Introduction
Telomeer beschermt chromosomale uiteinden van afwijkende fusion en degradatie. Zoogdieren telomeer is samengesteld uit G-rijke hexamere herhalingen, TTAGGG en shelterin complexen. De telomere repeat sequentie van de nematode is vergelijkbaar met die van zoogdieren (TTAGGC). De meeste eukaryoten gebruik maken van telomerase aan telomeer herhalingen toe te voegen aan hun chromosomale uiteinden. Echter, 10-15% van kankercellen gebruik telomerase onafhankelijk mechanisme, bekend als alternatieve Verlenging van Telomeren (ALT) 3. Eerder hebben we gemeld dat telomeer herhalingen en de bijbehorende sequenties, genoemd als Talt, werden versterkt in de telomeren van telomerase mutant lijnen die kritische steriliteit 2 overleefd.
Telomeerlengte werd gemeten door middel van kwantitatieve PCR of Southern blot, dat de gemiddelde lengte van telomeren totale 4,5,6,7 biedt. Lees telling van telomeer repeat in whole genome sequencing data is ook een indicator van de totale inhoud van telomeren 8. Hoewel Single telomeerlengte Analyse (STELA) kan over een lengte van een telomeer, kan geen ruimtelijke informatie telomeren 9 verschaffen. Terwijl POT-1 :: mCherry reportergen bevat de ruimtelijke informatie van telomeren in vivo, kan niet stukken dubbelstrengs telomeren vertegenwoordigen als POT-1 is een enkelstrengs telomeer eiwit 10.
Terwijl genoemde werkwijzen de gemiddelde informatie van repetitieve sequenties, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) maakt het mogelijk om de hoeveelheid en ruimtelijke patroon van afzonderlijke sequenties van belang mbt een chromosomaal gebied. In plaats van zuivering van DNA, weefsels of cellen gefixeerd met de natuurlijke ruimtelijke informatie in FISH behouden. Zo FISH is een zowel kwantitatieve als kwalitatieve tool voor het observeren van de individuele herhaalde sequenties, zoals telomeer herhalingen.
Dit protocol verschaft een efficiënte werkwijze voor het gelijktijdig detecteren van zowel telolouter en andere repeats gebaseerd op verbeteringen van eerder beschreven methoden 11,12. C. elegans larven of volwassenen zijn meercellig organisme met zeer gedifferentieerde cellen. De heterogeniteit van cellen belemmert op de kwantitatieve analyse van een groot aantal telomere spots. Om het aantal geanalyseerde cellen te maximaliseren, embryo geïsoleerd en uitgespreid op de-polylysine gecoate glaasjes voor FISH. Bovendien kan dit protocol ook worden gecombineerd met immunofluorescentie.
Als bewijs dat het protocol werkt, wordt aangetoond dat het mogelijk is om te observeren en te kwantificeren twee verschillende repetitieve sequenties. DNA-probe tegen TALT1 werd gegenereerd met PCR eenvoudige integratie digoxigenine-dUTP. Dan is deze TALT1 probe en fluorescentie-gemerkte telomere PNA probe werden gelijktijdig gehybridiseerd. Vervolgens werd digoxigenine gedetecteerd door immunofluorescentie canonieke werkwijzen. Wij presenteren hier de vertegenwoordiger van de beelden, waar TALT1 colocalized met de telomeer in TRT-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Labeling Probes met digoxigenine-dUTP door PCR
- Voer PCR labeling met 10x dNTP mengsel dat digoxigenine-dUTP zoals eerder beschreven 13.
- Zuiver PCR product met spin kolomzuivering volgens de instructies van de fabrikant.
- Als de probe korter dan 200 bp, verwijdert vrije digoxigenine-dUTP spin-kolomchromatografie uit het reactiemengsel plaats van spin-kolomzuivering.
2. Voorbereiden polylysine gecoate glaasjes
Opmerking: De gehele procedure duurt ongeveer 2 uur. Meeste stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur met uitzondering van de droogstap.
- Het schoonmaken van de slides
- Plaats de objectglaasjes in een plastic container en spoel de glaasjes kort in gedestilleerd water (DW). Verwijder het water en de houder te vullen met DW bevattende 1% glasreiniger.
- Schud de objectglaasjes gedurende 15 minuten bij 50 rpm bij kamertemperatuur (RT). Was de dia's met DW 3tijden gedurende 5 minuten elk bij kamertemperatuur.
- Was de dia's met 70% ethanol gedurende 15 min onder roeren. Gooi 70% ethanol en plaats de dia's op een 65 ° C droge blok en de lucht drogen gedurende 15 min.
- Polylysine coating van multiwell-objectglaasjes
Opmerking: polylysine coating objecthouder is een belangrijke stap, aangezien het de hechting monster gedurende de kleuringsprocedure. Slecht beklede slide zal resulteren in het verlies van het monster.- Verdun de polylysine voorraadoplossing tot 0,01% (w / v) in gedestilleerd water. Voeg 20 ul van de verdunde 0,01% (w / v) polylysine aan de putjes van een schone glasplaatje.
- Incubeer het objectglaasje gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de dia's op een 65 ° C droge blok en de lucht drogen gedurende 1 uur.
- Bewaar de polylysine dia's in de stofvrije doos.
3. Fixatie van Worms op de Slide Glass (figuur 1)
- De voorbereiding van embryo's voor FISH
Opmerking: Harvest wormen voordat alle tHij bacteriële voedsel wordt verbruikt door het kijken naar de groei van de media onder de microscoop. Verhongering vermindert de productie van eieren van volwassen wormen en verhoogt ei uitbroeden. Methoden worden beschreven in 14,15.- Groeien de wormen in 50 mm Petri-schaal volgens standaardwerkwijzen 14.
- Na al het bacteriële voedsel wordt geconsumeerd, snijd de agar media in het kwartaal af met een spatel. Steriliseer de spatel voor het snijden om besmetting te voorkomen.
- Zet al het stukje agar op de 100 mm nematode groei media (NGM) plaat. Draai het agar stuk op zijn kop voor de wormen aan de verse bacteriële voedsel te bereiken.
- Na 48 tot 72 uur, het verzamelen van de wormen met M9 buffer. Voeg 3-5 ml M9 buffer op de NGM plaat. Pipetteer M9 buffer op het oppervlak van de NGM wormen wassen.
- Verzamel de vloeistof met wormen en toe te voegen aan een 15 ml buis.
Opmerking: Als er agar puin na de oogst, centrifuge de wormen in een 30% sucrose-oplossing. Terwijl afval gepelleteerd, wormen drijvenhet oppervlak. - Voeg M9 buffer om het volume op 15 ml. Pellet de wormen door centrifugeren bij 300 xg gedurende 3 minuten en verwijder het grootste deel van de M9 buffer. Herhaal deze stap nog 2 keer.
Opmerking: Als de wormen nog steeds drijven na het centrifugeren, zet de rem niveau van de centrifuge naar waarde = 1. - Zuig M9 buffer. Voeg bleekoplossing de wormen. Per 0,5 ml wormen, voeg 6,5 ml van DW, 2 ml hypochloriet, 1 ml 5 M KOH.
- Incubeer de wormen schommelen bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten bij 50 rpm. Vortex wormen gedurende 15 seconden voor het mechanisch afschuiven de wormen en bloot de eieren.
- Houd u aan de buis onder een dissectie microscoop tijdens het bleken. Zorg ervoor dat de wormen in de helft worden gesneden en eieren worden vrijgegeven. Wanneer het grootste deel van de volwassen lichaam is opgelost, voeg M9 buffer om het volume op 15 ml.
- Centrifugeren bij 300 g gedurende 3 min. Zuig het grootste deel van de M9 en voeg verse M9 buffer om het volume op 15 ml. Herhaal wassen stap 3 keer.
Notitie:Vermijd het gebruik van overmatige hoeveelheid wormen, omdat ze het bleken proces belemmeren. Houd de totale reactietijd van minder dan 8 min, totdat het wassen. Over-gebleekte eieren produceren sterke autofluorescentie. - Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing met polysorbaat-20 (PBST) tot 200 pl en 200 pl 4% paraformaldehyde (PFA) tot 2% PFA maken.
Let op: Omdat PFA is kankerverwekkend, dragen beschermende kleding, handschoenen en een schild voor het gebruik van PFA. - Voeg 40 ul van de eieren in 2% PFA op de bron van polylysine gecoate slide.
- Plaats de objectglaasjes in een vochtige kamer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Sluit de vochtige kamer direct na de dia's binnen zijn geplaatst.
Opmerking: De eieren naar de bodem van de slede terwijl vast.
- De voorbereiding van ontleed geslachtsklieren voor FISH
- Harvest volwassen wormen gekweekt op 50 mm NGM plaat door pipetteren 1 ml M9 buffer. Harvest wormen voordat bacteriële voedsel is uitgeput.
- Was de wormen van alle bacteriën with M9 buffer, 2 keer.
Opmerking: Resterende bacteriën kan beïnvloeden ontleed gonaden plakken aan polylysine gecoate glaasjes. - Pellet de wormen door centrifugatie bij 300 x g. Verwijder M9 en de wormen naar de lege NGM plaat overzetten door micropipet.
- Voeg 30 pl M9 buffer bevattende 2 mM levamisol op een bron van polylysine behandeld slide.
- Voeg 500 pl buffer M9 een 1 ml buis. Met deze buffer om de wormen te dragen via de mond pipet.
- Vul het uiteinde van de mond pipet met M9 buffer door een capillair in 1 ml buis met het M9 buffer.
- Onder ontleden microscoop, zet de punt van de mond pipet vlak voor het hoofd van de volwassen worm en sleep de mond pipet, zodat de kop van wormen komt in de mond pipet. Zodra het hoofd van wormen komt de tip, zal het hele lichaam van de worm worden getrokken in de tip.
- Breng de wormen aan de polylysine gecoate dia met behulp van de mond pipet.
- Met behulp van een scheermes, afsnijdenf het hoofd of het puntje van de staart van wormen op de dia. Als de worm wordt gesneden, zal de geslachtsklieren eruit springt. Geslachtsklieren zal vasthouden aan de dia's.
- Maak minstens 30 wormen in een putje. Meer putjes kan worden gebruikt voor een andere 30 wormen.
- Plaats de dia in de vochtige kamer en zuig bij de M9 buffer met de mond pipet.
- Bevestig het monster door het toevoegen van 20 pl 2% PFA bij kamertemperatuur gedurende 15 min in vochtige kamer.
4. Fixatie en Permeabilisatie
- Plaats een aluminium blok op droog ijs en op te slaan in een diepvriezer (-80 ° C). WINKEL methanol en aceton bij -20 ° C.
- Na PFA fixatie stap 3.1.15 of 3.2.11, verwijder fixeermiddel met behulp micropipet verlaten ~ 5 ui van het fixeermiddel.
- Zet een andere polylysine gecoate dia op het monster dia. Verwijder het fixeermiddel met een papieren handdoek als de oplossing buitensporig. Laat de dia's niet verplaatsen als ze eenmaal aan elkaar geplakt zitten.
- Bevries de slidesop het aluminium blok ten minste 15 min.
Opmerking: De monsters kunnen worden bewaard gedurende minstens 2 - 3 dagen. - Terwijl de dia's worden ingevroren, zet de potten met koude methanol en aceton op ijs.
- Neem de dia's uit en draai ze te bevriezen-barst het monster. Gooi de bovenste slede. Onmiddellijk genieten van de dia in de ijskoude methanol gedurende 5 minuten.
- Breng de objectglaasjes ijskoude aceton gedurende 5 minuten.
- Was de dia 3 maal met PBST gedurende 5 minuten om resterende fixeermiddel verwijderen. Naar de volgende stap of de objectglaasjes in 100% ethanol bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: De monsters kunnen worden bewaard gedurende minstens 2 - 3 dagen.
5. Hybridisatie van gefixeerde cellen
- Voeg 20 gl RNase-oplossing (PBST dat 10 ug / ml RNase A). Incubeer de schuif in de vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Was de dia tweemaal in 2x zoutoplossing en natriumcitraat met polysorbaat-20 (2x SSCT) gedurende 15 minuten elk.
- Voeg 20ul hybridisatieoplossing en zet de vochtige kamer in de 37 ° C incubator. Na 1 uur, verwijder de hybridisatie-oplossing door pipetteren.
- Voor het verwijderen van hybridisatie-oplossing, de voorbereiding van de sonde. Als de sonde wordt dubbele DNA denatureren de probes door verwarming bij 95 ° C gedurende 5 min op een droog blok. Na verwarmen, koelen van de sonde op het ijs in het kort.
- Voeg 10 ul hybridisatieoplossing bevattende probes aan het monster. Voor PNA probe gebruiksconcentratie in een verhouding van 1: 2000 en dig-gelabelde probe, gebruiksconcentratie in een verhouding van 1: 200. Bedek het monster met deksel glas.
- Plaats een papieren handdoek gedrenkt in water op het verwarmingsblok (80 ° C). Zet een plastic deksel op het verwarmingsblok de vochtigheid en temperatuur te behouden.
- Nadat de temperatuur van het verwarmingsblok gestabiliseerd (bij 80 ° C), plaats het monster dia op de verwarmde keukenpapier en bedekken de monsters met kunststof deksel. Denatureren van het monster voor 3 min.
- IncUbate de objectglaasjes in een vochtige kamer gedurende de nacht bij 37 ° C.
6. Wast en immunofluorescentie
- Warm de hybridisatie- wasoplossing (2 x SSC, 50% formamide) bij 37 ° C.
- Was het monster in PBST tweemaal bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verwijder het deksel glas.
- Was het monster in hybridisatie- wasoplossing bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Was het monster dia in PBST 3 maal bij kamertemperatuur. Opmerking: Voer alle volgende stappen in vochtige kamer bij kamertemperatuur.
- Voeg 20 ul van blokkeeroplossing en incubeer 1 uur bij KT in de vochtige kamer.
- Verwijderen blokkeeroplossing en voeg FITC geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaamoplossing (1: 200) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
7. Montage en Observation
- Was het monster dia met PBST 2 keer voor 15 minuten elk.
- Voeg 10 ul van bevestigingsoplossing met DAPI. Leg het deksel glas en druk zachtjes. Verwijder eventuele overtollige oplossingmet een papieren handdoek.
- Verdamping van bevestigingsoplossing voorkomen, sluit de randen van het dekglaasje met nagellak.
- Observeer onder confocale microscoop. Uitsluiten embryo's met een hoge achtergrond. Focus op een veld met 4-20 kernen.
- Maak opnamen volgens de instructies van de fabrikant met 100X objectief.
Opmerking: Excite monster met 405 nm laser voor DAPI, met 555 nm laser voor Cy3, met 488 nm laser voor FITC.
8. Kwantificering van Telomere Signal
Opmerking: Kwantificering werd uitgevoerd zoals eerder 16 beschreven. Alle beelden die moeten worden vergeleken geboden bij dezelfde instelling zoals belichtingstijd en lichtbron.
- Exporteer de afbeelding in .tif-formaat.
- Download en installeer de software voor beeldanalyse.
- Voer de beeldanalyse-software en klik op de knop eens.
- Klik op te drukken. Open de beelden met telomeer FISH door te dubbelklikken op het beeldbestand.
- Klik[Bewerken] - [select verwerking regio], selecteer gebied van belang door links te klikken en te slepen. Uitsluiten alle niet-specifieke kleuring.
- Klik [maatregel] - [spot extincties], selecteer het kanaal met een telomeer signaal en voer de bestandsnaam om de resultaten in .txt bestand op te slaan.
Opmerking: De kolom resultaten zijn in de volgende volgorde: Fluorescentie spot, achtergrondintensiteit spot en gebied van vlek. - Kopieer de waarden en aftrekken achtergrond intensiteit van de spot van de fluorescentie van spot. De waarden kunnen nu statistisch geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerder werd gemeld dat de ALT overlevende kan ontstaan uit telomerase-deficiënte mutant, TRT-1 (ok410), in een lage frequentie door het repliceren van intern gelokaliseerde 'Template van ALT' (Talt) sequenties voor telomeren onderhoud 2. Gebruik PNA probe, konden we telomeren in ontleed geslachtsklieren (Figuur 2A) te visualiseren. De zwakke telomeer signaal werd waargenomen zowel in TRT-1 (ok410) en ALT overlevende. De fuzzy signaal werd overlapt alleen met DAPI, hetgeen suggereert dat zij geen autofluorescentie zijn. Interstitiële telomeer-achtige herhaling (ITR) wordt consistent waargenomen in TRF assay in de studie van C. elegans telomeer 4,10. Gezien hoge specificiteit PNA probe, ze waarschijnlijk worden de ITR verspreid over het genoom.
Het aantal telomeren plekken was ongeveer 9 per pachytene nucleus in TRT-1 (ok410).In eerder onderzoek werd 12 foci waargenomen door POT-1 :: mCherry eiwit, dat bindt aan enkelstrengs telomeer DNA 10. Maximaal 24 foci per nucleus werd waargenomen in de wildtype embryo 17. Het resultaat suggereert dat mCherry reporter werkwijze beter voor het experiment waarbij het aantal telomeren worden geteld. Maar PNA FISH is in staat om dubbelstrengs DNA telomeer evenals enkelstrengs telomeer DNA-sporen in verhouding tot de lengte van telomeren. Daarentegen is het aantal telomere spots ongeveer 7 ALT overlevende, die chromosomen gefuseerd (N = 3) 2. Dit resultaat is consistent met de voorspelling dat telomere spots 6 zou in ALT overlevende. We concludeerden dat het signaal intensiteit van ALT overlevende was voldoende om in acht worden genomen.
Telomeer signaal werd colocalized met TALT1 in de ALT overlevende, wat suggereert dat TALT1 wordt gebruikt als kopie matrijs voor telomeren in afwezigheid van telomerase (Figuur 3). Telomeer signaal ALT overlevenden gestegen ten opzichte van die van de ouderlijke TRT-1 (ok410) mutant, wat aangeeft dat telomere stevig wordt gehandhaafd ALT overlevenden zonder telomerase (figuur 4). Het signaal van de PNA probe groter dan die van digoxigenine-gemerkte probe (Figuur 4). Het ontwerpen van probes met PNA oligomeer zouden kunnen leiden tot sterker signaal dan digoxigenine-labeling.
Figuur 1:. Overzicht van FISH Experiment Eieren worden geoogst door bleken volwassen wormen en in 2% PFA gefixeerd op een met polylysine gecoate slide. Monsters worden bevriezen-gekraakt en gepermeabiliseerd met methanol en aceton voor sonde penetratie. Probes worden toegevoegd aan het monster en overnacht gehybridiseerd bij 37 ° C. Digoxigenine-gemerkte probe wordt gedetecteerd door immunofluorescentie. De monsters worden afgebeeld en vervolgens quantified Door de beeldanalyse software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Telomere FISH in de ontleed Gonads (A) Telomere (rood) werd gedetecteerd door Cy3-PNA- (TTAGGC) 3 in de distale punt van de geslachtsklieren (pijlpunt). De intensiteit van ALT overlevende is groter dan die van TRT-1 (ok410). image Z-stack werd teruggegeven met een maximale projectie. Kernen aangegeven met witte pijl wordt geblazen-up op de rechterbovenhoek. Schaal bar, 10 micrometer. (B) Aantal telomeren plekken per nucleus in pachytene fase werd gemeten door middel van visuele inspectie. N = 50. Error bars, SEM. Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.
Figuur 3:. Telomeren en TALT1 FISH in de Embryowet een representatief beeld van telomeren (rood) en TALT1 (groen) FISH. Telomeer en TALT1 probe werden gelijktijdig gehybridiseerd met embryo's. DNA werd tegengekleurd met DAPI (blauw). Schaal bar, 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Kwantificering van FISH gegevens Telomere en TALT1 intensiteit uit figuur 3 werden gekwantificeerd in de beeldanalyse software (een gift van Dr. Peter Lansdorp). Elke spot werd gekwantificeerd met drempelwaarde over 15 niet-specifieke background uitsluiten. T-test werd gebruikt voor het evalueren de statistische significantie. (* P <0,001). Error bars, SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste voordeel van ons protocol is de eenvoud van de procedure zonder merkbare schade aan de morfologie van celstructuur. Verschillende stappen werden geoptimaliseerd voor C. elegans FISH in dit protocol. De kritische stappen voor een succesvolle vissen omvatten etikettering van probes, fixatie van embryo's en penetratie. Digoxigenine-dUTP labeling methode biedt een eenvoudig te gebruiken methode labeling met behulp van PCR of nick-translatie. Om lange doelsequentie te labelen, is nick-translatie voorkeur. In dit geval moet de probes worden gedigereerd met geschikte restrictie-enzym om de penetratie van probes vergemakkelijken. Biotine-dUTP tag wordt afgeraden, omdat biotine-gelabelde probes overmaat achtergrondsignaal uit het cytoplasma geproduceerd. Hoewel endogene biotine blokkerende reagens is in de handel verkrijgbaar, werd niet geprobeerd.
In dit protocol wordt geïsoleerd's naar de dichtheid van cellen voor efficiënte kwantificering verhogen. Intestinale kernen van C. elegans zijn groot en polyploïde zijn, die te groot aantal en de intensiteit van telomere spots vergelijking met de rest van somatische kernen dragen. Daarom hele worm is niet geschikt voor het kwantificeren van telomeren in C. elegans. Daarentegen embryo's zijn geschikt voor de evaluatie van telomeerlengte aangezien zij homogeen cellen zonder effect polyploïdie.
Dit protocol maakt gebruik van 2% PFA fixeermiddel dat prima voor telomeren FISH gewerkt. Hoewel glutaaraldehyde zou resulteren in een lager achtergrondsignaal en harder fixatie in RNA in situ hybridisatie, glutaaraldehyde verhoogde autofluorescentie aanzienlijk 18. Deze overmaat achtergrond niet opgeheven na behandeling van natriumboorhydride, welke gereageerde aldehydegroep vermindert. Daarom werd glutaaraldehyde niet gebruikt. Wanneer de signaal-ruisverhouding laag is, kan het moment van prehybridisatie worden meerdere uren in beslag om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. InVoorts tijd stringente wassen kan worden verhoogd tot achtergrondniveau verlagen.
Kleuring techniek C. elegans kan een uitdaging voor de juiste permeabilisatie behandeling. C. elegans bevat dikke cuticulaire exoskeleton die penetratie van antilichamen en probes remt. Traditionele antilichaamkleuring werkwijze omvat het behandelen van collagenase, die veel tijd en optimalisatieproces vereist. De enzymatische penetratie methode ook schade aan de morfologie van de wormen in ruil voor penetratie efficiency. Freeze-crack en methanol-aceton behandeling werd gebruikt om de sonde penetratie te vergemakkelijken. Freeze-crack is eenvoudig en snel in vergelijking met chitinase of yatalase behandeling 19. Dehydratatie of rehydratatie methanol serie leek niet aan de kwaliteit van FISH beïnvloeden. Deze stappen zijn vereenvoudigd in dit protocol. Hoewel werd gemeld dat proteinase K digestie was nodig voor RNA in situ hybridisatie19, voor de hand liggende verschil werd niet waargenomen tussen telomeren FISH resultaten met en zonder proteinase K behandeling. Bovendien bevriezen kraken van embryo verschaft een gemakkelijk te gebruiken werkwijze voor het visualiseren van vele cellen gelijktijdig op één brandvlak voor grote kwantitatieve analyse.
Via PNA probe werd telomeer signaal significant verhoogd vergeleken met die verkregen met een DNA probe. Dit zou het gevolg van hogere bindingsaffiniteit voor zijn complementaire doelwit en het kleinere formaat (3 repeat tegenover 4 herhaling). Fluorescent gelabelde PNA probe ook direct bindt aan het doel, het minimaliseren volgende stappen. Sterke affiniteit gehandhaafd in de volgende immunofluorescentie stappen maakt het post-fixatie overbodig, wat achtergrondgeluid kan vermijden.
Echter enige beperkingen bestaan in deze techniek. Een daarvan is dat de permeabilisatie stap iets schaadt de morfologie ten koste van efficiënte sondepenetratie. Behandeling van gonades en embryo's met methanol en aceton vervormde cirkelvormigheid van kernen vergeleken met onbehandelde controle. Voor experimenten die perfect bewaard gebleven morfologie vereisen, moet verschillende permeabilisatie methode worden geprobeerd. Een ander is dat de telomere signaal wordt gekwantificeerd in willekeurige eenheden. Dit is voornamelijk te wijten aan verschillen tussen onafhankelijke experimenten. Ribosomaal DNA kan worden beschouwd als een interne controle voor elk monster normaliseren. Meer bruikbare methoden kan worden gevonden in referentie 20.
Een eenvoudige telomeer FISH protocol wordt hier beschreven, die minimaal stappen vereist. Vele stappen worden verminderd voor de analyse van grote hoeveelheden embryo. Toch kan verdere modificatie worden gemaakt sterker signaal, zoals chitinase behandeling voor penetratie en andere innovatieve trials. In combinatie met celkweek werkwijze kan superresolutie imaging mogelijk. Dit protocol kan helpen om de roman telomeer onderhoud mechanisme in C. te ontdekken elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).
