Introduction
テロメアは、異常な融合と分解から染色体末端を保護します。哺乳類テロメアは、Gリッチ六量繰り返し、TTAGGG、およびshelterin複合体で構成されています。線虫のテロメア反復配列は、哺乳動物（TTAGGC）のものと同様です。ほとんどの真核生物は、それらの染色体の末端にテロメアリピートを追加するには、テロメラーゼを利用します。しかし、10 -癌細胞の15％がテロメアの代替長くする（ALT）3として知られているテロメラーゼ独立した機構を利用します。以前、我々はテロメアとTALTという名前のその関連配列は、重要な無菌性2を生き延びテロメラーゼ変異系統のテロメアで増幅されたことを報告しました。
テロメア長は、定量的PCRにより、または合計テロメア4,5,6,7-の平均長さを提供し、サザンブロットによって測定しました。全ゲノム配列データにテロメアリピートの回数を読むまた、全テロメア内容8の指標です。罪が、GLEテロメア長解析（STELA）は、それがテロメア9の空間的な情報を提供することができない、単一のテロメアの長さを提供することができます。 POT-1 :: mCherryをレポータータンパク質が生体内でテロメアの空間的な情報を提供していますがPOT-1は、タンパク質10を結合一本鎖テロメアであるとして、それは、二本鎖テロメアの長さを表すことはできません。
上述の方法は、反復配列の平均の情報を提供するが、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、染色体規模量、対象の個々の配列の空間的なパターンを観察することができます。代わりにDNAの精製、組織または細胞は、FISHにおける天然の空間情報を保存するために固定されています。このように、FISHは、テロメアリピートなどの個々の反復配列の観察のための定量的および定性的な両方のツールです。
このプロトコルは、両方のteloの同時検出のための効率的な方法を提供します前述の方法11,12からの改良に基づく単なるおよびその他の繰り返し。C.エレガンスの幼虫や成虫は非常に分化した細胞と多細胞生物です。細胞の不均一性は、テロメアスポットの多数の定量分析に妨げます。分析した細胞の数を最大にするために、胚を単離し、FISH用ポリリジン被覆スライド上に広げています。また、このプロトコルは、免疫蛍光法と組み合わせることができます。
プロトコルが動作していることの証明として、我々は、2つの異なる反復配列を観察し、定量化することが可能であることを示します。 TALT1に対するDNAプローブは、ジゴキシゲニンdUTPをを取り入れたシンプルなPCRで生成しました。このTALT1プローブおよび蛍光標識されたテロメアPNAプローブを同時にハイブリダイズさせました。その後、ジゴキシゲニンは、標準的な免疫蛍光法によって検出しました。ここではTALT1はTRT-1にテロメアと共局在代表画像を提示します
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Protocol
PCRによりジゴキシゲニンdUTPで1標識プローブ
- 以前に13を説明したようにジゴキシゲニンdUTPをを含む10×dNTPミックスでPCRラベリングを行います。
- 製造者の指示に従ってスピンカラム精製を用いてPCR産物を精製します。
- プローブはより短い200bpのであれば、反応混合物からのスピンカラムクロマトグラフィーではなく、スピンカラム精製で無料ジゴキシゲニンdUTPをを削除します。
2.準備ポリリジン被覆スライド
注：全体の手順は、約2時間かかります。ステップのほとんどは、乾燥工程を除いて、室温で行われます。
- スライドのクリーニング
- プラスチック容器にスライドを置き、簡単に蒸留水（DW）でスライドをすすぎます。水を除去し、1％のガラスクリーナーを含むDWで容器を満たします。
- 室温（RT）で50 rpmで15分間スライドを攪拌します。 DW 3でスライドを洗浄室温で5分間、回。
- 攪拌しながら15分間、70％エタノールでスライドを洗浄します。 70％エタノールを捨て、15分間65℃で乾燥ブロックと空気乾燥でスライドを配置します。
- マルチウェルガラススライドのポリリジンコーティング
注：それは染色手順を通じてサンプルの接着性を提供するので、スライドガラスのポリリジンコーティングは、重要なステップです。不十分なコーティングされたスライドは、サンプルが失われます。- 蒸留水で（w / v）の0.01％にポリリジン原液を希釈します。きれいなガラススライドのウェルにポリリジン（w / v）の希釈した0.01％の20μLを加えます。
- 室温で5分間、ガラススライドをインキュベートします。
- 1時間65℃で乾燥ブロックと空気乾燥でスライドを置きます。
- 埃ボックスにポリリジンスライドを保管してください。
スライドガラス上のワームの3.固定（図1）
- FISHのための準備胚
注：収穫のワームをすべてトンの前に彼細菌食品は、顕微鏡下で増殖培地を見て消費されます。飢餓は、成虫の産卵を低減し、卵の孵化を増加させます。詳細な方法は、14,15に記載されています。- 標準的な方法14に従って50ミリメートルペトリ皿にワームを育てます。
- すべての細菌の食物が消費された後、スパチュラで四半期の寒天培地をカット。汚染を防止するために切断する前へらを滅菌します。
- 100ミリメートル線虫の増殖培地（NGM）プレート上の寒天のすべてのピースを置きます。新鮮な細菌性食品に到達するためにワームのために逆さまに寒天片を回します。
- 48〜72時間後、M9バッファーでワームを収集します。 NGMプレート上のM9緩衝液5ml - 3を追加します。ワームを洗浄するNGMの表面上にピペットM9バッファー。
- ワームと液体を収集し、15mlチューブに追加します。
注：30％ショ糖溶液中での収穫、遠心ワーム後の寒天の破片がある場合。破片をペレット化しているが、ワームは、上のフロート表面。 - 15ミリリットルにボリュームを補うためにM9のバッファを追加します。 3分間300×gで遠心分離することによってワームをペレットし、M9バッファーの大部分を除去。このステップをさらに2回繰り返します。
注：ワームはまだ遠心分離後、浮遊している場合は、値= 1に遠心分離機のブレーキレベルを設定します。 - 吸引しM9バッファー。ワームに漂白液を追加します。ワームの0.5ミリリットル当たり、次亜塩素酸の2ミリリットルをDWの6.5ミリリットルを追加し、5 M KOHの1ミリリットル。
- 50 rpmで3分間室温で揺らしながらワームをインキュベートします。 15秒間ボルテックスワームは、機械的にワームをせん断し、卵を露出させます。
- 漂白時に解剖顕微鏡下で管を観察します。ワームは半分に切断され、卵が放出されていることを確認します。成人の体のほとんどが解散されたときは、15ミリリットルにボリュームを補うためにM9のバッファを追加します。
- 3分間300×gで遠心分離します。吸引しM9の大部分を、15 mlにボリュームを構成するために、新鮮なM9バッファーを追加します。繰り返し洗浄ステップ3回。
注意：彼らは漂白工程を妨げるとして、ワームの過剰な量を使用することは避けてください。未満8分洗浄まで、全体的な反応時間をおいてください。過漂白卵は強い自家蛍光を生成します。 - 200μlの2％PFAを行うための4％パラホルムアルデヒド（PFA）を200μlまでのポリソルベート20（PBST）を含むリン酸緩衝生理食塩水を加えます。
注意：PFAは発癌性であるため、PFAを使用する前に、防護服、手袋、アイシールドを着用してください。 - ポリリジンコートスライドのウェルに2％PFAで卵の40μLを加えます。
- 加湿チャンバー内でスライドを置き、RTで15分間インキュベートします。スライドを内側に配置された直後の湿潤チャンバーを閉じます。
注：固定された状態で卵がスライドの底に沈みます。
- FISHのための解剖生殖腺の準備
- 収穫成虫はM9緩衝液1mlをピペットで50ミリメートルNGMプレート上で増殖させました。細菌性食品の前に収穫ワームが枯渇しています。
- 任意の細菌のウィットからワームを洗いますH M9緩衝液、2回。
注：残留細菌はポリリジン被覆スライドに付着解剖生殖腺を妨害し得ます。 - 300×gで遠心分離することによりワームをペレット。 M9を取り外し、マイクロピペットによって空のNGMプレートにワームを転送します。
- ポリリジン処理したスライドのほかに2mMのレバミゾールを含むM9緩衝液30μlを追加します。
- 1ミリリットルチューブにM9バッファー500μlのを追加します。口のピペットでワームを転送するために、このバッファを使用します。
- M9緩衝液を含む1mLのチューブに毛管を配置することによって、M9緩衝液で口ピペットの先端を満たします。
- ワームの頭が口のピペットに入るように解剖顕微鏡下で、ちょうど大人のワームやドラッグ口のピペットの頭の前で口のピペットの先端を置きます。ワームのヘッドが先端に入ると、ワームの本体全体をチップ内に描画されます。
- 口のピペットを用いて、ポリリジンコートスライドにワームを転送します。
- のかみそり、カットを使用して、頭やスライド上のワームの尾の先端F。ワームが切断されると、生殖腺が飛び出します。生殖腺は、スライドに固執します。
- 1つのウェル中に少なくとも30ワームを準備します。複数のウェルをさらに30ワームのために使用することができます。
- 加湿チャンバー内でスライドを入れて、口のピペットでM9バッファーを吸引します。
- 加湿チャンバー内で室温で15分間2％PFAを20μlを添加することにより、サンプルを修正してください。
4.固定および透過処理
- ドライアイス上にアルミニウムブロックを配置し、ディープフリーザーに保管（-80°C）。 -20℃に保管し、メタノールおよびアセトン。
- PFA固定工程3.1.15または3.2.11た後、固定液の〜5μLを残しマイクロピペットを用いて固定液を除去します。
- 試料スライド上の別のポリリジンコートスライドを入れてください。解決策が過剰である場合はペーパータオルで固定液を除去します。彼らは一緒に立ち往生しているしたら、スライドを移動しないでください。
- スライドを凍結少なくとも15分間、アルミブロック上。
注：サンプルは、少なくとも2のために保存することができます - 3日間。 - スライドが凍結されている間、氷上で冷メタノールおよびアセトンを含むjarを置きます。
- スライドを取り出し、サンプルを凍結クラックするためにそれらをねじります。上部のスライドを捨てます。すぐに5分間氷冷メタノール中にスライドを浸します。
- 5分間氷冷アセトンにスライドを転送します。
- 残留固定剤を除去するために、5分間、スライドをPBSTで3回洗浄します。次のステップに進むか、4℃で、100％エタノールでスライドを保存します。
注：サンプルは、少なくとも2のために保存することができます - 3日間。
固定された細胞の5ハイブリダイゼーション
- （PBSTはを10μg/ mlのRNase Aを含む）のRNase溶液20μlを追加します。 37℃で1時間湿潤チャンバー内のスライドをインキュベートします。
- 15分ごとに（2×SSCT）ポリソルベート20で2回生理食塩水とクエン酸ナトリウムで二回スライドを洗浄します。
- 20を追加します。ハイブリダイゼーション溶液μlの37℃のインキュベーターで加湿チャンバーを置きます。 1時間後、ピペッティングによりハイブリダイゼーション溶液を除去します。
- ハイブリダイゼーション溶液を取り外す前に、プローブを準備します。プローブが二本鎖DNAである場合、乾燥ブロック上95℃で5分間加熱することにより、プローブを変性させます。加熱後、簡単に氷の上にプローブを冷却します。
- サンプルにプローブを含むハイブリダイゼーション溶液10μlを加えます。 2,000及びDIG標識プローブのための、1の比率で使用濃度：200 PNAプローブ、1の比で使用濃度について。カバーガラスでサンプルをカバーしています。
- ヒートブロック（80℃）で水に浸した紙タオルを置きます。湿度と温度を維持するためにヒートブロック上のプラスチックの箱のカバーを置きます。
- 加熱ブロックの温度（80℃まで）安定した後、加熱されたペーパータオルの試料スライドを配置し、プラスチック製の箱のカバーを有するサンプルをカバーします。 3分間サンプルを変性。
- 株式会社一晩37℃で湿潤チャンバー内のスライドをubate。
6.洗浄および免疫蛍光
- 37°Cへのハイブリダイゼーション洗浄溶液（2×SSC、50％ホルムアミド）をウォームアップ。
- 室温で5分間二回PBSTでサンプルを洗ってください。カバーガラスを外します。
- 30分間、37℃でハイブリダイゼーション洗浄溶液中で試料を洗浄します。
- RTでPBSTで試料スライドを3回洗浄します。注：室温で湿潤チャンバー内の後続のすべての手順を実行します。
- ブロッキング溶液の20μlを添加して、湿潤チャンバー中、室温で1時間インキュベートします。
- ブロッキング溶液を外し、FITC結合抗ジゴキシゲニン抗体溶液（1：200）を追加し、室温でまたは4℃で一晩3時間。
7.取付け・観測
- 15分間ずつPBSTで2回サンプルスライドを洗浄します。
- DAPIでマウント溶液10μlを加えます。カバーガラスとプレスを静かに置きます。余分な溶液を除去しますペーパータオルで。
- 取付溶液の蒸発を防ぐために、マニキュアでカバーガラスのエッジをシール。
- 共焦点顕微鏡下で観察します。高いバックグラウンドを持つ胚を除外します。 20核 - 4でフィールドに焦点を当てています。
- 100X対物レンズで、製造元の指示に従って画像を撮影します。
注：FITCのための488nmレーザーで、Cy3のための555 nmレーザーで、DAPI用の405 nmのレーザーを試料にエキサイト。
テロメアシグナルの8定量
注意：以前に16記載のように定量化が行われました。比較されるすべての画像は、露光時間と光源を含む同じ設定で撮影する必要があります。
- tifファイル形式で画像をエクスポートします。
- 画像解析ソフトウェアをダウンロードし、インストールします。
- 画像解析ソフトウェアを実行し、ボタンを同意する]をクリックします。
- オープンボタンをクリックします。イメージファイルをダブルクリックすることにより、テロメアFISHで画像を開きます。
- クリック[編集] - [選択処理領域]、左クリックしてドラッグすることで、目的とする選択領域。すべての非特異的な染色を除外します。
- [対策]をクリックして - 、[光学密度を見つけ]テロメア信号とチャンネルを選択し、.txtファイルに結果を保存するファイル名を入力します。
注：結果の列の順序は、次のようにスポットの蛍光、スポットとスポットのエリアの背景強度を。 - 値をコピーし、スポットの蛍光からのスポットのバックグラウンド強度を差し引きます。値は、現在、統計的に分析することができます。
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Representative Results
これは、以前にALTの生存者は、内部ローカライズ」ALTのテンプレート「テロメア維持2用（TALT）配列を複製することによって、低周波では、テロメラーゼ欠損変異体、TRT-1（ok410）から出てくることが報告されました。 PNAプローブを使用して、我々は解剖生殖腺（ 図2A）にテロメアを可視化することができました。かすかなテロメア信号は、TRT-1（ok410）とALTの生存者の両方で検出されました。ファジー信号は、それらが自家蛍光ではないかもしれないことを示唆している、唯一のDAPIと重なりました。間質テロメア様反復（ITR）は、一貫してCの研究にTRFアッセイで観察されますエレガンステロメア4,10。 PNAプローブの高い特異性を考慮すると、それらは、ITRは、ゲノム全体に分散される可能性があります。
テロメアスポットの数は、TRT-1（ok410）で約9太糸期核当たりでした。以前の研究では、12病巣がPOT-1 :: mCherryをタンパク質、一本鎖テロメアDNA 10に結合することによって観察されました。核あたり24病巣の最大値は、野生型胚17で観察されました。結果は、mCherryをレポーター方法はテロメアの数をカウントする必要があり、実験のために良好であることを示唆しています。しかし、PNA FISHは、テロメアの長さに比例して二本鎖テロメアDNA、ならびに一本鎖テロメアDNAを検出することができます。対照的に、テロメアスポットの数は約7染色体に融合しているALTの生存者であった（N = 3）2。この結果は、テロメアスポットがALTの生存者で6だろうという予測と一致しています。我々は、ALTの生存の信号強度を観察するのに十分であると結論付けました。
テロメア信号はTALT1はteloの不存在下でテロメアのためのコピーテンプレートとして使用されていることを示唆し、ALTの生存者でTALT1と共局在しました。メラーゼ（ 図3）。 ALT生存者のテロメア信号は（ 図4）テロメアは堅牢テロメラーゼなしでALTの生存者で維持されていることを示す、親のTRT-1（ok410）突然変異体に比べて増加しました。 PNAプローブのシグナルは、ジゴキシゲニン標識プローブ（ 図4）のそれよりも大きかったです。 PNAオリゴマーとの設計プローブは、ジゴキシゲニン標識よりも強い信号が発生する場合があります。
図1：FISH実験の概要卵が成虫を漂白することにより回収し、ポリリジンでコーティングしたスライド上に2％PFAで固定されています。サンプルは凍結割れとプローブの浸透のためのメタノールとアセトンで透過されています。プローブがサンプルに添加し、37℃で一晩ハイブリダイズさせます。ジゴキシゲニン標識プローブは、免疫蛍光によって検出されます。次いで、試料を画像化しているquantifie画像解析ソフトウェアにより、D。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 解剖生殖腺におけるテロメアFISHは、（A）テロメア（赤）生殖腺の遠位先端部（矢印）でのCy3-PNA-（TTAGGC）3により検出しました。 ALTの生存の強度は、TRT-1（ok410）のそれよりも大きいです。 Zスタック画像は最大投影でレンダリングされました。核は吹きアップされて右上の白い矢印で示しました。スケールバーは10μm。太糸期段階での核あたりテロメアスポットの（B）の数を目視により測定しました。 N = 50エラーバー、SEM。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
図3： 胚におけるテロメアとTALT1 FISH代表テロメアの画像（赤）とTALT1（緑）FISH。テロメアとTALT1プローブが同時に胚にハイブリダイズさせました。 DNAをDAPI（青）で対比しました。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：FISH データテロメアの定量および図3からTALT1強度を画像解析ソフト（ピーター・Lansdorpからの贈り物）で定量しました。各スポットは、閾値レベルOVで定量しました。非特異的バックグラウンドを排除する小胞体15。 T検定は、統計的有意性を評価するために使用しました。 （* P <0.001）。エラーバーは、SEM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちのプロトコルの主な利点は、細胞構造の形態に目立つダメージのない手続きの簡単さです。いくつかのステップは、C。のために最適化されましたこのプロトコルでFISH エレガンス 。成功FISHのための重要なステップは、プローブのラベリング、胚および浸透の固定を含みます。ジゴキシゲニンdUTPを標識方法は、PCRまたはニックトランスレーションにより使いやすい標識法を提供します。長い標的配列にラベルを付けるには、ニックトランスレーションが好ましいです。この場合、プローブは、プローブの侵入を容易にするために、適切な制限酵素で消化されるべきです。ビオチン標識プローブは、細胞質からのバックグラウンド信号を過剰に産生されているためビオチン-dUTPタグは推奨されません。内因性ビオチンブロッキング試薬が市販されているが、それは行われませんでした。
このプロトコルは、効率的な定量化のための細胞の密度を増加させるために、単離された胚を使用します。 Cの腸内核。エレガンスは、サイズが大きく、過剰な数と体細胞核の残りの部分に比べてテロメアスポットの強度を寄与する、倍数体です。このため、全体のワームは、Cのテロメアの定量化には 適していませんエレガンス 。彼らは倍数性の影響を受けることなく、均質な細胞を提供するようにこれとは対照的に、胚は、テロメアの長さの評価に適しています。
このプロトコルは、テロメアFISHの罰金働いていた2％PFA固定液を使用しています。グルタルアルデヒドは、より低いバックグラウンド信号およびRNA in situハイブリダイゼーションで硬く固定をもたらすことが報告されていますが、グルタルアルデヒドは大幅に18自家蛍光を増加させました。この過剰なバックグラウンドは、未反応のアルデヒド基を減少させる水素化ホウ素ナトリウムの処理後に廃止されていませんでした。この理由のために、グルタルアルデヒドを使用しませんでした。信号対雑音比が低い場合には、プレハイブリダイゼーションの時間は、非特異的結合部位をブロックするために数時間まで延長することができます。にさらには、ストリンジェントな洗浄の時間は、バックグラウンドレベルを減少させるために増加させることができます。
で染色技法 C.エレガンスは、適切な透過性の治療のために挑戦することができます。C.エレガンスは、抗体およびプローブの浸透を阻害厚いクチクラ外骨格が含まれています。従来の抗体染色法が多くの時間と最適化プロセスを必要とするコラゲナーゼの治療を含みます。酵素浸透法も損害賠償の浸透効率の引き換えにワームの形態。凍結亀裂及びメタノール - アセトン処理は、プローブの浸透を促進するために使用されました。凍結亀裂キチナーゼまたはyatalase処理19と比較して、簡単かつ迅速です。脱水またはメタノールシリーズの再水和は、FISHの品質に影響を与えていないようでした。これらの手順は、このプロトコルで単純化されました。それは、プロテイナーゼK消化がRNA in situハイブリダイゼーションのために必要であったことが報告されたが、19、明らかな差が付きおよびプロテイナーゼK処理なしのテロメアFISH結果との間で観察されませんでした。また、胚の凍結割れは大きな定量分析のための単一の焦点面上で同時に多くの細胞を可視化するための使いやすい方法を提供します。
PNAプローブを使用することによって、テロメア信号は著しくDNAプローブを用いて得られたものと比較して増加しました。これは、その相補的な標的とその小さなサイズ（4リピートに比べて3リピート）のためのより高い結合親和性のためである可能性があります。蛍光標識されたPNAプローブを直接その後の工程を最小限に抑え、その標的に結合します。以下の免疫蛍光手順に維持強い親和性は、バックグラウンドノイズを回避することができ、後の固定が不要となります。
しかし、いくつかの制限は、この技術に存在しています。一つは、透過性のステップが少しダメージこと、効率的なプローブの浸透のコストで形態です。生殖腺の治療sおよびメタノールとアセトンとの胚は、未処理対照と比較して、核の真円度を歪め。完全に保存形態を必要とする実験のために、異なる透過処理方法が試みられるべきです。別のテロメア信号を任意の単位で定量化されることです。これは、主に独立した実験のばらつきに起因しています。リボソームDNAは、各サンプルを正規化するための内部コントロールとして考えることができます。もっと便利な方法は、参照20で見つけることができます。
シンプルなテロメアFISHプロトコルは、最小限の手順を必要とする、ここに記載されています。多くの手順は、胚の大量の分析のために低減されます。しかし、さらなる修飾は、そのような浸透のためキチナーゼ処理として強いシグナル、および他の革新的な試験のために作製することができます。細胞培養法と組み合わせて、超解像の撮像が可能です。このプロトコルは、Cで、新規テロメア維持メカニズムを発見するのを助けることができますエレガンス 。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).
