Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Observation og Kvantificering af telomer og repetitive sekvenser Brug Fluorescens Published: August 4, 2016 doi: 10.3791/54224
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

Introduction

Telomer beskytter kromosomale ender fra afvigende fusion og nedbrydning. Mammal telomer består af G-rige hexamere gentagelser, TTAGGG og shelterin komplekser. Den telomer gentagelsessekvens af nematoden ligner dem af pattedyr (TTAGGC). De fleste eukaryoter udnytte telomerase at tilføje telomer gentagelser til deres kromosomale ender. Men, 10 - 15% af kræftceller udnytte telomerase uafhængig mekanisme, kendt som Alternativ Forlængelse af Telomerer (ALT) 3. Tidligere vi rapporterede, at telomer gentagelser og dens tilhørende sekvenser, navngivet som Tält, blev opformeret i telomerer af telomerase mutant linjer, der overlevede kritisk sterilitet 2.

Telomerlængde blev målt ved kvantitativ PCR eller ved Southern blot, som tilvejebringer gennemsnitlige længde af de samlede telomerer 4,5,6,7. Læs optælling af telomer repeat i hele genomet sekventering data er også en indikator af de samlede telomer indhold 8. selvom SinGLE telomerlængde Analysis (STELA) kunne give længden af en enkelt telomer, kan det ikke give geografisk information af telomerer 9. Mens POT-1 :: mCherry reporter protein giver den geografisk information af telomerer in vivo, kan det ikke repræsentere længder af dobbelt-strenget telomerer, som POT-1 er en enkelt-strenget telomer bindende protein 10.

Mens ovennævnte fremgangsmåder giver det gennemsnitlige information af repetitive sekvenser, fluorescens in situ hybridisering (FISH) gør det muligt at observere mængden og rumlige mønster af individuelle sekvenser af interesse på en kromosomal skala. I stedet for rensning af DNA, er væv eller celler fikseret for at bevare den indfødte geografisk information i FISH. , FISH er således en både kvantitativ og kvalitativ redskab til observation af individuelle repeat sekvenser, såsom telomer gentagelser.

Denne protokol giver en effektiv fremgangsmåde til samtidig detektion af både teloblotte og andre gentagelser baseret på forbedringer fra tidligere beskrevne metoder 11,12. C. elegans larver eller voksne er flercellede organisme med højt differentierede celler. Heterogenitet celler hæmmer på kvantitativ analyse af et stort antal telomer pletter. For at maksimere antallet af analyserede celler, embryoer er isoleret og spredt på polylysin-belagte dias for FISH. Derudover kan denne protokol også kombineres med immunofluorescens.

Som bevis for, at protokollen fungerer, viser vi, at det er muligt at observere og kvantificere to forskellige repetitive sekvenser. DNA-probe mod TALT1 blev genereret med enkle PCR indarbejde digoxigenin-dUTP. Så denne TALT1 probe og fluorescensmærket telomer PNA probe blev hybridiseret samtidigt. Efterfølgende digoxigenin blev påvist ved kanoniske immunofluorescens metoder. Vi præsenterer her de repræsentative billeder, hvor TALT1 colocalized med telomer i TRT-1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mærkning af prober med digoxigenin-dUTP ved PCR

  1. Udfør PCR mærkning med 10x dNTP-blanding indeholdende digoxigenin-dUTP som tidligere beskrevet 13.
  2. Oprense PCR-produkt med spin-kolonne oprensning ifølge producentens anvisninger.
    1. Hvis sonden er kortere end 200 bp, fjerne frit digoxigenin-dUTP med spin-søjlechromatografi fra reaktionsblandingen i stedet for spin-kolonne oprensning.

2. Forberedelse Polylysin Coated Slides

Bemærk: Hele proceduren tager omkring 2 timer. De fleste af de trin udføres ved stuetemperatur bortset fra tørretrin.

  1. Rengøring objektglassene
    1. Placer dias i en plastikbeholder og glassene skylles kortvarigt med destilleret vand (DW). Tag vand og fylde beholderen med DW indeholdende 1% glasrens.
    2. Omrør objektglassene i 15 minutter ved 50 rpm ved stuetemperatur (RT). Vask dias med DW 3gange i 5 minutter hver ved stuetemperatur.
    3. Vaskes objektglassene med 70% ethanol i 15 minutter under omrøring. Kassér 70% ethanol og placere dias på en 65 ° C tør blok og lufttørre i 15 min.
  2. Polylysin belægning af multi-brønds objektglas
    Bemærk: Polylysin belægning af dias glas er et vigtigt skridt, da det giver prøven vedhæftning under hele farvningen procedure. Dårligt belagt objektglas vil resultere i tab af prøven.
    1. Fortynd polylysin stamopløsning til 0,01% (vægt / volumen) i destilleret vand. Tilsæt 20 pi af den fortyndede 0,01% (vægt / volumen) polylysin til brøndene i en ren glasplade.
    2. Inkubér objektglasset i 5 minutter ved stuetemperatur.
    3. Placer dias på en 65 ° C tør blok og lufttørre i 1 time.
    4. Opbevar polylysin dias i støvfri kassen.

3. Fiksering af Worms på Slide Glas (figur 1)

  1. Forberedelse embryoner til FISH
    Bemærk: Harvest orme før alle than bakteriel mad indtages ved at se væksten medier under mikroskop. Starvation reducerer ægproduktionen af ​​voksne orme og øger ægklækning. Detaljerede fremgangsmåder er beskrevet i 14,15.
    1. Grow ormene i 50 mm Petri-skål ifølge standardmetoder 14.
    2. Efter alt den bakterielle mad indtages, skære agar medier i kvartalet med spatel. Steriliser spatel før opskæring at forhindre forurening.
    3. Læg al stykke agar på 100 mm medier nematode vækst (NGM) plade. Vend agar stykke på hovedet for ormene at nå den friske bakteriel mad.
    4. Efter 48 til 72 timer, indsamle ormene med M9 buffer. Tilsæt 3 - 5 ml M9-puffer på NGM plade. Pipette M9 buffer på overfladen af ​​NGM at vaske orme.
    5. Opsamling af væsken med orm og tilføje til en 15 ml rør.
      Bemærk: Hvis der er agar vragrester efter høst, centrifuge orme i en saccharoseopløsning 30%. Mens debris pelleteres, orme flyde påoverfladen.
    6. Tilføj M9 buffer til at gøre op for lydstyrken til 15 ml. Pelletere orme ved centrifugering ved 300 xg i 3 min og fjerne det meste af M9 buffer. Gentag dette trin 2 gange.
      Bemærk: Hvis ormene stadig flyder efter centrifugering, indstilling af bremsen niveauet af centrifugen til at værdsætte = 1.
    7. Aspirer M9 buffer. Tilføj blegende opløsning til orme. Per 0,5 ml af orme, tilsættes 6,5 ml DW, 2 ml hypochlorit, 1 ml 5 M KOH.
    8. Inkuber ormene med rocking ved stuetemperatur i 3 min ved 50 rpm. Vortex orme i 15 sekunder til mekanisk forskydning orme og eksponere æggene.
    9. Overhold røret under en dissektion mikroskop under blegning. Sørg for, at orme skæres i halve og æg er frigivet. Når de fleste af den voksne krop opløses, tilføje M9 buffer til at gøre op for lydstyrken til 15 ml.
    10. Centrifuger ved 300 xg i 3 min. Aspirer meste af M9 og tilføje frisk M9 buffer til at gøre op for lydstyrken til 15 ml. Gentag vasketrin 3 gange.
      Note:Undgå at bruge overdreven mængde orme, da de hindrer blegning processen. Holde de samlede reaktionstid under 8 minutter, indtil vaskevæsken. Over-bleget æg producere stærk autofluorescens.
    11. Tilføj phosphatpufret saltvand med polysorbat-20 (PBST) op til 200 pi og 200 pi 4% paraformaldehyd (PFA) at gøre 2% PFA.
      Forsigtig: Da PFA er kræftfremkaldende, bære beskyttelsesdragt, handsker og øjenværn, før du bruger PFA.
    12. Tilføj 40 pi æggene i 2% PFA på brønden af ​​polylysin belagt dias.
    13. Objektglassene anbringes i et fugtigt kammer og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur. Luk fugtigt kammer lige efter objektglassene er placeret inde.
      Bemærk: Æggene sedimentere til bunden af ​​slæden, medens den fast.
  2. Forberedelse dissekerede gonader til FISH
    1. Harvest voksne orme dyrket på 50 mm NGM plade ved pipettering 1 ml M9-puffer. Harvest orme før bakteriel mad er opbrugt.
    2. Vask ormene fra enhver bakterier with M9-puffer, 2 gange.
      Bemærk: Resterende bakterier kan forstyrre de dissekerede kønskirtlerne klistrer til polylysin coatede objektglas.
    3. Pelletere orme ved centrifugering ved 300 x g. Fjern M9 og overføre orme til den tomme NGM plade ved mikropipette.
    4. Tilføj 30 pi M9 buffer indeholdende 2 mM levamisol på en brønd af polylysin behandlet dias.
    5. Der tilsættes 500 pi M9 buffer til en 1 ml rør. Brug denne buffer til at overføre orme gennem munden pipette.
    6. Fyld spidsen af ​​munden pipette med M9 buffer ved at placere et kapillarrør i 1 ml rør indeholdende M9 buffer.
    7. Under dissektionsmikroskop, satte spidsen af ​​munden pipette lige foran hovedet af voksne orm og træk mund pipette, så lederen af ​​orme kommer ind i munden pipette. Når hovedet af orme kommer ind i spidsen, vil hele kroppen af ​​orm trækkes ind i spidsen.
    8. Overfør ormene til polylysin belagt objektglas under anvendelse mundpipette.
    9. Ved hjælp af en barbermaskine, skåret aff hovedet eller spidsen af ​​halen af ​​orme på objektglasset. Når ormen er skåret, vil kønskirtlerne pop ud. Gonader vil holde sig til dias.
      1. Fremstilles mindst 30 orme i en brønd. Flere brønde kan anvendes i yderligere 30 orme.
    10. Sæt dias i fugtigt kammer og aspireres fra M9 buffer med munden pipette.
    11. Fix prøven ved tilsætning af 20 pi 2% PFA ved stuetemperatur i 15 minutter i fugtigt kammer.

4. Fiksering og Permeabilisering

  1. Placer en aluminium blok på tøris og opbevar det i en dybfryser (-80 ° C). Store methanol og acetone i -20 ° C.
  2. Efter PFA fiksering trin 3.1.15 eller 3.2.11, fjerne fiksativ hjælp mikropipette forlader ~ 5 ul af fiksativ.
  3. Sagt på en anden polylysin belagt slide på prøven dias. Fjern fiksativ med køkkenrulle hvis opløsningen er for høj. Flyt ikke slides, når de hænger sammen.
  4. Frys diasom aluminiumblok i mindst 15 min.
    Bemærk: Prøverne kan opbevares i mindst 2 - 3 dage.
  5. Mens dias bliver frosset, sætte krukkerne indeholder kold methanol og acetone på is.
  6. Tag dias ud og vride dem til at fryse-knække prøven. Kassér den øverste dias. suge straks glide ind i iskold methanol i 5 min.
  7. Overfør objektglassene til iskold acetone i 5 min.
  8. Vask præparatglassene 3 gange med PBST i 5 minutter for at fjerne resterende fiksativ. Fortsæt til næste trin eller gemme dias i 100% ethanol ved 4 ° C.
    Bemærk: Prøverne kan opbevares i mindst 2 - 3 dage.

5. Hybridisering af fikserede celler

  1. Tilsæt 20 pi RNase-opløsning (PBST indeholdende 10 ug / ml RNase A). Inkubér objektglasset i fugtigt kammer ved 37 ° C i 1 time.
  2. Vask præparatglasset to gange i 2 x saltvand og natriumcitrat med polysorbat-20 (2x SSCT) i 15 minutter hver.
  3. Tilføj 20pi hybridiseringsopløsning og sætte den fugtige kammer i 37 ° C inkubator. Efter 1 time fjernes hybridiseringsopløsningen ved pipettering.
  4. Før du fjerner hybridiseringsopløsning, forberede sonden. Hvis sonden dobbeltseng er DNA, denaturere proberne ved opvarmning ved 95 ° C i 5 minutter på en tør blok. Efter opvarmning afkøles proben på is kortvarigt.
  5. Tilsæt 10 pi hybridiseringsopløsning indeholdende prober til prøven. For PNA-probe, koncentration i et forhold på 1: 2.000 og til dig-mærket probe, koncentration i et forhold på 1: 200. Dæk prøven med dækglas.
  6. Sætte en køkkenrulle gennemvædet med vand på varmeblokken (80 ° C). Sæt en plastboks dækning på varme blokken for at bevare fugtighed og temperatur.
  7. Efter at temperaturen af ​​varmen blok er stabiliseret (til 80 ° C), anbring prøven slide på den opvarmede køkkenrulle og dække prøverne med plastik dæksel. Denaturere prøven i 3 min.
  8. IncUbate objektglassene i et fugtigt kammer natten over ved 37 ° C.

6. Vasker og Immunofluorescens

  1. Varm op hybridiseringsopløsningen vaskeopløsningen (2 x SSC, 50% formamid) til 37 ° C.
  2. Vask prøven i PBST to gange ved stuetemperatur i 5 min. Fjern låget glas.
  3. Vask prøven i hybridisering vaskeopløsning ved 37 ° C i 30 minutter.
  4. Vask prøven dias i PBST 3 gange ved RT. Bemærk: Udfør alle de efterfølgende trin i fugtigt kammer ved stuetemperatur.
  5. Tilsæt 20 pi blokeringsopløsning og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i fugtigt kammer.
  6. Fjern blokeringsopløsning og tilføje FITC konjugeret anti-digoxigenin antistof-opløsning (1: 200) i 3 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.

7. Montering og Observation

  1. Vask prøven slide med PBST 2 gange i 15 minutter hver.
  2. Tilsæt 10 pi monteringsløsning med DAPI. Sæt dækslet glas og tryk forsigtigt. Fjern overskydende løsningmed et stykke køkkenrulle.
  3. At forhindre fordampning af monteringsløsning, forsegle kanterne af dækglasset med neglelak.
  4. Overhold under konfokal mikroskop. Udelukke fostre med høj baggrund. Fokus på et felt med 4 - 20 kerner.
  5. Tag billeder i henhold til producentens instruktion med 100X objektiv.
    Bemærk: Excite prøve med 405 nm laser til DAPI, med 555 nm laser til Cy3, med 488 nm laser til FITC.

8. Kvantificering af telomer Signal

Bemærk: Kvantificering blev udført som tidligere 16 beskrevet. Alle billeder, der skal sammenlignes, bør tages med samme indstilling herunder eksponeringstid og lyskilde.

  1. Eksporter billedet i .tif format.
  2. Hent og installere billedet analyse software.
  3. Udfør billedanalyse software og klik enige knap.
  4. Klik åben knap. Åbn billederne med telomer FISH ved at dobbeltklikke på billedfilen.
  5. Klik[Edit] - [Vælg behandling region] skal du vælge region af interesse ved venstre-klik og trække. Udeluk alle de ikke-specifik farvning.
  6. Klik på [foranstaltning] - [spotte optiske tætheder], vælge kanal med telomer signal og indtast filnavnet for at gemme resultaterne i .txt-fil.
    Bemærk: Kolonnen af ​​resultater er i følgende rækkefølge: Fluorescens af stedet, baggrund intensitet plet og areal af stedet.
  7. Kopiér værdierne og trække baggrund intensitet udgangspunkt fluorescens af stedet. kan nu analyseres statistisk værdierne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det blev tidligere rapporteret, at ALT overlevende kan komme ud telomerase-mangelfuld mutant, TRT-1 (ok410), i lav frekvens ved at replikere internt lokaliserede 'Skabelon for ALT (Tält) sekvenser for telomer vedligeholdelse 2. Ved hjælp af PNA-probe, var vi i stand til at visualisere telomerer i dissekerede gonaderne (figur 2A). Den svage telomer-signalet blev påvist både i TRT-1 (ok410) og ALT overlevende. Den fuzzy signal blev overlappede kun med DAPI, hvilket tyder på, at de ikke kan være autofluorescens. Interstitiel telomer-lignende gentagelse (ITR) er konsekvent observeret i TRF assay i studiet af C. elegans telomer 4,10. Overvejer høj specificitet PNA-probe, vil de sandsynligvis blive ITR spredt i hele genomet.

Antallet af telomer pletter var ca. 9 pr pachytene kerne i TRT-1 (ok410).I den tidligere undersøgelse blev 12 foci observeret af POT-1 :: mCherry protein, som binder til enkeltstrenget telomer DNA 10. Højst 24 foci pr kerne blev observeret i vildtype embryoner 17. Resultatet tyder på, at mCherry reporter metode er bedre til eksperimentet, hvor antallet af telomerer skal tælles. Men PNA FISH er i stand til at opdage dobbeltstrenget telomer DNA samt enkeltstrenget telomer DNA i forhold med telomer længde. I modsætning hertil antallet af telomer pletter var ca. 7 i ALT overlevende, der har fusioneret kromosomer (N = 3) 2. Dette resultat er i overensstemmelse med den forudsigelse, at telomer pletter ville være 6 i ALT overlevende. Vi konkluderede, at signalet intensiteten af ​​ALT overlevende var tilstrækkeligt, der skal overholdes.

Telomer signal blev colocalized med TALT1 i ALT overlevende, hvilket tyder på, at TALT1 bruges som kopi skabelon til telomer i fravær af telomerase (figur 3). Telomer signal af ALT overlevende steget i forhold til den for parentale TRT-1 (ok410) mutant, hvilket indikerer, at telomer håndfast opretholdes i ALAT overlevende uden telomerase (figur 4). Signalet af PNA-probe var større end den af digoxigenin-mærket probe (figur 4). Design sonder med PNA oligomer kan resultere i stærkere signal end digoxigenin-mærkning.

figur 1
Figur 1:. Oversigt over FISH Eksperiment Æg høstes ved blegning voksne orme og fikseret i 2% PFA på en polylysin-coated objektglas. Prøver fryse-revnet og permeabiliseret med methanol og acetone i probe penetration. Prober til prøven og hybridiseret natten over ved 37 ° C. Digoxigenin-mærkede probe påvises ved immunofluorescens. Prøverne afbildet og derefter quantified fra billedet analyse software. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Telomer FISH i det dissekerede Gonader (A) telomer (rød) blev påvist ved Cy3-PNA- (TTAGGC) 3 i den distale spids af gonader (pilespids). Intensiteten af ALT overlevende er større end den for TRT-1 (ok410). Z-stack billede blev gengivet med maksimal projektion. Kerner angivet med hvid pil blæses op i øverste højre hjørne. Scale bar, 10 um. (B) Antal telomer spots pr kerne i pachytene etape blev målt ved visuel inspektion. N = 50. Fejl barer, SEM. Klik her for at seen større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3:. Telomer og TALT1 FISH i Embryoner Et repræsentativt billede af telomer (rød) og TALT1 (grøn) FISH. Telomer og TALT1 sonde blev hybridiseret til embryoner samtidigt. DNA blev modfarvet med DAPI (blå). Scale bar, 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Kvantificering af FISH data telomer og TALT1 intensitet fra figur 3 blev kvantificeret i billedet analyse software (en gave fra Dr. Peter Lansdorp). Hver plet blev kvantificeret med tærskelniveauet ovER 15 at udelukke uspecifik baggrund. T-test blev anvendt til vurdering af statistisk signifikans. (* P <0,001). Fejl barer, SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den største fordel ved vores protokol er enkeltheden af ​​proceduren uden mærkbar skade på morfologien af ​​cellestrukturen. Adskillige trin blev optimeret til C. elegans FISH i denne protokol. De kritiske trin for en vellykket FISH omfatter mærkning af sonder, fiksering af embryoner og penetration. Digoxigenin-dUTP mærkning metode giver en nem-at-bruge metoden ved PCR eller nick-translation mærkning. For at mærke lang målsekvens, er nick-translation foretrækkes. I dette tilfælde bør proberne spaltes med passende restriktionsenzym for at lette indtrængen af ​​prober. Biotin-dUTP tag anbefales ikke, fordi biotinmærkede prober produceret overskydende beløb af baggrunden signal fra cytoplasmaet. Selvom endogen biotin blokering reagens er kommercielt tilgængelige, blev det ikke forsøgt.

Denne protokol anvender isolerede embryoner til at øge densiteten af ​​celler til effektiv kvantificering. Intestinale kerner af C. elegans er store i størrelse og er polyploide, som bidrager overdrevne antallet og intensiteten af telomer pletter i forhold til resten af somatiske cellekerner. Af denne grund, hel orm er ikke egnet til kvantificering af telomerer i C. elegans. I modsætning hertil embryoner er egnede til evaluering af telomer længde som de giver homogene celler uden virkning polyploidi.

Denne protokol bruger 2% PFA fiksativ, der fungerede fint for telomer FISH. Selvom glutaraldehyd er rapporteret at resultere i en lavere baggrundssignal og hårdere fiksering i RNA in situ hybridisering, glutaraldehyd steg autofluorescens betydeligt 18. Dette overskud baggrund blev ikke ophævet efter behandling af natriumborhydrid, hvilket reducerer uomsat aldehydgruppe. Af denne grund blev glutaraldehyd ikke brugt. Hvis signal-støj-forholdet er lavt, kan tidspunktet for præhybridisering forlænges op til flere timer for at blokere ikke-specifikke bindingssteder. IDerudover kan tidspunktet for stringent vask øges for at mindske baggrundsniveau.

Farvningsteknik i C. elegans kan være en udfordring for korrekt permeabilization behandling. C. elegans indeholder tyk kutikulære Exoskeleton der inhiberer gennemtrængning af antistoffer og prober. Traditionelle antistoffarvning fremgangsmåde involverer behandling af collagenase, der kræver meget tid og optimeringsprocessen. Den enzymatiske penetration metode også skader morfologi ormene i udveksling af penetration effektivitet. Freeze-crack og methanol-acetone-behandling blev anvendt til at lette probe penetration. Frys-crack er enkel og hurtig i forhold til chitinase eller yatalase behandling 19. Dehydrering eller rehydrering methanol serien synes ikke at påvirke kvaliteten af ​​FISH. Disse trin blev forenklet i denne protokol. Selv om det blev rapporteret, at proteinase K-fordøjelse var nødvendig for RNA in situ hybridisering19, indlysende forskel blev ikke observeret mellem telomer FISH resultater med og uden proteinase K-behandling. Desuden fryse-krakning af embryonet, forudsat en nem-at-bruge metode til at visualisere mange celler samtidigt på en enkelt fokusplan for stor kvantitativ analyse.

Ved at bruge PNA-probe, blev telomer signal signifikant forøget sammenlignet med den opnået med en DNA-probe. Dette kan skyldes højere bindingsaffinitet for dets komplementære target og dets mindre størrelse (3 Gentag sammenlignet med 4 gentagelse). Fluorescensmærket PNA-probe også direkte binder til dets mål, hvilket minimerer efterfølgende trin. Stærk affinitet opretholdt i de følgende immunofluorescens trin gør post-fiksering unødvendig, hvilket kan undgå baggrundsstøj.

Der er dog nogle begrænsninger i denne teknik. Den ene er, at permeabilisering træde lidt skader morfologi på bekostning af effektiv probe penetration. Behandling af gonades og embryoner med methanol og acetone forvrænget cirkularitet af kerner i forhold til ubehandlet kontrol. For eksperimenter, der kræver perfekt bevaret morfologi, bør forsøges forskellige permeabilisering metode. En anden er, at telomer signalet er kvantificeret i arbitrære enheder. Dette skyldes primært variationer mellem uafhængige forsøg. Ribosomale DNA kan betragtes som en intern kontrol for at normalisere hver prøve. Mere nyttige metoder kan findes i henvisning 20.

En simpel telomer FISH protokol er beskrevet her, som kræver minimale trin. Mange trin reduceres til analyse af store mængder af embryoner. Dog kan yderligere modifikation være mulighed for stærkere signal, såsom chitinase behandling for penetration, og andre innovative forsøg. I kombination med cellekultur fremgangsmåde kan super-opløsning billeddannelse være mulig. Denne protokol kan bidrage til at opdage den mekanisme roman telomer vedligeholdelse i C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PNA probe PANAGENE custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments Roche 11207741910 use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP Roche 11573152910
Bovine serum albumin SIGMA-ALDRICH A-7906
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P-6148 prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield Vector Laboratories H-1200
Hybridizaiton solution 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution 2x SSC, 50% formamide
Formamide BIONEER C-9012 toxic
Methanol Carlo Erba
Acetone Carlo Erba
Heparin SIGMA-ALDRICH H3393 make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate SIGMA-ALDRICH 67578
10x PBS For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST 1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20 SIGMA-ALDRICH P-2287 Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) SIGMA-ALDRICH P-8920 prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50 GE healthcare 27-53310-01
20x SSC To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT 2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns Cosmo genetech CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN Dukssan pure chemicals 8AV721
Multi-well glass slide MP biomedicals 96041205
Nematode growth media To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole SIGMA-ALDRICH 196142
Razor Feather blade No. 11
Rnase A Enzynomics
BSA SIGMA-ALDRICH A7906
Confocal microsope Zeiss LSM 510 EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software  Dr. Peter Landsdorp TFL-telo http://www.flintbox.com/public/project/502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
  3. Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
  4. Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
  5. Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
  6. Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
  7. Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
  8. Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
  9. Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
  10. Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
  11. Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
  12. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
  13. Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
  16. Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
  17. Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
  18. Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
  19. Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
  20. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).

Tags

Molekylærbiologi telomer alternativ forlængelse af telomerer (ALT) fluorescens Colokalisering celledeling immunfluorescens PNA-prober billedbehandling kvantificering
Observation og Kvantificering af telomer og repetitive sekvenser Brug Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH) med PNA-prober i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seo, B., Lee, J. Observation and… More

Seo, B., Lee, J. Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (114), e54224, doi:10.3791/54224 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter