Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz Published: August 4, 2016 doi: 10.3791/54224

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Telomere schützt Chromosomenenden von anomalen Fusion und Abbau. Mammalian Telomer besteht aus G-reichen hexameren wiederholt, TTAGGG und Shelterin Komplexe. Die telomere Wiederholungssequenz des Nematoden ist ähnlich zu denen von Säugetieren (TTAGGC). Die meisten Eukaryoten nutzen Telomerase Telomerwiederholungen zu ihrer chromosomalen Enden hinzufügen. Allerdings, 10 - 15% der Krebszellen nutzen Telomerase unabhängigen Mechanismus, bekannt als Alternative Verlängerung von Telomeren (ALT) 3. Zuvor berichteten wir , dass Telomerwiederholungen und die damit verbundenen Folgen, wie TALT genannt, in den Telomeren der Telomerase Mutantenlinien verstärkt wurden , die zwei kritische Sterilität überlebt.

Telomerlänge wurde durch quantitative PCR oder durch Southern - Blot gemessen, die 4,5,6,7 durchschnittliche Länge von insgesamt Telomere zur Verfügung stellt. Lesen Anzahl der Telomer - Repeat in Genomsequenzierungsdaten ist auch ein Indikator für insgesamt Telomer Inhalt 8. Obwohl Single Telomerlänge Analysis (STELA) könnte die Länge eines einzelnen Telomere liefern, es 9 räumliche Informationen der Telomere nicht zur Verfügung stellen kann. Während POT-1 :: mCherry Reporterprotein die räumliche Information der Telomere in vivo liefert, kann sie nicht Längen von doppelsträngigen Telomere darstellen, als POT-1 ein Einzelstrang ist Telomer - bindendes Protein 10.

Während zuvor genannten Verfahren der gemittelten Daten von repetitiven Sequenzen bereitzustellen, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ermöglicht , die Menge und räumlichen Muster von individuellen Sequenzen von Interesse auf einer chromosomalen Skala zu beobachten. Anstelle der Reinigung von DNA werden Gewebe oder Zellen fixiert die native räumliche Informationen in FISH zu bewahren. Somit ist FISH eine sowohl quantitative als auch qualitative Werkzeug zur Beobachtung der einzelnen Wiederholungssequenzen, wie beispielsweise Telomerwiederholungen.

Dieses Protokoll liefert ein effizientes Verfahren zur gleichzeitigen Nachweis beider teloC. bloße und andere Wiederholungen von zuvor beschriebenen Methoden 11,12 auf Verbesserungen basieren. elegans Larven oder Erwachsene sind vielzelligen Organismus mit hoch differenzierten Zellen. Die Heterogenität von Zellen hemmt auf die quantitative Analyse einer großen Anzahl von Telomer Flecken. Um die Anzahl der analysierten Zellen zu maximieren, Embryonen isoliert und verteilt auf die Polylysin-beschichteten Objektträger für die Fische. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch mit Immunofluoreszenz kombiniert werden.

Als Beweis dafür, dass das Protokoll funktioniert, zeigen wir, dass es möglich ist, zwei unterschiedliche repetitive Sequenzen zu beobachten und zu quantifizieren. DNA-Sonde gegen TALT1 wurde erzeugt mit einfachen PCR-Digoxigenin-dUTP enthält. Dann ist diese TALT1 Sonde und Fluoreszenz-markierten Telomere PNA-Sonde wurden gleichzeitig hybridisiert. Anschließend wurde Digoxigenin durch kanonische Immunofluoreszenz Methoden nachgewiesen. Wir stellen Ihnen hier die repräsentativen Bilder , in denen TALT1 mit der Telomere in trt-1 kolokalisiert

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Markierung von Sonden mit Digoxigenin-dUTP durch PCR

  1. Führen Sie die PCR - Markierung mit 10x dNTP - Mix enthält Digoxigenin-dUTP wie zuvor 13 beschrieben.
  2. Reinige PCR-Produkt mit Spin-Säulenreinigung nach Herstelleranleitung.
    1. Wenn die Sonde kürzer als 200 bp ist, entfernen freie Digoxigenin-dUTP mit Spin-Säulenchromatographie aus der Reaktionsmischung statt Spin-Säulenreinigung.

2. Vorbereitung Polylysin beschichteten Objektträger

Anmerkung: Die gesamte Prozedur dauert etwa 2 Stunden. Die meisten Schritte werden bei Raumtemperatur mit Ausnahme der Trocknungsschritt durchgeführt.

  1. Die Reinigung der Folien
    1. Legen Sie die Folien in einem Plastikbehälter und spülen Sie die Objektträger kurz mit destilliertem Wasser (DW). Entfernen Sie das Wasser und füllen Sie den Behälter mit DW 1% Glasreiniger enthalten.
    2. Agitieren die Objektträger für 15 min bei 50 UpM bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Folien mit DW 3mal für 5 min bei RT jeweils.
    3. Waschen der Objektträger mit 70% Ethanol für 15 min unter Rühren. Entsorgen Sie 70% Ethanol und Objektträger auf einem 65 ° C trocken Block und der Luft trocknen für 15 min.
  2. Polylysin Beschichtung von Multi-Well-Objektträger aus Glas
    Hinweis: Polylysin Beschichtung von Glasobjektträger ist ein wichtiger Schritt, da es die Probe Adhäsion während des gesamten Färbeverfahrens liefert. Unzureichend beschichtete Folie in der Probenverlust führen wird.
    1. Verdünne die Polylysin-Stammlösung auf 0,01% (w / v) in destilliertem Wasser. Geben Sie 20 & mgr; l der verdünnten 0,01% (w / v) Polylysin in die Vertiefungen einer sauberen Glasobjektträger.
    2. Inkubieren Sie die Objektträger aus Glas für 5 min bei RT.
    3. Legen Sie die Dias auf einer 65 ° C trocken Block und der Luft trocknen für 1 Stunde.
    4. Bewahren Sie die Polylysin Folien in der staubfreien Feld.

3. Fixierung von Worms auf dem Folie-Glas (Abbildung 1)

  1. Vorbereiten von Embryonen für FISH
    Hinweis: Ernte Würmer vor allem ter bakterielle Nahrung wird durch die Beobachtung der Wachstumsmedien unter dem Mikroskop verbraucht. Starvation reduziert Eierproduktion von erwachsenen Würmer und erhöht Ei schlüpft. Detaillierte Verfahren sind in 14,15 beschrieben.
    1. Wachsen die Würmer in 50 mm Petrischale nach Standardverfahren 14.
    2. Nachdem das gesamte bakterielle Nahrung verbraucht wird, schneiden Sie die Agar-Medien in Quartal mit Spachtel. Sterilisieren Sie den Spachtel vor dem Schneiden eine Kontamination zu verhindern.
    3. Legen Sie die gesamte Stück Agar auf der 100 mm Nematoden Nährmedien (NGM) Platte. Drehen Sie den Agar Stück den Kopf für die Würmer die frische Bakterien Nahrung zu erreichen.
    4. Nach 48 bis 72 Stunden, die Würmer mit M9-Puffer zu sammeln. In 3 bis 5 ml M9-Puffer auf der NGM-Platte. Pipette M9-Puffer auf der Oberfläche der NGM die Würmer zu waschen.
    5. Sammeln Sie die Flüssigkeit mit Würmern und fügen Sie in ein 15-ml-Tube.
      Hinweis: Wenn es Agar Trümmer nach der Ernte, Zentrifuge die Würmer in einer 30% igen Saccharoselösung. Während Trümmer pelletiert werden, Würmer schwimmen aufdie Oberfläche.
    6. In M9 Puffer um das Volumen auf 15 ml zu bilden. Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 300 g für 3 Minuten und entfernen Sie die meisten der M9-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male.
      Hinweis: Wenn die Würmer noch nach dem Zentrifugieren schwimmend, stellen die Bremse Niveau der Zentrifuge = 1 zu bewerten.
    7. Absaugen M9-Puffer. Hinzufügen Bleichlösung auf die Würmer. Pro 0,5 ml Würmer, 6,5 ml DW, 2 ml Hypochlorit, 1 ml 5 M KOH hinzu.
    8. Inkubiere die Würmer mit 3 min bei 50 Upm bei RT rocking. Vortex Würmer für 15 Sekunden, um mechanisch die Würmer abzuscheren und die Eier aus.
    9. Beachten Sie die Röhre unter einem Präpariermikroskop während der Bleiche. Stellen Sie sicher, dass Würmer in zwei Hälften geschnitten und Eier freigesetzt werden. Wenn die meisten der erwachsenen Körper gelöst ist, fügen M9 Puffer das Volumen auf 15 ml zu bilden.
    10. Zentrifuge bei 300 × g für 3 min. Aspirieren die meisten der M9 und fügen Sie frisches M9 Puffer um das Volumen auf 15 ml zu bilden. Wiederholen Waschschritt 3 mal.
      Hinweis:Vermeiden Sie übermäßige Menge an Würmer verwenden, da sie den Bleichprozess behindern. Halten Sie die Gesamtreaktionszeit von weniger als 8 Minuten, bis die Wäsche. Über gebleichten Eier produzieren starke Autofluoreszenz.
    11. In phosphatgepufferter Salzlösung mit Polysorbat-20 (PBST) bis zu 200 & mgr; l und 200 & mgr; l von 4% Paraformaldehyd (PFA) 2% PFA zu machen.
      Achtung: Da PFA krebserregend ist, tragen Schutzkleidung, Handschuhe und Augenschutz vor PFA.
    12. In 40 ul der Eier in 2% PFA auf den gut Polylysin beschichteten Folie.
    13. Legen Sie die Folien in einer feuchten Kammer und Inkubation für 15 min bei RT. Schließen Sie die feuchte Kammer direkt nach dem die Dias nach innen gesetzt werden.
      Hinweis: Die Eier an der Unterseite des Schlittens absetzen, während fixiert wird.
  2. Vorbereiten seziert Gonaden für FISH
    1. Ernte erwachsenen Würmer auf 50 mm NGM Platte gewachsen durch Pipettieren 1 ml M9-Puffer. Ernte Würmer vor Bakterien Nahrung ist erschöpft.
    2. Waschen Sie die Würmer aus allen Bakterien Witzh M9-Puffer, 2 Mal.
      Hinweis: Rest Anhaften von Bakterien an Polylysin beschichteten Objektträger mit den seziert Gonaden stören können.
    3. Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 300 x g. Entfernen M9 und übertragen Sie die Würmer auf die leere NGM Platte von Mikropipette.
    4. In 30 ul M9-Puffer, der 2 mM Levamisol auf einem gut Polylysin behandelten Folie.
    5. Hinzufügen 500 ul M9-Puffer auf eine 1-ml-Röhrchen. Verwenden Sie diese Puffer die Würmer durch den Mund Pipette zu übertragen.
    6. Füllen Sie die Spitze des Mundpipette mit M9-Puffer durch eine Kapillare in der 1-ml-Röhrchen Platzieren der M9-Puffer enthält.
    7. Unter Binokular, legte die Spitze Mund Pipette direkt vor dem Kopf der erwachsenen Wurm und ziehen Mund Pipette so dass der Kopf von Würmern die Pipette den Mund gelangt. Sobald der Kopf von Würmern in die Spitze eintritt, wird der gesamte Körper der Wurm in die Spitze gezogen werden.
    8. Übertragen Sie die Würmer an die Polylysin beschichteten Objektträger mit Mund Pipette.
    9. Mit einer Rasierklinge geschnitten vonf den Kopf oder die Spitze des Schwanzes von Würmern auf der Folie. Wenn der Wurm geschnitten wird, erscheint die Gonaden aus. Gonaden wird auf den Folien kleben.
      1. Bereiten Sie mindestens 30 Würmer in einem gut. Weitere Brunnen kann für weitere 30 Würmer verwendet werden.
    10. Legen Sie die Folie in der feuchten Kammer und absaugen M9-Puffer mit Mund Pipette aus.
    11. Fixieren Sie die Probe durch Zugabe von 20 ul 2% PFA bei RT für 15 min in der feuchten Kammer.

4. Fixierung und Permeabilisierung

  1. Platzieren Sie ein Aluminiumblock auf Trockeneis und speichern sie in einem Tiefkühlschrank (-80 ° C). Store Methanol und Aceton in -20 ° C.
  2. Nach PFA Fixierung Schritt 3.1.15 oder 3.2.11, entfernen Fixiermittel mit Mikro verlassen ~ 5 ul des Fixiermittel.
  3. Mit anderen Polylysin beschichtete Folie auf dem Probenträger. Entfernen Sie die Fixiermittel mit einem Papiertuch, wenn die Lösung zu hoch ist. Sie nicht, die Dias zu bewegen, sobald sie aneinander haften.
  4. Frieren Sie die Folienauf dem Aluminiumblock mindestens 15 min.
    Hinweis: Die Proben können für mindestens 2 gelagert werden - 3 Tage.
  5. Während die Folien eingefroren werden, setzen die Gläser kaltes Methanol und Aceton auf Eis enthält.
  6. Nehmen Sie die Folien aus und drehen sie die Probe zu gefrier knacken. Entsorgen Sie die obere Folie. einweichen sofort die Folie in die eiskalten Methanol für 5 min.
  7. Die Objektträger in eiskaltem Aceton für 5 min.
  8. Waschen Sie die Folien 3-mal mit PBST für 5 min Rest Fixiermittel zu entfernen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt oder speichern Sie die Folien in 100% Ethanol bei 4 ° C.
    Hinweis: Die Proben können für mindestens 2 gelagert werden - 3 Tage.

5. Die Hybridisierung von fixierten Zellen

  1. Geben Sie 20 & mgr; l RNase-Lösung (PBST 10 ug / ml RNase A enthält). Inkubiere die Folie in der feuchten Kammer bei 37 ° C für 1 Stunde.
  2. Waschen Sie die Folie zweimal in 2x Kochsalzlösung und mit Natriumcitrat Polysorbat-20 (2x SSCT) für 15 min jeweils.
  3. In 20ul Hybridisierungslösung und setzen Sie die feuchte Kammer in den Inkubator 37 ° C. Nach 1 Stunde, entfernen Sie die Hybridisierungslösung durch Pipettieren.
  4. Vor Hybridisierungslösung zu entfernen, bereiten Sie die Sonde. Wenn die Sondendoppelstrang-DNA ist, denaturieren die Sonden durch Erhitzen bei 95 ° C für 5 min auf einer trockenen Block. Nach dem Erhitzen kühlen, um die Sonde auf Eis kurz.
  5. Zugabe von 10 & mgr; l Hybridisierungslösung Sonden an die Probe enthält. Für PNA-Sonde, Einsatzkonzentration bei einem Verhältnis von 1: 2000 und für die DIG-markierte Sonde, Einsatzkonzentration bei einem Verhältnis von 1: 200. Decken Sie die Probe mit Deckglas.
  6. Setzen Sie ein Papiertuch mit Wasser auf dem Wärmeblock getränkt (80 ° C). Legen Sie eine Kunststoff-Box Abdeckung auf dem Wärmeblock die Feuchtigkeit und die Temperatur zu erhalten.
  7. Nachdem die Temperatur des Wärmeblocks (bis 80 ° C) stabilisiert hat, stellen Sie den Probenträger auf dem erhitzten Papiertuch und decken die Proben mit dem Kunststoff-Box-Abdeckung. Denaturieren die Probe für 3 min.
  8. IncUbate die Folien in einer feuchten Kammer über Nacht bei 37 ° C.

6. Wäscht und Immunofluoreszenz

  1. Warm up der Hybridisierungswaschlösung (2 × SSC, 50% Formamid) bis 37 ° C.
  2. Waschen Sie die Probe in dem PBST zweimal bei RT für 5 min. Entfernen Sie das Deckglas.
  3. Waschen Sie die Probe in Hybridisierungswaschlösung bei 37 ° C für 30 min.
  4. Waschen Sie die Probenträger in PBST 3 mal bei RT. Hinweis: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in feuchten Kammer bei RT.
  5. In 20 ul Blockierungslösung und Inkubation für 1 h bei RT in der feuchten Kammer.
  6. Entfernen Blockierungslösung und fügen FITC konjugiertem anti-Digoxigenin-Antikörper-Lösung (1: 200) für 3 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C.

7. Montage und Beobachtung

  1. Waschen Sie den Probenträger mit PBST 2-mal für jeweils 15 min.
  2. In 10 ul Lösung mit DAPI Montage. Legen Sie das Deckglas und drücken Sie vorsichtig. Entfernen Sie überschüssige Lösungmit einem Papiertuch.
  3. Zum Verdampfen von Montagelösung, die Ränder des Deckglases mit Nagellack verhindern.
  4. Beobachten Sie unter konfokalen Mikroskop. Ausschließen Embryonen mit hohem Hintergrund. Konzentrieren Sie sich auf ein Feld mit 4 - 20 Kernen.
  5. Nehmen Sie Bilder nach den Anweisungen des Herstellers mit 100X Objektiv.
    Hinweis: Excite Probe mit 405-nm-Laser für DAPI, mit 555-nm-Laser für cy3, mit 488-nm-Laser für FITC.

8. Quantifizierung der Telomere Signal

Anmerkung: Die Quantifizierung erfolgte wie zuvor beschrieben 16. Alle Bilder, die verglichen werden sollte mit derselben Einstellung einschließlich Belichtungszeit und Lichtquelle genommen werden.

  1. Exportieren Sie das Bild in .tif-Format.
  2. Downloaden und die Bildanalyse-Software zu installieren.
  3. Führen Sie die Bildanalyse-Software und klicken Sie stimmen Taste.
  4. Klicken Sie auf Öffnen-Taste. Öffnen Sie die Bilder mit Telomer FISH durch einen Doppelklick auf die Bilddatei.
  5. Klicken[Bearbeiten] - [select Verarbeitungsbereich], wählen Sie eine Region von Interesse mit der linken Maustaste und ziehen. Ausschließen alle die nicht-spezifische Färbung.
  6. Klicken Sie auf [Maßnahme] - [optischen Dichten vor Ort], wählen Sie den Kanal mit Telomer-Signal und geben Sie den Dateinamen, um die Ergebnisse in TXT-Datei zu speichern.
    Hinweis: Die Spalte der Ergebnisse sind in der folgenden Reihenfolge: Fluoreszenz von Spot, Hintergrund-Intensität von Spot und Bereich der Stelle.
  7. Kopieren Sie die Werte und subtrahieren Hintergrund Intensität der Spot von Fluoreszenz von Spot. Die Werte können nun statistisch ausgewertet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Es wurde bereits berichtet , dass ALT Überlebende von Telomerase-defiziente Mutante entstehen kann, trt-1 (ok410), in niedriger Frequenz durch Replizieren intern lokalisierte 'Vorlage von ALT (TALT) Sequenzen für Telomererhaltung 2. Mit PNA - Sonde konnten wir Telomere in den sezierten Gonaden (2A) zu visualisieren. Das schwache Telomer - Signal wurde sowohl in trt-1 (ok410) und ALT Überlebende entdeckt. Die Fuzzy-Signal wurde überlappt nur mit DAPI, was darauf hindeutet, dass sie nicht Autofluoreszenz sein kann. Interstitial Telomer-like repeat (ITR) im TRF - Test in der Studie von C. konsequent beobachtet elegans Telomer 4,10. hohe Spezifität der PNA-Sonde unter Berücksichtigung, sind sie wahrscheinlich über das Genom der ITR dispergiert werden.

Die Anzahl der Telomer - Spots betrug etwa 9 pro pachytänen Kern in trt-1 (ok410).In der vorangegangenen Studie wurden 12 Herde von POT-1 beobachtet :: mCherry Protein, das 10 bis einsträngige Telomer - DNA bindet. Maximal 24 Foci pro Kern wurde in den Wildtyp - Embryonen 17 beobachtet. Das Ergebnis legt nahe, dass mCherry reporter Verfahren für das Experiment besser ist, wo die Anzahl der Telomere gezählt werden sollte. PNA FISH jedoch in der Lage, mit der Telomerlänge doppelsträngigen Telomer-DNA sowie einsträngige telomere DNA im Verhältnis zu detektieren. Im Gegensatz dazu die Zahl der Überlebenden telomere spots war ungefähr 7 in ALT, die Chromosomen fusioniert haben (N = 3) 2. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Vorhersage, daß telomere Flecken 6 in ALT Überlebenden wäre. Wir schlossen daraus, dass die Signalintensität von ALT Überlebenden ausreichend war zu beobachten.

Telomere Signal wurde mit TALT1 im ALT survivor colocalized, was darauf hindeutet, dass TALT1 als Kopiervorlage für Telomer in Abwesenheit von Telo verwendet wirdmerase (Abbildung 3). Telomere von ALT - Signal - Überlebenden erhöht , die der parentalen trt-1 (ok410) Mutante verglichen, was anzeigt , daß telomere robust in ALT Überlebenden ohne Telomerase (Abbildung 4) gehalten wird. Das Signal von PNA - Sonde war größer als die von Digoxigenin-markierten Sonde (Abbildung 4). Entwerfen Sonden mit PNA Oligomere könnten in stärkeres Signal als Digoxigenin-Markierung resultieren.

Abbildung 1
Abb . 1: Übersicht der FISH - Experiment Die Eier werden durch Bleichen erwachsenen Würmer und fixiert in 2% PFA auf einem Polylysin-beschichteten Objektträger geerntet. Die Proben werden gefrier rissig und mit Methanol und Aceton für die Sondenpenetration permeabilisiert. Sonden werden zu der Probe gegeben und über Nacht hybridisiert bei 37 ° C. Digoxigenin-markierte Sonde wird durch Immunofluoreszenz nachgewiesen. Die Proben werden abgebildet und dann quantified durch die Bildanalyse - Software. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Fig . 2: Telomere FISH in den Dissected Gonads (A) Telomere (rot) wurde von Cy3-PNA- (TTAGGC) 3 in der distalen Spitze der Gonaden (Pfeilspitze) nachgewiesen. Die Intensität der ALT Überlebende ist größer als die der trt-1 (ok410). Z-Stapel-Bild wurde mit einer maximalen Projektion gemacht. Nuclei von weißen Pfeil angedeutet ist auf der oberen rechten Ecke gesprengten. Maßstabsbalken, 10 & mgr; m. (B) Anzahl der telomere Spots pro Kern in Pachytän Phase wurde durch visuelle Inspektion gemessen. N = 50. Die Fehlerbalken, SEM. Bitte klicken Sie hier , umeine größere Version dieser Figur.

Figur 3
Abbildung 3:. Telomere und TALT1 FISH in der Embry Ein repräsentatives Bild von der Telomere (rot) und TALT1 (grün) FISH. Telomere und TALT1 Sonde wurden gleichzeitig an Embryonen hybridisiert. DNA wurde mit DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstabsbalken, 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abb . 4: Die Quantifizierung von FISH Daten Telomere und TALT1 Intensität von 3 wurden in der Bildanalyse - Software (ein Geschenk von Dr. Peter Landsdorp) quantifiziert. Jeder Spot wurde mit Schwellenwert ov quantifizierter 15 auszuschließen, nicht-spezifischen Hintergrund. T-Test wurde zur Bewertung der statistischen Signifikanz verwendet. (* P <0,001). Die Fehlerbalken, SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Der Hauptvorteil unserer Protokolls ist die Einfachheit des Verfahrens ohne nennenswerte Beschädigung der Morphologie der Zellstruktur. Wurden mehrere Schritte für C optimiert elegans FISH in diesem Protokoll. Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche FISH umfassen Kennzeichnung von Sonden, die Fixierung von Embryonen und Penetration. Digoxigenin-dUTP Markierungsverfahren bietet eine einfach zu bedienende Markierungsverfahren durch PCR oder Nick-Translation. Zur Kennzeichnung wird lange Zielsequenz, Nick-Translation bevorzugt. In diesem Fall sollten die Sonden mit geeigneten Restriktionsenzym verdaut werden, um das Eindringen von Sonden zu erleichtern. Biotin-dUTP-Tag wird nicht empfohlen, da Biotin-markierten Sonden überschüssige Menge an Hintergrundsignal aus dem Cytoplasma produziert. Obwohl endogenes Biotin Blockierungsreagenz im Handel erhältlich ist, wurde es nicht versucht.

Dieses Protokoll verwendet isolierte Embryonen, die Dichte der Zellen für eine effiziente Quantifizierung zu erhöhen. Intestinale Kerne von C. elegans sind groß und polyploiden sind, die dem Rest der somatischen Zellkerne gegenübermäßiger Anzahl und Intensität der telomere Flecken beitragen. Aus diesem Grund ist ganze Wurm für die Quantifizierung von Telomeren in C nicht geeignet elegans. Im Gegensatz dazu sind Embryonen für die Bewertung der Telomerlänge geeignet, da sie homogene Zellen ohne Polyploidie der Effekt.

Dieses Protokoll verwendet 2% PFA Fixiermittel für Telomer FISH fein gearbeitet. Obwohl Glutaraldehyd berichtet , ist in einem unteren Hintergrundsignal und härter Fixierung in RNA in situ Hybridisierung zu führen, erhöht Glutaraldehyd Autofluoreszenz deutlich 18. Dieser Überschuss Hintergrund wurde nicht nach der Behandlung von Natriumborhydrid abgeschafft, die nicht umgesetzten Aldehyd-Gruppe reduziert. Aus diesem Grund wurde Glutaraldehyd nicht verwendet. Wenn das Signal-zu-Rausch-Verhältnis niedrig ist, die Zeit der Vorhybridisierung kann auf mehrere Stunden verlängert werden unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. ImAußerdem Zeit stringenten Wasch erhöht werden Hintergrundpegel zu verringern.

Färbetechnik in C. elegans kann eine Herausforderung für die richtige Permeabilisierung Behandlung. C. elegans enthält dicke kutikulären Exoskelett , das Eindringen von Antikörpern und Sonden verhindert. Traditionellen Antikörperfärbung Verfahren beinhaltet die Behandlung von Kollagenase, was viel Zeit und Optimierungsprozess erfordert. Die enzymatische Penetrationsverfahren auch für Schäden, die Morphologie der Würmer im Austausch von Penetrationseffizienz. Gefrier Riss und Methanol-Aceton-Behandlung wurde verwendet, Sonde Eindringen zu erleichtern. Gefrier Riss ist einfach und schnell im Vergleich zu Chitinase oder Yatalase Behandlung 19. Dehydration oder Rehydrierung Methanol Serie schien nicht die Qualität der Fische zu beeinflussen. Diese Schritte wurden in diesem Protokoll vereinfacht. Obwohl berichtet wurde , dass die Proteinase K - Verdau für RNA in situ Hybridisierung erforderlich war19, offensichtliche Unterschied nicht zwischen Telomer FISH Ergebnisse mit und ohne Proteinase K - Behandlung beobachtet. Zusätzlich gefrier Cracken von Embryonen eine einfach zu bedienende Verfahren zum viele Zellen gleichzeitig auf einem einzigen Brennebene für große quantitative Analyse zu visualisieren.

Durch die Verwendung von PNA-Sonde wurde Telomer-Signal deutlich erhöht im Vergleich zu dem mit einer DNA-Sonde erhalten. Dies könnte für seine komplementäre Ziel und seiner geringeren Größe (3 Wiederholung im Vergleich zu 4 Wiederholung) zu einer höheren Bindungsaffinität fällig. Fluoreszierend markierten PNA-Sonde bindet auch direkt an sein Ziel, die Minimierung nachfolgenden Schritten. Starke Affinität in den folgenden Immunofluoreszenz Schritte beibehalten macht die Postfixierung überflüssig, die Hintergrundgeräusche zu vermeiden.

Es existieren jedoch einige Einschränkungen in dieser Technik. Einer ist, dass die Permeabilisierung leicht Schäden, die Morphologie bei den Kosten der effizienten Sonde Eindringschritt. Die Behandlung der Gonadens und Embryonen mit Methanol und Aceton verzerrt Kreisförmigkeit der Kerne im Vergleich zu unbehandelten Kontrolle. Für Experimente, die perfekt erhaltene Morphologie erfordern, sollten unterschiedliche Permeabilisierung Methode versucht werden. Ein weiterer Grund ist, dass die Telomer-Signal in willkürlichen Einheiten quantifiziert. Dies ist vor allem aufgrund von Variationen unter den unabhängigen Experimenten. Ribosomalen DNA kann als eine interne Kontrolle zur Normalisierung jeder Probe betrachtet werden. Weitere nützliche Methoden können in Bezug 20 gefunden werden.

Ein einfaches Telomer-FISH-Protokoll wird hier beschrieben, die minimale Schritte erfordert. Viele Schritte sind für die Analyse von großen Menge von Embryonen reduziert. Allerdings können weitere Modifikation für ein stärkeres Signal, wie Chitinase Behandlung für die Penetration und andere innovative Studien gemacht werden. In Kombination mit Zellkulturverfahren, bildgebenden Superauflösung möglich. Dieses Protokoll kann dazu beitragen , die neuen Telomererhaltung Mechanismus in C zu entdecken elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PNA probe PANAGENE custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments Roche 11207741910 use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP Roche 11573152910
Bovine serum albumin SIGMA-ALDRICH A-7906
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P-6148 prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield Vector Laboratories H-1200
Hybridizaiton solution 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution 2x SSC, 50% formamide
Formamide BIONEER C-9012 toxic
Methanol Carlo Erba
Acetone Carlo Erba
Heparin SIGMA-ALDRICH H3393 make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate SIGMA-ALDRICH 67578
10x PBS For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST 1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20 SIGMA-ALDRICH P-2287 Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) SIGMA-ALDRICH P-8920 prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50 GE healthcare 27-53310-01
20x SSC To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT 2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns Cosmo genetech CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN Dukssan pure chemicals 8AV721
Multi-well glass slide MP biomedicals 96041205
Nematode growth media To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole SIGMA-ALDRICH 196142
Razor Feather blade No. 11
Rnase A Enzynomics
BSA SIGMA-ALDRICH A7906
Confocal microsope Zeiss LSM 510 EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software  Dr. Peter Landsdorp TFL-telo http://www.flintbox.com/public/project/502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
  3. Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
  4. Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
  5. Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
  6. Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
  7. Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
  8. Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
  9. Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
  10. Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
  11. Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). (2006).
  12. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. Springer. 171-195 (2009).
  13. Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11 (2006).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. e4019 (2012).
  16. Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
  17. Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
  18. Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. 1-7 (2006).
  19. Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
  20. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).
Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seo, B., Lee, J. Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (114), e54224, doi:10.3791/54224 (2016).More

Seo, B., Lee, J. Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (114), e54224, doi:10.3791/54224 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter