Introduction
텔로미어는 비정상적인 융합 저하로부터 염색체 끝 부분을 보호합니다. 포유류 텔로미어는 G-풍부한 hexameric 반복, TTAGGG 및 shelterin 단지로 구성되어있다. 선충의 텔로미어 반복 서열은 포유 동물 (TTAGGC)의 그것과 유사하다. 대부분의 진핵 세포는 염색체 말단에 텔로미어의 반복을 추가하는 텔로 머라 제를 사용한다. 그러나, 10 - 암세포의 15 % 텔로미어 (ALT) 3의 대안 길어 알려진 텔로 머라 독립 메커니즘을 이용한다. 이전에, 우리는 텔로미어의 반복과 TALT라는 이름으로 관련 시퀀스가 중요한 불임이 살아 텔로 머라 돌연변이 라인의 텔로미어에서 증폭 된 보도했다.
텔로미어 길이를 정량적 PCR에 의해 또는 전체 -4,5,6,7- 텔로미어의 평균 길이를 제공 서던 블롯에 의해 측정 하였다. 전체 게놈 시퀀싱 데이터에서 텔로미어 반복의 읽기 횟수는 총 텔로미어의 내용 (8)의 지표입니다. 죄 있지만GLE 텔로미어 길이 분석 (STELA) 단일 텔로미어의 길이가,이 텔로미어 (9)의 공간 정보를 제공 할 수 제공 할 수있다. POT-1 :: mCherry 리포터 단백질이 생체 내에서 텔로미어의 공간 정보를 제공하는 반면 POT-1 단백질 (10)을 결합 단일 가닥 텔로미어이기 때문에, 그것은 이중 가닥 말단 소립의 길이를 나타낼 수 없다.
상기 방법은 반복적 인 시퀀스의 평균 정보를 제공하는 반면, 현장 하이브리드 (FISH)의 형광 염색체 규모에 금액과이자의 개별 시퀀스의 공간 패턴을 관찰 할 수 있습니다. 대신 DNA의 정제, 조직 또는 세포는 FISH에서 기본 공간 정보를 보존하기 위해 고정되어있다. 따라서, FISH는 텔로미어 반복 개별 반복 서열의 관찰을위한 양적 및 질적 도구입니다.
이 프로토콜은 모두 telo의 동시 검출을위한 효율적인 방법을 제공단순한 및 기타 반복 이전에 기술 된 방법 (11, 12)에서 개선을 기반으로. C. 엘레 유충 또는 성인 고도로 분화 된 세포와 다세포 유기체이다. 세포의 텔로미어 이질성 스폿 다수의 정량적 분석을 방해한다. 분석 된 세포의 수를 최대화하기 위해 배아 절연 및 FISH 용 폴리 리신 코팅 된 슬라이드에 도포한다. 또한,이 프로토콜은 또한 면역와 결합 될 수있다.
프로토콜이 동작하는 증거로서, 우리는 두 가지 관찰 반복 서열을 정량화 할 수 있음을 보여준다. TALT1에 대한 DNA 프로브는 간단한 PCR은 디그 옥시 제닌-dUTP를 통합하여 생성되었습니다. 그런 다음이 TALT1 프로브와 형광 표지 텔로미어 PNA 프로브를 동시에 하이브리드 하였다. 그 후, 디그 옥시 제닌은 표준 면역 형광 방법에 의해 검출되었다. 우리는 여기 TALT1는 TRT-1의 텔로미어와 colocalized 대표 이미지를 제시
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Protocol
PCR에 의한 디그 옥시 제닌 dUTP를 1. 레이블 프로브
- 이전 13 설명 된대로 10 배의 dNTP 믹스 디그 옥시 제닌 dUTP를을 포함하여 PCR 라벨링을 수행합니다.
- 제조자의 지시에 따라 스핀 컬럼으로 정제 PCR 생성물을 정제 하였다.
- 프로브가 짧을 200 bp의 경우, 반응 혼합물로부터 스핀 - 컬럼 크로마토 그래피보다는 스핀 칼럼 정제 무료 디그 옥시 제닌 dUTP를 제거.
2. 준비 폴리 라이신 코팅 슬라이드
참고 : 전체 절차는 약 2 시간 소요됩니다. 대부분의 단계는 건조 단계를 제외하고, 실온에서 수행된다.
- 슬라이드를 청소
- 플라스틱 용기에 슬라이드를 배치하고 간단히 증류수 (DW)와 슬라이드를 헹군다. 물을 제거하고 1 % DW 유리 세정제를 함유하는 용기를 채운다.
- 실온에서 50 rpm으로 (RT)에서 15 분 동안 교반 슬라이드. DW 3 슬라이드를 씻으RT에서 5 분마다 시간.
- 교반과 함께 15 분 동안 70 % 에탄올로 슬라이드를 씻으십시오. 70 % 에탄올을 취소하고 15 분 동안 65 ° C 건조 블록 공기 건조에 슬라이드를 배치합니다.
- 멀티 웰 유리 슬라이드 리신 코팅
참고 : 염색 과정에 걸쳐 샘플 밀착성을 제공하기 때문에, 슬라이드 유리 라이신 코팅은 중요한 단계이다. 저조한 코팅 된 슬라이드 샘플의 손실이 발생할 것입니다.- 0.01 % 폴리 리신으로 원액을 희석 (W / V) 증류수이다. 희석 된 0.01 %의 20 μl를 깨끗한 유리 슬라이드의 우물에 (w / v)의 폴리 리신을 추가합니다.
- RT에서 5 분 동안 유리 슬라이드 부화.
- 1 시간 동안 65 ° C 건조 블록 공기 건조에 슬라이드를 놓습니다.
- 먼지 무료로 상자에 폴리 라이신 슬라이드를 저장합니다.
슬라이드 유리에 벌레 3. 고정 (그림 1)
- FISH를위한 준비 배아
참고 : 수확 벌레를 모두 t 전에그 세균 음식 현미경 성장 배지를보고에 의해 소비된다. 기아는 성인 웜의 계란 생산을 줄이고 달걀 부화를 증가시킨다. 자세한 방법은 14, 15에 설명되어 있습니다.- 표준 방법 (14)에 따라 50mm 페트리 접시에 벌레를 성장.
- 모든 세균 음식을 섭취 한 후 주걱으로 분기 한천 미디어를 잘라. 오염을 방지하기 위해서 절단 전에 멸균 주걱.
- 100mm 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시에 한천의 모든 조각을 넣어. 신선한 박테리아 음식에 도달하는 벌레를 거꾸로 한천 조각을 돌립니다.
- 48 시간 72 후, M9 버퍼와 벌레를 수집합니다. NGM 플레이트에 M9 버퍼 5 ㎖ - 3을 추가합니다. NGM의 표면에 피펫 M9 버퍼는 벌레를 씻어.
- 벌레와 액체를 수집하고 15 ML 튜브에 추가 할 수 있습니다.
참고 : 30 % 자당 용액에서 수확, 원심 분리기 벌레 후 한천 이물질이있는 경우. 파편이 펠렛 동안, 웜에 떠표면. - 15 ml의 볼륨을 만들기 위해 M9 버퍼를 추가합니다. 3 분 300 XG에서 원심 분리하여 벌레를 펠렛과 M9 버퍼의 대부분을 제거합니다. 이 단계를 2 번 더 반복합니다.
참고 : 웜은 아직 원심 분리 한 후 부동 경우, 원심 분리기의 브레이크 레벨 = 1 값으로 설정. - 기음 M9 버퍼입니다. 벌레에 표백 솔루션을 추가합니다. 웜의 0.5 ml의 당 5 M KOH의 6.5 DW ml의, 차아 염소산 2 ㎖, 1 ml에 추가 할 수 있습니다.
- 50 rpm에서 3 분 동안 실온에서 락으로 벌레를 품어. 15 초 동안 소용돌이 웜은 기계적으로 벌레를 전단과 계란을 노출합니다.
- 표백하는 동안 해부 현미경 튜브를 관찰한다. 벌레가 반으로 잘라하고 계란이 해제되어 있는지 확인합니다. 성인 신체의 대부분이 용해되면, 15 ml의 볼륨을 만들기 위해 M9 버퍼를 추가합니다.
- 3 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 기음 M9의 대부분을 15 ml의 볼륨을 보충하기 위해 신선한 M9 버퍼를 추가합니다. 반복 세척 단계 3 회.
노트:그들은 표백 과정을 방해으로, 웜의 과도한 양을 사용하지 마십시오. 보다 8 분 세척까지 전체 반응 시간을 유지합니다. 오버 표백 계란 강한 자기 형광을 생산하고 있습니다. - 200 ㎕의 2 % PFA을 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 200 μL까지 폴리 소르 베이트 20 (PBST)을 인산염 완충 식염수를 추가한다.
주의 : PFA는 발암 물질이기 때문에, PFA를 사용하기 전에 보호 복, 보호 장갑 및 눈 방패를 착용하십시오. - 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드의 우물에 2 % PFA에서 계란의 40 μl를 추가합니다.
- 습기 챔버에 슬라이드를 넣고 실온에서 15 분 동안 품어. 슬라이드는 내부에 배치 된 직후 습기 챔버를 닫습니다.
참고 : 고정 된 상태로 계란은 슬라이드의 바닥에 정착.
- 물고기를 해부 생식선 준비
- 수확 성인 웜 M9 버퍼 1 ㎖를 피펫 팅에 의해 50mm NGM 판에 성장. 세균성 식품 전에 수확 웜은 고갈된다.
- 어떤 세균 기지에서 벌레를 씻어H M9 버퍼 2 회.
참고 : 잔류 박테리아는 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드에 달라 붙는 해부 생식선을 방해 할 수 있습니다. - 300 x g에서 원심 분리하여 벌레 펠렛. M9를 제거하고 마이크로 피펫에 의해 빈 NGM 플레이트로 웜을 전송합니다.
- 폴리 라이신 처리 된 슬라이드의 잘에 2 밀리미터의 levamisole을 포함하는 M9 버퍼의 30 μl를 추가합니다.
- 1 ML 튜브에 M9 버퍼의 500 μl를 추가합니다. 입 피펫으로 웜을 전송하기 위해 버퍼를 사용합니다.
- M9 버퍼를 함유하는 1 ㎖의 튜브에 모세관을 배치하여 M9 완충액 입 피펫의 끝을 채운다.
- 웜의 머리가 입 피펫을 입력하도록 해부 현미경, 단지 성인 웜 드래그 입 피펫의 머리 앞에 입 피펫의 팁을 넣어. 웜의 머리 끝을 입력하면, 웜의 몸 전체가 팁으로 그려집니다.
- 입 피펫을 사용하여 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드로 웜을 전송합니다.
- 의 절단, 면도칼을 사용하여머리 또는 슬라이드 웜의 꼬리의 끝 (F). 웜이 절단 될 때, 생식선 밖으로 나타납니다. 생식선은 슬라이드에 충실 할 것이다.
- 하나 잘 적어도 30 벌레를 준비합니다. 추가로 30 웰 웜에 사용될 수있다.
- 습기 챔버에 슬라이드를 넣고 입으로 피펫으로 M9 버퍼를 대기음.
- 습 챔버 내에서 15 분 동안 실온에서 2 % PFA 20 μl를 첨가하여 샘플을 고정한다.
4. 고정 및 Permeabilization
- 드라이 아이스에 알루미늄 블록을 놓고 깊은 냉동고에 보관 (-80 ° C). -20 ° C에 보관 메탄올 및 아세톤.
- PFA 고정 단계 3.1.15 또는 3.2.11 후 ~ 정착액의 5 μl를 마이크로 피펫 떠나는를 사용하여 정착액을 제거합니다.
- 샘플 슬라이드에 다른 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드를 넣습니다. 솔루션이 과도한 경우 종이 타월로 정착액을 제거합니다. 그들은 서로 붙어되면 슬라이드를 이동하지 마십시오.
- 슬라이드를 고정적어도 15 분 동안 알루미늄 블록.
주의 : 샘플을 적어도 2 저장 될 수있다 - 삼일. - 슬라이드가 고정되는 동안 얼음 냉 메탄올 및 아세톤을 함유하는 병을 넣어.
- 슬라이드를 꺼내 샘플을 동결 균열을 비틀어. 상단 슬라이드를 폐기하십시오. 즉시 5 분간 빙냉 메탄올로 슬라이드 소크.
- 5 분 동안 얼음처럼 차가운 아세톤으로 슬라이드를 전송합니다.
- 잔류 정착액을 제거하기 위해 5 분 동안 슬라이드를 PBST 3 회 반복한다. 다음 단계로 진행 또는 4 ° C에서 100 % 에탄올에 슬라이드를 저장합니다.
주의 : 샘플을 적어도 2 저장 될 수있다 - 삼일.
고정 세포의 5. 하이브리드
- (PBST 10 μg의 / ㎖의 RNase을 포함)의 RNase 용액 20 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 습한 챔버에서 슬라이드 부화.
- 폴리 소르 베이트 20 (2 배 SSCT) 15 분 각각에 2 배 식염수와 구연산 나트륨에 두 번 슬라이드를 씻으십시오.
- 20 추가하이브리드 솔루션의 μL와 37 ° C 배양기에서 습기 챔버를했습니다. 1 시간 후, 피펫으로 하이브리드 솔루션을 제거합니다.
- 하이브리드 솔루션을 제거하기 전에 프로브를 준비합니다. 상기 프로브는 이중 쇄 DNA가되면, 건조 블록을 5 분 동안 95 ℃에서 가열에 의해 프로브를 변성. 가열 후, 얼음 짧게에 프로브를 냉각.
- 샘플에 프로브를 포함하는 하이브리드 용액 10 μl를 추가합니다. 2,000 파기 표지 된 프로브 1의 비율로 사용 농도 : 200 PNA 프로브 1의 비율로 사용 농도. 커버 유리와 샘플을 커버.
- 열 블록 (80 ° C)에 물을 적신 종이 타월을 넣어. 습도 및 온도를 유지하기 위해 열 블록 플라스틱 상자 덮개를 넣는다.
- 가열 블록의 온도 (80 ℃로) 안정화 된 후, 가열 된 종이 수건 시료 슬라이드를 놓고 플라스틱 박스 커버와 함께 샘플을 커버한다. 3 분 동안 샘플을 변성.
- Inc의하룻밤 37 ℃에서 습기 챔버에서 슬라이드를 ubate.
6. 세척 및 면역 형광
- 37 ° C에 하이브리드 세척 용액 (2 × SSC, 50 % 포름 아미드)를 따뜻하게.
- 5 분 동안 실온에서 두 번 PBST에서 샘플을 씻으십시오. 커버 유리를 제거합니다.
- 30 분 동안 37 ℃에서 혼성화 세척 용액의 샘플을 씻는다.
- 3 회 RT에서 PBST의 샘플 슬라이드를 씻으십시오. 참고 : RT에 습기 챔버의 모든 후속 단계를 수행합니다.
- 차단 용액 20 μl를 추가하고 습기 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- 솔루션을 차단 제거하고 FITC 접합 된 항 디곡 시게 닌 항체 용액 (1 : 200)를 추가 RT 또는 밤새 4 ℃에서 3 시간 동안.
7. 설치 및 관측
- 15 분마다 PBST로 2 번 샘플 슬라이드를 씻으십시오.
- DAPI와 솔루션을 장착의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 커버 유리하고 Enter 키를 넣습니다. 초과 솔루션을 제거종이 수건.
- 장착 용액의 증발을 방지하기 위해, 매니큐어와 커버 유리의 가장자리를 밀봉.
- 공 초점 현미경으로 관찰한다. 높은 배경으로 배아를 제외합니다. 20 핵 - 4 필드에 초점을 맞 춥니 다.
- 100X 대물 렌즈와 제조업체의 지시에 따라 이미지를 가져 가라.
참고 : FITC에 대한 488 nm의 레이저로, CY3에 대한 555 nm의 레이저로, DAPI에 대한 405 nm의 레이저로 샘플을 익사이트.
텔로미어 신호의 8 정량
참고 : 이전 16 설명한 바와 같이 정량화가 이루어졌다. 비교 될 수있는 모든 이미지는 노출 시간 및 광원을 포함 동일한 설정으로 촬영한다.
- 이 .tif 형식으로 이미지를 보냅니다.
- 다운로드 및 이미지 분석 소프트웨어를 설치한다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 실행하고 버튼을 동의 클릭합니다.
- 열기 버튼을 클릭합니다. 이미지 파일을 두 번 클릭하여 텔로미어의 FISH와 이미지를 엽니 다.
- 딸깍 하는 소리[편집] - [선택 처리 영역, 왼쪽 버튼으로 클릭하고 드래그하여 관심의 선택 영역입니다. 모든 비특이적 염색을 제외.
- [광학 밀도를 발견] 텔로미어 신호 채널을 선택하고 .txt 파일에 결과를 저장할 파일 이름을 입력 - [측정]를 클릭합니다.
주 : 결과 열은 다음 순서대로 : 스폿의 형광 반점의 스폿 영역의 배경 강도. - 값을 복사하여 현장의 형광에서 현장의 배경 강도를 뺍니다. 값은 이제 통계적 분석 될 수있다.
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Representative Results
그것은 이전에 해당 ALT 생존자는 내부적으로 'ALT의 템플릿'(TALT) 텔로미어 유지 보수 2 시퀀스 지역화 복제하여 낮은 주파수에서, TRT-1 (ok410), 텔로 머라 아제가 결핍 된 돌연변이 체에서 나타날 수 있습니다보고되었다. PNA 프로브를 사용하여, 우리는 해부 생식선 (도 2A)에서 텔로미어를 시각화 할 수 있었다. 희미한 텔로미어 신호에 TRT-1 (ok410)와 ALT 생존자를 모두 검출되었다. 퍼지 신호는 그들이 자기 형광하지 않을 수 있음을 시사 만 DAPI와 중첩되었다. 전면 광고 텔로미어와 같은 반복 (ITR)는 지속적으로 C.의 연구에 TRF 분석에서 관찰된다 간스의 텔로미어 4,10. PNA 프로브의 특이성을 고려하면, 이들은 ITR은 게놈 전반에 걸쳐 분산 될 가능성이있다.
텔로미어 반점의 수는 TRT-1 (ok410) 약 9 pachytene 핵 당이었다.이전 연구에서, 12은 초점 POT-1 :: mCherry 단백질 단일 가닥 텔로미어 DNA 열 결합에 의해 관찰되었다. 핵 당 24 병소의 최대 야생형 배아 17에서 관찰되었다. 결과 mCherry 리포터 방법 텔로미어의 수를 계산한다 실험 좋다고 제안한다. 그러나 PNA FISH는 텔로미어 길이 비율 이중 가닥 텔로미어 DNA뿐만 아니라 단일 가닥 말단 소립 DNA를 검출 할 수있다. 반대로, 텔로미어 스폿의 수가 염색체 융합 한 ALT 생존자, 약 7이었다 (N = 3)이. 이 결과 텔로미어 스폿 ALT 생존자 6를 것이라고 예측과 일치한다. 우리는 ALT 생존자의 신호 강도를 관찰하기에 충분하다고 결론.
텔로미어 신호는 TALT1이 telo의 부재에서 텔로미어에 대한 사본을 템플릿으로 사용되는 것을 시사 ALT 생존자에 TALT1와 colocalized했다M 지우기 (그림 3). ALT 생존자의 텔로미어 신호는 (그림 4) 텔로미어가 견고 텔로 머라없이 ALT 생존자 유지되고있는 것을 나타내는, 부모의 TRT-1 (ok410) 돌연변이에 비해 증가. PNA 프로브 신호는 디곡시 제닌 - 표지 된 탐침 (도 4)보다 더 컸다. PNA 올리고머와 디자인 프로브는 디그 옥시 제닌 라벨보다 더 강한 신호가 될 수 있습니다.
그림 1 :. FISH 실험 계란의 개요 표백 성인 웜 수확 및 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드에 2 % PFA에 고정되어있다. 샘플은 동결 금 프로브 침투에 대한 메탄올, 아세톤으로 투과성이있다. 프로브가 샘플에 첨가하고, 37 ℃에서 밤새 혼성화한다. 디곡시 제닌 - 표지 된 탐침은 면역 형광에 의해 검출된다. 샘플은 다음 이미지화되고 quantifie이미지 분석 소프트웨어에 의해 거라고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 해부 생식선에서 텔로미어의 FISH은 (A) 텔로미어 (빨간색) 생식선의 원위 팁 (화살촉)에 CY3 - PNA- (TTAGGC) (3)에 의해 검출되었다. ALT 생존자의 강도는 TRT-1 (ok410)보다 크다. Z 스택 이미지는 최대 투사로 렌더링되었다. 흰색 화살표 핵 불어 업되어 오른쪽 상단 모서리에. 스케일 바, 10 μm의. pachytene 단계에서 핵 당 텔로미어 스폿 (B) 수를 육안으로 측정 하였다. N = 50 오류 바, SEM. 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
그림 3 :. 텔로미어와 태아의 TALT1 FISH 텔로미어 (적색)과 TALT1 (녹색) FISH의 대표 이미지입니다. 텔로미어와 TALT1 프로브는 동시에 배아에 하이브리드했다. DNA는 DAPI (파란색)으로 대조 하였다. 스케일 바, 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. FISH 데이터 텔로미어의 정량 및 그림 3에서 TALT1 강도는 이미지 분석 소프트웨어 (박사 피터 Lansdorp의 선물) 정량화 하였다. 각 지점은 임계 값 레벨 오븐으로 정량 하였다어 (15)는 비 특정 배경을 제외합니다. T 테스트는 통계적 유의성을 평가 하였다. (* p <0.001). 오류 바, SEM은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리 프로토콜의 주요 장점은 세포 구조의 형태로 눈에 띄는 손상없이 절차의 단순함이다. 여러 단계 C.에 최적화 된 이 프로토콜에 간스의 물고기. 성공적인 FISH를위한 중요한 단계는 프로브의 라벨, 배아 및 침투의 고정을 포함한다. 디그 옥시 제닌 표지 된 dUTP의 방법은, PCR이나 닉 - 번역에 의해 사용하기 쉬운 표시 방법을 제공한다. 긴 표적 서열 레이블을 지정하려면, 닉 번역이 바람직하다. 이 경우, 프로브는 프로브의 침투를 용이하게하기 위해 적절한 제한 효소로 분해되어야한다. 비오틴 표지 된 프로브는 세포질에서 배경 신호의 과잉 생산 때문에 비오틴-dUTP를 태그하지 않는 것이 좋습니다. 내인성 비오틴 차단 시약이 시판되고 있지만,이 시도되지 않았다.
이 프로토콜은 효율적인 정량화를위한 세포의 밀도를 증가시키는 절연 배아를 사용한다. C의 장 핵. 엘레 크기가 크고, 과도한 수와 체세포 핵의 나머지 부분에 비해 텔로미어 반점의 강도에 기여하는 배수체이다. 이러한 이유로, 전체 웜은 C에서 텔로미어의 정량에 적합하지 않습니다 간스. 그들은 배수성 효과없이 균질 한 세포를 제공 대조적으로, 배아 텔로미어 길이의 평가에 적합하다.
이 프로토콜은 텔로미어의 FISH를위한 괜찮 았는데 2 % PFA의 정착액을 사용합니다. 글루 타르 알데히드가 낮은 배경 신호와 현장 하이브리드의 RNA에서 어렵게 정착 될 것으로보고 있지만, 글루 타르 알데히드는 크게 18 형광도 증가했다. 이것은 과도한 배경 미 반응 알데히드기를 감소 수소화 붕소 나트륨의 처리 후 폐지되지 않았다. 이러한 이유로, 글루 타르 알데히드는 사용되지 않았다. 신호대 잡음비가 낮 으면 예비 혼성화의 시간은 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 몇 시간까지 확장 될 수있다. 에서첨가 엄격한 세척 시간은 백그라운드 레벨을 감소하기 위해 증가 될 수있다.
에서 염색 기술 C. elegans의 적절한 permeabilization 처리를위한 도전 일 수있다. C. 엘레 항체 및 프로브의 침투를 억제 두꺼운 cuticular 외골격이 포함되어 있습니다. 전통적 항체 염색 방법은 많은 시간과 최적화 과정을 요구 콜라겐의 치료를 포함한다. 침투 효율의 교환도 효소 침투 방법은 손상 웜의 형태를. 동결 균열 및 메탄올 - 아세톤 처리는 프로브의 침투를 촉진하기 위해 사용되었다. 냉동 균열이 키틴 또는 yatalase 처리 (19)에 비해 간단하고 빠르다. 탈수 메탄올 시리즈 재수 물고기의 품질에 영향을 보이지 않았다. 이 단계는이 프로토콜을 단순화했다. 그것은 테 K 소화가 현장 하이브리드의 RNA에 필요한 것을보고 있지만19, 명백한 차이와 테 K 처리없이 텔로미어의 FISH 결과 사이에 관찰되지 않았다. 또한, 동결 균열 큰 정량 분석을위한 단일 초점 평면에서 동시에 많은 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉬운 방법을 제공 배아.
PNA 프로브를 사용함으로써, 텔로미어 신호 크게 DNA 프로브 수득 비하여 증가 하였다. 이것은 그것의 보완적인 목표 (4 반복에 비해 3 반복)의 작은 크기에 높은 결합력으로 인해 수 있습니다. 형광 표지 된 PNA 프로브는 직접 후속 단계를 최소화 목표에 결합한다. 다음 면역 형광 단계에서 유지 강한 친 화성을 배경 잡음을 피할 수있는 불필요한 후 고정을합니다.
그러나 몇 가지 제한 사항이 기술에 존재한다. 하나는 permeabilization 효율적 프로브 침투 비용 손실을 다소 형태 단계 있다는 것이다. 생식선의 치료S, 메탄올, 아세톤으로 배아는 처리되지 않은 대조군에 비해 핵 원형 왜곡. 완벽하게 보존 된 형태를 필요로 실험을 위해, 다른 permeabilization 방법을 시도해야합니다. 또 텔로미어 신호가 임의의 단위로 정량화되고 있다는 것이다. 이것은 독립적 인 실험 중 변화에 주로 기인한다. 리보좀 DNA는 각 샘플을 정상화하기위한 내부 대조군으로서 간주 될 수있다. 더 유용한 방법을 참조 (20)에서 찾을 수 있습니다.
간단한 텔로미어의 FISH 프로토콜은 최소 단계를 요구하는, 여기에 설명되어 있습니다. 많은 단계 배아 다량의 분석 감소된다. 그러나, 다른 변형 예는 키틴 침투 치료 및 다른 혁신적인 실험으로, 강한 신호를 만들 수있다. 세포 배양 방법으로 조합하여 수퍼 - 해상도 이미징은 가능하다. 이 프로토콜은 C.의 소설 텔로미어 유지 관리 메커니즘을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다 간스.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
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