Abstract
De heterogene intratumorale accumulatie van liposomen is een belangrijke determinant van hun werkzaamheid. Zowel de chaotische tumor microcirculatie en verhoogde IFP verband houden met de heterogene intratumorale verdeling van nanotechnologie gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen zoals liposomen. In deze studie, de relatie tussen tumor microcirculatie, verhoogde IFP en accumulatie van nanodeeltjes werd onderzocht door middel van in vivo experimenten. Dit werd bereikt door evaluatie van de tumor microcirculatie met behulp van dynamische contrast versterkte computertomografie (DCE-CT) en meting van de tumor IFP met behulp van een nieuwe beeldgeleide robotic plaatsing van de naald dat is aangesloten op de micro-CT-scanner. De intra-tumorale accumulatie van liposomen werd bepaald door CT image-gebaseerde beoordeling van een nanodeeltje liposomale formulering die stabiel te kapselen het contrastmiddel johexol (CT-liposomen). CT beeldvorming termijn voor co-lokalisatie van de ruimtelijke verdeling vantumor hemodynamica, IFP en CT-liposoom accumulatie per individuele subcutane xenograft muismodel van borstkanker. Metingen leidde tot de ontdekking dat perfusie en plasmavolume fractie sterk mediatoren van de intratumorale verdeling van liposomen. Bovendien zijn de resultaten suggereren dat IFP speelt een indirecte rol als mediator liposoom distributie via het moduleren van de bloedstroom.
Introduction
Meten van de intratumorale accumulatie van nanodeeltjes geneesmiddelafgiftesystemen kan een belangrijk instrument om te bepalen of een voldoende concentratie van cytotoxische geneesmiddel in de tumor is gehaald. De ontwikkeling van "afbeeldbare" liposomale systemen zorgt voor niet-invasieve en kwantitatieve in vivo detectie van de geneesmiddelafgifte auto met beeldvormingsmodaliteiten zoals positron emissie tomografie (PET) 1, optische fluorescentie 2 en computertomografie (CT) 3, 4 en magnetische resonantie imaging (MRI) 5. Imaging is gebruikt om de farmacokinetica en biodistributie van liposoomafgiftesystemen bepalen en de mate van interindividuele en intratumorale heterogeniteit nanodeeltjes accumulatie 6,7 onthullen. Echter, beeldvorming van nanodeeltjes alleen niet de biologische barrières die hebben bijgedragen aan hun slechte accumulatie en distributie te identificeren. Deze kennis is van cruciaal belang voor de rDe nationale ontwikkeling van meer effectieve formuleringen, en strategieën ter verbetering van de intra-tumorale accumulatie 8. Het is aangetoond dat therapeutische strategieën kunnen worden toegepast op specifieke biologische barrières als gevolg een betere nanodeeltjes transport 9 moduleren. Daarnaast zijn nanodeeltjes formuleringen ontwikkeld om specifiek te overwinnen specifieke biologische transportbarrière 10. In beide scenario's kunnen metingen van biologische barrières worden gebruikt om het gebruik van een geschikte nanodeeltjes geneesmiddelafgifte strategie leiden.
Tumor microcirculatie en verhoogde IFP wordt aangenomen dat twee belangrijke determinanten van de intratumorale accumulatie van nanodeeltjes, zoals liposomen, in vaste tumoren 9,11. Echter, andere barrières die bijdragen aan slechte liposoom accumulatie onder een dichte extracellulaire matrix impermeabel vasculatuur en vast weefsel 12 druk. Deze barrières hebben betrekking op een ruimte-tijdmanier, met abnormale bloedstroom en verhoogde interstitiële vloeistof druk zijn twee belangrijke factoren die de eerste aflevering en extravasatie van nanodeeltjes. Zoals eerder besproken, tot oprichting van de relatie tussen de tumor microcirculatie, verhoogde IFP, en de intra-tumorale accumulatie van liposomen is absoluut noodzakelijk voor een goede interpretatie van de liposoom beeldgegevens. Hierin kwantitatieve methode om de relatie tussen de tumor microcirculatie, verhoogde IFP en nanodeeltjes accumulatie in een vaste tumor gemeten worden. Dit wordt bereikt door het uitvoeren van co-gelokaliseerde metingen van de intratumorale verdeling van een CT liposoom contrastmiddel middels volumetrische CT beeldvorming, tumor microcirculatie middels dynamische contrast versterkte computertomografie beeldvorming en tumor IFP met een beeldgeleide robotic naald positioneringssysteem, genaamd de CT-IFP robot 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in-vivo-experimenten werden uitgevoerd onder een protocol door de Universiteit Health Network Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.
1. Dierlijke Model
- Cultuur tussen 5-7 x 10 6 MDA-MB-231 borst adenocarcinoom tumorcellen in DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100x verdunning van penicilline-streptomycine.
- Oogst cellen wanneer ze 80% confluent met een 0,05% trypsine-EDTA-oplossing. Na 3-5 min neutraliseren trypsine-EDTA met een 3x volume van DMEM. Neem een 15 ul monster van cellen en te tellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer cellen tot een pellet gedurende 5 minuten bij 200 xg en resuspendeer in HBS bij een concentratie van 10 x 10 6 cellen per ml.
- Implant subcutane (SC) tumoren door het injecteren van 1-2 x 10 6 cellen in de achterpoot van ieder 8 tot 12 weken oude vrouwelijke SCID muizen (n = 5). Gebruik een standaard 25 G injectienaald.
- Monitor tumor groei met behulp van remklauwen (volume = 0,5 x lengte x breedte 2) en start de metingen zodra de SC tumoren een volume> 200 mm 3 (ongeveer 7-9 dagen) hebben bereikt.
2. CT-liposoom voorbereiding en karakterisering
- liposoompreparaat
- Ontbinden lipidecomponenten (200 mmol / L) voor CT-liposomen, zoals 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC), cholesterol (CH), en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3 -phosphoethanolamine-N-poly (ethyleenglycol) 2000 (DSPE-PEG2000) in watervrije ethanol bij 70 ° C bij een molaire verhouding van 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
- Verdamp ethanol handhaven warmte bij 70 ° C, voeg de CT-contrastmiddel iohexol (300 mg / ml jodium) aan de oplossing zodat de uiteindelijke lipide concentratie 100 mM.
- Handhaaf de oplossing bij 70 ° C gedurende 4 uur met frequente vortexen.
- Om unilamellaire blaasjes te verkrijgen, extrusie van de sample 5 times via twee gestapelde 200 nm poriegrootte membraan bij een druk van 250 psi en opnieuw extruderen van 5 doorloopt twee gestapelde 80 nm poriegrootte membraan bij 400 psi onder toepassing van een 10 ml lipide extruder. Pipetteer een volume van 10 ml liposomen in de extruder bij het begin van elke cyclus extrusie en verzamelen in een steriele conische buis of glazen flesje na elke extrusie cyclus.
- Verwijder de niet-ingekapselde iohexol door 16 uur dialyse met een 100 kDa molecuulgewicht uit (MWC) dialysezak tegen een 250-voudige volume overmaat van 0,02 mM HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS, pH 7,4). Plaats bijvoorbeeld 1 ml liposoomoplossing in de dialysezak met 250 ml HBS buiten de zak in een bekerglas.
- Concentreer het CT-liposomen met een 750.000 misch MWC commerciële tangentiale stroom volgens de instructies van de fabrikant. Concentreer tot een uiteindelijke jodium concentratie van ongeveer 55 mg ml-1.
- liposoom karakterisering
- Meet inkapselingsefficiëntie door verbreken van de CT-liposomen onder toepassing van een 10-voudig volume overmaat ethanol aan de ioxehol ontgrendelen en verdund met een 100-voudige volume overmaat gedeïoniseerd water (bijvoorbeeld 10 pi liposomen gescheurd met 100 gl ethanol en vervolgens verdund een eindvolume van 10 ml).
- Bepaal iohexol concentratie met UV spectrometer met detectie bij een golflengte van 245 nm. Bereken de encapsulaties efficiëntie door de verhouding hoeveelheid afgegeven iohexol middel aan de hoeveelheid middel toegevoegd tijdens de bereiding.
- Meet de potentiële hydrodynamische diameter en zeta met een dynamische lichtverstrooiing deeltjesgrootte analysator volgens de instructies van de fabrikant. Verdun de CT-liposoom oplossing 200x (bijvoorbeeld 5 gl liposoom in 1 ml eindvolume) in gedeïoniseerd water om metingen te vergemakkelijken.
3. CT beeldvorming van Tumor microcirculatie en CT-liposoomDistributie
LET OP: Volg de instructies van de fabrikant voor het uitvoeren van een volumetrische scan als verschillende software-versie of apparatuur wordt gebruikt.
- Verdoven elke muis met behulp van 2% isofluraan gemengd met medische lucht of zuurstof en bevestig door te knijpen de teen en observeren geen reactie. Toepassen zalf voor de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving. Immobiliseren dier in een buikligging door tapen poten om een dunne plastic bord.
- Plaats een maat 27 G katheter, verbonden tot 20 cm op de PE10 slang, in de laterale staartader en vast te zetten met een aantal stukjes tape.
- Bereid een 1 ml injectiespuit ten minste 200 gl van de CT-liposomen bevatten. Bereid een 1 ml spuit met zoutoplossing om de katheter te spoelen. Tenslotte stelt een 1 ml spuit met ten minste 150 gl vrije iohexol gemengd met zoutoplossing (9: 1 volumeverhouding).
- Plaats de muis naar voren gebogen op de micro-CT-scanner bed. Gebruik de laser positioning systeem om de Tumo plaatsenr ongeveer dezelfde oriëntatie voor elke scan.
- Plaats de CT-liposoom spuit in een spuitpomp en bevestig de katheter op de spuit. Stel de pomp snelheid van 10 pl per sec.
- Initialiseren van het systeem door het uitvoeren van een heldere-dark kalibratie scan met behulp van de CT-scanner console software. Selecteer de heldere-dark scan optie voor elk beeldvorming protocol van belang, selecteer helder-donker uit het drop down menu en druk op de scan knop om de kalibratie te starten.
- Voer een volumetrische anatomische micro-CT van de tumor voorafgaand aan de injectie contrastmiddel. Kijk naar de CT-scanner console software indicator om de CT-scanner veiligheidsvergrendelingen zijn gewist te garanderen. Op de CT-scanner console select scan selecteert u een x-ray energie van 80 kV, een buis stroom van 70 mA, en vangt 1.000 image projecties in de tijd 16 sec. Druk op de scan knop om de scan te starten.
- Gebruik de spuitpomp een bolus van CT-liposomen te injecteren in een concentratie van 400 mg jodium kg-1. Stel de pomp een volume van ongeveer 150 pi (uitgaande van een 25 g muis) geïnjecteerd. Druk op de knop 'start' op de pomp om te injecteren. Handmatig Spoel de katheter met 50 pi zoutoplossing (tweemaal het volume van de katheter) om de gehele hoeveelheid agens geïnjecteerd waarborgen en de katheter weg.
- Wacht 10 minuten na de injectie van CT-liposomen en vervolgens een tweede anatomische scan met dezelfde methode en instellingen in 3,5 beschreven.
- Voer een DCE-CT-scan door de spuitpomp tot een volume van 100 gl van de vrije iohexol gemengd met zoutoplossing te injecteren (9: 1 volumeverhouding) met behulp van dezelfde injectiesnelheid omgeving in 3,3 beschreven.
- Op de CT-scanner console selecteert de 5 min dynamische scan die een x-ray energie-instelling van 80 kV, een buis energie van 90mA gebruikt en vangt 416 beeld projecties per sec voor de eerste 30 seconden gevolgd door een acquisitie elke 10 sec . Capture 5 sec van DCE-CT data en druk op de startknop op het spuitgietenn pomp.
- Na de DCE-CT-scan uitvoeren van een volumetrische anatomische micro-CT scan.
- Leg anatomische CT-beelden tussen 48 en 72 uur na injectie van CT-liposomen, met dezelfde volumetrische CT instellingen met stappen 3,5.
- Reconstrueren de anatomische CT en DCE-CT-gegevens met behulp van de GPU-reconstructie software.
- Laad de afbeelding in de reconstructie software. Selecteer de regio van belang te worden gereconstrueerd door het tekenen van een ROI op de afbeelding met behulp van een muis. Stel de opslaglocatie en de bestandsnaam voor de gereconstrueerde afgebeeld en selecteer de output file type als '.mat'.
LET OP: De software zal automatisch de gereconstrueerde voxel grootte van 0,153 x 0,153 x 0,153 mm 3 voor anatomische scans en 0,153 x 0,153 x 0,462 mm 3 voor DCE-CT-scans. Klik op het 'begin reconstructie' knop.
- Laad de afbeelding in de reconstructie software. Selecteer de regio van belang te worden gereconstrueerd door het tekenen van een ROI op de afbeelding met behulp van een muis. Stel de opslaglocatie en de bestandsnaam voor de gereconstrueerde afgebeeld en selecteer de output file type als '.mat'.
- Met de pre-injectie en 10 min na injectie scans van de CT-liposoom Berekenenplasmavolume fractie 3 zoals eerder beschreven. Verder maken de pre-injectie en 5 min na injectie scans van iohexol de interstitiële volumefractie berekend zoals eerder beschreven 7.
- Verkrijgen tijd intensiteit curves (TIC) door het importeren van de DCE-CT-gegevens in de software die de mogelijkheid om een regio van belang (ROI) te identificeren in de tumor volume biedt. Bereken vervolgens de gemiddelde CT verbeteren de ROI als functie van de tijd. In dit experiment werd aangepaste software ontwikkeld om een ROI te identificeren en berekenen van de TIC.
- Verkrijgen van kwantitatieve schattingen van de perfusie en vasculaire permeabiliteit door het aanbrengen gemeten TIC behulp van een twee-compartimenten tracer kinetische model. Montage kan worden uitgevoerd met DCE-CT analysesoftware en gebruik apriori ramingen van de plasma volumefractie en interstitiële volumegehalten vastgesteld parameters in de twee compartimenten tracer kinetische model. Gebruik eerder gerapporteerde methoden om priori schattingen van het plasma te verkrijgenen een tussenliggende volumefracties 14.
4. Ruimtelijke Metingen van Tumor interstitiële vloeistof Pressure
- Om te meten IFP sluit de 25 G spinale naald om de druk transducer en de IFP acquisitie systeem door middel van 50 cm van PE20 polyethyleen buis. Spoel het hele systeem met een heparine sulfaat / zoutoplossing (1:10). Steriliseer de naald met 70% isopropyl voor gebruik.
- Schakel de acquisitie systeem en de lancering van de IFP acquisitie software en laadt de instellingen van bestanden naar het systeem om IFP metingen te verwerven in mmHg kalibreren. Klik op de knop verwerven om continu verzamelen IFP data.
- IFP voeren metingen tussen 48 en 72 uur na injectie van CT-liposomen (dit komt overeen met de verwachte piek accumulatie van de CT-liposomen in de tumor) met de onder 4.8 beschreven werkwijzen. Bevestig de IFP naald op de CT-IFP robot.
- Kalibratie uitvoeren scans om coördinatensystemen voor uitlijnende CT-IFP robot en de CT scanner. Voeg de ijkpuntmarker gehechtheid aan de CT-IFP robot en het uitvoeren van een vier volumetrische CT-scan met de ijkpuntmarker in vier verschillende posities.
- Start de CT-IFP robot controller software, initialiseren van de robot, en verplaats de robot om de drie standen door het invoeren van de x, y, z targeting posities en te klikken op de 'go' knop.
- Neem een CT-scan op de volgende x, y, z coördinaten: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; en (4) 0,0,10. Selecteer een 90 kV, 10 mA, 16 sec scan met behulp van de CT-scanner software en druk op 'Start' om de scan te starten. Reconstrueren de scan, zoals beschreven in 3.10.
- Start de CT-IFP robot alignment software. Klik op de knop 'toevoegen' in de regio 'Registration Data' geladen en selecteer de vier gereconstrueerde registratie scans verkregen in 4.3 en klik op 'open'.
LET OP: De pixel locatie van de vaste marker wordt automatisch in de Softwa worden ingevoerdopnieuw.- Klik op de knop 'Berekenen Transform' en klik vervolgens op de 'Apply Transform' knop. Dit genereert uitlijngegevens die zullen worden gebruikt om te zetten de CT-IFP robot coördinatensysteem aan de CT scanner coördinatensysteem. Nadat de kalibratie is voltooid, bevestigt het dier platform om de CT-IFP robot.
- Verdoven elke muis met behulp van 2% isofluraan gemengd met medische lucht of zuurstof en bevestig door te knijpen de teen en observeren geen reactie. Immobiliseren dier op de CT-IFP robot platform en de positie van de muis, zodat de tumor is toegankelijk voor de CT-IFP robotsysteem. Immobiliseren de tumor met behulp van tape, zodat het niet beweegt tijdens het IFP naald inbrengen.
- Voer een anatomische micro-CT scan voorafgaand aan het inbrengen van de IFP naald. Reconstrueren de CT-gegevens met behulp van de stappen in 3.10 beschreven.
- Laad de pre-naald inbrengen CT gegevens in de CT-IFP robot alignment software. Pas het raam en niveau om de tumor te visualiseren. Klik op The rand van de tumor in een afbeelding en klik vervolgens op een tweede rand locatie.
NB: De software zal een reeks van posities te berekenen langs een rechte lijn tussen de twee posities. Let op de x, y en z-coördinaten voor een reeks van 5-8 gelijkmatig posities in de lijst. - Bereid de IFP systeem spoelen van de naald met heparine-zoutoplossing vóór het inbrengen.
- Voer de eerste vooraf bepaalde naaldposities in de x, y, z, in de CT-IFP robot besturingssoftware en druk-beweging aan de knop 'go' om de robot te verplaatsen naar de gewenste positie. Klik op de 'Insert Needle' knop om de naald in het weefsel plaatst.
- Na het inbrengen van de naald zorgen voor een goede vloeiende communicatie tussen de IFP naald en het weefsel door te knijpen en het vrijgeven van de PE20 slang, en merkt op dat de IFP meting toe en keert terug naar de pre-knijpen waarde op de IFP acquisitie software. Weigeren metingen die niet terug te keren naar de uitgangswaarde.
- verwervenanatomische CT-scan met de naald ingebracht, klik vervolgens op de 'Retract Needle' knop op de CT-IFP robot control software om de naald uit het weefsel te trekken. Verwerpen iedere IFP metingen waarbij de IFP waarde niet terug naar de pre-naald inbrengen waarde na intrekking van de naald. Dit betekent de naald kunnen worden verstopt tijdens de meting. Herhaal stap 4,8-4,10 voor elke naald positie.
- Bepaal de naaldpositie binnen het tumorvolume door het berekenen van de x, y en z posities van de naald haven ten opzichte van het zwaartepunt van het tumorvolume zoals geïdentificeerd in de post-insertie volumetrische CT scan van de naald.
- Terug dieren naar de kooi na alle metingen zijn voltooid. Geen dieren onbeheerd achter, en zorg om ze te observeren, totdat het bewustzijn is herwonnen en zijn ze in staat om borstligging handhaven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hiervoor genoemde protocol moet CT-liposomen met een ingekapselde concentratie van iohexol, betekenen liposoom diameter en zeta potentieel van 55 mg ml -1, 91,8 ± 0,3 nm en -45,5 ± 2,5 mV, resp. Figuur 1a omvat representatief DCE-CT-beeldvorming resultaten, waarbij een tijdreeks van volumetrische gegevens die de temporele veranderingen in intratumorale accumulatie van iohexol tonen. Het selecteren van een ROI binnen de tumor levert een TIC dat kan worden gekwantificeerd met behulp van tracer kinetische modellering methoden om schattingen van de perfusie, vasculaire permeabiliteit, plasma volume fractie, en interstitiële volume fractie (Figuur 1b) te verkrijgen. In deze studie werd een twee compartimenten tracer kinetisch model gebruikt en geschikt om de gemeten TIC met een niet-lineaire curve fitting routine in Matlab 14 uitgevoerd. Segmenteren van het volume tumor in meerdere regio's van belang van gelijke grootte maakt voor het kwantificeren van tHij ruimtelijke verdeling van hemodynamische parameters binnen de tumor volume (figuur 1c). Segmentatie kan handmatig worden uitgevoerd, wat tijdrovend en moeilijk, ofwel automatisch, zoals hier uitgevoerd met een algoritme dat de tumor verdeeld in meerdere even grote ROI met een sferisch coördinatenstelsel. De DCE-CT werkwijzen kwantitatieve ramingen van de ruimtelijke verdeling van perfusie, vasculaire permeabiliteit, plasma volumefractie en interstitiële volumefractie. Deze parameters werden waargenomen ruimtelijk heterogeen hogere perfusie, plasma en interstitiële volumegehalten langs de omtrek ten opzichte van de centrale tumorvolume zijn.
De volumetrische CT beeldvormingswerkwijze toont de biologische verdeling en intratumorale verdeling van CT-liposomen. Figuur 2a toont de biologische verdeling van CT-liposomen 48 uur na injectie. De agent is nog steeds circuleert in the vaatstelsel, met aanzienlijke opname waargenomen in de milt en lever. De intratumorale accumulatie van CT-liposomen waargenomen heterogene, met overwegend perifeer accumulatie in vergelijking met het centrum, zoals aangegeven door de heldere gebieden in het tumorvolume (Figuur 2b).
Volumetrische CT beeldvorming kan worden gebruikt voor het bijhouden van de locatie van IFP metingen met de CT-IFP robot setup. Figuur 3a toont de plaatsing van de IFP naald in de tumor volume afgebeeld met behulp van hoge-resolutie micro-CT. De naald duidelijk herkenbaar in het tumorvolume waardoor ruimtelijk lokaliseren van de IFP metingen binnen het tumorvolume (figuur 3b). Het is mogelijk om een ruimtelijk plan van IFP gehele tumor te genereren door het uitvoeren van meerdere metingen binnen de IFP tumorvolume. De ruimtelijke IFP kan vervolgens worden gecorreleerd met de corresponderende metingen vantumor microcirculatie en CT-liposoom accumulatie.
Volumetrische CT beeldvorming maakt een gemeenschappelijk referentiekader waardoor co-lokaliseren metingen van hemodynamiek, IFP, en CT-liposoom accumulatie. Figuur 4 geeft een voorbeeld van ruimtelijk co-gelokaliseerde metingen van CT-liposoom accumulatie, IFP, perfusie, vasculaire permeabiliteit, plasma volumefractie en interstitiële volumefractie. Waargenomen werd dat perfusie en het plasma volumefractie was significant gecorreleerd met de intratumorale accumulatie van CT-liposomen subcutane MDA-MB-231 tumoren. Bovendien is de radiale verdeling van IFP gecorreleerd met hemodynamische metingen. Deze resultaten wijzen op een complexe ruimte-tijd relatie bestaat tussen de tumor microcirculatie, IFP en de intra-tumorale accumulatie van liposomen 14.
Figuur 1: DCE-CT beeldvorming van de tumor Microcirculation (a) een representatieve reeks temporele CT-beelden verzameld binnen het tumorvolume, die het contrastmiddel kinetiek als functie van de tijd.. De rode contour is een ROI waar de tijd intensiteit curve (TIC) wordt gemeten. (B) De TIC is fit behulp van een twee-compartimenten tracer kinetische model om kwantitatieve ramingen van hemodynamische parameters binnen de ROI opleveren. (C) Vertegenwoordiger ruimtelijke verdeling van kwantitatieve hemodynamische parameters in de tumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Volumetrische CT-beeldvorming van liposoom overge- atie. (a) Een vertegenwoordiger 3D-volume-gerenderde afbeelding aantonen van de biologische verdeling van CT-liposomen. (B) Vertegenwoordiger axiale, coronale en sagittale plakken genomen door het centrum van de tumor die de intra-tumorale accumulatie van CT-liposomen bij 48 uur na de injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Image Guided IFP metingen (a) Een vertegenwoordiger 3D-volume teruggegeven beeld van de CT-IFP robot systeem (groen) post-naald inbrengen in een onderhuidse tumor op 48 uur na injectie van CT-liposomen (oranje). (B) Een vertegenwoordiger CT beeld van de post-naald inbrengen./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:.-Co gelokaliseerde Metingen van Tumor Microcirculatie, IFP, en CT-liposoom accumulatie Panel toont een representatieve ruimtelijke co-lokalisatie van CT-liposoom accumulatie genomen 48 uur na de injectie, IFP, perfusie, vasculaire permeabiliteit, plasma volume fractie en interstitiële volume fractie. Re-print met toestemming van 14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methoden voor het image-gebaseerde meting die hierin mogelijk te maken bepaling van de ruimtelijke verdeling van de tumor microcirculatie eigenschappen, IFP, en CT-liposoom accumulatie. Eerdere pogingen om deze eigenschappen betrekking hebben vertrouwd op het uitvoeren van bulk metingen over meerdere tumor-dragende dieren en dus niet over de gevoeligheid voor mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de heterogeniteit in intra-tumorale accumulatie die vaak is waargenomen voor nano-sized drug delivery systemen 15 helderen. DCE-CT een werktuig voor de intratumorale variaties in de eigenschappen van de tumor microcirculatie meten volumetrische CT een nauwkeurige weergave van CT-liposoom depositie kinetiek en de CT-IFP robotsysteem een werktuig ruimtelijke kaart brengen van IFP verrichten hetzelfde dier. Bovendien DCE-CT beeldvorming is een klinisch goedgekeurde werkwijze voor het meten van tumor hemodynamiek in de klinische omgeving, waardoor de resultaten van deze studie potentieel klinisch verteen tafel.
Gezien de complexiteit van de metingen, zijn er verschillende kritische factoren voor het verzamelen van betrouwbare gegevens sets waarborgen. DCE-CT gebaseerde kwantificering van de tumor microcirculatie is misschien wel de meest moeilijk om nauwkeurige schattingen van de tumor hemodynamiek te waarborgen. Het vereist het verkrijgen van TIC's met een hoge signaal-ruisverhouding (SNR) en met gebruikmaking van een robuuste fitting algoritme om de TICs 16,17 kwantificeren. Visuele inspectie van TIC kan worden gebruikt om lage SNR analysegegevens verwijderen. Bovendien, als men niet genomen dan het aanbrengen van hoge SNR TIC kan ook leiden tot foutieve schattingen tumor perfusie, vasculaire permeabiliteit, plasma volumefractie en interstitiële volumefractie 16. Met het oog op de nauwkeurigheid kwantificering maximaliseren werd een strategie gebruikt om model onafhankelijke schattingen van het plasma en interstitiële volume fracties, die vervolgens als vaste parameters worden gebruikt tijdens de model fit van de gemeten TICs verkrijgen. Deze methodezorgt voor robuuste schattingen van de tumor perfusie en vasculaire permeabiliteit worden verkregen 15.
Robuuste analyse van de intratumorale verdeling van CT-liposomen vereist presterende volumetrische CT-beeldvorming na voldoende accumulatie van het middel. Uit eerdere studies, de piek tumor accumulatie van CT-liposomen plaatsvindt tussen 48 tot 72 uur in de muis xenotransplantaten 3,15. Verder bestaat er een lineair verband tussen CT-liposoom concentratie en contrastversterking CT beeldvorming waardoor eenvoudige kwantificering van variaties in intratumorale accumulatie van CT-liposomen 15.
Nauwkeurige metingen van IFP met de naald gebaseerde methode vereist een goede vloeistofverbinding tussen de katheter en de weefsel. Bovendien is het belangrijk om alleen gebruik tumoren die hoge centrale tumor IFP (> 5 tot 10 mmHg), anders zal er minimale ruimtelijke variatie in IFP. Ruimtelijke metingen van IFP met behulp van de CT-IFP robot systemcan uitdagend te wijten zijn aan het weefsel beweging veroorzaakt door de naald inbrengen. Imaging voor en na plaatsing van de naald is cruciaal voor het nauwkeurig identificeren van de plaatsing van de naald; echter, kan het moeilijk zijn om de positie tussen opeenvolgende plaatsingen naald door het weefsel kromtrekken tussen metingen betreffen. Het bleek dat willekeurig kiezen naaldposities resulteert in aanzienlijke weefsel vervorming tijdens het inbrengen van de naald. Daardoor is deze werkwijze mits de minst nauwkeurige ruimtelijke kaart brengen van IFP. Omgekeerd, het uitvoeren van metingen op een rechte baan over het volume van de tumor en het inbrengen van de naald raakt aan de baan kan de ruimtelijke nauwkeurigheid van IFP metingen te verbeteren. De naald raakt aan de baan minimaliseert de effecten van weefsel vervorming langs de meting spoorrichting.
Deze studie demonstreerde het vermogen om de ruimtelijke verdeling van de tumor microcirculatie, IFP en CT-liposoom accumulatie meten individuele tumor. Na het beheersen van deze technieken is het mogelijk om deze metingen onafhankelijk of uitvoeren om de tumor micro-omgeving en de gevolgen ervan geneesmiddelafgifte kenmerken. Met deze methoden in de MDA-MB-231 borst xenograft model onthulde dat perfusie en plasmavolume fractie sterk mediatoren van de intratumorale verdeling van liposomen 14. Er werd niet gevonden om een sterke relatie tussen IFP en liposoom distributie. Echter, IFP was sterk gecorreleerd met metingen van de tumor perfusie, wat suggereert dat IFP een indirecte rol kunnen spelen bij de bemiddeling liposoom distributie via modulatie van de bloedstroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells | ATCC | HTB-26 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Lipids Inc., USA | 850355P | |
| Cholesterol (CH) | Avanti Lipids Inc., USA | 700000P | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) | Avanti Lipids Inc., USA | 880128P | |
| Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml | GE Healthcare, CA | ||
| 80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 10 m Lipex Extruder | Nothern Lipids Inc, CA | ||
| Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa | Spectrum Labs, USA | ||
| 750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column | MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA | ||
| Peristaltic pump | Watson Marlow Inc., USA | ||
| UV spectrometer | Helios γ, Spectronic Unicam, USA | ||
| 90Plus particle size analyzer | Brookhaven, Holtsville, USA | ||
| eXplore Locus Ultra micro-CT system | GE Healthcare, CA | Manipulated using CT-Console Software | |
| AxRecon GPU-based Reconstruction | Acceleware Corp. CA | ||
| 27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set | Terumo Medical Products, USA | SV*27EL | |
| PE20 polyethylyne tubing | Becton Dickinson, USA | 427406 | |
| Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle | Becton Dickinson, USA | 405140 | IFP needle |
| P23XL pressure transducer | Harvard Apparatus, CA | P23XL | |
| PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 | ADInstruments Pty Ltd., USA | PL3504, FE221 | IFP acquisition system and acquisition software |
| CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) | Parallax Innovations, CA | Manipulated using CT-IFP robot Control Software | |
| CT-IFP robot alignment software | Custom Matlab software | ||
| DCE-CT Analysis Software | Custom Matlab software | ||
| Matlab 2013b | Mathworks, USA |
References
- Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19 (12), 2577-2584 (2008).
- Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution. Molecular Imaging. 12 (3), 148-160 (2013).
- Stapleton, S., et al. A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors. PloS one. 8 (12), e81157 (2013).
- Zheng, J., et al. A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery. Biomaterials. 67, 160-168 (2015).
- Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications. Pharmaceutical research. 24 (6), 1193-1201 (2007).
- Harrington, K. J., et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. Clinical Cancer Research. 7 (2), 243-254 (2001).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).
- Stapleton, S., Milosevic, M. F. Cancer Targeted Drug Delivery. , Springer. 241-272 (2013).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).
- Bax, J. S., et al. 3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions. Medical physics. 40 (1), 011909 (2013).
- Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation. Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability. Medical physics. 36 (7), 2923-2933 (2009).
- Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37 (1), 30-51 (2010).
