Introduction
Telomer skyddar kromosomändarna från avvikande fusion och nedbrytning. Däggdjur telomer består av G-rika hexamera upprepningar, TTAGGG och shelterin komplex. Telomeren upprepningssekvens av nematoden är liknande dem i däggdjur (TTAGGC). De flesta eukaryoter använder telomeras för att lägga till telomeren upprepar sina kromosomändarna. Men 10-15% av cancerceller utnyttjar telomeras oberoende mekanism, känd som alternativ Förlängning av Telomerer (ALT) 3. Tidigare rapporterade vi att telomeren upprepar och dess tillhörande sekvenser, namnges som tält, amplifierades i telomererna av telomeras muterade linjer som överlevde kritisk sterilitet 2.
Telomerlängd mättes genom kvantitativ PCR eller Southern blöt, vilket ger genomsnittliga längden av den totala telomerer 4,5,6,7. Läs räkning av telomer upprepa i hela genomet sekvenseringsdata är också en indikator på den totala telomeren innehåll 8. Även om SinGLE telomerlängd Analysis (STELA) skulle kunna ge längden på en enda telomer, kan det inte ge rumslig information om telomerer 9. Medan POT-1 :: mCherry reporterprotein ger den rumsliga information av telomerer in vivo, kan den inte representera längder av dubbelsträngade telomerer, som POT-1 är ett enkelsträngat telomer-bindande protein 10.
Medan ovannämnda metoder ger i genomsnitt information repetitiva sekvenser, fluorescens in situ hybridisering (FISH) gör det möjligt att observera mängden och rumsliga mönster av enskilda sekvenser av intresse på en kromosom skala. Istället för rening av DNA, är vävnader eller celler fast att bevara den naturliga geografisk information i fisk. Således är FISH en både kvantitativ och kvalitativ verktyg för observation av enskilda upprepade sekvenser, såsom telomeren upprepas.
Detta protokoll ger en effektiv metod för samtidig detektion av både telobara och andra upprepningar baserad på förbättringar från tidigare beskrivna metoder 11,12. C. elegans larver eller vuxna är flercellig organism med högt differentierade celler. Heterogenitet celler hindrar på kvantitativ analys av ett stort antal telomeren fläckar. För att maximera antalet celler som analyserats, embryon isoleras och sprids på polylysin-belagda objektglas för fisk. Dessutom kan detta protokoll också kombineras med immunofluorescens.
Som ett bevis på att protokollet fungerar, visar vi att det är möjligt att observera och kvantifiera två olika repetitiva sekvenser. DNA-sond mot TALT1 genererades med enkel PCR införliva digoxigenin-dUTP. Då denna TALT1 sond och fluorescensmärkt telomer PNA prob hybridiserades samtidigt. Därefter digoxigenin detekteras genom kanoniska immunofluorescens metoder. Vi presenterar här de representativa bilder där TALT1 samlokaliserades med telomeren i TRT-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Märkning Prober med digoxigenin-dUTP genom PCR
- Utför PCR märkning med 10x dNTP-blandning innehållande digoxigenin-dUTP som tidigare beskrivits 13.
- Rena PCR-produkten med spinnkolonnrening enligt tillverkarens anvisningar.
- Om sonden är kortare än 200 bp, avlägsna fritt digoxigenin-dUTP med spin-kolonnkromatografi från reaktionsblandningen snarare än spin-reningskolonn.
2. förbereda Polylysin Belagda Slides
Notera: Hela proceduren tar ca 2 h. De flesta av stegen utförs vid rumstemperatur med undantag för torkningssteget.
- Rengöring av objektglasen
- Placera glasen i en plastbehållare och skölj glasen hastigt med destillerat vatten (DW). Avlägsna vattnet och fylla behållaren med DW innehållande 1% glasrengöringsmedel.
- Agitera objektglasen under 15 min vid 50 rpm vid rumstemperatur (RT). Tvätta bilderna med DW 3gånger under 5 min vardera vid RT.
- Tvätta objektglasen med 70% etanol under 15 min med omröring. Kassera 70% etanol och placera glasen på en 65 ° C torr blocket och lufttorka i 15 min.
- Polylysin beläggning av flera brunnar glas
Obs: Polylysin beläggning av objektglas är ett viktigt steg, eftersom det ger prov vidhäftning under hela färgningsproceduren. Dåligt belagda objektglaset kommer att resultera i förlust av provet.- Späd polylysin stamlösningen till 0,01% (vikt / volym) i destillerat vatten. Tillsätt 20 | il av den utspädda 0,01% (vikt / volym) polylysin till brunnarna i en ren glasskiva.
- Inkubera objektglaset under 5 min vid RT.
- Placera objektglasen på en 65 ° C torr blocket och lufttorka under 1 h.
- Förvara polylysin glider i dammfri låda.
3. Fixering av Worms på objektglas (Figur 1)
- Förbereda embryon för FISH
Obs: Harvest maskar innan alla than bakteriell mat konsumeras genom att titta på tillväxtmedier under mikroskop. Svält minskar äggproduktion av vuxna maskar och ökar ägg kläckning. Detaljerade metoder beskrivs i 14,15.- Odla maskar i 50 mm Petriskål enligt standardmetoder 14.
- Efter all den bakteriella mat konsumeras, klippa agar media i kvartalet med spatel. Sterilisera spateln innan du skär för att förhindra förorening.
- Sätta alla bit agar på 100 mm rundmasken tillväxt media (NGM) platta. Vänd agar bit upp och ned för maskarna att nå den färska bakterie mat.
- Efter 48-72 timmar, samla maskar med M9 buffert. Tillsätt 3 - 5 ml M9 buffert på NGM plattan. Pipett M9 buffert på ytan av NGM att tvätta maskar.
- Samla vätskan med maskar och lägga till ett 15 ml rör.
Obs: Om det finns agar skräp efter skörd, centrifugera maskar i en 30% sackaroslösning. Medan skräp pelleteras, maskar flyta påytan. - Lägg M9 buffert för att göra upp volymen till 15 ml. Pelle maskarna genom centrifugering vid 300 xg under 3 min och avlägsna det mesta av M9-buffert. Upprepa detta steg 2 gånger.
Obs: Om maskar fortfarande flytande efter centrifugering, ställa bromsnivå centrifugen att värdera = 1. - Aspirera M9-buffert. Lägg blekningslösning till maskar. Per 0,5 ml av maskar, tillsätt 6,5 ml DV, 2 ml av hypoklorit, 1 ml 5 M KOH.
- Inkubera maskar med gungning vid RT i 3 min vid 50 rpm. Vortex maskar i 15 sekunder för att mekaniskt klippa maskar och exponera ägg.
- Observera rör under en dissektion mikroskop under blekning. Se till att maskar skärs i halvor och ägg frigörs. När det mesta av den vuxna kroppen upplöses, lägga M9 buffert för att göra upp volymen till 15 ml.
- Centrifugera vid 300 xg under 3 min. Aspirera de flesta av M9 och tillföra ny M9 buffert för att göra upp volymen till 15 ml. Upprepa tvättsteg 3 gånger.
Notera:Undvik att använda överdriven mängd maskar, eftersom de hindrar blekningsprocessen. Hålla den totala reaktionstiden är mindre än 8 min tills tvätten. Över-blekt ägg producera starka autofluorescens. - Lägg fosfatbuffrad saltlösning med polysorbat-20 (PBST) upp till 200 l och 200 pl 4% paraformaldehyd (PFA) för att göra 2% PFA.
Varning: Eftersom PFA är cancerframkallande, bära skyddskläder, handskar och ögonskydd innan du använder PFA. - Tillsätt 40 | il av äggen i 2% PFA på brunnen av polylysin belagd slid.
- Placera objektglasen i en fuktkammare och inkubera i 15 min vid RT. Stäng den fuktiga kammaren direkt efter bilderna är placerade inuti.
Notera: Äggen sedimentera till botten av sliden samtidigt är fixerad.
- Förbereda dissekerade gonader för fisk
- Skörd vuxna maskar som odlas på 50 mm NGM platta genom att pipettera 1 ml M9 buffert. Harvest maskar innan bakteriell mat är slut.
- Tvätta maskar från alla bakterier with M9 buffert, 2 gånger.
Obs: Rest bakterier kan störa de dissekerade gonaderna fastnar polylysin belagda diabilder. - Pelle maskarna genom centrifugering vid 300 x g. Ta M9 och överföra maskar till den tomma NGM plattan genom mikropipett.
- Tillsätt 30 pl M9 buffert innehållande 2 mM levamisol på en brunn med polylysin behandlade objektglaset.
- Tillsätt 500 pl av M9-buffert till en 1 ml-rör. Använd denna buffert att överföra maskar genom munnen pipett.
- Fylla spetsen på mun pipetten med M9-buffert genom att placera en kapillär i en ml rör innehållande M9-buffert.
- Enligt dissekera mikroskop, sätta spets mun pipett precis framför huvudet på vuxna masken och dra mun pipett så att huvudet av maskar kommer in i munnen pipett. När chefen för maskar kommer in i spetsen, kommer hela kroppen av masken dras in i spetsen.
- Överför maskar till polylysin belagda bilden med hjälp av mun pipett.
- Med hjälp av en rakkniv, skär avf huvudet eller spetsen på svansen av maskar på objektglaset. När masken skärs kommer gonaderna poppa ut. Gonader fastnar på bilderna.
- Förbereda minst 30 maskar i en brunn. Fler brunnar kan användas under ytterligare 30 maskar.
- Sätt bilden i fuktig kammare och aspirera av M9 buffert med mun pipett.
- Fixera provet genom tillsats av 20 | il av 2% PFA vid RT under 15 min i fuktkammare.
4. Fixering och Permeabilization
- Placera en aluminiumblock på torris och förvara den i en frys (-80 ° C). Store metanol och aceton i -20 ° C.
- Efter PFA fixering steg 3.1.15 eller 3.2.11, ta bort fixativ hjälp av mikropipett lämnar ~ 5 pl av fixativ.
- Annorlunda polylysin belagd glida på provglaset. Avlägsna fixativet med pappersduk om lösningen är överdriven. Flytta inte bilderna när de sitter ihop.
- Frysa objektglasenpå aluminiumblocket under minst 15 min.
Notera: Proverna kan förvaras i minst 2 - 3 dagar. - Medan bilderna håller på att frysas, sätta burkarna innehåller kall metanol och aceton på is.
- Ta bilderna ut och vrida dem att fryst knäcka provet. Kassera den övre sliden. Omedelbart blöt bilden i iskall metanol under 5 minuter.
- Överför objektglasen till iskall aceton under 5 min.
- Tvätta bilderna 3 gånger med PBST under 5 min för att avlägsna kvarvarande fixativ. Fortsätt till nästa steg eller lagra bilder i 100% etanol vid 4 ° C.
Notera: Proverna kan förvaras i minst 2 - 3 dagar.
5. Hybridisering av fixerade celler
- Tillsätt 20 | il RNas-lösning (PBST innehållande 10 | ig / ml RNas A). Inkubera objektglaset i fuktig kammare vid 37 ° C under 1 timme.
- Tvätta bilden två gånger i 2x saltlösning och natriumcitrat med polysorbat-20 (2x SSCT) under 15 minuter vardera.
- tillsätt 20il hybridiseringslösning och sätta den fuktiga kammaren i 37 ° C inkubator. Efter en timme, ta bort hybridiseringslösningen genom pipettering.
- Innan du tar bort hybridisering lösning, förbereda sonden. Om sonden är dubbelsträngat DNA, denaturera proberna genom uppvärmning vid 95 ° C under 5 min på en torr block. Efter uppvärmning, kyla sonden på is kort.
- Tillsätt 10 | il hybridiseringslösning innehållande prober till provet. För PNA-sond, tillåtna koncentration vid ett förhållande av 1: 2000 och för dig-märkt sond, tillåtna koncentration vid ett förhållande av 1: 200. Täck provet med täckglaset.
- Sätta en pappershandduk indränkt med vatten på värmeblock (80 ° C). Sätt en plastlådans lock på värmeblocket för att bevara fukt och temperatur.
- Efter det att temperaturen hos värmeblocket har stabiliserats (till 80 ° C), placera provet glida på den uppvärmda pappershandduk och täcka proven med plastlådans lock. Denaturera provet under 3 minuter.
- incUbate glasen i en fuktig kammare över natten vid 37 ° C.
6. Tvättar och Immunofluorescens
- Värma upp hybridisering tvättlösning (2 x SSC, 50% formamid) till 37 ° C.
- Tvätta provet i PBST två gånger vid RT i 5 min. Ta bort täckglaset.
- Tvätta provet i hybridisering tvättlösning vid 37 ° C under 30 min.
- Tvätta provet objektglaset i PBST 3 gånger vid RT. Obs: Utför alla efterföljande steg i fuktig kammare vid RT.
- Tillsätt 20 | il blockeringslösning och inkubera under 1 h vid RT i fuktig kammare.
- Avlägsna blockeringslösning och tillsätt FITC-konjugerad anti-digoxigenin-antikropp-lösning (1: 200) under 3 h vid RT eller över natten vid 4 ° C.
7. Montering och miljöövervakning
- Tvätta provet objektglaset med PBST 2 gånger under 15 min vardera.
- Tillsätt 10 pl av monteringslösning med DAPI. Sätt täckglaset och tryck försiktigt. Ta bort överskottslösningmed en pappershandduk.
- För att förhindra avdunstning av monteringslösning, försegla kanterna på täckglaset med nagellack.
- Provet i konfokalmikroskop. Uteslut embryon med hög bakgrund. Fokus på ett fält med 4 - 20 kärnor.
- Ta bilder enligt tillverkarens anvisningar med 100X objektiv.
Obs: Excite prov med 405 nm laser för DAPI, med 555 nm laser för Cy3, med 488 nm laser för FITC.
8. Kvantifiering av Telomer Signal
Obs: Kvantifiering gjordes som beskrivits tidigare 16. Alla bilder som ska jämföras ska tas med samma inställning inklusive exponeringstid och ljuskälla.
- Exportera bilden i TIF-format.
- Ladda ner och installera mjukvara för bildanalys.
- Utför bildanalysmjukvara och klicka överens knappen.
- Klicka på knappen Öppna. Öppna bilder med telomer FISH genom att dubbelklicka på bildfilen.
- Klick[Redigera] - [välj bearbetning region], välj område av intresse genom att vänsterklicka och dra. Uteslut alla icke-specifik färgning.
- Klicka på [åtgärd] - [spot optiska densiteter], välja kanal med telomer signal och ange filnamnet för att spara resultaten i .txt-fil.
Obs: kolonn av resultaten är i följande ordning: Fluorescens av fläck, bakgrundsintensiteten för fläcken och området av plats. - Kopiera värdena och subtrahera bakgrundsintensitet utgångspunkt fluorescens plats. Värdena kan nu analyseras statistiskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det har tidigare rapporterats att ALT överlevande kan ta sig ur telomeras-mutant, TRT-1 (ok410), i låg frekvens genom att replikera internt lokaliserad "mall av ALT" (tält) sekvenser för telomer underhåll 2. Med hjälp av PNA-sond, kunde vi visualisera telomerer i dissekerade könskörtlarna (figur 2A). Den svaga telomeren signal detekterades både i TRT-1 (ok410) och ALT överlevande. Den statistiska signalen lappade endast med DAPI, vilket tyder på att de inte kan vara autofluorescens. Interstitiell telomer-liknande upprepningen (ITR) är genomgående observeras i RF-analysen i studien av C. elegans telomeren 4,10. Med tanke på hög specificitet PNA-sond, kommer de sannolikt att ITR spridda över hela genomet.
Antalet telomeren fläckar var cirka 9 per pachytene kärna i TRT-1 (ok410).I den tidigare studien 12 foci observeras av POT-1 :: mCherry protein, som binder till enkelsträngat telomer-DNA 10. Högst 24 härdar per kärna observerades i vild typ embryon 17. Resultatet tyder på att mCherry reporter metod är bättre för experimentet där antalet telomerer ska räknas. Emellertid PNA FISH kan detektera dubbelsträngad telomer-DNA såväl som enkelsträngat telomer-DNA i proportion till telomerlängd. Däremot var antalet telomeren fläckar var cirka 7 i ALT överlevande, som har sammansmält kromosomer (N = 3) 2. Detta resultat är i linje med den prognos som telomeren fläckar skulle vara 6 i ALT överlevande. Vi drog slutsatsen att signalstyrkan i ALT överlevande var tillräcklig för att följas.
Telomer-signal samlokaliserades med TALT1 i ALT överlevande, vilket tyder på att TALT1 används som kopia templat för telomer i frånvaro av telomerase (Figur 3). Telomer signal ALAT överlevande ökat jämfört med den hos föräldra TRT-1 (ok410) mutant, vilket tyder på att telomer är robust hålls i ALT överlevande utan telomeras (Figur 4). Signalen av PNA proben var större än den för digoxigenin-märkt prob (figur 4). Utforma prober med PNA-oligomer kan resultera i starkare signal än digoxigenin-märkning.
Figur 1:. Översikt över FISH Experiment ägg skördas genom blekning vuxna maskar och fixeras i 2% PFA på en polylysin-belagd bild. Prover frys knäckt och permeabiliserades med metanol och aceton för sondpenetration. Prober tillsättes till provet och hybridiserades över natten vid 37 ° C. Digoxigenin-märkt prob detekteras genom immunofluorescens. Proverna avbildas och därefter quantified av bildanalysmjukvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Telomer FISH i dissekerade Könskörtlar (A) Telomer (röd) detekterades genom Cy3-PNA- (TTAGGC) 3 i den distala spetsen av gonader (pilspets). Intensiteten av ALT överlevande är större än den för TRT-1 (ok410). Z-stack bilden återges med maximal projektion. Kärnor indikeras av vit pil blåses upp i det övre högra hörnet. Skalstock, 10 | j, m. (B) Antal telomeren fläckar per kärna i pachytene skede mättes genom visuell inspektion. N = 50. Felstaplar, SEM. Klicka här för att seen större version av denna siffra.
Figur 3:. Telomere och TALT1 FISH i Embryon En representativ bild av telomer (röd) och TALT1 (grön) FISH. Telomer och TALT1 sonden hybridiserades till embryon samtidigt. DNA motfärgades med DAPI (blå). Skala bar, 10 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Kvantifiering av FISH Data Telomer och TALT1 intensitet från figur 3 kvantifierades i bildanalysmjukvara (en gåva från Dr. Peter Lansdorp). Varje plats kvantifierades med tröskelnivån OVer 15 för att utesluta icke-specifik bakgrund. T-test användes för att utvärdera statistisk signifikans. (* P <0,001). Felstaplar, SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den största fördelen med våra protokoll är enkelheten i förfarandet utan märkbar skada på morfologin hos cellstrukturen. Flera steg optimerades för C. elegans FISH i detta protokoll. De kritiska steg för framgångsrik FISH inkluderar märkning av prober, fixering av embryon och penetration. Digoxigenin-dUTP märkningsmetod ger en enkel att använda märkningsmetod genom PCR eller nick-translation. Att märka lång målsekvens är nick-translation föredra. I detta fall bör sondema spjälkas med lämpligt restriktionsenzym för att underlätta penetrationen av prober. Biotin-dUTP tagg rekommenderas inte eftersom biotinmärkta sökfragment producerade överskottsmängd av bakgrundssignal från cytoplasman. Även endogen biotin blockeringsreagens är kommersiellt tillgänglig, det var inte försökt.
Detta protokoll använder isolerade embryon för att öka tätheten av celler för effektiv kvantifiering. Intestinala kärnor av C. elegans är stora i storlek och är polyploida, som bidrar alltför många och intensitet telomeren fläckar jämfört med resten av somatiska kärnor. Av denna anledning är inte lämplig för kvantifiering av telomererna i C. hela masken elegans. Däremot embryon är lämpliga för utvärdering av telomerlängd eftersom de ger homogena celler utan effekt av polyploidi.
Detta protokoll använder 2% PFA fixativ som fungerade bra för telomer FISH. Fastän glutaraldehyd har rapporterats resultera i en lägre bakgrundssignal och hårdare fixering i RNA in situ hybridisering, ökad glutaraldehyd autofluorescens avsevärt 18. Detta överskott bakgrund avskaffades inte efter behandling av natriumborhydrid, vilket minskar oreagerad aldehydgrupp. Av denna anledning var glutaraldehyd används inte. Om signal-brusförhållande är låg, kan tidpunkten för förhybridisering förlängas upp till flera timmar för att blockera icke-specifika bindningsställen. IDessutom kan ökad tid av stringent tvättning för att minska bakgrundsnivå.
Färgningstekniken i C. elegans kan vara en utmaning för korrekt permeabilization behandling. C. elegans innehåller tjock cuticular exoskelett som hämmar penetration av antikroppar och prober. Traditionella antikroppsfärgningsmetoden innefattar behandling av kollagenas, som kräver mycket tid och optimeringsprocess. Den enzymatiska penetrationsmetoden också skadestånd Morfologin för maskar i utbyte av penetrationseffektivitet. Freeze-crack och metanol-aceton behandling för att underlätta sondpenetration. Frys spricka är enkelt och snabbt jämfört med kitinas eller yatalase behandling 19. Uttorkning eller rehydrering metanol serie tycks inte påverka kvaliteten på FISH. Dessa steg förenklades i detta protokoll. Även om det rapporterades att proteinas-K-spjälkning krävdes för RNA in situ hybridisering19 uppenbara skillnaden observerades inte mellan telomer FISH resultat med och utan proteinas K-behandling. Dessutom, fryst sprickbildning av embryon som en enkel att använda metoden för att visualisera många celler samtidigt på en enda fokalplan för stor kvantitativ analys.
Genom att använda PNA prob, var telomer signal signifikant ökat jämfört med den som erhålls med en DNA-sond. Detta kan bero på högre affinitet till dess komplementära mål och dess mindre storlek (3 upprepa jämfört med 4 upprepa). Fluorescensmärkt PNA prob också direkt binder till sitt mål, vilket minimerar efterföljande steg. Stark samhörighet upprätthålls i följande immunfluorescens steg gör efterfixering onödig, vilket kan undvika bakgrundsljud.
Det finns dock vissa begränsningar i denna teknik. En är att permeabilization steg något skadar morfologi på bekostnad av effektiv sondpenetration. Behandling av gonads och embryon med metanol och aceton förvrängd cirkel av kärnor jämfört med obehandlad kontroll. För experiment som kräver perfekt bevarad morfologi, bör olika permeabilization metoden prövas. En annan är att telomeren signalen kvantifieras i godtyckliga enheter. Detta beror främst på variationer bland oberoende experiment. Ribosomal DNA kan betraktas som en intern kontroll för att normalisera varje prov. Mer användbara metoder kan återfinnas i referens 20.
En enkel telomer FISH protokoll beskrivs här, som kräver minsta steg. Många steg reduceras för analys av stora mängder av embryon. Emellertid kan ytterligare modifiering göras för starkare signal, såsom kitinas behandling för penetrering, och andra innovativa försök. I kombination med cellodlingsmetod, kan super-resolution imaging vara möjlig. Detta protokoll kan bidra till att upptäcka mekanismen nya telomer underhåll i C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).
