Introduction
Suspensívoros bentónicos juegan un papel esencial en el funcionamiento de los ecosistemas marinos 1. Al filtrar grandes volúmenes de agua 2,3, se quitan y excretan partículas (plancton y detritus) y los compuestos disueltos 1 (y las referencias en él) y son un importante agente de acoplamiento pelágico-bentónico 4,5 y 6,7 ciclo de nutrientes. La medición precisa de las partículas y compuestos disueltos retirados y excretados por suspensívoros bentónicos (tales como esponjas, ascidias, poliquetos y bivalvos) es fundamental para entender su fisiología, metabolismo, y la ecología de la alimentación. Junto con el bombeo de medidas de la velocidad, sino que también permite una cuantificación de los flujos de nutrientes mediadas por estos organismos y su impacto ecológico sobre la calidad del agua, así como en los procesos a escala del ecosistema.
Elegir el método adecuado para la medición de las tasas de extracción y producción de partículas y disuelto comlibras por organismos filtradores suspensión es crucial para la obtención de datos fiables en cuanto a su actividad de alimentación 8. Como ha señalado Riisgård y otros, inapropiadas resultados metodologías de polarización, distorsionar las condiciones experimentales, producir estimaciones incorrectas de la ingestión y excreción de ciertas sustancias, y puede conducir a la cuantificación errónea de los flujos de nutrientes procesados por estos organismos.
Los dos métodos utilizados con mayor frecuencia para medir partículas y los flujos de nutrientes disueltos en filtradores implicar la incubación (técnicas indirectas) o la recogida simultánea de ambiente y agua exhalado (técnicas directas). Técnicas de incubación se basan en la medición de la tasa de cambio en la concentración de partículas y nutrientes disueltos en el agua se incubaron, y la estimación de las tasas de producción o la extracción en comparación con controles adecuados 8. Sin embargo, encierra un organismo en una cámara de incubación puede alterar su feeding y el bombeo de comportamiento debido a los cambios en el régimen de flujo natural, debido a una disminución de oxígeno y / o de la concentración de la comida, o debido a la acumulación de compuestos de excreción en el 7,9 agua de incubación (y sus referencias). Además de los efectos de confinamiento y de suministro de agua modificada, un importante sesgo de técnicas de incubación se debe a efectos de re-filtración (véase, por ejemplo 10). Aunque algunos de estos problemas metodológicos se han superado mediante el uso de el volumen y la forma correcta de la recipiente de incubación 11 o con la introducción de un sistema de campana de vidrio de recirculación in situ 12, esta técnica a menudo subestima velocidades de eliminación y de producción. Cuantificar el metabolismo de los compuestos disueltos tales como nitrógeno orgánico disuelto (DON) y el carbono (DOC) o nutrientes inorgánicos, ha demostrado ser especialmente propensos a sesgos provocados por técnicas de incubación 13.
A finales de los años 60 y principios de los 70, Henry Reiswig9,14,15 pionero en la aplicación de las técnicas directas para cuantificar la eliminación de partículas por esponjas Caribe gigantes, mediante el muestreo por separado el agua inhalado y exhalado por los organismos en situ. Debido a la dificultad de aplicar la técnica de Reiswig en alimentadores de suspensión más pequeñas y en condiciones bajo el agua más desafiantes, la mayor parte de la investigación en este campo se limita a la de laboratorio (in vitro) empleando técnicas de incubación principalmente indirectos 16. Yahel y sus colegas volver a montar Reiswig de directa técnica in situ para trabajar en condiciones de menor escala. Su método, denominado InEx 16, se basa en un muestreo bajo el agua simultánea del agua inhalado (A) y exhalado (Ex) por organismos inalteradas. La diferente concentración de una sustancia (por ejemplo, bacterias) entre un par de muestras (InEx) proporciona una medida de la retención (o producción) de dicha sustancia por el animal. La técnica emplea tubos InEx abiertas yse basa en el chorro excurrent producido por la actividad de bombeo del organismo estudiado para reemplazar pasivamente el agua del ambiente en el tubo de recogida. Mientras Yahel y sus colegas han aplicado con éxito esta técnica en el estudio de más de 15 diferentes de suspensión alimentadores taxones (por ejemplo, 17), el método está limitada por el alto nivel de la práctica y la experiencia requerida, por el tamaño minúsculo de unos orificios excurrentes, y por las condiciones del mar.
Para superar estos obstáculos, hemos desarrollado una técnica alternativa basada en la aspiración controlada de la muestra de agua a través de tubos minuto (diámetro externo <1,6 mm). Nuestro objetivo era crear un dispositivo simple, fiable y de bajo costo que permitiría limpio y controlado en el muestreo del agua situ a partir de un punto muy específico, como el orificio de excurrente filtradores bentónicos. Para ser eficaz, el método tiene que ser no intrusiva con el fin de no afectar el régimen de flujo ambiente o modificar el behavior de los organismos estudiados. El dispositivo que aquí se presenta se denomina VacuSIP. Es una simplificación del sistema SIP desarrollado por Yahel et al. (2007) 18 para el punto de muestreo basado en ROV en las profundidades del mar. El VacuSIP es considerablemente más barato que el SIP original y se ha adaptado para el trabajo a base de buceo. El sistema fue diseñado de acuerdo a los principios presentados y probados por Wright y Stephens (1978) 19 y Møhlenberg y Riisgård (1978) 20 para entornos de laboratorio.
Aunque el sistema VacuSIP fue diseñado para estudios in situ del metabolismo de los alimentadores de suspensión bentónicos, también se puede utilizar para estudios de laboratorio y donde se requiere una, muestra de agua en el punto fuente controlada y limpio. El sistema es especialmente útil cuando se requiere la integración durante períodos prolongados (min-horas) o en filtraciones in situ. El VacuSIP ha sido utilizado con éxito en el laboratorio Yahel desde 2011, y tiene tambiénha empleado en dos estudios recientes de los flujos de nutrientes mediados por especies de esponjas del Caribe y el Mediterráneo 21 (Morganti et al. Presentado).
El uso de muestreadores específicas, la duración prolongada de muestreo, y las condiciones de campo, en el que se aplica VacuSIP, implica algunas desviaciones de los protocolos estándar oceanográficos para recoger, filtrar y almacenar muestras de analitos sensibles. Para reducir el riesgo de contaminación por el sistema VacuSIP o el riesgo de modificación de la muestra de agua por la actividad bacteriana después de la recogida, probamos varios en los procedimientos de filtración y de almacenamiento in situ. Diferentes dispositivos de filtrado, recipientes de recogida, y los procedimientos de almacenamiento se examinaron con el fin de lograr la técnica más adecuada para el análisis de inorgánico disuelto (PO 4 3-, NO x -, NH 4 +, SiO 4) y orgánica (DOC + DON) compuestos, y ultra-plancton (<1081; m) y partículas orgánicas (POC + muestreo PON). Para reducir aún más el riesgo de contaminación, especialmente en condiciones de campo, el número de etapas de manipulación se redujo al mínimo. El formato visual en el que se presenta el método está orientada para facilitar la reproducibilidad y de reducir el tiempo necesario para aplicar de manera eficiente la técnica.
Resumen del sistema
Para muestra en agua in situ bombeada desde los alimentadores de suspensión con orificios exhalantes tan pequeños como 2 mm, la actividad de bombeo de cada muestra se visualizó por primera vez por que liberan de forma filtrada fluoresceína teñido de agua de mar al lado del orificio (s) de inhalantes y observar su flujo desde la abertura excurrente 16 (ver también la Figura 2B en 18). El agua inhalado y exhalado por la muestra de estudio (incurrente y excurrentes) son entonces muestras de forma simultánea con el uso de un par de tubos hora instalados en manipulador a la medida o en dos de los "arms "de un trípode portátil flexibles al revés (figura 1 y complementario de vídeo 1). El agua inhalado por el organismo estudio se recoge mediante el posicionamiento cuidadosamente el extremo proximal de un tubo en el interior o cerca de la abertura de inhalantes del organismo estudio. Un idéntica tubo se coloca dentro del orificio excurrent. Esta operación requiere un buen cuidado de evitar el contacto o perturbación del animal, por ejemplo, mediante resuspensión de sedimentos. para comenzar el muestreo, un buzo perfora un tabique en el recipiente de recogida con una aguja de jeringa unida a la extremo distal de cada tubo, permitiendo que la presión de agua externa para forzar el agua en la muestra en el recipiente a través del tubo de muestreo. la succión es iniciada por el vacío creado previamente en los viales y por la diferencia de presión entre el agua externa y el recipiente de muestra evacuado .
Para asegurar una colección de agua limpia exhalado y para evitar la aspiración accidental de Ambiagua ent 16, la tasa de muestreo del agua debe mantenerse a una tasa significativamente más baja (<10%) que el caudal excurrente. La velocidad de aspiración se controla por la longitud del tubo y su diámetro interior (ID). El diámetro interno pequeño también asegura un volumen muerto insignificante (<200 l por cada metro de tubo). El muestreo durante períodos prolongados (minutos a horas) hace que sea posible la integración de la agregación inherente de la mayoría de las sustancias de interés. Para asegurarse de que las muestras se conservan adecuadamente en sesiones de toma de muestras submarinas prolongados, así como para el transporte al laboratorio, una en la filtración situ se recomienda para analitos sensibles. La selección de los vasos de muestreo, conjunto de filtración, y los tubos están dictadas por los organismos de estudio y la pregunta de investigación específica. El protocolo se describe a continuación asume que un perfil metabólico completo es de interés (para una revisión véase la Figura 2). Sin embargo, la naturaleza modular del protocolo permite fo modificación fácil para dar cabida a los planes de muestreo simples o incluso muy diferentes. Para un perfil metabólico completo, el protocolo de muestreo debe incluir los siguientes pasos: (1) la visualización de flujo; (2) El muestreo de alimentación ultra-plancton (plancton <10 micras); (3) El muestreo absorción de nutrientes inorgánicos y excreción (utilizando los filtros en línea); (4) El muestreo disuelto absorción orgánica y excreción (utilizando los filtros en línea); (5) se alimentan de partículas y la excreción (utilizando los filtros en línea); (6) Repita el paso 2 (ultra-plancton alimentación como control de calidad); (7) de flujo de visualización.
Cuando logísticamente factible, se recomienda que las mediciones de perfiles metabólicos se combinan con la velocidad de bombeo (por ejemplo, el método de velocidad frente de colorante, en 16), así como con las mediciones de respiración. Estas mediciones se toman mejor al principio y al final de la sesión de muestreo. Para la medición de la respiración, optodes bajo el agua o micro-electrodos son preferibles.
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Protocol
1. Los pasos preparatorios y de limpieza Procedimientos
- Solución de limpieza
- Use equipo de protección, una bata de laboratorio y guantes en todo momento. Llevar a cabo estos pasos preparatorios en un espacio limpio y libre de polvo y humo.
- Preparar una solución de ácido clorhídrico al 5-10% (HCl) con productos frescos y de alta calidad, agua doblemente destilada.
- Prepare un 5% de mezcla básica altamente soluble de solución de tensioactivo aniónico y no iónico (Ver Lista de Materiales) con productos frescos y de alta calidad, agua doblemente destilada.
- Almacenar todas las soluciones de limpieza, lavado con ácido contenedores.
- Pasos de preparación y procedimientos de limpieza (en el laboratorio)
NOTA: Si los compuestos de fósforo no sean de interés, el lavado HCl puede ser reemplazado por ácido fosfórico de alta calidad (H 3 PO 4) de lavado (8% H 3 PO 4 concentración final).- Use equipo de protección, una bata de laboratorio y guantes en todo momento.
- lavarel aparato de muestreo (excluido el acero inoxidable Swinney soporte del filtro en línea) con una amplia cantidad de agua de alta pureza. Deje el aparato de inmersión en una solución de HCl 5-10% durante la noche. Enjuague el aparato de nuevo con una amplia cantidad de agua destilada doble de alta calidad.
- Lavar los soportes de los filtros de acero inoxidable Swinney en línea con una amplia cantidad de agua de alta pureza. Deje los soportes de los filtros que empapan en 5% de mezcla básica altamente soluble de la solución de tensioactivos aniónicos y no iónicos durante la noche. Enjuague de nuevo con un amplio alta calidad del agua doblemente destilada.
- Seque todo el aparato de muestreo, envolverlos en papel de aluminio y guardar en una caja limpia hasta su uso.
- Control de la tasa de succión
- Control de la velocidad de muestreo mediante el ajuste de la longitud y el diámetro interno de la tubería de admisión de acuerdo con la profundidad de trabajo previsto y temperatura del agua. Utilice la siguiente ecuación (derivado de la ecuación de Hagen-Poiseuille utilizado para plenamente desadesa- flujo laminar tubería) como guía:
donde F = velocidad de flujo (cm 3 min -1),? P = presión diferencial (bar), r = entrada de la tubería radio interno (cm), K = 2.417 x 10 -9 (sec -2), L = longitud del tubo (cm ), V = viscosidad del agua (g cm -1 s -1). Véase la Tabla 1 para más detalles. - Mantenga velocidad de muestreo por debajo de 1% de la velocidad de bombeo del animal estudiado.
NOTA: El uso de recipientes evacuados, a veces con un vacío desconocido plantea complicaciones adicionales. Por lo tanto, una prueba de campo es muy recomendable. A 10 m de profundidad y ~ 22 ° C el agua de mar (40 PSU), un tubo de 50 cm de entrada con un diámetro interno de 254 micras ofrece una velocidad de aspiración promedio de ~ sec 26 l -1 (1,56 ml min -1).
- Control de la velocidad de muestreo mediante el ajuste de la longitud y el diámetro interno de la tubería de admisión de acuerdo con la profundidad de trabajo previsto y temperatura del agua. Utilice la siguiente ecuación (derivado de la ecuación de Hagen-Poiseuille utilizado para plenamente desadesa- flujo laminar tubería) como guía:
- vasos de muestreo
- Para las muestras de pequeño volumen (3-20 ml, por ejemplo, ultra-plancton para cyt flujogeo-) utilizan tubos de plástico estériles pre-aspiradora.
NOTA: Pre-aspiradora tubos de plástico estériles se emplean rutinariamente para análisis de sangre estándar en los seres humanos; asegúrese de usar los tubos estériles sin aditivos. Estos tubos de plástico estériles aspiradas son mejor muestreados con el uso de soporte de tubo estéril, de un solo uso con fuera del centro Luer. Si bien este es el aparato de muestreo más segura y eficiente, que tiene un volumen muerto ligeramente más grande en comparación con una aguja simple. - Para las muestras de agua más grandes, tales como nutrientes y materia orgánica disuelta, utilizar 40 o 60 ml viales de vidrio que cumplen con los criterios de la Agencia de Protección Ambiental (EPA) para análisis orgánicos volátiles. Estos viales incluyen un tapón de polipropileno con un septum de silicona PTFE enfrentado.
- Para volúmenes más grandes, incluso, utilizar botellas de penicilina con tapones de goma o termos.
- Usar frascos de polietileno de alta densidad (HDPE) frascos para muestras de sílice.
- Para aumentar el volumen de la muestra y para reducir el riesgo de que el desprendimiento del tapóndurante el ascenso, evacuar (vacío) artículos 1.4.2-1.4.4 antes de la inmersión con una bomba de vacío. De vacío de forma manual mediante el uso de una bomba de vacío manual o incluso aspirando el aire con una jeringa. Sin embargo, para obtener mejores resultados, se recomienda una buena bomba de vacío. liofilizadores estándar proporciona alto vacío.
NOTA: Prestar especial atención cuando se utilizan grandes frascos de la aspiradora para asegurar que la velocidad de aspiración inicial más rápida no contaminaría las muestras de agua exhalado.
- Para las muestras de pequeño volumen (3-20 ml, por ejemplo, ultra-plancton para cyt flujogeo-) utilizan tubos de plástico estériles pre-aspiradora.
- Los procedimientos de limpieza de recipientes
- Para orgánicos disueltos y NH4 + análisis, utilizar nuevos viales pre-limpiado la EPA.
- Enjuagar los viales (vidrio y polietileno de alta densidad) para el análisis de otros nutrientes como sigue:
- Enjuague los viales (vidrio y polietileno de alta densidad) y las tapas de polipropileno con agua doblemente destilada de alta calidad. Instalar un nuevo tabique de silicio.
- Remojar los viales de vidrio (HDPE) y en el 10% de HCl durante al menos 3 días y enjuagar con abundante agua de alta calidad bidestilada.
- Quemar los viales de vidrio a 450 ° C durante 4 horas y se deja enfriar en el horno. Instalar el tapón, y envolver en papel de aluminio hasta su uso.
- filtros
- Utilizar filtros de fibra de vidrio libre de aglutinantes para la filtración de todas las muestras orgánicas disueltas (por ejemplo, DOC, DON) y para la recogida de la materia orgánica en partículas (por ejemplo, POC, PON). Empacar cada filtro de vidrio en un sobre de papel de aluminio por separado. Combustión a 400 ° C durante 2 horas para volatilizar los residuos orgánicos y guardar en un recipiente limpio y seco hasta su uso.
- Utilizar un exentos de ligante filtros de fibra de vidrio como anteriormente, o membranas de policarbonato de 0,2 micras para el muestreo de nutrientes inorgánicos (por ejemplo, PO 4 3-, NO x -, NH4 +). Limpiar el último una vez instalado en el soporte del filtro tal como se explica a continuación (1.7.3).
- Use 0,2 micras filtros de membranas de policarbonato para la toma de muestras de sílice. Limpiarlos una vez installed en el soporte del filtro tal como se explica a continuación (1.7.3).
- Preparación de conjunto de filtración
- Se filtra la mezcla básica altamente soluble de tensioactivos aniónicos y solución de agente tensioactivo no iónico y la alta calidad de agua destilada doble a través de un filtro de 0,2 micras antes de usarlos para limpiar el conjunto de filtración.
- conjunto de filtración por los nutrientes y orgánicos disueltos distintos de la sílice:
- Coloque unas quemados filtros de fibra de vidrio libre de aglutinantes en el interior del acero inoxidable de soporte del filtro limpiado en línea Swinney.
- Utilice una jeringa de limpiarse con ácido para correr 100 ml de 5% de mezcla básica altamente soluble de tensioactivos aniónicos y solución de agente tensioactivo no iónico y, a continuación 100 ml de agua destilada doble de alta calidad a través de todo el conjunto.
- Conjunto de filtración de SiO4:
- Coloque el filtro de policarbonato en el interior del soporte del filtro de policarbonato limpiado (portafiltros PC).
- Utilice una jeringa de limpiarse con ácido para rONU 30 ml de HCl al 5% y 30 ml de agua destilada doble de alta calidad a través de todo el conjunto.
- sistema de ensamblaje
- Montar el sistema para el trabajo bajo el agua usando un tubo de PEEK (poliéter-éter-cetona) con un diámetro exterior (OD) de 1,6 mm y un diámetro interno (ID) de 254 micras o 177 micras.
- Use un cuchillo o PEEK cortador afilado para cortar los tubos a la longitud requerida.
- En su extremo distal (lado de recipiente de la muestra), la medida de cada tubo con un conector Luer macho unido a una aguja de la jeringa. Asegúrese de seguir las instrucciones del fabricante y alinear la parte plana del casquillo azul sin pestañas con el extremo del tubo antes de apretar la tuerca verde.
- Una el tubo de PEEK al trípode "brazos" o manipulador hecha a la medida mediante el uso de una cinta aislante.
- Adjuntar una aguja de jeringa desechable al conector Luer macho. Mantenga la aguja con su tapa protectora para evitar lesiones. Etiquetar claramente el código de engranajes de muestreo y color todos los componentes inhalados y exhalados (por ejemplo, verde = A, rojo = Ex).
- Del mismo modo el código de color de los vasos de muestreo con conjuntos de vasos de toma de muestras pareadas numerada secuencialmente.
donde F = velocidad de flujo (cm 3 min -1),? P = presión diferencial (bar), r = entrada de la tubería radio interno (cm), K = 2.417 x 10 -9 (sec -2), L = longitud del tubo (cm ), V = viscosidad del agua (g cm -1 s -1). Véase la Tabla 1 para más detalles. 2. Submarino de Trabajo
- La preparación del lugar de trabajo
- Estudio preliminar y selección de muestras
NOTA: Debido a la naturaleza compleja del protocolo de muestreo bajo el agua, dedicando el tiempo necesario para la preparación asegurará una inmersión de muestreo eficiente.- Inspeccionar el lugar de trabajo y hacer los preparativos necesarios antes de tiempo.
- Seleccionar y marcar los organismos objetivo adecuados que se pueden acceder con relativa facilidad. Dado que no todos los organismos pueden ser necesariamente activa en el momento de la inmersión de muestreo, preparación de más estaciones de trabajo de lo que espera a la muestra.
- La instalación de soportes de base
- when trabajando en sustrato estabilizado:
- Montar el clip de liberación rápida original del trípode flexible de pesos en 1 kg de buceo y simplemente colocarla al lado del animal diana.
- Cuando se trabaja en paredes verticales:
- placas de montaje en la base de apoyo para el sistema VacuSIP, ganchos para útiles accesorios, y perchas para el recipiente colector bandeja portadora durante la etapa de preparación del lugar de trabajo (2.1.1).
- Cuando se utilizan los trípodes portátiles flexibles, utilizar pernos o resina epoxi de dos componentes para fijar placas de 10x10 cm de PVC junto a cada animal de destino. Cada placa tiene que tener un agujero para colocar los clips de liberación rápida del trípode portátil flexible.
- Una vez que la resina ha curado y las placas de base se encuentra rígidamente montada a la pared, el tornillo en los clips de liberación rápida, que sirve como un punto de fijación firme para el trípode portátil flexible para el sistema VacuSIP.
- when trabajando en sustrato estabilizado:
- Estudio preliminar y selección de muestras
- Instalación del VaCusip
- Compruebe si la muestra está bombeando por la liberación de fluoresceína filtrada al lado del orificio de inhalantes y confirme que el colorante está emergiendo a través del orificio exhalaciones como se describe en Yahel et al. (2005) 16.
- Instalar el dispositivo VacuSIP y colocar el tubo de inhalantes (EN) de muestreo dentro del orificio de inhalantes o simplemente al lado de él (a menos de ~ 5 mm). Asegúrese de que el tubo de inhalantes no está en la proximidad de otro orificio exhalante.
- Dirigir con cuidado el tubo de muestreo exhalante (EX) hacia el sifón osculum / exhalante e inserte muy suavemente hacia adentro, hasta que se posicione 1-5 mm en el interior del osculum / sifón exhalante (ver Figura 1 y complementario de vídeo 1). Tenga mucho cuidado de no hacer contacto con o de alguna otra manera el organismo muestreada.
- Antes y durante la toma de muestras a comprobar la ubicación de ambos tubos.
- Después de la comprobación de muestreo si la muestra está todavía bombeando como described anteriormente (2.2.1).
NOTA: Debido a que el movimiento de un brazo del trípode cuando la manipulación de la otra podría ocurrir, asegúrese de colocar en primer lugar el tubo de muestreo de inhalantes y en segundo lugar el tubo exhalante, lo que requiere una manipulación más precisa. Después de esta orden, incluso si la manipulación del tubo de muestreo exhalante puede hacer que el movimiento del tubo de inhalantes, que no afectará a la toma de muestras.
- Procedimiento de muestreo bajo el agua modular
NOTA: A la espera de la pregunta de investigación, cada una de las etapas experimentales siguientes se puede realizar como un experimento independiente. El protocolo de muestreo perfil metabólico completo que se describe a continuación es un proceso largo, que requiere hasta 8 horas por espécimen (para una revisión véase la Figura 2 y Tabla 2). Como las condiciones y regulaciones de buceo difieren entre los sitios de muestreo, las regiones y las instituciones, los planes de buceo no están incluidos en este protocolo. Sin embargo, dedicar un cuidado extremo y meticulous la planificación del plan de buceo. Prestar especial atención para evitar la saturación y el yoyo perfiles de inmersión. Cuando sea posible, es aconsejable llevar a cabo estos experimentos a poca profundidad (<10 m). respiradores de circuito cerrado puede ser muy útil para este tipo de sistemas de muestreo prolongados.- Antes de que comience el muestreo real, asegúrese de que no hay rastros visibles de residuos de fluoresceína se mantienen y que los sedimentos en suspensión se han resuelto o han wafted de distancia.
- Ultra-plancton, (sin filtro se instala en este paso!)
- Utilice la aguja para perforar la (inhalada) y EX (exhalado) aspiraron tubos de plástico estéril septos. Compruebe que el agua gotea en al ritmo previsto y recoger muestras de agua de 2-6 ml.
- En la recuperación, mantener las muestras en una caja fría en hielo. En el laboratorio, preservar con 1% de paraformaldehído + 0,05% de glutaraldehído grado EM (concentración final), o 0,2% de glutaraldehído grado EM. Congelar crioviales en nitrógeno líquido y se almacena a -80 y# 176; C hasta su análisis.
- Muestreo de silicato y almacenamiento
- Instalar el soporte del filtro PC acero pre-limpiado en línea que contiene una membrana de policarbonato de 0,2 micras entre la aguja y el conector Luer macho en el extremo distal del tubo.
- Perforar la tapa del tabique de los viales de polietileno de alta densidad pre-limpiado (frascos de HDPE) para iniciar el muestreo. Compruebe que los dos muestreadores están goteando y recoger 15 ml de agua en cada vial.
- Mantener las muestras refrigeradas (4 ° C) hasta su análisis. Si el análisis no puede comenzar dentro de dos semanas, almacenar a -20 ° C. Para el análisis, asegúrese de que las muestras se descongelan a 50 ° C durante al menos 50 minutos para disolver los geles de sílice.
NOTA: La membrana se puede conservar para microscopía o análisis de ADN según sea necesario.
- Inorgánicos disueltos (PO 4 3-, NO x -, NH4 +)
- reemplazar tél conjunto de filtro de PC con un soporte de filtro de acero inoxidable en línea previamente limpiadas que contiene un filtro de vidrio pre-combustión.
- Antes del muestreo, aseguran que se pasaron al menos 20 ml de muestras de agua marina a través de todo el sistema de filtración mediante el uso de EPA, viales de polietileno de alta densidad u otro recipiente de vacío para iniciar la succión. Medir el volumen del agua recogida antes de que se descartan.
- Perforar la tapa del tabique de los viales de vidrio apropiadas para iniciar el muestreo de la EPA, compruebe que ambas muestras están goteando, y recoger 25-30 ml de nitrato y fosfato de análisis.
- Cambiar a nuevos viales de vidrio de la EPA para el análisis de amoniaco, compruebe que ambas muestras están goteando, y recogen 20 ml en cada vial.
- Mantener las muestras en una caja fría en hielo y se almacena a -20 ° C hasta el análisis.
NOTA: Si sólo el filtrado es de interés, filtros de jeringa desechables se pueden utilizar para los pasos 2.3.3 y 2.3.4.
- Compuestos orgánicos disueltos de muestreo y ST (DOC + DON)oring
NOTA: Mantenga las muestras lo más vertical posible durante todo el manejo de modo que el agua de la muestra no entre en contacto con los tabiques de silicio.- Siga utilizando el conjunto de filtro de acero inoxidable y recoger 20 ml de las muestras de agua de mar en nuevos viales de vidrio de la EPA, como se describe anteriormente.
- En la recuperación, mantener las muestras en una caja fría en hielo. En el laboratorio, utilizar una pipeta Pasteur de vidrio pre-combustión para fijar las muestras con ácido ortofosfórico (añadir 5-6 gotas de ácido de calidad de metales traza 25% en una muestra de 20 ml, concentración final 0,04%) o ácido clorhídrico (añadir 2 gotas de metales traza de grado ácido concentrado en una muestra de 20 ml, concentración final 0,1%) y mantener refrigerado.
- Mantener las muestras refrigeradas (4 ° C) hasta su análisis. Si las muestras no se analizan dentro de una semana de la recogida, se almacena a -20 ° C hasta el análisis.
- Materia orgánica particulada (POC, PON, POP)
- Seguir utilizando el stainless conjunto de filtro y el filtro de acero al menos 500 ml de agua de mar en un frasco de vacío 250 ml evacuado. Vuelva a colocar los frascos si es necesario.
- En la recuperación, utilizar una jeringa llena de aire para evacuar toda el agua de mar remanente del soporte del filtro, envolver en papel de aluminio y guardar en una caja fría en hielo. En el laboratorio, extraer los filtros de los portafiltros y almacenar a -20 ° C hasta el análisis.
- Antes de que comience el muestreo real, asegúrese de que no hay rastros visibles de residuos de fluoresceína se mantienen y que los sedimentos en suspensión se han resuelto o han wafted de distancia.
Figura 1. Un ejemplo de instalaciones correctas del VacuSIP: (a) el muestreo de la ascidia Polycarpa mytiligera (Golfo de Aqaba, Mar Rojo) usando un manipulador hecha a la medida con el código de color que se utiliza para el verde y amarillo para inhalado muestras de agua exhalado (foto por Tom Shelizenger y Yuval Yacobi); (B) el muestreo de las oroides esponja Agelas (Mediterráneo noroccidentalMar) con una anchura de 3 mm osculum, utilizando el dispositivo VacuSIP. El código de color utilizado es de color amarillo para inhalado y rojo para las muestras de agua exhalado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Descripción de la técnica VacuSIP se describe en la sección de protocolo. El trabajo de laboratorio está representado en cuadros de color amarillo, el trabajo de campo en cajas azules. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Las frecuencias de muestreo promedio generales (ml min-1) obtenidos con diferentes contenedoresutilizados para los depósitos de agua y diferentes niveles de vacío: los frascos no aspiraron (ninguno); viales de vidrio y frascos de HDPE EPA aspiraron la mitad de su volumen (½ volumen); tubos de plástico estériles ya aspiraron por el fabricante. Trabajando a 5-8 m de profundidad, temperatura del agua de 18-22 ° C, utilizando tubos de PEEK de 79 cm de longitud y de 25 m de diámetro interno.
Tabla 2. Resumen de la recipiente de muestreo, el conjunto de filtro de fijador, en línea, el almacenamiento y los métodos de análisis descritos en la sección de protocolo. Los compuestos analizados son: la abundancia de plancton ultra-(plancton <10 micras), silicato (SiO4), fosfato (PO 4 3-), nitritos + nitratos (NO 2 - + NO 3 -), materia orgánica disuelta (DOM), amonio (NH4 +) y materia orgánica particulada(POM). Todos los vasos de muestreo tienen tapa de septo de silicio y se aspiran antes del muestreo. Los fijadores son: paraformaldehído + glutaraldehído (GLUT + Parafor), ácido fosfórico (H 3 PO 4) y ácido clorhídrico (HCl). Los conjuntos de filtros en línea utilizados son: soportes de los filtros de policarbonato y policarbonato membrana de 0,2 micras filtros (filtro de membrana de soporte de PC + PC) y los soportes de filtro de acero inoxidable y fibra de vidrio sin aglutinante Filtros de GFF.
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Representative Results
La optimización de los métodos de recolección de agua de mar
Selección de los viales de colección y procedimiento de limpieza
recipientes colectores compatibles con VacuSIP deben tener un tabique que permite el muestreo a ser iniciado por la perforación con una aguja de la jeringa. Deben soportar la presión bajo el agua elevada (2-3 bares en la escafandra autónoma típicos profundidad de trabajo), y deben mantener el vacío. Muchos (pero no todos) de las marcas viales aprobados por la EPA para el análisis de compuestos orgánicos volátiles cumplen con estos criterios. viales pre-limpiado aprobados para DOC y análisis de DON también están disponibles. Para poner a prueba la idoneidad de estos viales para la recogida y el análisis de nutrientes y optimizar los procedimientos de limpieza, se recogió el agua doblemente destilada de alta calidad en tubos de polipropileno-ácido (tubos de PP), que acaba de adquirir, en unafrascos de polietileno de alta densidad (CID-limpiado viales de polietileno de alta densidad), y en viales de vidrio de la EPA, todas equipadas con una cápsula de cierre de politetrafluoroetileno (PTFE). Los viales de polietileno de alta densidad y tubos de polipropileno se limpiaron como se describe en la sección 1.5.2 anterior, y los viales de vidrio de la EPA fueron limpiados por el fabricante.
La cantidad de NH 4 + encontrado en viales de vidrio de la EPA era relativamente mínimo (≤ 0,1 mol L -1) y depende de la doble calidad estándar de agua destilada de alta calidad. Por el contrario, NH + 4 concentraciones aumentaron significativamente (hasta 3 y 7 veces, respectivamente) y exhibió una mayor variabilidad en tubos de polipropileno de ácido limpiados y en viales de polietileno de alta densidad (ANOVA F (5,53) = 7,183, p < 0,001, Figura 3). No hubo efecto de doble contacto de agua destilada de alta calidad con el septo de silicio en el análisis de amonio.
Comparación de los nuevos viales de vidrio frente a viales de vidrio limpios / reciclados
Para probar si viales de vidrio EPA se podrían utilizar para el análisis de nutrientes más de una vez, el NO x -, PO 4 3-, y NH 4 + concentraciones en muestras de agua marina recogidos en nuevos viales de vidrio de la EPA se compararon con los recogidos en viales de vidrio usadas EPA. Los nuevos viales de vidrio de la EPA se pre-limpiados por el fabricante, mientras que los viales de vidrio reciclado se limpiaron como se describe anteriormente (1.5.2). Frascos reciclados tenían significativamente más alta concentración de NH4 +, hasta 1,5 veces el nivel encontrado en los nuevos viales de vidrio (prueba t, p <0,001, n = 5). No se encontraron diferencias significativas en el NO x - y PO 4 3- contenido entre las muestras recogidas en frascos reciclados y las muestras recogidas en el nuevo vidrioviales (Figura 4).
Colección silicato y procedimientos de almacenamiento
Para determinar el mejor recipiente de muestreo para el análisis de silicato, se recogió agua destilada doble de alta calidad en (viales HDPE) sin limpiar y en tubos de polipropileno-ácido (tubos de PP), en viales de polietileno de alta densidad de ácido limpiado, y en viales de vidrio de la EPA. La concentración de silicato esperado era cercano a cero, por lo que se consideraron los valores que se desviaban de la concentración esperada contaminada. La concentración de silicato difería significativamente entre las muestras recogidas en los diferentes viales (ANOVA, F (3,19) = 210.047, p <0,001), mostrando la menor concentración de SiO 4 en los frascos de HDPE-ácido limpiado. Viales de vidrio de borosilicato de las muestras contaminadas, con la concentración final SiO4 aumentar hasta en un 7 molL-1 (Figura 5).
Selección de aparatos de filtración de la materia orgánica disuelta (DOM) y el análisis de nutrientes
Para determinar qué aparato de filtro produce la más baja en blanco en el análisis de orgánico disuelto (DOC y DON) y nutrientes inorgánicos (NO x -, NH 4 +, PO 4 3-), soportes de los filtros de acero inoxidable se compararon con policarbonato en línea Swinney soportes de filtro. Con cada tipo de soporte del filtro que hemos probado tanto en la membrana de policarbonato y un filtro de fibra de vidrio pre-combustión. La combinación de soporte del filtro de acero inoxidable y filtro de fibra de vidrio de combustión proporciona los espacios en blanco más bajos, mientras que el soporte del filtro de policarbonato Swinney equipado con membrana de policarbonato claro contaminado las muestras hasta 9 veces. El aumento de los volúmenes de lavado hizo no resuelve este problema (Figura 6).
Figura 3. concentración de amonio (mol L-1, ± SD media) recogidos con diferentes viales: (1) frasco de HDPE sin limpiar; (2) frasco de HDPE limpio; (3) El HDPE limpio vial + Parafilm; (4) vial de vidrio de la EPA; (5) vial de vidrio Parafilm EPA +; (6) Se entrega limpio tubo de PP. El Parafilm se colocó para probar si el septo de silicio puede contaminar las muestras de agua. Para cada tratamiento se analizaron 9 muestras de agua destilada doble de alta calidad. Las muestras se analizaron fresco. No se encontraron diferencias significativas entre los cuatro vasos de muestreo (ANOVA, F (5,53) = 7.183, p <0,001, test de potencia = 0,992). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. amonio (NH4 +), nitritos + nitratos (NOx -), y las concentraciones de fosfato (PO 4 3-) (mol L -1, media ± DE) de muestras de agua marina recogidas en la nueva (oscuro) y reciclados / limpian viales de vidrio (blanco) de la EPA. El agua de mar se recogió en la Zona de acuarios experimentales del Instituto de Ciencias del Mar y se filtró con soporte para filtro de acero inoxidable y filtro de vidrio. Las muestras de agua se analizaron fresco. El asterisco (*) indica que la diferencia es significativa (prueba t, p <0,001, n = 5, prueba de potencia = 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5. concentración de silicato (mol L-1, ± SD media) en la alta calidad del agua doblemente destilada, recogidas en diferentes viales: tubos de PP-ácido limpiado, tubos, frascos de HDPE PP-ácido limpiado, nuevos viales de vidrio de la EPA. No se encontraron diferencias significativas entre los cuatro materiales de toma de muestras (ANOVA, F (3,19) = 210.047, p <0,001, prueba de potencia = 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Al examinar el efecto de diferentes conjuntos de filtración y lavar los volúmenes de nitritos + nitratos (NO x - mol L -1). Las muestras para el NOx - se obtuvieron mediante el filtrado de las muestras de agua de mar con acero inoxidable (SS ftitular iltrar) o policarbonato en línea portafiltros Swinney (PC) de soporte del filtro equipada con una membrana de policarbonato (PC filtro) o un pre-combustión filtros de fibra de vidrio. Para los filtros de PC, diferentes volúmenes (10, 30, 60, 90 y 120 ml) de HCl al 5% y de alta calidad de agua bidestilada se utilizaron para el lavado del conjunto de filtro, el volumen de lavado se da en paréntesis en la leyenda de la figura. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n = 5). El agua de mar se recogió en la Zona de acuarios experimentales del Instituto de Ciencias del Mar y las muestras se analizaron fresco después de la filtración. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Ejemplo de resultados experimentales: se inhala (EN, negrocírculo) y exhalados (EX, triángulo rojo) emparejado concentraciones de la muestra de agua (mol L-1) de diferentes sustancias procesadas por la esponja Chondrosia reniformis en el Mar Mediterráneo: (A) de amonio (NH4 +); (B) + nitrito de nitrato (NOx -); (C) de fosfato (PO 4 3-); (D) de silicato (SiO4); (E) de carbono orgánico disuelto (DOC); (F) disuelto nitrógeno orgánico (DON); (G) de carbono orgánico planctónicas (LPOC); (H) de nitrógeno orgánico planctónicas (LPON). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Un ejemplo de un flujo cytometría análisis de muestras de agua emparejadas extraídas del agua inhalado (A, C, E, G) y exhalado (B, D, F, H) por la esponja Chondrosia reniformis: (A, B, C, D) las poblaciones de fitoplancton; (E, F, G, H) bacterias heterótrofas. En AB y EF del muestreo fue clara y precisa (todos los grupos planctónicos fueron retenidos de manera eficiente). CD y GH son ejemplos de contaminación del agua exhalado, que muestran baja eliminación de todos los grupos planctónicos. Syn:. Synechococcus sp, pico: picoeukariotes autótrofos, nano: nanoeukaryotes autótrofos, alto: las bacterias heterotróficas con alto contenido de ADN, bajo:. Bacterias heterotróficas con bajo contenido de ADN Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figur complementariae la eficiencia de la célula 1. retención de diferentes presas planctónicas por la almeja Chama pacifica: Prochlorococcus sp. (Pro), Synechococcus sp. (SYN), pico-eucariotas (Pico euk), nano-eucariotas (Nano euk). Las barras de error = IC del 95%. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Complementario de video 1. El muestreo de la ascidia mytiligera Polycarpa usando un manipulador hecha a la medida con el código de color que se utiliza para inhalado verde y amarillo para las muestras de agua exhalado. Los tubos de muestreo (PEEK, ID 54 m, 75 cm de largo) se colocan cuidadosamente en los inhalantes exhalantes y sifones de la ascidia. El agua se introduce en que los tubos de vacío a una velocidad de ~ 1 ml min -1. En esta demostración fluoresceína se utiliza para visualizar el chorro exhalante. Tenga en cuenta que el tubo de muestreo exhalante se coloca así wiel chorro fino exhalante. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
pasos preparatorios
Viales de colección para DOM y análisis de nutrientes
Desde vasos colectores pueden interactuar con el micro-constituyentes disueltos y las paredes de toma de muestras puede ser un sustrato para las bacterias de crecimiento 30-34, se ensayaron diferentes viales para DOM y recogida de nutrientes. Borosilicato no se recomienda para la cuantificación de sílice 33,35, desde botellas de vidrio pueden aumentar la concentración inicial de sílice por hasta dos veces si las muestras no se congelan rápidamente 30. Nuestros resultados demuestran que el uso de viales pre-limpiado EPA da lugar a espacios en blanco de baja concentración de DOC, DON, y nutrientes inorgánicos, sobre todo para el amonio.
DOC filtración y almacenamiento
La filtración es una requiere y, en muchos casos, es el primer paso de análisis en química marina ymicrobiología. Si bien es posible filtrar las muestras después de la recogida en el laboratorio, este procedimiento no se recomienda para el trabajo in situ, donde las muestras se recogen bajo el agua, a menudo en lugares remotos, horas o días fuera de las instalaciones de laboratorio apropiadas. El uso de la línea en, en la filtración situ minimiza la manipulación de la muestra y por lo tanto reduce el riesgo de contaminación. En la filtración situ también elimina la mayor parte de las bacterias y reduce el riesgo de que la composición de la muestra se verá alterada por el metabolismo bacteriano durante el muestreo prolongado y transporte hora. El conjunto de filtración aumenta el volumen muerto del aparato, toma de muestras y también puede ser una fuente de contaminación. Una selección de los titulares posible de filtro más pequeños (por ejemplo, en línea Swinney soporte del filtro 13 mm) y el tubo de PEEK minutos (por ejemplo, 254 micras ID) se reduce el volumen muerto y el riesgo de contaminación por el agua ambiente.
Si el filtro no es adecuadoutilizados o si no se lava cuidadosamente, artefactos y la contaminación de las muestras de agua es probable que ocurran 32,36-39. Los estudios de análisis de COD mostraron que los filtros y los soportes de los filtros hechos de compuestos orgánicos (policarbonato y PFA-PTFE) pueden resultar en la contaminación severa DOC 32,37, especialmente cuando no enjuagarse a fondo con la alta calidad del agua doblemente destilada 38. El presente protocolo y los resultados siguen estas directrices y también indican que los soportes de los filtros de policarbonato deben ser evitados.
En el trabajo in situ y la interoperación
El sistema VacuSIP es una técnica de muestreo directo que facilita el estudio del metabolismo de los alimentadores de suspensión no perturbadas en su entorno natural y la cuantificación de su papel ecológico en el sistema. Para los buceadores experimentados y equipados, la aplicación del método VacuSIP es simple y sólo requiere tr cortaESP ACIO. Experimentos InEx VacuSIP están diseñados para un análisis "-diseño within' estadística (es decir, el análisis de medida emparejado o repetidas), por lo tanto el control de la mayoría de los artefactos analíticos, incluidos altos espacios en blanco. El uso de succión controlada asegura velocidades de muestreo lentas y ajustables, evitando así la contaminación accidental de agua exhalado con agua a temperatura ambiente. Siempre que sea posible, se recomienda la selección de los sitios de trabajo con baja turbidez actual y baja y se asegurará resultados más limpios y precisos. El tiempo de muestreo prolongado (minutos a horas) permite la integración de la alta distribución irregular que caracteriza a la capa límite bentónica. Todas estas características aseguran que cuando se aplica correctamente el método VacuSIP es muy resistente, que proporciona resultados fiables y reproducibles, incluso cuando se trabaja con un pequeño número de repeticiones. Un ejemplo de los resultados típicos obtenidos a partir de una esponja Mediterráneo y especies de almeja del Indo-Pacífico se muestra en la Figura 7 y Supplementario Figura 1.
Al igual que con cualquier técnica, la VacuSIP no está exenta de peligros potenciales. El problema más común es la contaminación de la muestra de agua exhalado con agua a temperatura ambiente. Las razones de estos artefactos incluyen alta tasa de succión, desprendimientos de tubo, y el comportamiento de los animales. La selección adecuada de la frecuencia de muestreo correcta depende de las estimaciones previas de la velocidad de flujo excurrente. Estas estimaciones se pueden obtener mediante el método de velocidad frente de colorante 16. Idealmente, el caudal de aspiración debe mantenerse por debajo del 1% de la velocidad de bombeo (por ejemplo, 1 ml min -1 para una hora 6 L -1 velocidad de bombeo). Para evitar la contaminación con agua a temperatura ambiente, la frecuencia de muestreo no debe ser mayor que 10% de la velocidad de bombeo.
Para el control de la velocidad de muestreo, la longitud y el diámetro interno de la tubería de admisión deben ajustarse de acuerdo a la profundidad de trabajo previsto y temperatura del agua. La ecuación de Hagen-Poiseuille (véase la sección 1.3.1 arriba) se pueden utilizar como una guía. Sin embargo, esta ecuación debe ser considerada como una aproximación de primer orden desde el? P y disminución de la tasa de muestreo con el tiempo de muestreo y filtración en línea añade incertidumbres. El uso de contenedores evacuados, a veces con presiones de vacío desconocidos, introduce complicaciones adicionales. Un ejemplo de cómo las tasas de muestreo varía como una función de diferentes contenedores evacuados con diferente de vacío, se muestra en la Tabla 1.
La reducción de la velocidad de muestreo se logra fácilmente mediante el ajuste de la longitud del tubo y ID, sin limitaciones técnicas a esta reducción (velocidades de muestreo de unos microlitros por hora son factibles). Sin embargo, los experimentadores deben ser conscientes de la frecuencia de muestreo lenta dictada por esta limitación para los animales con velocidad de bombeo lento y de pequeños organismos o muestras. La consecuencia inmediata de la frecuencia de muestreo lento es el volumen limitado de agua que se puede recoger en una sola toma de muestras SESSIen. Este bajo volumen limitará el número de análisis y réplicas que se pueden ejecutar con estas muestras, y por lo tanto también limitar la información que puede obtenerse a partir de estas poblaciones.
desalojamiento tubo puede ser fácilmente detectado y el muestreo se puede interrumpir o reiniciado, a condición de que un buzo está a la escucha constante. En contraste, el cese de bombeo durante el muestreo no siempre es fácil de detectar. Esto es cierto no sólo para las esponjas, sino también para los tunicados, bivalvos y poliquetos. De hecho, contrariamente a la creencia común, los eventos en los que un ascidia o un bivalvo dejó de bombear se documentaron con ningún cambio visible en la geometría del sifón (Yahel, datos no publicados). Por otra parte, en algunos casos, tunicados pueden mantener bombeo activo sin la secreción de malla (es decir, sin la filtración tiene lugar).
El control de la velocidad de muestreo es crítica. A este respecto el VacuSIP es mejor que otros métodos, especialmente cuando los animales de estudio son relativEly pequeña o cuando se bombean lentamente. Las jeringas son particularmente difíciles de controlar 2. Por ejemplo, Perea-Blázquez y colaboradores (2012a) 40 utilizan una jeringa para muestrear el agua exhalado por varias especies de esponjas templado y sorprendentemente no encontraron un patrón general de la ingestión / excreción de nutrientes particulares (NO 2 -, NO 3 -, NH 4 +, PO 4 3-, SiO4). La falta de un patrón claro es probablemente el resultado de la contaminación de las muestras exhalados con agua a temperatura ambiente debido al uso de la jeringa. La contaminación es evidente por el extremadamente bajo eficiencia de retención de pico plancton informado por Perea-Blázquez y colaboradores (2012b) 41 por sus esponjas: 40 ± 14% de las bacterias heterótrofas y 54 ± 18% de Synechococcus sp. Para la comparación, usando la VacuSIP, Mueller et al. (2014) 21 informó una eficiencia de remoción de bacterias heterótrofas de72 ± 15% en Siphonodictyon sp. y 87 ± 10% en Cliona delitrix.
Para verificar la calidad de la muestra y asegurar que no hay contaminación del ambiente del agua se produce, es muy recomendable analizar en primer lugar las muestras de plancton pico y nano mediante citometría de flujo. Este análisis rápido, fiable y barato proporcionará información inmediata de calidad de la muestra. Es muy común para algunos taxones presas como Synechococcus sp. para ser eliminado en cerca de 90% de eficiencia 14,42 por esponjas y ascidias. Desviaciones significativas respecto a este punto de referencia sugieren que la contaminación podría haber ocurrido (Figura 8).
Para el muestreo fiable y limpia, hacer el experimento de diseño satisface las siete reglas simples que: (1) realizar un estudio preliminar (incluyendo estimaciones de la tasa de bombeo) y preparar así el lugar de trabajo; (2) conocer los animales estudiados; (3) verificar que la muestra estudiada tiene una abertura excurrente bien definido unand lugar accesible; (4) verificará que las muestras estudiadas está bombeando antes y después de cada toma de muestras; (5) Colocar el tubo para la recogida del agua exhalado ligeramente dentro de la abertura excurrente (Figura 1); (6) utiliza una velocidad de muestreo <10% de la velocidad de flujo excurrent, 1% es muy recomendable; (7) definir un criterio de calidad y omitir pares Inex sospechosos.
Siguiendo estas sencillas reglas, el sistema VacuSIP ofrece un método práctico y fiable para medir qué tan activo particulado proceso de alimentadores de suspensión y compuestos disueltos en condiciones naturales, permitiendo estimaciones precisas y comparables que se pueden utilizar para evaluar el papel funcional de los organismos filtradores en diferentes ecosistemas alrededor el mundo.
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Acknowledgments
Agradecemos a Manel Bolívar por su ayuda en el trabajo de campo. Estamos muy agradecidos con el "Parc Natural del Montgrí, las Illes Medes y el Baix Ter" por su apoyo a nuestros permisos de investigación y muestreo. El manipulador submarino fue diseñado por Ayelet Dadon-Pilosof y fabricado por el Sr. Pilosof. Este trabajo fue apoyado por el proyecto del Gobierno español CSI-Coral [número de concesión CGL2013-43106-R para RC y RM] y por una beca FPU del "Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" a TM. Esta es una contribución de la Biogeoquímica Marina y el grupo de Investigación del Cambio Global financiado por el Gobierno catalán [número de concesión 2014SGR1029] e ISF subvención 1280-1213 y BSF subvención 2.012.089 a G. Yahel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10 pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (254 µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01 in ID x 5 ft length. Alternative ID can be used. |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA Vials | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manufactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09). |
| HDPE Vials | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42). |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13 mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13 mm of diameter, pore size 0.7 µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13 mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13 mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 70 Solution | Decon Labs | 1002 | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25 mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100 g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7 mm x 30 mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2 ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55 mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 or Alternatively use Ultra-Pure Hydrochloric acid, final concertation 0.1% | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500 g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 or Alternatively use standard laboratory vacuum pump |
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