Introduction
Telômeros protege as extremidades cromossômicas de fusão e degradação aberrante. dos telómeros de mamífero é composto de repetições rico em G hexaméricas, TTAGGG, e complexos shelterin. A sequência do telómero repetição da nemátodo é semelhante aos dos mamíferos (TTAGGC). A maior parte dos eucariotas utilizam telomerase para adicionar repetições telómeros para as suas extremidades cromossómicas. No entanto, de 10 - 15% de células de cancro utilizam mecanismo independente da telomerase, conhecido como Alongamento Alternativa dos telómeros (ALT) 3. Anteriormente, relatou que repete a telómeros e suas sequências associados, nomeados como tAlt, foram amplificados nos telômeros de linhas mutantes de telomerase que sobreviveram a esterilidade crítica 2.
Comprimento dos telómeros foi medida por PCR quantitativo, ou por transferência de Southern, o que proporciona o comprimento médio do total de telómeros 4,5,6,7. Contagem lida da repetição dos telômeros em dados de sequenciamento do genoma inteiro é também um indicador do total conteúdo dos telômeros 8. embora Single telômero Comprimento Análise (STELA) poderia fornecer o comprimento de uma única telômeros, ele não pode fornecer informação espacial dos telômeros 9. Enquanto POT-1 :: proteína repórter mCherry fornece a informação espacial dos telômeros in vivo, não pode representar comprimentos de telômeros de cadeia dupla, como POT-1 é um single-filamento de proteína 10 de ligação dos telômeros.
Embora os métodos acima mencionados fornecer as informações média de seqüências repetitivas, hibridização fluorescente in situ (FISH) permite observar a quantidade e padrão espacial das seqüências individuais de interesse em uma escala cromossômica. Em vez da purificação do ADN, os tecidos ou as células são fixadas para preservar a informação espacial nativa em peixes. Assim, o peixe é uma ferramenta quantitativa e qualitativa para a observação de sequências de repetição individuais, como repete a telómeros.
Este protocolo fornece um método eficiente para a detecção simultânea de ambos telomeros e outras repete com base em melhorias de métodos anteriormente descritos 11,12. C. elegans larvas ou adultos são organismo multicelular com células altamente diferenciadas. A heterogeneidade das células impede-se na análise quantitativa de um grande número de pontos a telómeros. Para maximizar o número de células analisadas, os embriões são isolados e espalhe sobre as lâminas revestidas com polilisina para os peixes. Além disso, este protocolo pode também ser combinada com a imunofluorescência.
Como uma prova de que o protocolo funciona, mostram que é possível observar e quantificar duas sequências repetitivas diferentes. sonda de DNA contra TALT1 foi gerado com simples PCR incorporando digoxigenina-dUTP. Em seguida, esta sonda TALT1 e sonda PNA telômero marcados com fluorescência foram hibridizadas simultaneamente. Subsequentemente, digoxigenina foi detectada por métodos de imunofluorescência canónicas. Apresentamos aqui as imagens representativas onde TALT1 colocalized com o telômero no TRT-1
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Protocol
1. As sondas de marcação com digoxigenina-dUTP por PCR
- Realizar etiquetagem 10x PCR com mistura de dNTP contendo digoxigenina-dUTP como previamente descrito 13.
- Purificar produto de PCR com a purificação spin-coluna de acordo com as instruções do fabricante.
- Se a sonda é mais curto do que 200 pb, remover livre digoxigenina-dUTP por cromatografia em coluna de spin-a partir da mistura reaccional em vez de purificação de spin-coluna.
2. Preparar Slides polilisina revestido
Nota: O procedimento completo demora cerca de 2 horas. A maior parte dos passos são realizados à temperatura ambiente excepto para o passo de secagem.
- Limpeza das lâminas
- Colocar as lâminas em um recipiente plástico e enxaguar as lâminas brevemente com água destilada (DW). Remover a água e encher o recipiente com DW contendo 1% de limpa-vidros.
- Agita-se as lâminas durante 15 minutos a 50 rpm à temperatura ambiente (TA). Lavar as lâminas com DW 3vezes durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
- Lavam-se as lâminas com etanol a 70% durante 15 min com agitação. Descartar 70% de etanol e colocar as lâminas sobre um bloco seco de 65 ° C e secar ao ar durante 15 min.
- polilisina revestimento de lâminas de vidro multi-poços
Nota: revestimento polilisina de vidro corrediça é um passo importante, uma vez que prevê a adesão da amostra durante todo o processo de coloração. Mal lâmina revestida irá resultar na perda de amostra.- Dilui-se a solução stock de polilisina a 0,01% (w / v) em água destilada. Adicionar 20 ul da diluído a 0,01% (w / v) de polilisina para os poços de uma lâmina de vidro limpa.
- Incubar a lâmina de vidro durante 5 min à TA.
- Colocar as lâminas em um bloco seco a 65 ° C e ar seco durante 1 h.
- Armazenar os slides polilisina na caixa livre da poeira.
3. Fixação de Worms na lâmina de vidro (Figura 1)
- Preparando embriões para FISH
Nota: vermes Colheita antes de tudo tele comida bacteriana é consumida por assistindo os meios de crescimento sob o microscópio. A fome reduz a produção de ovos de vermes adultos e aumenta a eclosão dos ovos. Métodos pormenorizados são descritos em 14,15.- Cresça os vermes em 50 mM de placa de Petri de acordo com métodos padrão 14.
- Depois de toda a comida bacteriana é consumido, cortar o ágar no trimestre com uma espátula. Esterilizar a espátula antes de cortar para evitar a contaminação.
- Coloque todo o pedaço de agar na 100 milímetros meios de crescimento de nematóides (NGM) placa. Vire a peça agar de cabeça para baixo para os vermes para alcançar a comida bacteriana fresca.
- Após 48 a 72 horas, recolher os vermes com tampão M9. Adicionar 3 - 5 ml de tampão M9 na placa NGM. Pipeta tampão M9 na superfície de NGM para lavar os vermes.
- Recolhe-se o líquido com vermes e adicionar a um tubo de 15 ml.
Nota: Se houver resíduos agar após a colheita, centrifugar os vermes em uma solução de sacarose 30%. Enquanto os detritos são sedimentadas, vermes flutuar sobrea superfície. - Adicionar tampão M9 para tornar-se o volume para 15 ml. Agregar as minhocas por centrifugação a 300 xg durante 3 min e remover a maior parte do tampão M9. Repita este passo mais 2 vezes.
Nota: Se os vermes ainda estão flutuando após a centrifugação, defina o nível de freio da centrífuga para o valor = 1. - Aspirar tampão M9. Adicionar solução de branqueamento para os vermes. Por 0,5 ml de vermes, adicionar 6,5 ml de DW, 2 ml de hipoclorito, 1 mL de 5 M KOH.
- Incubar os vermes com agitação à TA durante 3 min a 50 rpm. vermes vortex durante 15 segundos para cortar mecanicamente os vermes e expor os ovos.
- Observe o tubo sob um microscópio de dissecção durante o clareamento. Certifique-se de que os vermes são cortadas ao meio e os ovos são liberados. Quando a maior parte do corpo adulto é dissolvido, adicione tampão M9 para tornar-se o volume para 15 ml.
- Centrifugar a 300 xg durante 3 min. Aspirar a maior parte da M9 e adicionar tampão M9 fresco para fazer aumentar o volume para 15 ml. etapa de lavagem Repita 3 vezes.
Nota:Evitar o uso de quantidade excessiva de vermes, em que dificultam o processo de branqueamento. Manter o tempo de reacção total a menos de 8 minutos até a lavagem. Over-branqueada ovos produzem forte autofluorescência. - Adicionar solução salina tamponada com fosfato de polissorbato-20 (PBST) até 200 uL e 200 uL de paraformaldeído a 4% (PFA) para tornar a 2% de PFA.
Atenção: Desde PFA é cancerígeno, usar vestuário de protecção, luvas e proteção ocular antes de utilizar PFA. - Adicionar 40 ul de os ovos em 2% de PFA para o poço de polilisina revestida slides.
- Colocar as lâminas numa câmara húmida e incubar durante 15 min à TA. Feche a câmara úmida logo após os slides são colocados dentro.
Nota: Os ovos para liquidar o fundo de slides enquanto está a ser corrigido.
- Preparando gônadas dissecados para peixes
- Colheita vermes adultos crescidos em 50 mm placa NGM pipetando 1 ml de tampão M9. vermes colheita antes de alimentar bacteriana está esgotada.
- Lave os vermes a partir de qualquer wit bactériash tampão M9, 2 vezes.
Nota: as bactérias residuais podem interferir com as gônadas dissecados de degola para lâminas de polilisina revestido. - Agregar as minhocas por centrifugação a 300 x g. Remover M9 e transferir os vermes à placa NGM vazia por micropipeta.
- Adicionar 30 mL de tampão M9 contendo levamisole 2 mM em um poço de polilisina tratada slide.
- Adicionar 500 ul de tampão M9 para um tubo de 1 ml. Utilize este tampão para transferir os vermes com uma pipeta boca.
- Encher a ponta da pipeta de boca com tampão M9 pela colocação de um capilar no tubo 1 ml contendo o tampão M9.
- Sob microscópio de dissecação, coloque a ponta da pipeta na boca apenas na frente da cabeça do verme adulto e arraste pipeta de boca de modo que a cabeça de vermes entra na pipeta de boca. Uma vez que a cabeça de vermes entra a ponta, todo o corpo de verme serão atraídos para a ponta.
- Transfira os vermes para o slide polilisina revestido usando pipeta boca.
- Usando uma navalha, corte def a cabeça ou a ponta da cauda de vermes no slide. Quando o worm é cortado, as gônadas irá aparecer. Gônadas vai ficar com os slides.
- Preparar pelo menos 30 vermes em um poço. Mais poços pode ser usado por mais 30 vermes.
- Coloque a lâmina na câmara húmida e aspirar o tampão de M9 com pipeta de boca.
- Fixar a amostra por adição de 20 ul de 2% de PFA à TA durante 15 minutos em câmara húmida.
4. Fixação e permeabilização
- Coloque um bloco de alumínio em gelo seco e armazená-lo em um congelador (-80 ° C). metanol loja e acetona em -20 ° C.
- Após PFA passo de fixação 3.1.15 ou 3.2.11, remova o fixador usando micropipeta deixando ~ 5 mL do fixador.
- Coloque outro slide polilisina revestido na lâmina de amostra. Remover o fixador com toalha de papel, se a solução for excessiva. Não mova os slides uma vez que eles estão presos juntos.
- Congelar as lâminassobre o bloco de alumínio de pelo menos 15 min.
Nota: As amostras podem ser armazenadas durante pelo menos 2 - 3 dias. - Enquanto os slides estão sendo congelados, coloque os frascos contendo metanol frio e acetona em gelo.
- Tome os slides fora e torcê-los a congelar-rachar a amostra. Descartar a corrediça superior. mergulhar imediatamente o slide para o metanol gelado durante 5 min.
- Transferir as lâminas para acetona arrefecida em gelo durante 5 min.
- Lavar as lâminas 3 vezes com PBST, durante 5 min para remover fixador residual. Avance para o próximo passo ou armazenar as lâminas em etanol a 100% a 4 ° C.
Nota: As amostras podem ser armazenadas durante pelo menos 2 - 3 dias.
5. Hibridação de células fixadas
- Adicionar 20 ul de solução de RNase (PBST contendo 10 ug / ml de RNase A). Incubar a lâmina na câmara húmida a 37 ° C durante 1 h.
- Lava-se a corrediça duas vezes em solução salina e 2x com citrato de sódio polissorbato-20 (2x SSCT) durante 15 min cada.
- Adicionar 20ul de solução de hibridação e o colocar em câmara húmida a 37 ° C incubadora. Depois de 1 h, remover a solução de hibridação por pipetagem.
- Antes de remover solução de hibridização, preparar a sonda. Se a sonda é DNA de cadeia dupla, desnaturar as sondas por aquecimento a 95 ° C durante 5 min num bloco seco. Após o aquecimento, esfriar a sonda brevemente gelo.
- Adicionar 10 ul de solução de hibridação contendo sonda com a amostra. Para sonda de PNA, a concentração de uso a uma razão de 1: 2000 e de uma sonda marcada com Dig, concentração de uso a uma razão de 1: 200. Cobrir a amostra com tampa de vidro.
- Coloque uma toalha de papel embebido com água sobre o bloco de aquecimento (80 ° C). Coloque uma tampa de caixa de plástico no bloco de aquecimento para preservar a umidade e temperatura.
- Depois de a temperatura do bloco de aquecimento se estabilizou (a 80 ° C), colocar a lâmina de amostra sobre a toalha de papel e aquecida cobrir as amostras com a tampa da caixa de plástico. Desnaturar a amostra durante 3 minutos.
- IncUbate as lâminas em câmara úmida durante a noite a 37 ° C.
6. lavagens e Imunofluorescência
- Aquecer a solução de lavagem de hibridação (SSC 2x, 50% de formamida) a 37 ° C.
- Lava-se a amostra em duas vezes o PBST à TA durante 5 min. Retire a tampa de vidro.
- Lava-se a amostra na solução de lavagem de hibridação a 37 ° C durante 30 min.
- Lave a lâmina de amostra em PBST 3 vezes à temperatura ambiente. Nota: Execute todos os passos subsequentes na câmara húmida à temperatura ambiente.
- Adicionar 20 ul de solução de bloqueio e incubar durante 1 h à TA na câmara húmida.
- Remoção da solução de bloqueio e adicionar solução de anticorpo conjugado com FITC anti-digoxigenina (1: 200) durante 3 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
7. Montagem e Observação
- Lava-se a lâmina de amostra com PBST 2 vezes durante 15 minutos cada.
- Adicionar 10 ul de solução de montagem com DAPI. Coloque a tampa de vidro e pressione suavemente. Remova qualquer excesso de soluçãocom uma toalha de papel.
- Para evitar a evaporação da solução de montagem, selar as bordas da tampa de vidro com unha polonês.
- Observar ao microscópio confocal. Excluir embriões com elevado ruído de fundo. Concentre-se em um campo com 4 - 20 núcleos.
- Tome imagens de acordo com as instruções do fabricante com lente objetiva de 100X.
Nota: Excite amostra com 405 a laser nm para DAPI, com 555 a laser nm para Cy3, com 488 a laser nm para FITC.
8. Quantificação dos Telómero sinal
Nota: A quantificação foi realizada tal como anteriormente descrito 16. Todas as imagens que estão a ser comparadas deve ser tomado com mesma configuração, incluindo o tempo de exposição e uma fonte de luz.
- Exportar a imagem em formato .tif.
- Baixar e instalar o software de análise de imagem.
- Executar o software de análise de imagem e clique no botão Concordo.
- Clique no botão aberto. Abra as imagens com os peixes dos telômeros, clicando duas vezes no arquivo de imagem.
- Clique[Editar] - [região de processamento seleção], seleccione uma região de interesse por clique com o botão esquerdo e arrastando. Excluir toda a coloração não específica.
- Clique [medida] - [manchar densidades ópticas], selecione o canal com o sinal dos telômeros e digite o nome do arquivo para salvar os resultados no arquivo .txt.
Nota: A coluna de resultados estão na seguinte ordem: A fluorescência de ponto, a intensidade da mancha e a área da mancha de fundo. - Copiar os valores e subtrair intensidade da mancha de fundo de fluorescência da mancha. Os valores podem agora ser analisados estatisticamente.
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Representative Results
Foi relatado anteriormente que o sobrevivente ALT pode emergir de mutante telomerase deficiente, TRT-1 (ok410), em baixa frequência, replicando localizada internamente 'Template da ALT' (tAlt) sequências para manutenção dos telômeros 2. Usando sonda PNA, fomos capazes de visualizar os telômeros nas gônadas dissecados (Figura 2A). O sinal dos telômeros fraco foi detectado tanto no TRT-1 (ok410) e sobrevivente ALT. O sinal fuzzy foi sobreposto somente com DAPI, sugerindo que eles podem não ser autofluorescência. Intersticial telômero-like repeat (ITR) é observado de forma consistente no ensaio TRF no estudo da C. elegans telômero 4,10. Considerando a alta especificidade da sonda PNA, que são susceptíveis de ser o ITR dispersos por todo o genoma.
O número de pontos dos telômeros foi de aproximadamente 9 por núcleo pachytene no TRT-1 (ok410).No estudo anterior, 12 focos foi observado por POT-1 :: proteína mCherry, que se liga ao DNA dos telômeros em cadeia simples 10. Máximo de 24 focos por núcleo foi observada nos embriões de tipo selvagem 17. O resultado sugere que o método de repórter mCherry é melhor para o experimento em que o número de telómeros deve ser contado. No entanto PNA FISH é capaz de detectar o DNA do telômero de cadeia dupla, bem como DNA dos telômeros de cadeia simples em proporção com o comprimento dos telômeros. Em contraste, o número de pontos telómeros foi de aproximadamente 7 em sobrevivente ALT, que se fundiram cromossomas (N = 3) 2. Este resultado é consistente com a previsão de que pontos telomere seria sobrevivente 6 em ALT. Concluiu-se que a intensidade do sinal de ALT sobrevivente foi suficiente para ser observado.
sinal dos telómeros foi co-localizada com o sobrevivente TALT1 em ALT, sugerindo que TALT1 é utilizado como molde para a cópia do telómero na ausência de teloda polimerase (Figura 3). Telomere sinal de sobreviventes de ALT aumentaram em comparação com a de TRT-1 (ok410) mutante parental, indicando que é robusta dos telómeros mantida em sobreviventes de ALT sem telomerase (Figura 4). O sinal da sonda de PNA era maior do que a sonda marcada com digoxigenina (Figura 4). Projetando sondas com oligómero de ANP pode resultar em sinal mais forte do que digoxigenina-rotulagem.
Figura 1:. Visão de FISH Experiment ovos são colhidos pelo branqueamento vermes adultos e fixadas em 2% PFA em uma lâmina revestida de polilisina. As amostras são congelar-rachada e permeabilizadas com metanol e acetona para a penetração da sonda. As sondas são adicionadas à amostra e hibridados durante a noite a 37 ° C. sonda de digoxigenina marcado é detectado por imunofluorescência. As amostras são, em seguida, representada por imagem e quantified pelo software de análise de imagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. PEIXES Telómero nas gônadas Dissecadas (A) Telómero (vermelho) foi detectada por Cy3-PNA- (TTAGGC) 3 na ponta distal de gónadas (ponta de seta). A intensidade de sobrevivente ALT é maior do que a de TRT-1 (ok410). imagem Z-stack foi rendida com projeção máxima. Núcleos indicados pela seta branca é soprada para cima no canto superior direito. Barra de escala, 10 | im. (B) Número de pontos dos telômeros por núcleo em fase pachytene foi medida por inspeção visual. N = 50. As barras de erro, SEM. Por favor clique aqui para veruma versão maior desta figura.
Figura 3:. Telomere e TALT1 FISH nos embriões Uma imagem representativa do telômero (vermelho) e TALT1 FISH (verde). Telômero e sonda TALT1 foram hibridadas com embriões simultaneamente. DNA foi contrastado com DAPI (azul). Barra de escala, 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Quantificação de FISH Dados Telomere e intensidade TALT1 na Figura 3 foram quantificadas no software de análise de imagem (uma oferta do Dr. Peter Lansdorp). Cada local foi quantificada com ov nível de limiarer 15 para excluir o fundo não específico. T-teste foi utilizado para avaliar a significância estatística. (* P <0,001). As barras de erro, SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A principal vantagem do nosso protocolo é a simplicidade do processo sem danos visíveis para a morfologia da estrutura celular. Vários passos foram otimizados para C. elegans FISH neste protocolo. Os passos críticos para os peixes de sucesso incluem a rotulagem de sondas, a fixação de embriões e penetração. método de marcação com digoxigenina-dUTP fornece um método de rotulagem de fácil utilização por PCR ou por nick-translation. Para rotular sequência alvo por muito tempo, é o preferido nick-translation. Neste caso, as sondas devem ser digerido com a enzima de restrição apropriada para facilitar a penetração das sondas. Biotina-dUTP tag não é recomendado porque as sondas marcadas com biotina produzido quantidade excessiva de sinal de fundo do citoplasma. Embora reagente biotina endógena de bloqueio encontra-se comercialmente disponível, ele não foi tentada.
Este protocolo utiliza embriões isolados para aumentar a densidade de células para a quantificação eficiente. Núcleos intestinal de C. elegans são grandes em tamanho e são poliplóides, que contribuem número excessivo e intensidade das manchas telomere em comparação com o resto dos núcleos somáticos. Por esta razão, verme todo não é adequado para a quantificação dos telómeros em C. elegans. Em contraste, os embriões são apropriados para a avaliação da duração do telómero que proporcionam células homogéneas, sem efeito de poliploidia.
Este protocolo utiliza 2% PFA fixador que funcionou bem para FISH telômero. Embora o glutaraldeído é relatada como resultando num sinal de fundo inferior e mais difícil a fixação no RNA de hibridação in situ, glutaraldeído aumentou significativamente 18 autofluorescência. Este excesso de fundo não foi abolida após tratamento de boro-hidreto de sódio, o que reduz o grupo aldeído que não reagiu. Por este motivo, não foi utilizado o glutaraldeído. Se a relação sinal-ruído é baixo, tempo de pré-hibridação pode ser estendido até várias horas para bloquear locais de ligação não específicos. DentroAdicionalmente, o tempo de lavagem rigorosas podem ser aumentados para diminuir o nível de fundo.
técnica de coloração em C. elegans pode ser um desafio para o tratamento permeabilização adequada. C. elegans contém exoesqueleto cuticular espesso que inibe a penetração de anticorpos e sondas. método de coloração de anticorpo tradicional envolve o tratamento de colagenase, o que requer um processo muito tempo e optimização. O método de penetração enzimática também prejudica a morfologia dos vermes em troca de eficiência de penetração. Freeze-crack e tratamento de metanol-acetona foi usado para facilitar a penetração da sonda. Congelar-crack é simples e rápido em comparação com quitinase ou yatalase tratamento 19. Desidratação ou reidratação da série de metanol não parecem afectar a qualidade do peixe. Estas etapas foram simplificadas neste protocolo. Embora tenha sido relatado que a digestão com proteinase K foi necessária para o RNA de hibridação in situNão foi observada 19, diferença óbvia entre os resultados dos telômeros peixe com e sem tratamento com proteinase K. Além disso, congelar-cracking de embriões fornecidos um método fácil de usar para a visualização de muitas células simultaneamente em um único plano focal para grandes análise quantitativa.
Ao utilizar sonda de PNA, de sinal dos telómeros foi significativamente aumentada em comparação com o obtido com uma sonda de ADN. Isto pode ser devido a uma maior afinidade de ligação para o seu alvo complementar e a sua dimensão menor (3 repetição comparado com 4 repetição). sonda PNA marcado por fluorescência também se liga directamente ao seu alvo, minimizando etapas subsequentes. forte afinidade mantida nos seguintes passos de imunofluorescência faz com que a pós-fixação desnecessárias, o que pode evitar o ruído de fundo.
No entanto, existem algumas limitações nesta técnica. Uma delas é que o passo de permeabilização ligeiramente a morfologia danos ao custo de penetração de sonda eficiente. Tratamento da gónadas e embriões com metanol e acetona distorcida circularidade de núcleos em comparação com controlo não tratado. Para as experiências que requerem a morfologia perfeitamente preservados, método de permeabilização diferente deve ser tentada. Outra razão é que o sinal de telómeros é quantificado em unidades arbitrárias. Isto é principalmente devido a variações entre experiências independentes. DNA ribossomal pode ser considerada como um controlo interno para normalizar cada amostra. Mais métodos úteis podem ser encontrados na referência 20.
Um protocolo telômero FISH simples é descrito aqui, o que requer etapas mínimas. Muitos passos são reduzidos para a análise de grande quantidade de embriões. Contudo, outra modificação pode ser feita para o sinal mais forte, tal como o tratamento de quitinase para a penetração, e outros ensaios inovadoras. Em combinação com o método de cultura de células, de imagem de super-resolução pode ser possível. Este protocolo pode ajudar a descobrir o novo mecanismo de manutenção dos telômeros em C. elegans.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
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