Abstract
Гетерогенный внутри опухолевой накопление липосом является критическим фактором, определяющим их эффективность. И хаотичным микроциркуляции опухоли и повышенные IFP связаны с гетерогенной внутрибрюшного опухолевое распределения на основе нанотехнологий систем доставки лекарственных средств, таких как липосомы. В настоящем исследовании, взаимосвязь между опухолью микроциркуляции, повышенной IFP и накопления наночастиц было исследовано с помощью экспериментов в естественных условиях. Это было достигнуто путем оценки микроциркуляции опухоли с использованием динамической контрастности расширенной компьютерной томографии (АКД-КТ) и измерение опухоли IFP с использованием нового изображения наведением системы размещения роботизированная иглы, соединенный с микро-КТ сканера. Внутри опухолевой накопление липосом определяли с помощью КТ изображения на основе оценки липосомном наночастиц, которые стабильно герметизировать Контрастное вещество иогексол (CT-липосом). КТ изображения позволило совместной локализации пространственного распределенияОпухолевые гемодинамика, IFP и накопление КТ-липосома в индивидуальной модели подкожного ксенотрансплантата мыши рака молочной железы. Измерения привели к открытию того, что перфузия и объем фракции плазмы являются сильными медиаторами распределения внутрибрюшного опухолевый липосом. Кроме того, результаты показывают, что ПСИ играет косвенную роль в опосредовании распределение липосом путем модуляции кровотока.
Introduction
Измерение внутри опухолевой накопление наночастиц системы доставки лекарственных средств может стать важным инструментом для определения наличия адекватной концентрации цитотоксического препарата была достигнута в опухоли. Развитие «Имидж-состоянии" липосомальных систем позволяет неинвазивным и количественное в естественных условиях обнаружение доставки лекарственного средства транспортного средства с использованием методов визуализации , таких как позитронно - эмиссионной томографии (ПЭТ) 1, оптической флуоресценции 2 и компьютерной томографии (КТ) 3, 4 и магнитно - резонансная томография (МРТ) 5. Обработки изображений используется для определения фармакокинетики и биораспределение липосомальных систем доставки и выявить степень межпредметных и внутри опухолевой гетерогенности в наночастицами накопления 6,7. Тем не менее, изображения наночастиц в одиночку не идентифицирует биологические барьеры, которые способствовали их плохого накопления и распределения. Это знание имеет первостепенное значение для гАЦИОНАЛЬНЫЙ разработка более эффективных составов, а также стратегии улучшения внутри опухолевой накопления 8. Было показано , что терапевтические стратегии могут быть применены для модулирования специфические биологические барьеры что приводит к улучшению переноса наночастиц 9. Кроме того, препараты из наночастиц были разработаны специально для преодоления специфической биологической транспортного барьера 10. В обоих случаях измерения биологических барьеров могут быть использованы для руководства использования соответствующей стратегии наночастиц для доставки лекарственного средства.
Опухоль микроциркуляции и повышенные ПСИ как полагают, являются двумя ключевыми факторами , определяющими внутриатомного опухолевый накопления наночастиц, такие как липосомы, в солидных опухолях 9,11. Тем не менее, другие барьеры, чтобы способствовать накоплению плохой липосом включают плотный внеклеточный матрикс, непроницаемый сосудистую сеть , и давление 12 твердой ткани. Эти барьеры связаны в пространственно-временнойСпособ, с ненормальным кровотока и повышение интерстициального давления жидкости является двумя важными факторами, способствующими первоначальную поставку и кровоизлияние наночастиц. Как уже обсуждалось ранее, установление взаимосвязи между микроциркуляции опухоли, повышенное IFP, и внутриливанской опухолевый накопление липосом является обязательным для правильной интерпретации данных липосомами изображений. При этом количественные методы для измерения отношения между микроциркуляции опухоли, повышенное IFP, и накопление наночастиц в твердой опухоли представлены. Это достигается путем выполнения колокализуются измерений внутри опухолевой распределения КТ липосомная контрастного агента с использованием объемной КТ, опухоль микроциркуляции с помощью динамической контрастности усиливается вычисленный изображений томографии, а также опухоли IFP с использованием изображения наведением роботизированной системы позиционирования иглы, названные робот CT-IFP 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты в естественных условиях были проведены в соответствии с протоколом , утвержденным Institutional уходу и использованию животных комитета университета сеть здравоохранения путем.
1. Животная модель
- Культура от 5 до 7 х 10 6 MDA-MB-231 опухоли аденокарциномы молочной железы клеток в DMEM вместе с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 - кратном разведении пенициллин-стрептомицина.
- Урожай клетки, когда они 80% сплошности с использованием 0,05% раствора трипсина-ЭДТА. Через 3-5 мин нейтрализации трипсин-ЭДТА с 3-кратным объемом DMEM. Возьмите 15 мкл аликвоты клеток и подсчета использованием гемоцитометра. Центрифуга клетки в гранулы в течение 5 мин при 200g, и повторно приостанавливать в HBS при концентрации 10 х 10 6 клеток на мл.
- Имплантат подкожно (SC) опухоли путем инъекции 1 до 2 × 10 6 клеток в задней конечности каждой от 8 до 12 недельных самок SCID мышей (п = 5). Используйте стандартный 25 G иглы для инъекций.
- монитор тumor роста , используя суппорты (объем = 0,5 х длина х ширина 2) и начать измерения , как только опухоли SC достигли объема> 200 мм 3 (приблизительно от 7 до 9 дней).
2. CT-липосома Получение и определение характеристик
- липосом Подготовка
- Растворите липидные компоненты (200 ммоль / л) для CT-липосом, в том числе 1,2-дипальмитоил-SN-глицеро-3-фосфохолина (ДПФХ), холестерин (СН), и 1,2-дистеароил-Sn-глицеро-3 -phosphoethanolamine-N-поли (этиленгликоль) 2000 (DSPE-PEG2000) в безводном этаноле при 70 ° с при мольном соотношении 55: 40: 5 DPPC CH: ДСФЭ-PEG2000.
- Выпаривают этанол, поддерживая высокую температуру при 70 ° С, а затем добавить КТ контрастное вещество иогексол (300 мг / мл йода) к раствору так, чтобы конечная концентрация липида составляет 100 мМ.
- Поддержание раствора при 70 ° С в течение 4 ч с частым встряхиванием.
- Для получения однослойных везикул, прессовать образец 5 тимЕ. С. через два уложены 200 размер нм пор мембран при давлении 250 фунтов на квадратный дюйм и выталкивать снова на 5 циклов через два сложенных 80 нм мембран с размером пор при 400 фунтов на квадратный дюйм с использованием 10 мл липидного экструдера. Капают объем 10 мл липосом в экструдер в начале каждого цикла экструзии и собирают в стерильную пробирку или стеклянную пробирку коническим после каждого цикла экструзии.
- Удалить неразделанный инкапсулированные иогексол на 16 ч диализа с использованием молекулярной массой 100 кДа, отрезали (MWC) диализный мешок против 250-кратного объема избытка 0,02 мМ HEPES-солевом буферном растворе (HBS, рН 7,4). Например, поместите 1 мл раствора липосом внутри мешка диализом с помощью 250 мл HBS вне мешка в стакане.
- Концентрат CT-липосом с использованием 750,000 сономических MWC коммерческую систему тангенциального потока в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрат до конечной концентрации йода примерно 55 мг мл -1.
- липосом Характеристика
- Измерить эффективность инкапсулирования путем разрывания CT-липосом с использованием 10-кратного объема избытка этанола , чтобы освободить ioxehol , а затем разбавленным с помощью 100-кратного объема избыток деионизированной воды (т.е. 10 мкл липосом разрываются с использованием 100 мкл этанола , а затем разбавляли до конечного объема 10 мл).
- Определить концентрацию йогексола с помощью УФ-спектрометра с детектированием при длине волны 245 нм. Расчет эффективности инкапсулированных, принимая величину коэффициента высвобождаемого иогексола агента к количеству агента, добавленного в процессе приготовления.
- Измерьте диаметр и дзета-потенциал гидродинамический с использованием динамического рассеяния света частиц по размерам системы анализатора в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести КТ-раствора липосом путем 200x (т.е. 5 мкл липосом в 1 мл конечного объема) в деионизированной воде для облегчения измерений.
3. КТ опухолевой микроциркуляции и CT-липосомраспределение
Примечание: Следуйте инструкциям производителя для выполнения объемного сканирования, если используется другая версия программного обеспечения или оборудования.
- Обезболить каждой мыши, используя 2% изофлуран, смешанный с медицинским кислородом или воздухом и подтвердить зажимая палец и не соблюдая никакой реакции. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Зафиксировать животное в положении лежа пластырем лапы к тонкой пластиковой доске.
- Поместите заказ 27 G катетер, соединенный с 20 см на PE10 трубки, в боковую хвостовую вену и зафиксировать на месте с помощью нескольких кусков ленты.
- Подготовить 1 мл шприц, чтобы содержать, по меньшей мере, 200 мкл CT-липосом. Подготовьте 1 мл шприц с физиологическим раствором, чтобы использовать для промывки катетера. И, наконец, подготовить 1 мл шприц с, по меньшей мере 150 мкл свободного иогексола, смешанного с физиологическим раствором (9: 1 соотношение по объему).
- Поместите мышь ничком на микро-КТ планшете сканера. С помощью лазерной системы позиционирования для размещения TUMOR примерно в той же ориентации для каждого сканирования.
- Поместите CT-липосом шприц в шприцевой насос и прикрепить катетер к шприцу. Установите скорость насоса 10 мкл в секунду.
- Инициализировать систему, выполняя ярко-темно-калибровочный сканирование с использованием программного обеспечения консоли КТ-сканера. Выберите опцию сканирования ярко-темным для каждого протокола формирования изображения интереса, выберите ярко-темный из выпадающего меню и нажмите на кнопку сканирования, чтобы начать процесс калибровки.
- Выполните объемный анатомический микро-КТ опухоли до начала любой инъекции контрастного вещества. Посмотрите на индикатор консоли программного обеспечения томограф для обеспечения безопасности КТ-сканера блокираторы были очищены. На КТ сканера консоли выберите сканирования выберите энергию рентгеновского излучения 80 кВ, ток трубки 70 мА, и захватывает 1000 проекции изображения с течением времени 16 сек. Нажмите кнопку сканирования, чтобы начать сканирование.
- С помощью шприцевого насоса, чтобы ввести болюс КТ-липосом при концентрации 400 мг йода на кг-1. Установите насос для того чтобы придать объем приблизительно 150 мкл (при условии 25 г мыши). Нажмите кнопку "Пуск" на насосе, чтобы впрыснуть. Вручную промойте катетер с 50 мкл физиологического раствора (в два раза объем катетера), чтобы обеспечить весь объем агента посеянный и катетер ясно.
- Подождите 10 мин после инъекции CT-липосом, а затем выполнить вторую анатомическое сканирование, используя тот же метод и параметры, описанные в 3.5.
- Выполните сканирование АКД-CT, установив шприцевой насос для впрыска объемом 100 мкл свободного иогексола, смешанного с физиологическим раствором (соотношении 9: 1 по объему) с использованием той же установки скорости впрыска, описанной в разделе 3.3.
- На консоли КТ-сканера выберите 5 мин динамическое сканирование, которое использует установку рентгеновского энергии 80 кВ, энергии трубки 90мА, улавливает 416 изображений проекции каждую секунду в течение первых 30 секунд и с последующим приобретением каждые 10 сек , Захват 5 сек данных АКД-CT, а затем нажать кнопку запуска на injectioп насос.
- После АКД-КТ выполняют объемную анатомическую микро-КТ.
- Захват анатомических КТ-изображений между 48 и 72 ч после инъекции CT-липосом, используя те же самые объемные параметры трансформаторов тока, как описано в 3.5 шагов.
- Восстанавливают анатомические данные КТ и АКД-КТ с помощью программного обеспечения GPU-реконструкции.
- Загрузите изображение в программу реконструкции. Выберите интересующую область быть реконструирована рисовании ROI на изображение с помощью мыши. Установить место сохранения и имя файла для реконструированный отображаемого и выбрать выходной тип файла как '.mat'.
Примечание: Программное обеспечение автоматически установит реконструированного размер воксела к 0,153 х 0,153 х 0,153 мм 3 для анатомических сканирования и 0,153 х 0,153 х 0,462 мм 3 для сканирования АКД-КТ. Нажмите на кнопку "начать реконструкцию».
- Загрузите изображение в программу реконструкции. Выберите интересующую область быть реконструирована рисовании ROI на изображение с помощью мыши. Установить место сохранения и имя файла для реконструированный отображаемого и выбрать выходной тип файла как '.mat'.
- С помощью предварительного впрыска и 10 мин сканирование после инъекции CT-липосом для расчетаПлазма объемная доля , как описано ранее 3. Кроме того, использование предварительного впрыска и 5 мин после инъекции сканирование иогексола для расчета интерстициальный объемной доли , как описано выше 7.
- Получить интенсивность времени кривые (тиков) путем импорта данных АКД-CT в программное обеспечение, которое обеспечивает возможность идентификации области интереса (ROI) в пределах объема опухоли. Затем рассчитывают среднее повышение КТ в ROI в зависимости от времени. В этом эксперименте специальное программное обеспечение было разработано, чтобы определить ROI и рассчитать ТЭП.
- Получить количественные оценки перфузии и сосудистой проницаемости путем подгонки измеренных ТЭП с использованием кинетической модели двухкамерный копира. Место может быть выполнена с помощью программного обеспечения АКД-КТ анализа и использования априорной оценки объема плазмы фракции и фракции интерстициального объема в качестве фиксированных параметров в кинетической модели двухкамерный копиром. Использование ранее сообщалось о способах получения априорных оценок плазмыа и интерстициальные объемные доли 14.
4. Пространственные измерения опухолевого интерстициального давления жидкости
- Для измерения IFP соединить спинальную иглу 25 G к датчику давления и к системе сбора IFP через 50 см от PE20 полиэтиленовых труб. Промыть всю систему с гепарин сульфат / солевой раствор (1:10). Стерилизовать иглу с 70% изопропилового перед использованием.
- Включите систему сбора и запустить программное обеспечение сбора IFP и загрузить файлы настроек для калибровки системы измерений приобрести IFP в мм ртутного столба. Нажмите кнопку нажить непрерывно собирать данные IFP.
- Провести измерения IFP между 48 и 72 ч после инъекции CT-липосом (это соответствует приблизительное время пика накопления КТ-липосом в опухоли), с использованием способов, описанных в пункте 4.8. Присоединить иглу IFP к роботу CT-IFP.
- Выполнение калибровки сканирования для выравнивания систем координат дляробот CT-IFP и сканер КТ. Добавьте фидуциального вложение маркера для робота CT-IFP и выполнить четыре объемных КТ с нормирующего маркера в четырех различных положениях.
- Запуск программного обеспечения контроллера робота CT-IFP, инициализировать робота, и переместите робота на три позиции, введя х, у, z таргетинг позиции и нажав кнопку "Go".
- Возьмите КТ по следующему х, у, г координаты: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; и (4) 0,0,10. Выберите 90 кВ, 10 мА, 16 сек сканирования с помощью программного обеспечения КТ-сканера и нажмите 'Start', чтобы начать сканирование. Реконструировать сканирование, как описано в 3.10.
- Запустите программное обеспечение выравнивания робота CT-IFP. Нажмите на кнопку "Добавить", загруженную в регионе "Регистрационные данные" и выберите четыре реконструированные регистрации сканирования, полученные в 4.3, затем нажмите кнопку "открытым".
Примечание: Пиксель расположение нормирующего маркера будет автоматически введен в Softwaчисло рейнольдса- Нажмите на кнопку "Рассчитать" Transform, а затем нажмите кнопку "Применить" Transform. Это генерирует данные выравнивания, которые будут использоваться для преобразования робот CT-IFP системы координат к томографа системе координат. После завершения калибровки, прикрепить платформу животных к роботу CT-IFP.
- Обезболить каждой мыши, используя 2% изофлуран, смешанный с медицинским кислородом или воздухом и подтвердить зажимая палец и не соблюдая никакой реакции. Зафиксировать животное на платформе робота CT-IFP и расположите мышь таким образом, что опухоль доступна для системы робота CT-IFP. Зафиксировать опухоль с помощью липкой ленты таким образом, что он не двигается во время введения иглы IFP.
- Провести анатомическую микро-КТ до введения иглы IFP. Реконструировать данные КТ, используя шаги, описанные в 3.10.
- Загрузите предварительно иглы вставки CT данных в программное обеспечение выравнивания робота CT-IFP. Отрегулируйте окно и уровень визуализации опухоли. Нажмите на гое край опухоли в любом изображении, а затем нажмите на втором месте обода.
Примечание: Программа будет вычислять ряд позиций вдоль линейной линии между двумя позициями. Обратите внимание, что х, у и г координаты для ряда 5 до 8 равномерно расположенных позиций из списка. - Подготовка системы IFP путем промывки иглы с гепарином физиологическим раствором перед введением.
- Введите первые заранее определенные позиции иглы в х, у, г, в программное обеспечение управления роботом CT-IFP и пресс-перейти на кнопку "Go" для перемещения робота в нужное положение. Нажмите кнопку "Вставьте иглу", чтобы вставить иглу в ткань.
- После введения иглы обеспечивают хорошую жидкостную связь между иглой IFP и ткани, зажимая и отпуская PE20 трубки, отметив, что измерение увеличивается IFP и возвращается к предварительно зажимая значение на программном обеспечении приобретения IFP. Отклонить измерения, которые не возвращают к исходному уровню.
- Приобретатьанатомическое КТ с иглой, вставленной, а затем нажмите кнопку "RETRACT игла" на программное обеспечение управления роботом CT-IFP, чтобы убрать иглу из ткани. Отклонить любые IFP измерения, где значение IFP не возвращается к значению вставки предварительно иглы после извлечения иглы. Это означает, что игла может быть засорены во время измерения. Повторите шаги 4.8 до 4.10 для каждого положения иглы.
- Определить положение иглы в пределах объема опухоли путем вычисления x, y, и Z позиции иглы порта относительно центра масс объема опухоли, как это определено в пост-вставки объемной КТ иглы.
- Возвращение животных в клетки после того, как все измерения завершены. Не оставляйте животных без присмотра, и заботиться, чтобы наблюдать за ними, пока сознание не было вновь, и они способны поддерживать грудины лежачее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Указанный протокол должен давать CT-липосом с инкапсулированным концентрацией иогексола, средний диаметр липосом и дзета - потенциал 55 мг мл -1, 91,8 ± 0,3 нм и -45.5 ± 2,5 мВ соответственно. На рисунке 1а включает в себя репрезентативную АКД-КТ результаты, получая временные ряды объемных данных, которые показывают временные изменения в внутри опухолевого накопления иогексола. Выбор ROI в пределах опухоли дает TIC , которая может быть определена количественно с использованием методов кинетического моделирования трассирующие для получения оценок перфузии, проницаемости сосудов, плазмы объемной доли и интерстициальной объемной доли (рис 1b). В этом исследовании, кинетическая модель двухкамерный трейсер использовали и подтянутым к измеренной ТЭП с использованием нелинейной кривой подгонки рутина , реализованный в Matlab 14. Сегментация объема опухоли на несколько областей, представляющих интерес одинакового размера позволяет количественно оценить тон пространственное распределение гемодинамических параметров в пределах объема опухоли (рис 1в). Сегментация может быть выполнена либо вручную, что отнимает много времени и трудно, или автоматически, как выполняются здесь, используя алгоритм, который делит опухоль в нескольких трансформирования одинакового размера с помощью сферической системы координат. Методы АКД-CT обеспечивают количественные оценки пространственного распределения перфузии, проницаемости сосудов, плазменной объемной доли и интерстициальной объемной доли. наблюдались эти параметры, чтобы быть пространственно неоднородны с более высоким уровнем перфузии, плазмы и интерстициальной объемных долей по периферии по сравнению с центральным объемом опухоли.
Метод объемной визуализации КТ выявляет биораспределение и внутри опухолевой распределение CT-липосом. На рисунке 2а показаны биораспределение CT-липосом на 48 ч после инъекции. Агент по-прежнему циркулирует в год сосудистой системы, при значительном поглощении наблюдается в селезенке и печени. Внутриизмерительные опухолевый накопление КТ-липосом наблюдалось гетерогенна, с преимущественно периферического накопления по сравнению с центром, как обозначено ярких областей в пределах объема опухоли (2б).
Объемный КТ изображения может использоваться для отслеживания местоположения измерений IFP с использованием установки робота - СТ-IFP. На рис.3 показано размещение иглы IFP в пределах объема опухоли , как визуализируют с помощью высокого разрешения микро-КТ. Игла может быть четко определены в объеме опухоли , позволяя для пространственной локализации IFP измерений в пределах объема опухоли (рис 3b). Можно сформировать пространственную карту IFP по всей опухоли путем выполнения нескольких IFP измерений в пределах объема опухоли. Пространственное IFP затем могут быть соотнесены с соответствующими измерениямимикроциркуляция опухоли и накопление КТ-липосомами.
Объемный КТ томография позволяет общей системе отсчета , дающими возможность совместно локализовать измерения гемодинамики, IFP, и накопление КТ-липосомами. Рисунок 4 приведен пример пространственно колокализуются измерений КТ-липосом накопления, IFP, перфузия, проницаемость сосудов, плазма объемная доля, и интерстициальный объемная доля. Было отмечено, что перфузию и объем фракции плазмы значимо коррелировали с интра-опухолевый накопления КТ-липосом в подкожных MDA-MB-231 опухолей. Кроме того, радиальное распределение IFP коррелирует с гемодинамическими измерений. Эти результаты указывают на сложный пространственно-временная связь существует между микроциркуляции опухоли, IFP и внутрибрюшного опухолевое накопления липосом 14.
Рисунок 1: ДСЕ-КТ опухоли микроциркуляции (а) представитель серии временных КТ - изображений , собранных в пределах объема опухоли, изображающая кинетику контрастный агент , как функции от времени.. Красный контур представляет собой ROI, где измеряется кривая интенсивности времени (TIC). (Б) TIC годен с использованием двухкамерной кинетической модели копира , чтобы получить количественные оценки гемодинамических параметров в пределах ROI. (С) представитель пространственное распределение количественных параметров гемодинамики в опухоли. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Объемный КТ-визуализации липосом Accumul вания. (а) представитель 3D - объем-воспроизводимое изображение демонстрирует биораспределение CT-липосом. (Б) представитель осевые, корональной и сагиттальной срезы , взятые через центр опухоли , показывающий внутрисетевой опухолевое накопление КТ-липосом на 48 ч после инъекции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Изображение Ведомый IFP Измерения (а) Представитель 3D объемного изображение из системы робота CT-IFP (зеленый цвет) вставки после иглы в подкожной опухоли на 48 ч после инъекции CT-липосом (оранжевый). (Б) представитель КТ изображение вставки после иглы./54226/54226fig3large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Колокализуются Измерения опухолевого микроциркуляции, IFP, и накопление КТ-липосом панель , показывающая репрезентативную пространственное совместной локализации КТ-липосом накопления приняты 48 ч после инъекции, IFP, перфузии, проницаемость сосудов, объемной фракции плазмы и интерстициальный объемная доля. Повторная печать с разрешением от 14 лет . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы измерения на основе изображения, представленные здесь позволяют определить пространственное распределение свойств опухоли микроциркуляции, IFP и КТ-липосом накопления. Предыдущие попытки связать эти свойства полагались на выполнение объемных измерений на нескольких несущих опухоль животных и , следовательно , не хватает чувствительности для выяснения механизмов , ответственных за неоднородности в внутрибрюшного опухолевое накопления , которые обычно наблюдались для наноразмерных систем доставки лекарственных средств 15. АКД-КТ обеспечивает инструмент для измерения внутри- опухолевый вариации свойств микроциркуляции опухоли, объемная КТ дает точного описания кинетики осаждения КТ-липосом, и робот-система КТ-ПСИ обеспечивает инструмент для выполнения пространственной отображение IFP в то же животное. Кроме того, АКД-КТ томография является клинически одобрен метод измерения опухолевые гемодинамику в клинических условиях, что делает результаты этого исследования потенциально клинически TRANSLстол.
Учитывая сложность измерений, есть несколько важных факторов, чтобы обеспечить сбор надежных наборов данных. АКД-КТ на основе количественной оценки микроциркуляции опухоли, вероятно, наиболее трудно обеспечить точные оценки опухолевых гемодинамики. Это требует получения ТЭП с высоким отношением сигнал - шум (SNR) и используя надежный алгоритм подбора для количественного определения тиков 16,17. Визуальный осмотр ТЭП может быть использован для удаления данных низкого SNR из анализа. Кроме того, если не принять мер , то установка высокого SNR ТЭП может также привести к ошибочным оценкам опухоли перфузии, проницаемости сосудов, плазмы объемной доли и интерстициальный объемной доли 16. В целях обеспечения максимальной точности количественного определения использовалась стратегия для получения модели независимой оценки плазмы и интерстициальной объемных долей, которые затем используются в качестве основных параметров в процессе модели подгонки измеренных ТЭП. Этот методобеспечивает надежные оценки перфузии опухоли и проницаемости сосудов получают 15.
Надежный анализ внутрисуставной опухолевый распределения КТ-липосом требует проведения объемной КТ после достаточного накопления агента. Из предыдущих исследований, накопление опухоли пик КТ-липосом происходит между 48 до 72 ч в ксенотрансплантатов мыши 3,15. Кроме того , существует линейная зависимость между концентрацией CT-липосом и контрастного усиления в компьютерной томографии , позволяющей для простого количественного вариаций внутри опухолевого накопления КТ-липосом 15.
Точные измерения IFP с использованием метода игольчатый основе требуется хорошая жидкостную связь между катетером и ткани. Кроме того, важно только опухолей использования, которые имеют высокий уровень центральной опухоли IFP (> 5 до 10 мм рт.ст.), в противном случае будут минимальными пространственные вариации в IFP. Пространственные измерения IFP с использованием CT-IFP ограбитьOT systemcan быть сложной задачей из-за движения ткани, вызванное введением иглы. Обработки изображений до и после размещения иглы имеет решающее значение для точного определения размещения иглы; Тем не менее, это может быть трудно соотнести положение между последующими игольчатых размещений из-за ткани короблению между измерениями. Было установлено, что случайный выбор игольчатых позиций, приводит к значительной деформации ткани при введении иглы. В результате, этот способ при условии, наименее точный пространственное отображение IFP. С другой стороны, выполнение измерений вдоль линейной дорожки поперек объема опухоли и введение иглы по касательной к трассе может улучшить пространственную точность измерений IFP. Установка иглы по касательной к дорожке минимизирует эффект деформации ткани вдоль направления измерения дорожки.
Это исследование продемонстрировало способность измерять пространственное распределение опухолей микроциркуляции, IFP и накопление КТ-липосом в индивидуальной опухоли, После освоения этих методов, можно затем выполнить эти измерения независимо друг от друга или вместе, чтобы охарактеризовать микроокружение опухоли и ее влияние на доставку лекарственного средства. Используя эти методы в модели рака молочной ксенотрансплантата MDA-MB-231 показали , что перфузионная и объем фракции плазмы являются сильными медиаторами внутриатомного опухолевое распределения липосом 14. Там не было установлено, что тесная взаимосвязь между IFP и распределение липосом. Тем не менее, ПСИ был сильно коррелирует с измерениями опухоли перфузией, предполагая, что ПСИ может играть косвенную роль в опосредовании распределение липосом путем модуляции кровотока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells | ATCC | HTB-26 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Lipids Inc., USA | 850355P | |
| Cholesterol (CH) | Avanti Lipids Inc., USA | 700000P | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) | Avanti Lipids Inc., USA | 880128P | |
| Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml | GE Healthcare, CA | ||
| 80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 10 m Lipex Extruder | Nothern Lipids Inc, CA | ||
| Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa | Spectrum Labs, USA | ||
| 750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column | MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA | ||
| Peristaltic pump | Watson Marlow Inc., USA | ||
| UV spectrometer | Helios γ, Spectronic Unicam, USA | ||
| 90Plus particle size analyzer | Brookhaven, Holtsville, USA | ||
| eXplore Locus Ultra micro-CT system | GE Healthcare, CA | Manipulated using CT-Console Software | |
| AxRecon GPU-based Reconstruction | Acceleware Corp. CA | ||
| 27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set | Terumo Medical Products, USA | SV*27EL | |
| PE20 polyethylyne tubing | Becton Dickinson, USA | 427406 | |
| Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle | Becton Dickinson, USA | 405140 | IFP needle |
| P23XL pressure transducer | Harvard Apparatus, CA | P23XL | |
| PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 | ADInstruments Pty Ltd., USA | PL3504, FE221 | IFP acquisition system and acquisition software |
| CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) | Parallax Innovations, CA | Manipulated using CT-IFP robot Control Software | |
| CT-IFP robot alignment software | Custom Matlab software | ||
| DCE-CT Analysis Software | Custom Matlab software | ||
| Matlab 2013b | Mathworks, USA |
References
- Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19 (12), 2577-2584 (2008).
- Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution. Molecular Imaging. 12 (3), 148-160 (2013).
- Stapleton, S., et al. A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors. PloS one. 8 (12), e81157 (2013).
- Zheng, J., et al. A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery. Biomaterials. 67, 160-168 (2015).
- Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications. Pharmaceutical research. 24 (6), 1193-1201 (2007).
- Harrington, K. J., et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. Clinical Cancer Research. 7 (2), 243-254 (2001).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).
- Stapleton, S., Milosevic, M. F. Cancer Targeted Drug Delivery. , Springer. 241-272 (2013).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).
- Bax, J. S., et al. 3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions. Medical physics. 40 (1), 011909 (2013).
- Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation. Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability. Medical physics. 36 (7), 2923-2933 (2009).
- Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37 (1), 30-51 (2010).
