フィールドワークの彼の援助のためマネルボリバルに感謝します。私たちは、研究とサンプリング権限への支援のための「パルクナチュラル・デル・モングリ、レメデス島IエルBaixのテル」に感謝しています。水中マニピュレータはAyelet Dadon-Pilosofによって設計され、氏Pilosofにより作製しました。この作品は、スペイン政府のプロジェクトCSI-コーラル[RCおよびMRへの助成金番号CGL2013-43106-R]によって、およびTMに「MINISTERIOデEducaciòn、文化のy Deporte（MECD）」からFPUの交わりによってサポートされていました。これはG. Yahelへカタロニア政府が資金を提供海洋生物地球化学と地球変動研究グループからの寄与[助成金番号2014SGR1029]とISF助成金1280から1213とBSFの助成金2012089です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
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