Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Observasjon og Kvantifisering av telomere og repeterende sekvenser med fluoresens Published: August 4, 2016 doi: 10.3791/54224
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

Introduction

Telomerer beskytter kromosomendene fra avvikende fusjon og degradering. Pattedyr-telomer er sammensatt av G-rike heksa gjentar, TTAGGG og shelterin komplekser. Telomere gjenta sekvensen av nematode er lik de i pattedyr (TTAGGC). De fleste eukaryoter utnytte telomerase å legge telomere gjentar sine kromosom ender. Men 10 - 15% av kreftceller benytter telomerase uavhengig mekanisme, kjent som Alternativ Forlengelse av Telomerer (ALT) 3. Tidligere rapporterte vi at telomere gjentar og tilhørende sekvenser, navngitt som Talt, ble forsterket i telomerer av telomerase mutant linjer som overlevde kritisk sterilitet to.

Telomerlengde ble målt ved hjelp av kvantitativ PCR eller ved Southern blot, som tilveiebringer gjennomsnittlige lengden av de totale telomerer 4,5,6,7. Les telling av telomerer gjenta i hele genomsekvense data er også en indikator på totalt telomere innholdet 8. selv Single telomerlengde Analysis (STELA) kunne gi lengden av en enkelt telomer, kan det ikke gi romlig informasjon fra telomerer 9. Mens POT-1 :: mCherry reporter protein gir den romlige informasjonen telomerer in vivo, kan det ikke representere lengder av dobbelt-strandet telomerer, som POT-en er en enkelt-strand telomer-bindende protein 10.

Selv om disse fremgangsmåter gir i gjennomsnitt informasjonen av repetitive sekvenser, fluorescens in situ hybridisering (FISH) gjør det mulig å observere mengden og romlig mønster av individuelle sekvenser av interesse på en kromosomal målestokk. I stedet for rensing av DNA, blir vev eller celler fiksert for å bevare den opprinnelige romlig informasjon i fisk. Dermed er FISH en både kvantitativ og kvalitativ verktøy for observasjon av enkelt gjentatte sekvenser, for eksempel telomere gjentas.

Denne protokollen gir en effektiv metode for simultan deteksjon av både telobare og andre gjentar basert på forbedringer fra tidligere beskrevne metoder 11,12. C. elegans larver eller voksne er flercellet organisme med høyt differensierte celler. Heterogeniteten av celler hindrer på kvantitativ analyse av et stort antall av telomere flekker. For å maksimere antall celler analysert, embryoer er isolert og spredt på polylysinet-belagt lysbilder for fisk. I tillegg kan denne protokollen også kombineres med immunfluorescens.

Som et bevis på at protokollen virker, viser vi at det er mulig å observere og kvantifisere to forskjellige repeterende sekvenser. DNA-probe mot TALT1 ble generert med enkle PCR innlemme digoxigenin-dUTP. Da er dette TALT1 sonde og fluorescens-merket telomerer PNA probe ble hybridisert samtidig. Deretter digoksigenin ble detektert ved kanoniske immunfluorescens metoder. Vi presenterer her de representative bildene der TALT1 colocalized med telomere i TRT-en

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. merking prober med Digoxigenin-dUTP ved PCR

  1. Utfør PCR merking med 10x dNTP mix inneholder digoxigenin-dUTP som tidligere beskrevet 13.
  2. Rens PCR produkt med spin-kolonne rensing i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Hvis sonden er kortere enn 200 bp, fjerne fritt digoxigenin-dUTP med spin-kolonne-kromatografi fra reaksjonsblandingen i stedet for spin-kolonne-rensing.

2. Å polylysin Coated Slides

Merk: Hele prosedyren tar ca 2 timer. Mesteparten av trinnene blir utført ved romtemperatur med unntak av tørketrinnet.

  1. Rengjøring av lysbilder
    1. Plasser lysbildene i en plastboks og skyll lysbildene kort med destillert vann (DW). Fjern vannet og fyll beholderen med DW inneholder 1% glass renere.
    2. Agitere lysbildene i 15 minutter ved 50 rpm ved romtemperatur (RT). Vask lysbildene med DW 3ganger i 5 minutter hver ved RT.
    3. Vask objektglassene med 70% etanol i 15 minutter under omrøring. Kast 70% etanol og plassere lysbilder på en 65 ° C tørr blokk og lufttørke i 15 min.
  2. Polylysin lag av multi-brønn glass
    Merk: polylysin belegg av glide glass er et viktig skritt, fordi det gir prøven heft hele fargeprosedyre. Dårlig belagte lysbilde vil resultere i tap av prøven.
    1. Fortynn polylysin stamløsning til 0,01% (w / v) i destillert vann. Tilsett 20 pl av den fortynnede 0,01% (vekt / volum) polylysin til brønnene til en ren glassplate.
    2. Inkuber objektglasset i 5 min ved RT.
    3. Plasser lysbilder på en 65 ° C tørr blokk og lufttørke for en time.
    4. Oppbevar polylysinet lysbildene i støvfri boks.

3. Fiksering av Worms på Slide Glass (figur 1)

  1. Forbereder embryoer for FISH
    Merk: Harvest-ormer før alle than bakteriell mat er fortært ved å se på vekstmaterialet under mikroskop. Sult reduserer egg produksjon av voksne ormer og øker egg klekking. Detaljerte metoder er beskrevet i 14,15.
    1. Vokser ormer i 50 mm petriskål i henhold til standardmetoder 14.
    2. Etter all den bakterielle mat er fortært, kutt agar media i kvart med slikkepott. Steriliser slikkepott før du skjærer for å hindre forurensning.
    3. Sett hele stykke agar på 100 mm nematode vekstmedier (NGM) plate. Snu agar stykke opp ned for ormer å nå frisk bakterie mat.
    4. Etter 48-72 timer, samle ormer med M9 buffer. Tilsett 3 - 5 ml M9 buffer på NGM plate. Pipetter M9 buffer på overflaten av NGM å vaske ormer.
    5. Samle væsken med ormer og legge til en 15 ml tube.
      Merk: Hvis det er agar rusk etter innhøsting, sentrifuge ormer i en 30% sukrose løsning. Mens rusk er pelletert, ormer flyte påoverflaten.
    6. Legg M9 buffer for å gjøre opp volumet til 15 ml. Pellet ormer ved sentrifugering ved 300 x g i 3 minutter, og fjerne det meste av M9 buffer. Gjenta dette trinnet 2 flere ganger.
      Merk: Hvis ormene er fortsatt flytende etter sentrifugering, sette bremsen nivået av sentrifugen til verdi = 1.
    7. Sug M9 buffer. Legg bleking løsning på ormer. Per 0,5 ml ormer, tilsett 6,5 ml DW, 2 ml av hypokloritt, 1 ml av 5 M KOH.
    8. Inkuber ormer med gynge ved RT i 3 min ved 50 rpm. Vortex ormer i 15 sekunder for å mekanisk skjær ormer og avsløre eggene.
    9. Observer rør under en disseksjon mikroskop under bleking. Kontroller at ormer er halvert og egg er gitt ut. Når det meste av den voksne kroppen er oppløst, tilsett M9 buffer for å gjøre opp volumet til 15 ml.
    10. Sentrifuger ved 300 x g i 3 min. Aspirer meste av M9 og tilsett frisk M9 buffer for å gjøre opp volumet til 15 ml. Gjenta vasketrinn 3 ganger.
      notat:Unngå å bruke overdreven mengde ormer, som de hindrer blekeprosessen. Hold den totale reaksjonstiden mindre enn 8 min inntil vaske. Over-bleket egg produsere sterk autofluorescence.
    11. Legg fosfat saltløsning med polysorbat 20 (PBST) opp til 200 mL og 200 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) for å gjøre 2% PFA.
      Advarsel: Siden PFA er kreftfremkallende, bruke verneklær, hansker og øye skjold før bruk PFA.
    12. Legg 40 mL av eggene i 2% PFA på godt over polylysin belagt lysbilde.
    13. Plasser lysbildene i et fuktighetskammer og inkuberes i 15 min ved RT. Lukk fuktig kammer rett etter lysbildene er plassert på innsiden.
      Merk: Eggene bosette til bunnen av lysbildet mens å være løst.
  2. Forbereder dissekert gonadene for FISH
    1. Høste voksne ormer dyrket på 50 mm NGM plate ved å pipettere 1 ml M9 buffer. Slakte ormer før bakteriell mat er oppbrukt.
    2. Vask ormer fra noen bakterier viddh M9 buffer, 2 ganger.
      Merk: Rest bakterier kan forstyrre de dissekert gonadene fra stikker til polylysin belagt lysbilder.
    3. Pellet ormer ved sentrifugering ved 300 x g. Fjern M9 og overføre ormer til tom NGM plate av mikropipette.
    4. Legg 30 mL M9 buffer som inneholder 2 mM levamisol på en brønn med polylysin behandlet lysbilde.
    5. Legg 500 mL av M9 buffer til en 1 ml-rør. Bruk av denne buffer for å overføre ormer gjennom munnen pipette.
    6. Fyll spissen av pipetten munnen med M9 buffer ved å plassere en kapillar i en ml rør inneholdende M9 buffer.
    7. Under dissekere mikroskop, sette tuppen av munn pipette like foran hodet til voksen orm og dra munn pipette slik at leder av ormer kommer inn i munnen pipette. Når hodet av ormer kommer inn i spissen, vil hele kroppen av ormen trekkes inn i tuppen.
    8. Overfør ormer til polylysinet belagt lysbildet bruker munn pipette.
    9. Ved hjelp av en barberhøvel, kuttet avf hodet eller tuppen av halen av ormer på lysbildet. Når ormen er kuttet, vil gonadene sprette ut. Gonader vil holde seg til lysbildene.
      1. Forbered minst 30 ormer i en brønn. Flere brønner kan anvendes i ytterligere 30 ormer.
    10. Sett lysbildet i fuktig kammer og aspirer av M9 buffer med munn pipette.
    11. Fix prøven ved tilsetning av 20 pl 2% PFA ved RT i 15 minutter i fuktig kammer.

4. Fiksering og Permeabilization

  1. Plasser en aluminiumsblokk på tørris og lagre den i en dypfryser (-80 ° C). Butikk metanol og aceton i -20 ° C.
  2. Etter PFA fiksering trinn 3.1.15 eller 3.2.11, fjerne fiksativ bruker mikropipette forlater ~ 5 mL av fiksativ.
  3. Sagt på en annen polylysin belagt lysbilde på prøven lysbildet. Fjern det fiksativ med papirhåndkle hvis oppløsningen er overdreven. Ikke flytt lysbildene når de henger sammen.
  4. Frys lysbildenepå aluminiumsblokk i minst 15 min.
    Merk: Prøvene kan oppbevares i minst 2 - 3 dager.
  5. Mens lysbildene blir frosset, sette krukkene inneholder kald metanol og aceton på is.
  6. Ta lysbildene ut og vri dem til å fryse-knekke prøven. Kast den øvre lysbilde. Umiddelbart suge lysbilde i iskald metanol i 5 min.
  7. Overfør lysbilder til iskald aceton i 5 min.
  8. Vask lysbildene 3 ganger med PBST i 5 min for å fjerne rester av bindemiddel. Fortsett til neste steg, eller lagre lysbildene i 100% etanol ved 4 ° C.
    Merk: Prøvene kan oppbevares i minst 2 - 3 dager.

5. Hybridisering av fikserte celler

  1. Tilsett 20 ul RNase-oppløsning (PBST inneholdende 10 pg / ml RNase A). Inkuber objektglasset i fuktig kammer ved 37 ° C i 1 time.
  2. Vask objektglasset to ganger i 2x saltvann og natriumcitrat med polysorbat-20 (2x SSCT) i 15 minutter hver.
  3. Legg 20ul hybridisering løsning og sette fuktig kammer i 37 ° C inkubator. Etter 1 time, fjern hybridiseringsoppløsningen ved pipettering.
  4. Før du fjerner hybridisering løsning, forberede sonden. Dersom proben blir dobbelt-trådet DNA, denaturere probene ved oppvarming ved 95 ° C i 5 minutter på en tørr blokk. Etter oppvarming, kjøle sonde på isen kort.
  5. Tilsett 10 mL av hybridisering oppløsning inneholdende prober til prøven. For PNA probe, anvendelse konsentrasjon ved et forhold på 1: 2000 og for grave-merket probe, anvendelse konsentrasjon ved et forhold på 1: 200. Dekk prøven med dekkglass.
  6. Sett et papirhåndkle fuktet med vann på varmeblokk (80 ° C). Sett en plastboks dekselet på varmeblokk for å bevare fuktighet og temperatur.
  7. Etter at temperaturen på varmeblokken har stabilisert seg (til 80 ° C), plasserer prøven lysbildet på det oppvarmede papirhåndkle og dekke prøver med plastboksdekselet. Denaturere prøven i 3 min.
  8. IncUbate lysbildene i en fuktig kammer over natten ved 37 ° C.

6. Vasker og immunfluorescens

  1. Varm opp hybridisering vaskeoppløsning (2 x SSC, 50% formamid) til 37 ° C.
  2. Vask prøven i PBST to ganger ved RT i 5 min. Ta av dekselet glass.
  3. Vask prøven i hybridisering vaskeløsningen ved 37 ° C i 30 minutter.
  4. Vask prøven raset i PBST 3 ganger på RT. Merk: Utfør alle de påfølgende trinnene i fuktkammer ved RT.
  5. Tilsett 20 ul blokkeringsløsning og inkuber i 1 time ved romtemperatur i fuktig kammer.
  6. Fjern blokkeringsløsning og tilsett FITC-konjugert anti-digoksigenin antistoff-løsning (1: 200) i 3 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.

7. Montering og Observasjon

  1. Vask prøven glide med PBST 2 ganger i 15 minutter hver.
  2. Tilsett 10 mL av monteringsløsning med DAPI. Sett glasset og trykk forsiktig. Fjern overflødig oppløsningmed et papirhåndkle.
  3. For å forhindre fordamping av monteringsløsning, forsegle kantene av dekkglasset med neglelakk.
  4. Observer henhold konfokalmikroskop. Ekskluder embryoer med høy bakgrunn. Fokuser på et felt med 4 - 20 kjerner.
  5. Ta bilder i henhold til produsentens instruksjoner med 100X objektiv.
    Merk: Excite prøven med 405 nm laser for DAPI, med 555 nm laser for Cy3, med 488 nm laser for FITC.

8. Kvantifisering av telomere Signal

Merk: Kvantifisering ble gjort som beskrevet tidligere 16. Alle bildene som skal sammenlignes bør tas med samme innstilling inkludert eksponeringstid og lyskilde.

  1. Eksportere bilde i TIF format.
  2. Last ned og installer bildeanalyse programvare.
  3. Utfør bildeanalyse programvare og klikk enig knappen.
  4. Klikk åpne-knappen. Åpne bilder med telomerer FISH ved å dobbeltklikke på bildefilen.
  5. Klikk[Rediger] - [velg behandling region], velg region av interesse ved å venstreklikke og dra. Ekskluder alle ikke-spesifikk farging.
  6. Klikk på [tiltaket] - [øye optisk tetthet], velge kanal med telomere signal og angi filnavnet for å lagre resultater i .txt-fil.
    Merk: Kolonnen av resultatene er i følgende rekkefølge: Fluorescens av sted, bakgrunn intensiteten av sted og areal av sted.
  7. Kopiere verdiene og trekker bakgrunn intensiteten av sted fluorescens av sted. Verdiene kan nå statistisk analysert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det ble tidligere rapportert at ALT overlevende kan komme ut av telomerase-mangel mutant, TRT-en (ok410), i lav frekvens ved å kopiere internt lokaliserte 'mal av ALT "(Talt) sekvenser for telomere vedlikehold 2. Ved hjelp av PNA sonde, var vi i stand til å visualisere telomerer i de dissekerte gonadene (figur 2A). Den svake telomer-signal ble påvist både i TRT-en (ok410) og ALT overlevende. Den uklare signal ble overlappet bare med DAPI, noe som tyder på at de ikke kan være autofluorescence. Interstitiell telomer-lignende repeat (ITR) er konsekvent observert i TRF analyse i studiet av C. elegans telomere 4,10. Vurderer høy spesifisitet PNA sonde, er de sannsynligvis til å bli den ITR spredt over hele genomet.

Antallet telomere flekker var ca 9 per pachytene kjernen i TRT-en (ok410).I forrige studien ble 12 foci observert av POT-1 :: mCherry protein som binder seg til enkeltkjedet telomer-DNA 10. Maksimalt 24 foci per kjerne ble observert i villtype embryoer 17. Resultatet antyder at mCherry reporter metode er bedre for forsøket hvor antall telomerer skal telles. Men PNA FISH er i stand til å oppdage dobbeltrådet telomer-DNA samt enkeltrådet telomere DNA i proporsjon med telomerlengde. I motsetning til dette antall telomere flekker var ca. 7 i overlevende ALT, som har smeltet kromosomer (N = 3) 2. Dette resultatet er i overensstemmelse med den forutsigelse at telomere flekker ville være seks i ALT overlevende. Vi konkluderte med at signalstyrken for ALT overlevende var nok til å bli observert.

Telomer-signalet ble colocalized med TALT1 i ALT overlevende, noe som tyder på at TALT1 brukes som kopi mal for telomere i fravær av Telomerase (figur 3). Telomer-signal av ALAT overlevende økt sammenlignet med foreldre TRT-en (ok410) mutant, som indikerer at telomer er robust opprettholdt i ALAT overlevende uten telomerase (figur 4). Signalet til PNA-proben var større enn den til digoxigenin-merket probe (figur 4). Designing prober med PNA oligomer kan resultere i sterkere signal enn digoxigenin-merking.

Figur 1
Figur 1:. Oversikt over FISH Experiment egg høstes ved bleking voksne ormer og fikseres i 2% PFA på en polylysin-belagt lysbilde. Prøver blir fryse-sprukket og permeabilisert med metanol og aceton for sonde penetrasjon. Probene blir tilsatt til prøven og hybridisert over natt ved 37 ° C. Digoksigenin-merket probe blir detektert ved immunfluorescens. Prøvene ble fotografert og deretter quantified av bildeanalyse programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Telomere fisk i dissekert Gonader (A) telomere (rød) ble oppdaget av Cy3-PNA- (TTAGGC) tre i den distale spissen av gonadene (pilspiss). Intensiteten av ALT overlevende er større enn den for TRT-1 (ok410). Z-stack bildet ble gjengitt med maksimal projeksjon. Atomkjerner angitt med hvit pil blåses opp i øvre høyre hjørne. Scale bar, 10 mikrometer. (B) Antall telomere flekker per kjerne i pachytene scenen ble målt ved visuell inspeksjon. N = 50. Feilfelt, SEM. Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Telomere og TALT1 FISH i Embryoet Et representativt bilde av telomerer (rød) og TALT1 (grønn) FISH. Telomerer og TALT1 probe ble hybridisert til embryoer samtidig. DNA ble motfarget med DAPI (blå). Scale bar, 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Kvantifisering av fiskedata telomere og TALT1 intensitet fra figur 3 ble kvantifisert i bildeanalyse programvare (en gave fra Dr. Peter Lansdorp). Hvert sted ble kvantifisert med terskelnivå over 15 for å utelukke ikke-spesifikk bakgrunn. T-test ble anvendt for å evaluere statistisk signifikans. (* P <0,001). Feil barer, SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den største fordelen med vår protokoll er enkelheten av fremgangsmåten uten merkbar skade på morfologi av cellestrukturen. Flere trinn var optimalisert for C. elegans FISH i denne protokollen. De kritiske trinn for vellykket FISH inkluderer merking av prober, fiksering av embryoer og penetrasjon. Digoxigenin-dUTP merking metoden gir en lett-å-bruke merking metode ved PCR eller nick-oversettelse. For å markere lang målsekvens, er nick-oversettelse foretrukket. I dette tilfellet bør probene være spaltet med passende restriksjonsenzym for å lette penetreringen av prober. Biotin-dUTP tag anbefales ikke fordi biotin-merkede prober produsert overskytende beløp av bakgrunnssignal fra cytoplasma. Selv endogent biotin blokkering reagens er kommersielt tilgjengelig, ble det ikke forsøkt.

Denne protokollen bruker isolerte embryoer for å øke tettheten av celler for effektiv kvantifisering. Tarm kjerner av C. elegans er store i størrelse og er polyploid, som bidrar overdreven antallet og intensiteten til telomere flekker i forhold til resten av somatiske kjerner. Av denne grunn er hel orm ikke egnet for kvantifisering av telomerer i C. elegans. I motsetning til dette, embryoer er egnet for evaluering av telomer-lengden som de gir homogene celler uten virkning av polyploidi.

Denne protokollen bruker 2% PFA fiksativ som fungerte fint for telomere FISH. Selv om glutaraldehyd er rapportert å resultere i en lavere bakgrunn signal og hardere fiksering i RNA in situ hybridisering, glutaraldehyd øket betraktelig autofluorescens 18. Det overskytende bakgrunn ble ikke opphevet etter behandling med natriumborhydrid, noe som reduserer ureagert aldehyd gruppe. Av denne grunn ble glutaraldehyd ikke brukt. Dersom signal-til-støy-forholdet er lavt, kan tidspunktet for prehybridiserings forlenges opp til flere timer for å blokkere ikke-spesifikke bindingsseter. IDessuten kan tiden for stringent vask bli øket for å redusere bakgrunnsnivå.

Farging teknikk C. elegans kan være en utfordring for riktig permeabilization behandling. C. elegans inneholder tykk cuticular exoskeleton som hemmer inntrengning av antistoffer og sonder. Tradisjonell antistoffarging fremgangsmåte omfatter behandling av kollagenase, noe som krever mye tid og optimaliseringsprosessen. Den enzymatiske penetrasjon metoden også skader morfologi av ormer i utveksling av penetrasjon effektivitet. Fryse-sprekk og metanol-aceton-behandling ble anvendt for å lette gjennomtrengning probe. Freeze-sprekk er enkle og raske i forhold til kitinase eller yatalase behandling 19. Dehydrering eller rehydrering av metanol-serien synes ikke å påvirke kvaliteten på fisken. Disse trinnene ble forenklet i denne protokollen. Selv om det ble rapportert at proteinase K-fordøyelse var nødvendig for RNA in situ hybridisering19, åpenbare forskjell ble ikke observert mellom telomere FISH resultater med og uten proteinase K-behandling. I tillegg, fryse-cracking av embryoer gitt en lett-å-bruke fremgangsmåten for visualisering av mange celler samtidig på en enkelt fokusplanet for stor kvantitativ analyse.

Ved hjelp av PNA-proben, ble telomere signal signifikant økt sammenlignet med den som oppnås med en DNA-probe. Dette kan skyldes høyere bindende affinitet for sin komplementære mål og sin mindre størrelse (3 gjenta sammenlignet med 4 gjenta). Fluorescensmerkede PNA probe også direkte bindes til målet, noe som reduserer påfølgende trinn. Sterk affinitet opprettholdt i de følgende immunfluorescens måten gjør det post-fiksering unødvendig, noe som kan unngå bakgrunnsstøy.

Men noen begrensninger finnes i denne teknikk. Den ene er at den permeabiliseringen trinn svakt skader morfologien på bekostning av effektiv sonde penetrasjon. Behandling av gonades og embryoer med metanol og aceton forvrengt sirkularitet av kjerner sammenlignet med ubehandlet kontroll. For eksperimenter som krever perfekt bevart morfologi, bør annen permeabilization metoden forsøkes. Et annet er at den telomere signalet blir kvantifisert i vilkårlige enheter. Dette er hovedsakelig på grunn av variasjoner mellom uavhengige eksperimenter. Ribosomalt DNA kan bli betraktet som en intern kontroll for å normalisere hver prøve. Flere nyttige metoder kan finnes i referanse 20.

En enkel telomer FISH protokollen er beskrevet her, noe som krever minimale trinn. Mange trinn er redusert for analyse av store mengder embryoer. Imidlertid kan ytterligere modifikasjon gjøres for sterkere signal, slik som chitinase behandling for gjennomtrengning, og andre nye forsøk. I kombinasjon med celledyrkningsmetode, kan super-bilde oppløsning være mulig. Denne protokollen kan bidra til å oppdage nye telomere vedlikehold mekanisme i C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PNA probe PANAGENE custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments Roche 11207741910 use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP Roche 11573152910
Bovine serum albumin SIGMA-ALDRICH A-7906
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P-6148 prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield Vector Laboratories H-1200
Hybridizaiton solution 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution 2x SSC, 50% formamide
Formamide BIONEER C-9012 toxic
Methanol Carlo Erba
Acetone Carlo Erba
Heparin SIGMA-ALDRICH H3393 make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate SIGMA-ALDRICH 67578
10x PBS For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST 1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20 SIGMA-ALDRICH P-2287 Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) SIGMA-ALDRICH P-8920 prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50 GE healthcare 27-53310-01
20x SSC To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT 2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns Cosmo genetech CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN Dukssan pure chemicals 8AV721
Multi-well glass slide MP biomedicals 96041205
Nematode growth media To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole SIGMA-ALDRICH 196142
Razor Feather blade No. 11
Rnase A Enzynomics
BSA SIGMA-ALDRICH A7906
Confocal microsope Zeiss LSM 510 EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software  Dr. Peter Landsdorp TFL-telo http://www.flintbox.com/public/project/502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
  3. Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
  4. Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
  5. Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
  6. Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
  7. Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
  8. Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
  9. Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
  10. Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
  11. Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
  12. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
  13. Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
  16. Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
  17. Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
  18. Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
  19. Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
  20. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).

Tags

Molecular Biology telomere alternativ forlengelse av telomerer (ALT) fluorescens Colocalization celledeling immunfluorescens PNA sonder bildebehandling kvantifisering
Observasjon og Kvantifisering av telomere og repeterende sekvenser med fluoresens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH) med PNA prober i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seo, B., Lee, J. Observation and… More

Seo, B., Lee, J. Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (114), e54224, doi:10.3791/54224 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter