VacuSIP, en forbedret Inex Metode for Published: August 3, 2016 doi: 10.3791/54221

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Teresa Morganti^1,2, Gitai Yahel³, Marta Ribes², Rafel Coma¹

¹Department of Marine Ecology, Centre d’Estudis Avançats de Blanes (CEAB-CSIC), ²Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC), ³The School of Marine Science, Ruppin Academic Center

Introduction

Bunnhenge matere spille viktige roller i funksjon av marine økosystemer ^1. Ved å filtrere store mengder vann ^2,3, de fjerner og skille ut partikler (plankton og detritus) og oppløste forbindelser ¹ (og referanser deri), og er et viktig middel for bentisk-pelagisk kopling ^4,5 og næringsstoff sykling ^6,7. Nøyaktig måling av partikler og oppløste forbindelser fjernet og utskilles av bunn suspensjon brett (som svamper, sjøpung, børstemark og muslinger) er grunnleggende for å forstå deres fysiologi, metabolisme, og fôring økologi. Sammen med pumping hastighetsmålinger, gjør det også en tallfesting av nærings flukser mediert av disse organismene og deres økologiske innvirkning på vannkvaliteten så vel som på økosystemet skala prosesser.

Velge den riktige metoden for å måle fjerning og produksjonsrater av partikler og oppløst compounds av henge filter feeders er avgjørende for å skaffe pålitelige data om deres fôring aktivitet ^8. Som påpekt av Riisgård og andre, upassende metoder skjevhet resultater, forvrenge eksperimentelle forhold, produsere uriktige beregninger av inntak og utskillelse av visse stoffer, og kan føre til feilaktig tallfesting av nærings flukser behandles av disse organismene.

De to hyppigst benyttede metoder for å måle partikler og oppløste næringsstoffer flukser i filter feeders bære enten inkubasjon (indirekte teknikk) eller samtidig samling av ambient og pustet ut vann (direkte teknikker). Ruge teknikkene er basert på måling av hastigheten av endring i konsentrasjonen av partikler og oppløste næringsstoffer i inkubert vann, og å estimere forekomsten av produksjon eller fjerning sammenlignet med betryggende kontroll ^8. Men omslutter en organisme i en inkubasjon kammer kan endre sin feeding og pumping oppførsel på grunn av endringer i den naturlige strømningsregime, på grunn av en nedgang i oksygen og / eller i mat konsentrasjon, eller på grunn av opphopning av utskillelse forbindelser i inkubasjonen vann ^7,9 (og referanser deri). I tillegg til effekten av innesperring og modifiserte vanntilførsel, en større skjevhet av inkuberingsbetingelser teknikker som stammer fra re-filtreringseffekter (se for eksempel ^10). Selv om noen av disse metodiske problemer er blitt overvunnet ved hjelp av riktig volum og form av inkubasjonen beholderen ¹¹ eller med innføring av en resirkulerende klokkekrukke system in situ ¹² denne teknikk undervurderer ofte fjerning og produksjonsrater. Kvantifisering metabolismen av oppløste forbindelser, slik som oppløst organisk nitrogen (DON) og karbon (DOC) eller uorganiske næringsstoffer, har vist seg å være spesielt utsatt for skjevheter som følge av ruge teknikker ^13.

På slutten av 60-tallet og begynnelsen av 70-tallet, Henry Reiswig^9,14,15 pioner bruk av direkte teknikker for å kvantifisere partikkel fjerning av gigantiske Caribbean svamper med separat prøvetaking vannet innånding og pustes ut av organismene i situ. På grunn av vanskeligheter med å anvende Reiswig teknikk på mindre fjæring matere og i mer utfordrende forholdene under vann, ble mesteparten av forskningen på dette feltet begrenset til laboratoriet (in vitro) ansette meste indirekte ruge teknikker ^16. Yahel og kolleger ombygget Reiswig direkte in situ teknikken til å fungere i mindre skala forhold. Deres metode, betegnet Inex ^16, er basert på samtidig undervanns prøvetaking av vann inhalert (I) og utåndet (Ex) ved uforstyrret organismer. Den forskjellig konsentrasjon av en substans (for eksempel bakterier) mellom et par av prøver (Inex) gir et mål for bibeholdelsen (eller produksjon) av det stoff av dyret. Inex teknikk syssels åpent rør oger avhengig av excurrent stråle produsert av pumpe aktiviteten av den undersøkte organisme til passivt å erstatte det omgivende vannet i oppsamlingsrøret. Mens Yahel og kolleger har med hell brukt denne teknikken i studiet av over 15 forskjellige suspensjon matere taxa (f.eks ^17), er metoden begrenset av det høye nivået av praksis og erfaring som kreves, ved minuscule størrelsen på noen excurrent åpninger, og ved å sjøforhold.

For å overvinne disse hindringene, har vi utviklet en alternativ teknikk basert på kontrollert suge av samplet vann gjennom minute rør (utvendig diameter <1,6 mm). Vårt mål var å lage en enkel, pålitelig og rimelig enhet som ville tillate ren og kontrollert in situ vannprøver fra en svært bestemt punkt, for eksempel excurrent åpningen av bunnhenge matere. For å være effektive, har metoden for å være ikke-påtrengende for ikke å påvirke omgivelsene strømningsregime eller endre behavior av de undersøkte organismer. Enheten som presenteres her er betegnet VacuSIP. Det er en forenkling av den SIP-system utviklet av Yahel et al. (2007) ¹⁸ for ROV-basert point sampling i dyphavet. Den VacuSIP er vesentlig billigere enn den opprinnelige SIP og det er tilrettelagt for SCUBA basert arbeid. Systemet ble utviklet i henhold til prinsippene presentert og testet av Wright og Stephens (1978) ¹⁹ og Møhlenberg og Riisgård (1978) ²⁰ for laboratoriet.

Selv om VacuSIP system er designet for in situ studier av metabolisme av bunnopphengsbrett, kan den også brukes for laboratoriestudier og hvor det kreves en kontrollert og ren, punkt-kilde vannprøve. Systemet er spesielt nyttig når integrasjon over lengre perioder (min-timer) eller in situ filtre er påkrevd. Den VacuSIP har vært brukt med hell på Yahel lab siden 2011, og har ogsåvært ansatt i to nyere studier av nærings flukser mediert av Karibien og Middelhavet svamp arter ²¹ (Morganti et al. innsendt).

Bruk av bestemte samplere, langvarig prøvetaking varighet, og feltforhold, der VacuSIP er anvendt, innebære noen avvik fra standard oseanografiske protokoller for innsamling, filtrering, og lagring av prøver for sensitive analytter. For å redusere risikoen for forurensning av den VacuSIP systemet og fare for modifikasjon av den samplede vann ved bakteriell aktivitet etter samling, testet vi forskjellige in situ filtrering og lagringsprosedyrer. Forskjellige filtrering enheter, samling fartøyer, og lagring av fremgangsmåter ble undersøkt for å oppnå den mest egnede teknikk for analyse av oppløst uorganisk (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, _NH4 ^+, SiO ₄₎ og organisk (DOC + DON) forbindelser, og ultra-plankton (<1081; m) og partikkel organisk (POC + PON) prøvetaking. For ytterligere å redusere risikoen for forurensning, spesielt under feltforhold, ble antall håndteringstrinn reduseres til et minimum. Den visuelle format hvor fremgangsmåten er presentert er orientert for å lette reproduserbarhet, og for å redusere den tid som er nødvendig for effektivt å bruke teknikken.

Systemoversikt

For å prøve in situ pumpet vann fra suspensjons forer med exhalant åpninger så små som 2 mm, blir pumping aktivitet av hver prøve først visualisert ved å slippe ut filtrert fluorescein farget sjøvann ved siden av inhaleringsmiddel åpningen (e) og å observere dens strømning fra excurrent åpning ¹⁶ (se også figur 2B i ^18). Vannet inhalert og pustes ut av studien prøven (incurrent og excurrent) blir deretter samtidig samplet ved anvendelse av et par med liten rør installert på spesialbygde manipulatoren eller på to av de "arms "av en opp-ned fleksibel bærbart stativ (figur 1 og Supplerende Video 1). Vannet inhaleres av studien organismen blir samlet ved forsiktig å posisjonere den proksimale ende av et rør inne i eller i nærheten av inhaleringsmiddel åpning av studien organisme. En identisk røret blir så plassert på innsiden av excurrent åpningen. Denne operasjonen krever god forsiktighet for å unngå kontakt eller forstyrrelse av dyret, for eksempel ved sediment resuspensjon. til å begynne samplings, skjærer en dykker en skillevegg i oppsamlingskaret med en sprøyte nål festet til distale ende av hvert rør, slik at det ytre vanntrykk for å tvinge det samplede vann inn i beholderen gjennom prøvetakingsrøret. suge~~POS=TRUNC er initiert ved hjelp av vakuum tidligere opprettet i ampullene og av trykkforskjellen mellom det ytre vann og det evakuerte prøvebeholderen .

For å sikre en ren samling av utåndet vann og for å unngå utilsiktet suging av ambient vann ¹⁶ må vannet samplingsfrekvens holdes på et betydelig lavere hastighet (<10%) enn excurrent strømningshastighet. Sugehastigheten styres ved lengden av røret, og dens indre diameter (ID). Den lille indre diameter sikrer også en ubetydelig dødt volum (<200 mL per meter rør). Prøvetaking over lengre perioder (minutter til timer) gjør det mulig å integrere den iboende patchiness av de fleste stoffer av interesse. For å sikre at prøvene er tilstrekkelig bevart i lange undervanns prøvetakinger så vel som for transport til laboratoriet, en in situ filtrering anbefales for følsomme analytter. Valg av prøvetakingsbeholdere, filtrering montering og rør er diktert av studie organismer og den spesifikke problemstillingen. Protokollen er beskrevet nedenfor går ut på at en fullstendig metabolsk profil er av interesse (for en oversikt se figur 2). Men den modulære naturen til protokollen kan feller enkel modifisering for å imøtekomme enklere eller til og med svært forskjellige prøvetakingsordninger. For fullstendig metabolsk profil, bør prøvetakingsprotokollen omfatter følgende trinn: (1) Flow visualisering; (2) Prøvetaking ultra-plankton fôring (plankton <10 mm); (3) Prøvetaking uorganiske næringsstoffer opptak og utskillelse (ved hjelp av in-line filter); (4) Prøvetaking oppløst organisk opptak og utskillelse (ved bruk av in-line filter); (5) partikler mating og utskillelse (ved bruk av in-line filter); (6) Gjenta trinn 2 (ultra-plankton fôring som kvalitetssjekk); (7) Flow visualisering.

Når logistisk mulig, anbefales det at den metabolske profilmålinger kombineres med pumpehastigheten (for eksempel fargestoffet fremre hastighet metode, i ^16), så vel som med respirasjon målinger. Disse målingene er best tatt ved begynnelsen og slutten av prøvetagnings sesjon. For åndedrett måling, undervanns optodes eller mikroelektroder er å foretrekke.

Protocol

1. forberedende skritt og rengjøringsprosedyrer

1. rensemiddel
   1. Bruke verneutstyr, laboratoriefrakk og hansker til alle tider. Utføre disse forberedende trinnene i en ren plass fri for støv og røyk.
   2. Forbered en saltløsning 5-10% syre (HCl) med frisk, høy kvalitet, dobbelt destillert vann.
   3. Forbered en 5% svært løselig enkel blanding av anioniske og ikke-ioniske overflateaktive løsning (Se Materials List) med frisk, høy kvalitet, dobbelt destillert vann.
   4. Oppbevar alle løsninger i ren, vasket syre containere.
2. Forberedende trinn og rengjøringsprosedyrer (i laboratoriet)
   MERK: Hvis fosforforbindelser ikke er av interesse, kan HCl-vaske erstattes av høy kvalitet fosforsyre (H ₃ PO ₄₎ vask (8% H ₃ PO _{4-sluttkonsentrasjon).}
   1. Bruke verneutstyr, laboratoriefrakk og hansker til alle tider.
   2. vaskprøvetakingsapparatet (med unntak av den in-line rustfritt stål Swinney filterholder) med rikelig mengde vann av høy renhet. La apparatet suger i 5-10% HCl løsning over natten. Skyll apparatet igjen med rikelig mengde av høy kvalitet dobbel destillert vann.
   3. Vask in-line rustfritt stål Swinney filterholdere med rikelig mengde høy renhet vann. La filterholderne soaking i 5% svært løselig enkel blanding av anioniske og ikke-ioniske tensider løsning over natten. Skyll dem igjen med rikelig høy kvalitet dobbel destillert vann.
   4. Tørk all prøvetaking apparat, pakk dem inn i aluminiumsfolie og ha i en ren boks før bruk.
3. Suge rate kontroll
   1. Styrer samplingsfrekvensen ved å justere lengden og indre diameter av inntaksrøret i henhold til den planlagte arbeidsdybden og vanntemperatur. Bruke følgende ligning (avledet fra den Hagen-Poiseuille ligning anvendes for fullt utvikviklet Laminar rør flow) som en guide: der F = strømningshastighet (cm ³ min ^-1), AP = differansetrykk (bar), r = innløpsslangen innvendig radius (cm), K = 2,417 x 10 ^-9 (sek ^-2), L = rørlengde (cm ), V = vannets viskositet (g ^{cm-1 sek-1).} Se tabell 1 for flere detaljer.
   2. Hold samplingsfrekvensen under 1% av pumpehastigheten av den undersøkte dyr.
      MERK: Bruk evakuert containere, noen ganger med ukjente vakuum utgjør ytterligere komplikasjoner. Derfor er en felttest sterkt anbefalt. På 10 m dybde og ~ 22 ° C sjøvann (40 PSU), en 50 cm innløpsrøret med en indre diameter på 254 um gir en gjennomsnittlig sugehastighet på ~ 26 mL sek ^-1 (1,56 ml ^min-1).
4. prøvetaking fartøy
   1. For små volum prøver (3-20 ml, f.eks, ultra-plankton for flyt cytometry) bruker forhåndsstøvsugd sterile plastrør.
      MERK: Pre-støvsugd sterile plastrørene blir rutinemessig ansatt for standard blodprøver hos mennesker; sørg for å bruke sterile rør uten tilsetningsstoffer. Disse suges sterile plastrørene er best samplet med bruk av sterile, engangsbruk rørholder med utenfor sentrum Luer. Selv om dette er den sikreste og mest effektive prøvetakingsapparat, den har et litt større dødvolum sammenlignet med en enkel nål.
   2. For større vannprøver som næringsstoffer og oppløste organiske, bruker 40 eller 60 ml hetteglass som oppfyller Environmental Protection Agency (EPA) kriterier for flyktige organiske analyser. Disse ampuller inkluderer polypropylen cap med en PTFE-faced silikon septum.
   3. For enda større volumer, bruke penicillin flasker med gummipropper eller termosflasker.
   4. Bruk høy tetthet polyetylen flasker (HDPE hetteglass) for silika prøver.
   5. For å øke prøvevolum og for å redusere risikoen for proppen løsnerunder oppstigningen, evakuere (vakuum) objekter 1.4.2-1.4.4 før dykket med en vakuumpumpe. Vakuum manuelt ved hjelp av en håndvakuumpumpe eller til og med ved å suge luft med en sprøyte. Men for best resultat, er en god vakuumpumpe anbefales. Standard lyophilizers gir høyt vakuum.
      MERK: Vær spesielt oppmerksom ved bruk av store støvsugd flasker for å sikre at den raskere innledende sugehastigheten ikke vil forurense utåndet vannprøver.
5. Vessel rengjøringsprosedyrer
   1. For oppløste organiske og NH ₄ ⁺ analyse, bruk nye pre-renset EPA ampuller.
   2. Skyll hetteglass (glass og HDPE) for analyse av andre næringsstoffer som følger:
      1. Skyll hetteglass (glass og HDPE) og polypropylen caps med høy kvalitet dobbel destillert vann. Installer en ny silisium septum.
      2. Bløthetteglass (glass og HDPE) i 10% av HCl i minst 3 dager og skyll med rikelig høy kvalitet dobbel destillert vann.
      3. Forbrenne glassampuller ved 450 ° C i fire timer og la den avkjøles i ovnen. Monter lokket, og pakk inn i aluminiumsfolie før bruk.
6. filtre
   1. Bruk bindemiddel fritt glass fiber filtre for filtrering av alle oppløste organiske prøver (f.eks, DOC, DON) og for innsamling av partikulære organiske (f.eks POC, PON). Pakken hver glassfilter i en separat aluminiumsfolie konvolutt. Forbrenne ved 400 ° C i 2 timer for å fordampe organiske rester og lagrer i en ren og tørr fartøy inntil bruk.
   2. Bruke enten et bindemiddelfrie glassfiberfiltere som ovenfor, eller 0,2 um polykarbonatmembraner for prøvetaking uorganiske næringsstoffer (for eksempel, PO ₄ ^3-, NO _x ^-, _NH4 ^+). Rengjør siste gang installert i filterholderen som beskrevet nedenfor (1.7.3).
   3. Bruk 0,2 mikrometer polykarbonatmembraner filtre for silika prøvetaking. Rengjør dem en gang installed i filterholderen som beskrevet nedenfor (1.7.3).
7. Utarbeidelse av filtreringsenheten
   1. Filtrer det meget oppløselige grunnleggende blanding av anioniske og ikke-ioniske overflateaktive oppløsning og høy kvalitet dobbeltdestillert vann gjennom et 0,2 um filter før de kan brukes for å rengjøre filtreringsenheten.
   2. Filtreringsenheten for næringsmidler og oppløste organiske stoffer andre enn silisiumdioksyd:
      1. Plasser et forbrennes bindemiddel fritt glassfiberfilter inne i renset in-line rustfritt stål Swinney filterholderen.
      2. Bruke en syre renset sprøyte for å løpe 100 ml 5% meget oppløselig grunnleggende blanding av anioniske og ikke-ioniske overflateaktive oppløsning og deretter 100 ml av høy kvalitet dobbeltdestillert vann gjennom hele sammenstillingen.
   3. Filtreringsenheten for SiO _4:
      1. Plasser polykarbonat filter inne i renset polykarbonat filterholderen (PC filterholderen).
      2. Bruke en syre renset sprøyte til run 30 ml 5% HCl og 30 ml av høy kvalitet dobbeltdestillert vann gjennom hele montasjen.
8. system montering
   1. Montere system for undervannsarbeid ved hjelp av PEEK (polyeter-eter-keton) rør med utvendig diameter (OD) på 1,6 mm og en indre diameter (ID) på 254 um eller 177 um.
   2. Bruk en skarp kniv eller PEEK cutter å kutte rørene til ønsket lengde.
   3. I sin distale ende (prøvebeholder side), passer til hvert rør med en hannlueråpningen festet til en sprøytenål. Pass på at du følger produsentens anvisninger og justere den flate siden av blå flensløse hylse med enden av røret før du trekker den grønne mutteren.
   4. Fest PEEK slangen til stativ "armer" eller spesialbygd manipulator ved hjelp av et isolerende tape.
   5. Fest en engangs sprøytespissen til den mannlige Luer kontakten. Hold nålen med beskyttelseshette for å forebygge skader. Skal merkes godt prøvetaking utstyr og fargekode alle inhalerte og utåndet komponenter (for eksempel grønn = In, rød = Ex).
   6. Tilsvarende fargekode prøvetakings fartøy med sett av sammenkoblede prøvetaking fartøy sekvensielt nummerert.

2. Arbeids Underwater

1. Arbeid grunnarbeid
   1. Foreløpig kartlegging og valg av prøver
      MERK: På grunn av den komplekse natur av undervanns prøvetaking protokollen, viet den nødvendige tid til forberedelse vil sikre en effektiv prøvetaking dykk.
      1. Kartlegge arbeidsstedet og gjøre nødvendige forberedelser på forhånd.
      2. Velg og merk egnede målorganismer som kan nås relativt lett. Siden ikke alle organismer nødvendigvis være aktive på tidspunktet for prøvetaking dykk, forberede flere arbeidsstasjoner enn du forventer å smake.
   2. Installasjon av base støtter
      1. when jobber med jevnet underlaget:
         1. Monter den opprinnelige quick release klipp av den fleksible stativ på 1 kg dykking vekter og bare plassere den ved siden av målet dyr.
      2. Ved arbeid på vertikale vegger:
         1. Mount basen støtteplater for VacuSIP systemet, kroker for tilbehør utstyr, og kleshengere for oppsamlingskaret bærer brett under arbeidet grunnarbeid scenen (2.1.1).
         2. Ved bruk av fleksible bærbare stativer, bruker bolter eller to-komponent epoxy å fikse 10x10 cm PVC plater ved siden av hvert mål dyr. Hver plate må ha et hull for å feste quick release klipp av den fleksible bærbare stativ.
         3. Når harpiksen er herdet og bunnplatene er solid festet til veggen, skru inn quick release klipp, som et fast festepunkt for fleksibel bærbar tripod for VacuSIP system.
2. Installere VaCUSIP
   1. Sjekk om prøven er å pumpe ved å slippe filtrert fluorescein fargestoff ved siden av sniffe åpningen og bekrefte at fargen fremstår gjennom exhalent åpningen som beskrevet i Yahel et al. (2005) ^16.
   2. Installer VacuSIP enheten og plasser sniffe (IN) prøvetakingsrør i sniffe åpningen eller bare ved siden av det (innen ~ 5 mm). Kontroller at sniffe røret er ikke i nærheten av en annen exhalant åpning.
   3. Nøye direkte exhalant (EX) prøvetakingsrøret mot osculum / exhalant hevert og svært sett det forsiktig inn til det er plassert 1-5 mm inne i osculum / exhalant hevert (se figur 1 og analytiker Video 1). Ta stor forsiktighet for ikke å få kontakt med eller på annen måte forstyrre samplet organisme.
   4. Før og under prøvetaking dobbeltsjekke plasseringen av både rør.
   5. Etter at prøvetagnings sjekke om prøven er fortsatt pumping som desbert ovenfor (2.2.1).
      MERK: Fordi bevegelsen av en arm av stativ når manipulere andre kan oppstå, sørg for å først plassere inhalant prøvetakingsrøret og dernest exhalant tube, noe som krever mer presis manipulasjon. Etter denne rekkefølgen, selv om manipulering av exhalant prøvetakingsrøret kan forårsake bevegelse av inhaleringsmiddel røret, vil det ikke påvirke prøvetaking.
3. Modular undervanns prøvetaking
   MERK: Avventer på problemstillingen, kan hver av de eksperimentelle trinnene nedenfor utføres som en frittstående eksperiment. Den fulle metabolsk profil prøvetakings protokoll beskrevet nedenfor er en tidkrevende prosess, som krever opptil 8 timer pr prøve (for en oversikt se figur 2 og tabell 2). Som dykkeforhold og regelverk skiller mellom prøvetakingssteder, regioner og institusjoner, er dykking planer ikke inkludert i denne protokollen. Likevel vie ekstrem forsiktighet og METIculous planlegging til dykking plan. Vær spesielt nøye med å unngå metning og yoyo dykkeprofiler. Når det er mulig, er det tilrådelig å gjennomføre disse forsøkene på grunne dyp (<10 m). Lukket krets rebreathers kan være svært nyttig for slike lengre prøvetakingsordninger.
   1. Før selve prøvetaking begynner, sørg for at ingen synlige spor av fluorescein rest gjenstår og at suspenderte sedimenter har blitt avgjort eller har wafted unna.
      
   2. Ultra-plankton, (ingen filter er installert i dette trinnet!)
      1. Bruk nål å pierce IN (inhalert) og EX (utåndet) støvsugd sterile plastrør septa. Kontroller at vann drypper inn på den planlagte rente og samle 2-6 ml vannprøver.
      2. På gjenfinning, holde prøvene i en kald boks på is. I laboratoriet, bevare med 1% paraformaldehyde + 0,05% EM grade glutaraldehyd (endelig konsentrasjon), eller 0,2% EM klasse glutaraldehyd. Fryse cryovials i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 &# 176; C inntil analyse.
   3. Silikat prøvetaking og lagring
      1. Installer pre-renset in-line rustfritt PC filterholderen inneholdende en 0,2 um polykarbonatmembran mellom nålen og den luer hankontakt i den distale ende av røret.
      2. Pierce septumhetten av de forhånds rengjøres med høy tetthet polyetylen flasker (HDPE hetteglass) for å starte prøvetaking. Kontroller at begge prøvetakere er dryppende og samle 15 ml vann i hvert hetteglass.
      3. Hold prøvene avkjølte (4 ° C) inntil analyse. Hvis analysen ikke kan begynne i løpet av to uker, lagre ved -20 ° C. For analyse, sørg for at prøvene er tint ved 50 ° C i minst 50 minutter for å oppløse silikageler.
         MERK: Membranen kan bli bevart for mikroskopi eller DNA-analyse etter behov.
   4. Oppløste uorganiske partikler (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ⁺⁾
      1. Bytt tHan PC filterenhet med en pre-renset in-line-filter av rustfritt stål holder som inneholder en pre-forbrent glassfilter.
      2. Før prøvetaking, sørge for at minst 20 ml sjøvann prøver ble ført gjennom hele filtreringssystem ved hjelp av EPA, HDPE-flasker eller andre vakuumkammer for å starte sug. Måle volumet av det oppsamlede vann før de kastes.
      3. Pierce septumhetten av de aktuelle EPA glassampuller å starte prøvetaking, må du kontrollere at begge prøvetakere er dryppende, og samle 25-30 ml for nitrat og fosfat analyse.
      4. Bytt til nye EPA hetteglass for ammoniakk analyse, må du kontrollere at begge prøvetakere er dryppende, og samle 20 ml i hvert hetteglass.
      5. Hold prøvene i en kald boks på is og oppbevares ved -20 ° C inntil analyse.
         MERK: Hvis bare filtratet er av interesse, kan engangssprøytefilter brukes for trinn 2.3.3 og 2.3.4.
   5. Oppløste organiske (DOC + DON) prøvetaking og stOring
      MERK: Hold prøvene så oppreist som mulig gjennom å håndtere slik at prøven vann ikke kommer i kontakt med silikon septa.
      1. Fortsett å bruke rustfritt stål filterenheten og samle 20 ml saltvannsprøvene i nye EPA glassampuller, som beskrevet ovenfor.
      2. Ved henting, holde prøvene i en kald boks på is. I laboratoriet, bruke en pre-forbrent glass Pasteur pipette å fikse prøvene med fosforsyre (legg 5-6 dråper 25% spormetallkvalitet syre i en 20 ml prøve, sluttkonsentrasjon 0,04%) eller saltsyre (tilsett 2 dråper av spormetallkvalitet konsentrert syre i en 20 ml prøve, sluttkonsentrasjon 0,1%) og oppbevares i kjøleskap.
      3. Hold prøvene avkjølte (4 ° C) inntil analyse. Hvis prøvene ikke er analysert innen en uke samling, lagre ved -20 ° C inntil analyse.
   6. Partikkel organisk materiale (POC, PON, POP)
      1. Fortsett å bruke stainless stål filterenheten og filter minst 500 ml sjøvann inn i et evakuert 250 ml termosflaske. Bytt kolber om nødvendig.
      2. På gjenfinning, bruk en luftfylt sprøyte til å evakuere alle resterende sjøvann fra filterholderen, pakk den inn i aluminiumsfolie, og oppbevar i en kald boks på is. I laboratoriet, fjerne filtrene fra filterholderne og oppbevar ved -20 ° C inntil analyse.

Figur 1. Et eksempel på riktige installasjoner av VacuSIP: (A) prøvetaking ascidian polycarpa mytiligera (Akababukten, Rødehavet) ved hjelp av en spesialbygd manipulator med fargekode brukes grønt for innånding og gult for utåndet vannprøver (bilde av Tom Shelizenger og Yuval Yacobi); (B) prøvetaking svamp Agelas oroides (NW MiddelSea) med en osculum bredde på 3 mm, ved hjelp av VacuSIP enheten. Fargekoden som brukes er gul for inhalasjon og rødt for utåndet vannprøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Oversikt over VacuSIP teknikk som er beskrevet i protokollen delen. Laboratoriet arbeider er representert i gule bokser, feltarbeidet i blå bokser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1. Den totale samplingsfrekvens (ml min ^-1) oppnådd med ulike beholderebrukes for vannsamlinger og forskjellige vakuumnivåer: flaskene ikke ble støvsugd (ingen); EPA hetteglass og HDPE ampuller ble støvsugd halvparten av sitt volum (½ volum); sterile plastrørene allerede suges av produsenten. Arbeid på 5-8 m dybde, vanntemperatur på 18-22 ° C, ved hjelp av PEEK rør av 79 cm lengde og på 25 mikrometer innvendig diameter.

Tabell 2. Oversikt over prøvetagningsbeholderen, fiksativ, in-line-filter sammenstilling, lagring og analytiske metoder som er beskrevet i protokollen delen. De analyserte forbindelser er: ultra-plankton overflod (plankton <10 mikrometer), silikat (SiO _4), fosfat (PO ₄ ^3-), nitritt + nitrat (NO ₂ ^- + NO ₃ ^-), oppløst organisk materiale (DOM), ammonium _(NH4 ⁺⁾ og partikkelformet organisk materiale(POM). Alle prøvetakings fartøyene har silisium septumhette og støvsugd før prøvetaking. De fiksativ er: paraformaldehyd + glutaraldehyd (Glut + Parafor), orto-fosforsyre (H ₃ PO ₄₎ og saltsyre (HCl). In-line filterkombinasjoner som brukes er: polykarbonat filterholdere og polykarbonat membran 0,2 mikrometer filtre (PC filterholderen + PC membran) og rustfritt stål filterholdere og bindemiddel fritt glass fiber filtre GFF.

Representative Results

Optimalisering av sjøvann innsamlingsmetoder

Valg av solfangeren ampuller og rengjøringsmetoder

VacuSIP-kompatible samle fartøy skal ha en skillevegg som gjør at prøvetaking for å bli initiert av piercing med en sprøyte nål. De bør tåle forhøyet undervannstrykket (2-3 barer på typiske scuba arbeidsdybde), og bør holde et vakuum. Mange (men ikke alle merke) av hetteglass som er godkjent av EPA for analyse av flyktige organiske stoffer oppfyller disse kriterier. Forhånds renset ampuller godkjent for DOC og DON-analyse er også tilgjengelig. For å teste egnetheten av disse ampullene for innsamling og analyse av næringsstoffer og for å optimalisere rengjøringsprosedyrer, ble høy kvalitet dobbel destillert vann samles i syre renset polypropylen rør (PP rør), nylig kjøpt, i enCid-renset høy tetthet polyetylen flasker (HDPE flasker), og i EPA hetteglass, alle utstyrt med en polytetrafluoretylen (PFTE) septumhette. De HDPE flasker og polypropylen rør ble renset som beskrevet i avsnitt 1.5.2 ovenfor, og EPA hetteglass ble rengjort av produsenten.

Mengden av _NH4 ⁺ funnet i EPA-glassampuller ble forholdsvis minimal (≤ 0,1 umol ^L-1) og er avhengig av høy kvalitet dobbeltdestillert vann standard kvalitet. I motsetning til dette, NH ⁺ ₄ konsentrasjoner betydelig høyere (opp til 3 og 7 ganger, henholdsvis) og oppviste en høyere variasjon i syre rensede polypropylenrør og i høy-tetthet polyetylen ampuller (ANOVA F _(5,53) = 7,183, p < 0,001, figur 3). Det var ingen effekt av høy kvalitet dobbelt destillert vann i kontakt med silikon septum på ammonium-analyse.

Sammenligning av nye glassflasker kontra renset / resirkulerte glassflasker

For å teste om EPA hetteglass kan benyttes til næringsanalyse mer enn en gang, NO _x ^-, PO ₄ ^3-, og NH ₄ ⁺ konsentrasjoner i sjøvann prøver samlet inn i nye EPA hetteglass ble sammenlignet med de som samlet seg på brukte EPA hetteglass. De nye EPA hetteglass ble pre-renset av produsenten, mens de resirkulerte glassflasker ble renset som beskrevet ovenfor (1.5.2). Resirkulert ampuller hadde signifikant høyere _NH4 ⁺ konsentrasjon, opp til 1,5 ganger det nivået som finnes i nye glassampuller (t-test, p <0,001, n = 5). Ingen signifikante forskjeller ble funnet i NO _x ^- og PO ₄ ^3- innhold mellom prøvene samlet i resirkulerte flasker og prøver samlet i nye glassampuller (figur 4).

Silikat innsamling og lagring av prosedyrer

For å bestemme den beste samplings beholder for analyse av silikat, ble høy kvalitet dobbeltdestillert vann oppsamlet i ikke-renset og sure-renset polypropylenrør (PP rør), i syre renset høy-tetthet polyetylen ampuller (HDPE ampuller), og i EPA hetteglass. Den forventede silikat-konsentrasjonen var nær null, slik verdier som avviker fra den forventede konsentrasjon ble betraktet som forurenset. Den silikat-konsentrasjon betraktelig forskjellig mellom prøvene som er samlet i de forskjellige ampuller (ANOVA, F _(3,19) = 210,047, p <0,001), som viser den laveste SiO _{4-konsentrasjonen} i syre renset HDPE ampuller. Borsilikatglass ampuller forurenset prøvene, med den endelige SiO ₄ konsentrasjonen øker med inntil 7 mikromolL ^-1 (figur 5).

Valg av filtreringsapparat for oppløst organisk materiale (DOM) og næringsanalyse

For å bestemme hvilken filteranordning frembringer den laveste emnet ved analyse av oppløst organisk (DOC og DON) og uorganiske næringsstoffer (NO _x ^-, _NH4 ^+, PO ₄ ^3-), rustfritt stål filterholdere ble sammenlignet med polykarbonat in-line Swinney filterholdere. Med hver filterholder typen vi testet både polykarbonatmembran og pre-forbrent glassfiberfilter. Kombinasjonen av rustfritt stål filterholderen og forbrennes glassfiberfilter gitt de laveste blanks, mens polykarbonat Swinney filterholderen utstyrt med polykarbonat membran tydelig forurenset prøvene med opptil ni ganger. Økende vaskemengder gjorde ikke løse dette problemet (Figur 6).

Figur 3. Ammonium konsentrasjon (umol L ^-1, gjennomsnitt ± SD) innsamlet med forskjellige ampuller: (1) rengjort HDPE hetteglass; (2) Renset HDPE flaske; (3) Renset HDPE hetteglass + Parafilm; (4) EPA hetteglass; (5) EPA hetteglass + Parafilm; (6) Renset PP tube. Den Parafilm ble plassert for å teste om silisium septum kan forurense vannprøvene. For hver behandling 9 prøver av høy kvalitet dobbelt-destillert vann ble analysert. Prøvene ble analysert frisk. Signifikante forskjeller ble funnet mellom de fire utvalgs fartøy (ANOVA, F _(5,53) = 7,183, p <0,001, strøm test = 0,992). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 4. Ammonium (NH ₄ ^+), nitritt + nitrat (NOx ^-) og fosfat (PO ₄ ^3-) konsentrasjoner (mikromol L ^-1, gjennomsnittlig ± SD) av sjøvannsprøver samlet inn i nye (mørke) og resirkulert / rengjøres (hvit) EPA hetteglass. Sjøvann ble samlet inn på Experimental Aquaria Zone for Institute of Marine Science og ble filtrert med rustfritt stål filterholderen og glassfilter. Vannprøvene ble analysert frisk. Stjernen (*) indikerer at forskjellen er signifikant (t-test, p <0,001, n = 5, makt test = 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

.jpg "/>
Figur 5. Silikat konsentrasjon (umol L ^-1, gjennomsnittlig ± SD) i høy kvalitet dobbelt destillert vann samles i forskjellige hetteglass: syre renset PP rør, PP-rør, syre renset HDPE ampuller, nye EPA hetteglass. Signifikante forskjeller ble funnet mellom de fire sampler materialer (ANOVA, F _(3,19) = 210,047, p <0,001, makt test = 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Undersøke effekten av ulike filtreringssammenstillinger og vaskevolum på nitritt + nitrat (NO _x ^- umol ^L-1). Prøver for NO _x ^- ble erholdt ved å filtrere de sjøvannsprøvene med rustfritt stål (SS fIlter holder) eller polykarbonat in-line Swinney filterholdere (PC filterholderen) utstyrt med enten en polykarbonat membran (PC filter) eller en pre-forbrent glassfiberfiltre. For PC-filtrene, ble forskjellige volumer (10, 30, 60, 90 og 120 ml) av 5% HCl og høy kvalitet dobbeltdestillert vann som brukes for vasking av filtersammenstillingen, er vaskevolumet gitt i parentes i figuren forklaringen. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 5). Sjøvann ble samlet inn på Experimental Aquaria Zone for Institute of Marine Science og prøvene ble analysert frisk etter filtreringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Eksempel på eksperimentelle resultater: inhalert (IN, svartsirkel) og utåndet (EX, rød trekant) sammen vannprøve konsentrasjoner (mikromol L ^-1) av forskjellige stoffer behandles av svampen Chondrosia reniformis i Middelhavet: (A) ammonium (NH ₄ ^+); (B) nitritt + nitrat (NOx ^-); (C) fosfat (PO ₄ ^3-); (D) Silikat (SiO _4); (E) oppløst organisk karbon (DOC); (F) oppløst organisk nitrogen (DON); (G) planktoniske organisk karbon (LPOC); (H) planktoniske organisk nitrogen (LPON). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8. Et eksempel på en strømnings cytomEtry analyse av parede vannprøver trukket fra vannet inhalert (A, C, E, G) og utåndet (B, D, F, H) av svampen Chondrosia reniformis: (A, B, C, D) algepopulasjoner; (E, F, G, H) heterotrofe bakterier. I AB og EF prøvetaking var ren og nøyaktig (alle planktoniske grupper ble effektivt beholdt). CD og GH er eksempler på utåndet vann forurensning, viser lav fjerning av alle planktoniske grupper. Syn:. Synechococcus sp, pico: autotrofe picoeukariotes, nano: autotrofe nanoeukaryotes, høy: heterotrofe bakterier med høyt DNA-innhold, lav. Heterotrofe bakterier med lav DNA-innhold Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

supplerende Figure 1. Cell retensjonseffektiviteten forskjellige planktoniske byttedyr av musling Chama Pacifica: Prochlorococcus sp. (Pro), Synechococcus sp. (Syn), pico-eukaryoter (Pico EUK), nano-eukaryoter (Nano EUK). Feilfelt = 95% CI. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende Video 1. Prøvetaking den ascidian polycarpa mytiligera ved hjelp av en spesialbygd manipulator med fargekode brukes grønt for inhalasjon og gult for utåndet vannprøver. Prøverør (PEEK, ID 54 mikrometer, 75 cm lang) er nøye plassert i exhalant og inhalant vannlåser av ascidian. Vann er enn trukket inn i evakuert rør med en hastighet på ~ 1 ml ^min-1. I denne demonstrasjonen fluorescin fargestoff blir brukt til å visualisere exhalant stråle. Merk at exhalant prøvetakingsrøret er plassert godt witynne exhalant jet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

forberedende skritt

Collector ampuller for DOM og næringsanalyse

Siden Samler fartøy kan interagere med oppløste mikrobestanddeler og sampler vegger kan være et substrat for bakterievekst ^30-34, forskjellige ampuller for DOM og nærings samling ble testet. Borosilikat er ikke anbefalt for silika kvantifisering ^33,35, siden glassflasker kan øke den opprinnelige konsentrasjonen av silika med opp til to ganger hvis prøvene ikke er raskt frosset ^30. Våre resultater viser at bruk av pre-renset EPA ampuller resulterer i lav konsentrasjon blanks for DOC, DON, og uorganiske næringsstoffer, spesielt for ammonium.

DOC filtrering og lagring

Filtrering er en nødvendig og, i mange tilfeller, er det første analysetrinnet i marin kjemi ogmikrobiologi. Mens det er mulig å filtrere prøvene etter samling i laboratoriet, er denne prosedyren ikke anbefalt for in situ arbeid, hvor prøvene er samlet under vann, ofte på avsidesliggende steder, timer eller dager unna riktig laboratoriefasiliteter. Bruken av in-line, in situ filtrering reduserer prøvehåndtering og derved reduserer risikoen for forurensning. In situ filtrering fjerner også de fleste av de bakterier og reduserer risikoen for at prøven vil blandingen bli endret av bakteriell metabolisme under den langvarige prøvetaking og transport tid. Filtreringsenheten øker dødvolumet av prøvetakingsapparatet, og kan også være en kilde for forurensning. Et utvalg av de minste mulige filterholderne (for eksempel i linje Swinney filterholder 13 mm) og minutt PEEK slangen (som 254 um ID) reduserer dødvolumet, og risikoen for forurensning av omgivende vann.

Dersom den riktige filteret er ikkebrukes eller hvis den ikke vaskes nøye, gjenstander og forurensning av vannprøvene er sannsynlig ^32,36-39. Studier av DOC-analyse viste at filtre og filterholdere laget av organiske forbindelser (polykarbonat og PFA-PTFE) kan føre til alvorlig DOC forurensning ^32,37, spesielt når det ikke er grundig spylt med høy kvalitet dobbelt destillert vann ^38. Protokoll og resultater følger disse retningslinjene, og også indikere at polykarbonat filterholdere bør unngås.

In situ arbeid og gjøre bruk

Den VacuSIP system er en direkte prøvetakingsteknikk som muliggjør studium av metabolismen av uforstyrret suspensjons matere i sitt naturlige miljø, og kvantifisering av deres økologiske rolle i systemet. For erfarne og utstyrt dykkere, er anvendelsen av VacuSIP metoden enkel og krever bare kort trinnelukker. Inex VacuSIP eksperimenter er utformet for en "within'-konstruksjon statistisk analyse (dvs. paret eller gjentatt tiltak analyse), derfor kontrollere for de fleste analytiske gjenstander inkludert høye mellomrom. Bruken av kontrollert sug sikrer langsomme og justerbare samplingsfrekvens, og dermed hindre utilsiktet forurensning av utåndet vann med omliggende vann. Der det er mulig, er utvalget av arbeidsplasser med lav strøm og lav turbiditet anbefalt og vil sikre renere og mer nøyaktige resultater. Den forlengede prøvetaking tid (minutter til timer) tillater integrering av høy patchiness som preger bentiske grenselaget. Alle disse funksjonene sikrer at når riktig brukt den VacuSIP metoden er svært robust, og gir pålitelige og replicable resultater selv når du arbeider med et lite antall replikater. Et eksempel på typiske resultater oppnådd fra et middelhavs svamp og Indo-Pacific musling artene er vist i figur 7 og Supplementær Figur 1.

Som med alle teknikk, er det VacuSIP ikke fritt for potensielle fallgruver. Det mest vanlige problemet er at forurensning av den utpustede vannprøven med omgivende vann. Årsakene til disse gjenstandene inkluderer høy sugehastighet, tube dislodgments, og dyrs atferd. Riktig valg av den riktige samplingshastigheten er avhengig av tidligere estimater av excurrent strømningshastighet. Slike estimater kan oppnås ved hjelp av fargestoff fremre hastigheten metode ^16. Ideelt sett bør sugehastigheten holdes under 1% av pumpehastigheten (for eksempel 1 ml ^min-1 for en 6 timers L ^-1 pumpehastighet). For å unngå forurensning med omgivende vann, må samplingsfrekvens aldri være større enn 10% av pumperaten.

For å kontrollere for samplingsfrekvensen, bør lengde og indre diameter av innløpsrøret justeres i henhold til den planlagte arbeidsdybden og vanntemperatur. Hagen-Poiseuilleschen ligning (se kapittel 1.3.1 ovenfor) kan brukes som en veiledning. Imidlertid bør denne ligningen betraktes som en første ordens tilnærmelse fordi AP og samplingshastigheten reduseres med samplingstiden og in-line filtrering gir usikkerhet. Bruken av evakuerte beholdere, noen ganger med ukjente vakuumtrykk, introduseres ytterligere komplikasjoner. Et eksempel på hvordan samplingsfrekvens varierer som en funksjon av forskjellige evakuerte beholdere med forskjellig vakuum, er vist i tabell 1.

Redusere samplingsraten er lett oppnås ved å justere slangelengden og ID, med ingen tekniske begrensninger til denne reduksjonen (samplingsfrekvenser på noen få mikroliter per time er mulig). Likevel bør experimenters være klar over den langsomme samplingsfrekvensen bestemt av denne begrensning for dyr med lav pumpehastighet og for små organismer eller prøver. Den umiddelbare konsekvensen av langsom samplingsfrekvens er begrenset volum av vann som kan samles under en enkelt sampling sessipå. Det lave volumet vil begrense antall analyser og gjentak som kan kjøres med disse prøvene, og vil dermed også begrense informasjonen som kan hentes fra disse populasjonene.

Tube løsner kan lett oppdaget og prøvetaking kan avbrytes eller startes på nytt, forutsatt at en dykker holder konstant vakt. I motsetning til dette, er avslutning av pumping under prøvetakingen ikke alltid lett å oppdage. Dette gjelder ikke bare for svamper, men også for kappedyr, muslinger, og børstemark. Faktisk, i motsetning til vanlig oppfatning, hendelser der en ascidian eller en skjell stoppet pumping ble dokumentert med ingen synlig endring i vannlåsen geometri (Yahel, upubliserte data). Videre, i noen tilfeller kan kappedyr opprettholde aktiv pumping uten mesh sekret (det er, er ingen filtrering finner sted).

Kontrollere samplingsfrekvens er kritisk. I denne forbindelse er VacuSIP er bedre enn andre metoder, spesielt når forsøks dyrene er relatively små eller når de pumpe sakte. Sprøyter er spesielt vanskelig å kontrollere ^to. For eksempel, Perea-Blazquez og kolleger (2012a) ⁴⁰ brukes en sprøyte for å smake på vannet pustes ut av flere tempererte svamp arter og overraskende fant ikke et generelt mønster av inntak / utskillelse av bestemte næringsstoffer (NO ₂ ^-, NO ₃ ^-, NH ₄ ^+, PO ₄ ^3-, SiO _4). Mangelen på et klart mønster er sannsynligvis et resultat av forurensning av den utpustede prøver med omgivende vann på grunn av bruk sprøyte. Forurensning er tydelig fra den ekstremt lave retensjonseffektiviteten av pico plankton rapportert av Perea-Blázquez og kolleger (2012b) ⁴¹ for deres svamper: 40 ± 14% av heterotrofe bakterier, og 54 ± 18% av Synechococcus sp. Til sammenligning, ved hjelp av VacuSIP, Mueller et al. (2014) ²¹ rapporterte en fjerningseffektivitet av heterotrofe bakterier av72 ± 15% i Siphonodictyon sp. og 87 ± 10% i Cliona delitrix.

Hvis du vil kontrollere prøven kvalitet og sikre at ingen forurensning av ambient vann oppstår, anbefaler vi på det sterkeste å først analysere pico og nano planktonprøver ved hjelp av flowcytometri. Denne rask, pålitelig og billig analyse vil gi umiddelbar informasjon av prøvekvalitet. Det er veldig vanlig for noen byttedyr taxa som Synechococcus sp. fjernes på nær 90% effektivitet ^14,42 av svamper og ascidian. Vesentlige avvik fra denne referanse tyder på at forurensningen kan ha oppstått (Figur 8).

For pålitelig og ren prøvetaking, sørge for at eksperimentet utforming tilfredsstiller sju enkle regler: (1) å utføre en foreløpig undersøkelse (inkludert pumping rente estimater) og forberede arbeidsstedet godt; (2) kjenner de studerte dyr; (3) bekrefte at de studerte prøven har en veldefinert excurrent åpning ennd tilgjengelig sted; (4) bekrefte at de studerte prøven er å pumpe før og etter hver prøvetaking; (5) plassere røret for oppsamling av den utpustede vann litt innenfor den excurrent åpning (figur 1); (6) bruk samplingsfrekvens <10% av den excurrent strømningshastighet, 1% sterkt anbefalt; (7) definerer et kvalitetskriterium og utelate mistenkte Inex par.

Etter disse enkle reglene, tilbyr VacuSIP systemet en praktisk og pålitelig metode for å måle hvor aktiv fjæring forer prosess partikler og oppløste forbindelser i naturgitte forhold, slik at nøyaktige og sammenlignbare estimater som kan brukes til å vurdere den funksjonelle rollen filter feeders i forskjellige økosystemer rundt verden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10 pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (254 µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used.
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA Vials	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09).
HDPE Vials	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42).
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13 mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13 mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13 mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 70 Solution	Decon Labs	1002	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25 mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100 g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7 mm x 30 mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2 ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1%
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500 g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump