Summary
適応進化と分離技術は、ヘキソースおよび酵素でペントース混合糖がundetoxified加水分解物を糖化し、40以上のグラム/ Lのエタノールを蓄積するために急速に消費することができますScheffersomyces stipitis株NRRL Y-7124の誘導体を得るために説明し、実証されています。
Introduction
リグノセルロース系バイオマスの推定年間13億ドライトンは、エタノールの生産を支援し、米国は30％、その石油消費量を削減する可能性があります。1グルコースとキシロースの豊富な植物バイオマス加水分解利回り糖混合物は、発酵阻害物質が必要な化学的前処理によって生成されますがヘミセルロースを分解し、酵素の攻撃のためにセルロースを露出させます。酢酸、フルフラール、およびヒドロキシメチルフルフラール（HMF）は、前処理の間に形成する多くの阻害剤の中で重要な構成要素であると考えられています。フォワードリグノセルロースエタノール産業を移動させるために、研究手順は、生存し、効率的に必要とされるそのような阻害化合物の存在下でヘキソース及びペントース糖の両方を使用するように機能し得る酵母株の進化を可能にします。例えばサッカロマイセス・セレビシエなどの伝統的な工業用酵母株、かなりの追加の弱点は、効率的にfermenできないことです植物バイオマスの加水分解物で使用可能なキシロースのt。
ピキアstipitis型株 NRRL Y-7124（5773 CBS）は、最近、名前が変更さScheffersomycesのstipitisは、よくキシロースをエタノールに発酵することが知られているネイティブのペントース発酵酵母である。2,3ここに追求された株NRRL Y-7124の進化それが報告されているので、最適なメディアで4,5,6。少しキシリトール副産物と40グラム/ Lを超えると経済的に回収エタノールを蓄積するネイティブの酵母株の最大の可能性を持っている、S。 stipitis株 NRRL Y-7124は0.41±0.06N・G / G、高細胞密度培養（6グラム/ L細胞）である。7,8抵抗の収率で40時間（4 cm G / L / hr）で70グラム/ Lのエタノールを生産します発酵エタノール、フルフラールの阻害剤、およびHMFも報告されている、 図9およびS. stipitisは、商業規模のエタノールproductioで利用できる最も有望なネイティブペントース発酵酵母の中にランクされていますnはリグノセルロースから。10我々の目的は、産業用途に適した株NRRL Y-7124のより強固な派生物に向かって進化を強制するために、多様なundetoxifiedリグノセルロース加水分解物とエタノールの選択圧を適用することでした。求められる改善された機能のうち、キーが濃縮された加水分解物中の速い糖取り込み率、より効率的な混合糖利用のための減少diauxy、エタノールおよび阻害剤の高い公差ました。 S.の応用undetoxified加水分解物へのstipitisは 、overlimingなどの加水分解物の無害化処理に関連した追加営業費用を排除するための研究の主要な焦点でした。
二つの工業的に有望な加水分解物は、進化を強制的に適用した：糖化アンモニア繊維拡張前処理トウモロコシ茎葉加水分解物（AFEX CSH）を酵素や酸で前処理スイッチグラスの加水分解液（PSGHL）を希薄11,12 AFEX前処理技術がに開発されています。希薄酸前処理が最も一般的に酵素糖化用セルロース系バイオマスを露出するように練習し、現在最も低コストの技術を表しながら、発酵阻害物質の生成を最小限に抑えます。 PSGHLは、前処理後に残ったセルロースから分離可能であり、特徴的に加水分解されたヘミセルロースからキシロースが豊富ではなく、グルコースが低いです。 AFEX CSHとPSGHL組成物は、進化のプロセスを管理するために悪用された重要な側面が互いに異なります。 AFEX CSHはPSGHL（ 表1）と比較して、アミノ酸およびアンモニア態窒素源でフランアルデヒド及び酢酸インヒビターで低いが高いです。 PSGHLが優勢糖が利用可能であるキシロースの新たな課題が発生します。したがってPSGHLは、具体的には、加水分解に改善されたキシロースの利用のために利用可能な酵母の商用利用を防止弱点を豊かにすることが適切です。でもネイティブペントース発酵酵母の中で、次善の砂糖キシロオリゴへの依存SEは、細胞の成長をサポートすると修復はさらに難しいため、様々な理由のの加水分解物で次のようになります。による酸化還元不均衡への代謝に構造的完全性、および中断をセルに広範囲の損傷を引き起こす栄養不足、阻害剤9窒素の補給を、特にの形でアミノ酸は、発酵のためにかなりの運転コストを表すことができます。分離株のスクリーニングとランキングに窒素補給の影響は、スイッチグラス加水分解物で調査しました。
改善された個体はSの天然の遺伝的多様性に依存し、複数の選択圧を使用して進化する集団に濃縮しました2さまざまな加水分解物、エタノールまたはUV放射への曝露によって誘発される人口と突然変異stipitis。選択圧は、Sの進化の進行状況を調査するために並列に直列に適用されました成長し、加水分解において効率的に発酵することが目的のデリバティブに向かってstipitis（ 図1）。ますます困難な加水分解物中の官能集団の反復培養は固形分20％の負荷で調製12％グルカンAFEX CSHあるいはPGSHLのいずれかの希釈系列を用いたマイクロプレートで達成しました。連続培養におけるキシロースに対するエタノールの不自由な成長のアプリケーションさらに向上AFEX CSHは、キシロース利用の抑制をエタノールに少ない感受性を実証する表現型を濃縮することにより、集団を適応しました。後者の特徴は、最近、グルコース発酵以下の菌株NRRL Y-7124によってペントース利用に問題が示された。PSGHL上の8濃縮は次の加水分解物の機能性を広げるために調査しました。
推定は、Sの誘導体を向上しましたstipitis NRRL Y-7124は、最も一般的な集団からコロニーを選択するストレス状態と希釈平板の下で目標と濃縮を使用して、進化過程の各段階から単離しました。無次元相対性能指数（RPIS）は、速度論的挙動は、印加異なる加水分解物の種類および栄養補助食品を評価した全体的なパフォーマンスに基づいて、歪みをランク付けするために使用しました。様々な適応手順の成功は、Sの機能性を向上させるがリグノセルロース加水分解物でstipitisが以前undetoxified加水分解物に経済的なエタノール生産を実証する菌株は、以前に報告されていない、文書化されている。13-17進化の手順を使用して、ここでより詳細に可視化するために、Slininger ら 18を大幅に超える改善された株を開発します親株NRRL Y-7124とAFEXのCSHで> 40グラム/ Lのエタノールを生産し、適切な窒素源を補充した糖化スイッチグラス加水分解物（SGH）を酵素することができます。これらの新規株は、エタノール産業の発展リグノセルロースにし、追加のゲノミクス研究棟の対象として今後注目されています以前に配列決定株NRRL Y-11545のもので、図1に図解さ進化のさまざまな段階の間に生成トップの株の19ゲノミクス研究はさらに菌株改良研究の前置きとして、開発中に発生した遺伝的変化の歴史を解明することになります。
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Protocol
1.アッセイのための材料および装置の起動準備
- 進化、単独での使用とランク付け手続きの前処理反応で18〜20％の初期バイオマス乾燥重量を使用して加水分解物を準備します。 Slininger らは詳細な方法のために2015年18進化 、単離またはランク付けに使用される窒素サプリメントN1またはN2とAFEX CSH、PSGHL、およびSGHを準備するために参照してください。各加水分解型の組成については、 表1を参照してください。
注：窒素比（C：N）に1モルの炭素：42に要塞SGH-N1 = SGH：SGHの窒素要塞は、以下のように定義さSGH-N1またはSGH-N2と命名した尿素を含む窒素源とし、ビタミン、遊離アミノ酸定義されたソースからのカゼイン、D、L-トリプトファン、L-システイン、及びビタミンからの酸（例えば、〜モル窒素Nの15％は第一級アミノ窒素（PAN）及びであること〜Nの85％が尿素です）。 SGH-N2 37に要塞化された= SGH：1 C：最も低コストの商用ソースOなどの尿素および大豆粉とNFのアミノ酸およびビタミンは、〜PANからNの12％、尿素88％を提供します。 - ARS・カルチャー・コレクション（農業利用研究国立センター、ピオリア、イリノイ州）から親株の凍結乾燥文化、Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124（CBS 5773）を取得し、指示通りにグリセロールストック培養を準備します。 -80℃で、親酵母および10％グリセロール中でその誘導体の保存培養を維持します。
- 寒天プレート酵母麦芽ペプトンデキストロース（YM）にストリークグリセロールストック（3グラム/ Lの酵母抽出物、3グラム/ Lの麦芽エキス、5グラム/ Lペプトン、10グラム/ Lのブドウ糖、20グラム/ L寒天）とインキュベート48- 25℃で72時間。8開発のプレートは液体前培養接種材料として使用する前に4℃で一週間まで保存することができます。
- 準備最適なミディアム（ODM）、以前に親strでキシロースからエタノールへの最適な変換のために開発された工業用製剤手順20と互換性の合成培地を定義AIN Scheffersomyces（ピキア）NRRL Y-7124をstipitis。7、挑戦エタノールにもキシロース給電連続培養進化を発酵性能のバイオアッセイのためのすべての前培養し、培養物中で定義された培地を使用して。 ODMの組成を表2に参考のために記載されています。
- 前述のように、18は 620nmの（620）での培養の吸光度を測定するために、適宜、cuvette-またはマイクロプレート読み取り分光光度計を用いて細胞バイオマスを分析します。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはより高いスループットのために、グルコース及びキシロースのロボット酵素決意を用いて培養試料中の糖類、エタノール、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（HMF）、および酢酸を定量します。
2. AFEX CSHのシリアル転送中に堅牢なデリバティブを充実
- 株NRRL Y-7124の前培養を接種します。 75 mlのODM + 150グラム/ LのキシロースへYM寒天から転送細胞はO下で増殖する能力を維持するためsmoticストレス。シリコンスポンジで閉じた125ミリリットルフラスコ中の前培養は、（回転数150rpm、1 "軌道）を振とうしながら25℃で24時間プラグインキュベートします。
- 使用するために冷たい水の中に百分の6から12グルカンAFEXのCSHの凍結アリコートを解凍します。必要に応じてpHを5に調整し、フィルタの前の96ウェルマイクロプレートに希釈系列を調製する滅菌。
- 初期吸光度（620 nm）の620≥0.1を可能にするために、ウェルあたり前培養を数マイクロリットルの接種、その後、ウェルあたり50μlのと加水分解物希釈あたり8ウェルを有するマイクロプレートを記入してください。湿度のための湿ったペーパータオルでプラスチックの箱に25℃で静的に24〜48時間培養します。
- 初期A 620≥0.1を達成するために、目に見えて、新しい加水分解物希釈系列の各ウェルに620> 1、転送1-5μlに成長した最も集中加水分解物希釈を使用しました。
- 分光光度計を用いてマイクロプレートで増殖培養A 620を監視します。未接種の希釈系列SER対照およびブランクとしてVES。プレートの蓋は、汚染を防止するために、監視中にオンのまま、との読みがそれに応じて調整されています。
- 定期的に改善された株のその後の単離のために、または継続的な加水分解物希釈系列をreinoculatingで使用するための適応培養物のグリセロールストックを準備します。植民地化最大の加水分解物濃度の株式、プール4つのウェル（200μl）を調製しました。 -80℃で10％グリセロール中で細胞を凍結する、クライオバイアル中の20％の滅菌グリセロールで1：1を混ぜます。
- 12％グルカンAFEXのCSHの伸びは24時間で一貫して表示されるまで繰り返して、2.3から2.6を繰り返します。
3. AFEX CSHに濃縮した後、単一細胞トレラントデリバティブを分離
- ストリークは、（620〜0.1初期）3マイクロプレートウェルのそれぞれに3％または6％グルカンAFEX CSH（pHは5）の50μLを接種するYM寒天培地への適応培養物のグリセロールストック、及び使用のスジを選択しました。ステップ2.3のように24時間マイクロプレート培養します。プールのレプリカYMまたは6％グルカンAFEXのCSH寒天への最高の加水分解物力強い成長と強度、および希釈プレートでTE植民地化井戸。 1として、後者を準備します。フィルタの1ミックス暖かいオートクレーブし30グラム/ Lの寒天液で12％グルカンAFEX CSHを滅菌しました。
- グリセロールストック培養として凍結し、25℃で24〜48時間のインキュベーション後に成長を示す最高希釈プレートから5単一コロニーを選択してください。ストリークYMプレートに各コロニー。 24時間インキュベート。無菌ループでは、10％グリセロールの少量に細胞の先進連勝を転送し、細胞を懸濁し、-80℃で凍結するために2-3クライオバイアルに配布するミックス。
4.親と比較するとAFEX CSHトレラント誘導体の性能を評価します
- テストは簡単な6％グルカンAFEX CSHバッチ培養で分離さ。
- 48時間プレートから転送細胞は、620 = 10. 1μlの細胞懸濁液を調製してpH 7リン酸カリウム緩衝液（0.4 mM）のグリセロールストックから画線620 = 0.2を初期する50μlの3％グルカン加水分解物の4つのウェルのそれぞれに接種するために、各サスペンション。ステップ2.3のように24時間マイクロプレート培養します。滅菌水で3：グルカンAFEX CSH 1を12％に希釈してpHが5で3％グルカンAFEXのCSHを準備します。
- 転送2 24時間のマイクロプレートウェルは、完全な強さの50％で使用されるpH 5 12％グルカンAFEXのCSHの25ミリリットル前培養に接種します。 〜150rpmで（1 "軌道）、25℃にて24時間、シリコンスポンジの閉鎖と50ミリリットルフラスコ中で前培養をインキュベートする加水分解物を1希釈することにより、半強12％グルカンAFEXのCSHを準備します。滅菌水で1。
- 620 = 0.1を初期と同様の25ミリリットルの成長培養液に接種するために半強加水分解前培養を使用してください。 （4.1.2）上記のように成長培養をインキュベートし、毎日（0.2ミリリットル）をサンプリングします。バイオマスの蓄積（620）および糖と発酵生成物（HPLC）の濃度を監視します。
- また、リピッチ（ すなわち 、収穫とreuse）8％グルカン加水分解物のバッチ培養における試験のために6％グルカンAFEXのCSH成長酵母集団、前述のように18
- 前述したように、12％グルカン加水分解物に供給することによりrepitched 6％グルカンAFEX CSH培養物の代わりに、さらなる試験集団。18
- 混合糖類とODMのバッチ培養で分離株のdiauxicラグをテストします。
- YMグリセロールスジからループ伝達によってシリコーンスポンジの閉鎖と125ミリリットルフラスコ中の150グラム/ Lのキシロースで75ミリリットルのODMの前培養を接種します。ステップ2.1のように24時間インキュベート。
- ODMはpH6.5で75グラム/ Lのグルコースおよび75グラム/キシロースのLを含むと同様の75ミリリットル試験培養物を接種するために予備培養物を使用してください。 25℃、150rpmでフラスコを振ります。毎日サンプル。
- 初期pHをpH 6-7デュを維持するために、試験培養物中で6.0±0.2に設定されている以外は代替的に、同様のプロトコルを使用して、グルコースおよびキシロースの発酵中diauxyの0-15 G / L酢酸の影響を試験します前述のように、酢酸消費を鳴らす。18
5.エタノールチャレンジキシロース利用のために選択する連続培養を適用します
- 60〜100グラム/ Lのキシロース、pHは6.3±0.2で20〜50グラム/ Lのエタノールで連続培養フィード培地としてODMを準備します。 ~0.5エタノール/ gキシロースの潜在的な収量を想定150グラム/ Lのキシロースの部分的な発酵をシミュレートするために、キシロースおよびエタノールの組み合わせを選択し、50〜70グラム/ Lの発生するエタノールの潜在的に対応する。8
- 連続培養の接種物を調製するために、エタノールフリーODM（100グラム/ Lのキシロースの75ミリリットルに48時間YMプレートからAFEX CSHトレラントコロニー（コロニー5に類似した例では、 図1）ループにより代表を転送し、この場合には）125ミリリットルフラスコインチ25℃、24時間、150 rpmで（1 "軌道）でインキュベートする。ボリュームを保持する最初の連続培養のそれと一致するように前培養ODMのキシロース濃度を選択してください。
- pHは6.3±0.2でのODMの連続培養保持容量はコロニー5に類似AFEX CSHトレラント分離株（ 図1の前培養濃縮物の〜5〜10ミリリットルと+ 20グラム/ Lのエタノール100グラム/ Lのキシロースを持つ接種）は、最初の620〜0.5で100ミリリットルを得ることができます。ジャケット100 mlのスピナーフラスコ中で25℃で培養保持容積（V R）を維持し、200rpmで撹拌し、滅菌pH電極、pH調整および温度制御循環水浴を装備。
- 最初は、細胞増殖が原因エタノール曝露に遅くなりますので、pHが作動ポンプを使用して投薬するフィード培地を設定します。このように、さらにpH低下を停止し、培養発酵は5.4にpHが低下したときに100グラム/ Lのキシロースおよび50グラム/ LのエタノールでpH-6.3 ODMを供給するためのポンプを設定します。廃液ポンプが連続的に培養表面をスキミングで100mlにボリュームを維持します。その結果、エタノール濃度は、継続的な代謝や摂食と共に上昇します。 廃液測定し、連続培養物から生細胞濃度、製品および基質の分析のためのすべての48〜72時間のサンプル（1-2 ml）を描き、前述したように。18生細胞濃度を見つけるには、内のサンプルの連続1：10希釈液を作りますバッファ（4.1.1を参照）と拡散板YM寒天培地に希釈（1.2.1を参照）。廃液回収率（Q）に基づいて、Sの例では、希釈率（D）（Q / V R）を計算し、そしてstipitisは、それが0から0.01時間に変え-1。
- 濃縮で、その時点で最も普及している堅牢な入植を表す、30から100個のコロニーを形成するバッファリングされたサンプルの希釈液の生存性プレートから単離することにより、定期的にグリセロールストックを保存します。 10％グリセロールを約5 mlの洪水プレート重複クライオバイアルの調製を可能にします。メンテナンスや休息のために、連続培養を停止し、必要に応じて最新の（耐性）グリセロールストック（複数可）を使用して再起動します。
- 、ほとんどのストリークグリセロールストック（複数可）を再起動するにはYM寒天培地に耐性集団とは、上記のようにインキュベーションのためにエタノールフリーODMの前培養物にループによって24〜48時間細胞を移します。前培養酵母の濃縮物を使用して620 0.5初期するODMのボリュームを保持している100ミリリットルに接種し、フィード培地の流れが再開される前に、文化はバッチ式固定相に成長することができます。
- 文化は0.01時間-1のキシロース上> 25グラム/ Lのエタノールの存在下で>で着実に成長することができた場合は、低で連続培養フィード（ODM + 60 30〜50グラム/ Lの範囲グラム/ Lのキシロース+エタノール）を起動希釈率は〜0.01時間-1ボリュームを保持100mlに（最初にODM +60 G / Lキシロース+が20g / Lエタノール）。時間が経つにつれて、50グラム/ Lに向けてフィードにエタノールを上げます。グリセロールストックでの高度な集団をキャプチャします。
注：低希釈率を維持することは、十分に高い細胞濃度の形成は、酸素の可用性とサポート発酵を低減することができます。 - 任意選択的に、紫外線（UV）irradiatを適用グリセロールストック集団への毎月のイオンは、連続培養をreinoculateするために使用されます。
- 60グラム/ Lのキシロース、および単一の滅菌フラスコ内のすべての株式をプールを備えた（前培養のように）ODM 10ml中のグリセロールストックスジからの再懸濁コロニー。わずか6 / mlのプレートを4-5ペトリ皿の底部を覆うように、約5×10 8の生細胞/ mlでプールした細胞懸濁液を適用します。標準的な使い捨てペトリプレートの6ミリリットルカバレッジを得るためには、表面張力を克服し、その後9ミリリットルを除去するために15ミリリットルを分配します。
- 生物学的安全キャビネット内の光源からのUVする各オープン培養プレートを公開します。希望の殺傷率> 90％を得るために、UV露光時間または距離を調整します。ここでは、ソースから約56センチメートルで45分間さらします。
- 照射前後の板細胞懸濁液を希釈します。コロニー形成単位に基づいて推定キル率。 S.のための例をstipitis、殺虫率は〜97％でした。
- 箔-COVにUV-さらされた培養物（24〜30ミリリットル）を転送50ミリリットルのフラスコをered、および生存細胞の割合が小さい〜1×10 8生存可能なSに再入力できるようにするために24時間25℃、150rpmでインキュベート細胞/ ml stipitis。培養物をインキュベートしている間の写真の再活性化を防止することにより、ホイルカバーが突然変異を保持します。
- 〜1×10 7生存細胞/ mlに連続培養を接種するために再増殖突然変異を誘発文化を使用してください。選択プロセスを継続するためにエタノールに富むODM + 60グラム/ Lキシロース媒体フィードを再起動します。
6.グリセロールストック集団を評価し、エタノールの存在下で改善されたキシロース発酵を持つものを同定
- ストリークは、エタノールの存在下でのキシロースの最高の成長と発酵のための画面の最初のステップとして、YM寒天培地にグリセロールストック培養液を選択しました。
- 150グラム/ LのグルコースとODMで75ミリリットルの前培養にスジ寒天からスクリーニングされる各進化人口を移し、125ミリリットルのフラスコ96でインキュベート試験培養物のための接種材料として使用する前に時間。大グルコース成長集団はキシロース資化のための酵素の誘導が必要になります。
- 60グラム/ Lのキシロース+ 30〜45グラム/ LのエタノールODMで40の620の初期、及び25℃でインキュベートし、30ミリリットルに細胞を懸濁、各培養を収穫、誘導をテストするには、回転数150rpm（1 "軌道）シリコンスポンジクロージャで50mlフラスコ中。HPLC分析によってキシロースの取り込みを監視するために1日2回のサンプルを描画します。
- また、Slininger らに記載されているように、18は 、エタノールの存在下でのキシロース上での増殖を評価する125ミリリットルフラスコ中の150グラム/ LのキシロースとODMの75ミリリットルにループ伝達することにより、各進化人口の前培養を準備し、96をインキュベートします25℃、150 rpmで（1 "軌道）のhr。ODM + 60グラム/ Lのキシロース+ 125ミリリットルフラスコ中の30〜45グラム/ Lのエタノール25ミリリットル中0.1の低い初期620に試験培養物を接種する。インキュベート25℃、300 rpmで、1 "軌道とサンプルでフラスコ。
- ステップ6の結果に基づいて、上に成長し、エタノールの存在下でキシロースを発酵させる優れた能力を示すグリセロールストック集団を選択します。ストリークプレートにこれらを使用してください。ストリーク次いで、プレートを細胞懸濁液を620 = 0.5まで、96ディープウェルプレートで前培養を接種するために使用される620 = 5の高密度緩衝細胞懸濁液を調製するために使用されます。 ODM + 50グラム/ Lのキシロース（なしエタノール）で1：PSGHLに1ミリリットル予備培養物が1で混合接種します。空のウェル96ウェル、通気低蒸発とディープウェルプレートを25℃で48時間、400rpmで、1 "軌道のためにカバーしています。独立した別のグリセロールストック集団で前培養をインキュベートします。
- 1 PSGHL：ODM + 50 20、30、または40グラム/ Lエタノールでグラム/ Lのキシローストレラント入植を豊かにするために、各前培養物を使用して、16 1ミリリットルが1で620〜0.5を初期する文化を複製接種。濃縮cultuをインキュベート前培養と同様にresは。
- それぞれ異なるグリセロールストックについては、最も高いエタノール濃度が成長し、キシロース使用を可能と培養ウェルを収穫。グリセロール中に保存するために流行し、単一のコロニーを得るために、YM寒天培地に各細胞株をプレート。グリセロールストックの調製のためのYM寒天プレートに細胞株およびストリーク各あたり10個のコロニーを選択してください。
8.さらにAFEX CSH用として、PSGHLのシリアル転送中に堅牢な進化株を充実します
- NRRL Y-7124（親）の前培養を準備し、AFEX CSHトレラントは隔離進化、および連続培養は、エタノールの存在下でキシロースを使用するために強化された能力を持つ集団に進化しました。 AFEX CSH加水分解物適応プロセス用（ステップ2.1）上記のようにグリセロールストック筋からのループによってODM + 150グラム/ Lキシロースの75ミリリットルを接種します。
- 増大する濃度のシリーズを提供するために、水でPSGHLを希釈します。それぞれを使用して、3つの細胞株の各々について、96ウェルマイクロプレートを準備PSGHL希釈は50μlの8井戸を埋めるために。 620〜0.1から0.5を初期する希釈系列の各50μlのマイクロ培養物に接種するために前培養物を使用してください。
- 文化はΔtimeあたりΔA620の安定した14-dの平均比で完全な強さの加水分解物で増殖することができるまで、上記（ステップ2）に詳述AFEX CSH加水分解物の適応と同じ手順を使用してPSGHLの強みを増加させる酵母の進化を続けますなどのシリアル転送は、追加の4ヶ月間継続しています。
エタノールチャレンジの有無にかかわらずPSGHLグラデーションを使用して9アイソ単一細胞コロニー
- 単一セルがYM寒天培地に希釈メッキにより完全戦力PSGHL最終適応プレートから直接分離し得ます。先に説明した（ステップ3.2）としてグリセロールストックを準備するためにYMプレートに3つの細胞株とバーストリークのそれぞれについて、10大きなコロニーを選択してください。
- 必要に応じて、より早い時点を探ります3つの細胞株の保存されたグリセロールストックから単離することにより進化過程。
- グリセロールストックスジからのループによって各細胞株について前培養物を接種し、30ミリリットルODM + 50グラム/ Lのキシロース上で24時間（50ミリリットルフラスコ、25℃、150 rpm）をインキュベートします。
- 初期A 620〜0.2にマイクロプレートウェルに50％のPSGHLの50μLを接種し、静的に48時間インキュベートすることにより予備培養からの加水分解物中の成長への挑戦細胞。
- （配信〜プレートあたり300-400生細胞）0から50パーセント強の加水分解物の範囲PSGHL勾配寒天プレート上に各富んだ文化の0.1ミリリットルを広げ、勾配の可能な限り最高の加水分解物濃度領域から細胞株あたり10単一コロニーを選びます21ストリークは、ステップ3.2のようにグリセロールストックの調製のためのYMにコロニーを選びました。
- 代わり勾配寒天プレートに接種する、9.2.3ステップの代替として、620〜0.2が当初、96ウェルマイクロプレートのウェルに接種、WHEウェル再10〜40グラム/ Lの50〜100％の強度およびエタノールへの加水分解物の濃度の範囲を含むように設計されています。この場合、マイクロプレートを72〜96時間を開発し、そうでない場合はステップ2.3のように。希釈平板を介して成長を示す最も過酷な加水分解物、エタノールの組み合わせのウェルから10単一コロニーを分離し、ステップ3.2のようにグリセロールストックを準備します。
一次スクリーニングでは10、二つの栄養条件でPSGHL上のパフォーマンスを比較し、ランキングによって劣った分離株を排除
- 30の5セットの画面にPSGHL性能の高スループットディープウェルプレートスクリーンを適用すると、上位6株を選択するためのコントロールとしてNRRL Y-7124親と（ 図1の進化例のコロニー5に類似）AFEX CSHトレラント分離株と一緒に隔離します各セットから（20％）は、二次スクリーニングレベル（ステップ12）に渡します。
- ウェルあたり1ミリリットルを満たしたとWiを覆われたディープウェルプレート中の画面を行います黒のシリコーン低蒸発シール付き番目のステンレス製の蓋。インキュベーター/シェーカーのボードにすべてのプレートをクランプし、25℃、400 rpmで（1「シェーカー軌道）で動作します。開いた井戸によって異なる分離株の分離を可能にするためにパターンを埋めるすべてのディープウェルプレートを設計します。
- 栽培を開始するには、30から調製したグリセロールスジからの細胞のビーズを選ぶ（ステップ3、7、および9）は、上記のようにして得られた分離株ODM + 50グラム/ Lのキシロースのウェルを複製し、48時間インキュベートします。
- ODM + 10グラム/ Lグルコース+ 50グラム/ Lのキシロースで1：分離株を前培養のための挑戦媒体としては、PSGHL 1を混合することにより、50％のPSGHLを準備します。 30分離株2つの制御系統をスクリーニングするために、16の単離物の各々につき2つのウェルを有する2プレートは、異なる単離体の間に空のウェルを残して、充填されています。
- チャレンジ文化、転送、分離株およびコントロールのそれぞれのための2つの50％のPSGHLチャレンジ培養ウェルのそれぞれにODMの前培養（620〜10）の50μlの体積についてのinitiを取得しますアルA 620〜0.5および72時間インキュベートします。
- スクリーニングは隔離のために異なる栄養豊かさの2つのテストメディアを使用してください：60％のPSGHL + ODM栄養素を。 75％PSGHL + ODM + YM栄養素と。 ODMは50グラム/ L砂糖（ステップ1.3）で使用するための標準としての強度の半分で（糖を除く）ODMの栄養素を追加します。指定されたように、3グラム/ Lの酵母抽出物、3グラム/ Lの麦芽エキス、5グラム/ Lペプトンの標準強度の半分で（糖を除く）YMの栄養素を追加します。
- 2試験媒体のそれぞれに対して620〜0.5 5の深い井戸を初期する千μLを接種するために、72時間、50％のPSGHLチャレンジ前培養液50μlを転送することにより、試験培養物を接種します。
- それぞれが毎日隔離サンプル。エタノール上清を得るために、マイクロチューブ、遠心分離（5533×gで、15分）にウェルの内容物をピペットで、グルコースとキシロース高スループット分析します。分光光度計を用いて620で、96ウェルマイクロプレート（200μL/ウェル）などのバイオマスを測定します。
- 30の各セット内にありますolates（S. stipitis NRRL Y-7124のための5セットは株を進化させ）、ステップ以下11で説明したように相対的なパフォーマンス指標（RPI）を計算し、エタノール収率（供給初期砂糖ごとに蓄積された最大エタノール）に基づいて各株をランク付けするために使用するテストされ、キシロース消費速度の両方の試験媒体上の（最初の96時間当たりに消費キシロース濃度）。
11.ランクは相対的な性能指数（RPI）を使用した主PSGHL画面で分離さ
- 一次スクリーニングに続いて、30が60％のPSGHLと75％PSGHL、すなわち 、実験ごとに2つの異なる栄養製剤でPSGHLに隔離する画面に5つの異なる実験のそれぞれに分離しランク付けするために、無次元の相対的な性能指標（RPI）を計算します。
- 与えられた実験において試験分離株のグループ内の分離株の性能をランク付けに使用するための統計的パラメータFを計算します。F =（XX 平均 ）/秒。ここで、Xは、そのような収率（Y）として、性能パラメータでありますまたは速度（R）は、それぞれの個々の分離株について観察された、X の平均とのながら、平均と標準偏差は、それぞれ、Xのすべてが所与の実験内の隔離のために観察されます。正規分布の場合、-2 <F <2。
- 各実験で分離するために、レートに基づいて相対的なパフォーマンスを計算し、RPI R =（2 + F R）100/4×、と同様100/4×利回りに基づいて相対的なパフォーマンス、RPI Y =（2 + F Y）を計算。 RPIの値は（最高に最低）〜0から100パーセンタイルの範囲です。 RPIの平均収量および速度寄与は、このアプリケーションでは同等の重みを与えている=（RPI Y + RPI R）/ 2を、次のようにそれぞれが与えられた加水分解実験内隔離のために次にRPI平均値を計算します。
重要性が等しくないと考えられる場合、一般的に、収率および速度パラメータは重み付けすることができることに注意してください。 - テストした加水分解物のn種類を横切って全体的な RPIを計算します。 全体的な RPI =ΣI = 1、nは [（RPI Y + RPI R）/ 2] I / N。それぞれが30の分離株と2つのコントロールの実験セットに分離することを検討してください。 〜150シングルコロニーの主な順位の間、キシロースに富むためにPSGHLを適応分離株、 全体的に 、画面に適用される2 PSGHL製剤全体の速度及び収率のために計算されるRPI すなわち、60％のPSGHLおよび75％PSGHL、ここで、n = 2。
- 全体的に 、各実験内RPIに基づいて、二次画面に渡す分離株の上部割合を選択します。この例では、株の上位20％（ すなわち、150の30の試験）を通過するように選択されます。
二次スクリーニングでは12、最高機能する堅牢な株を明らかにするために、複数の完全な加水分解物（> 100グラム/ L混合糖類）上のトップ一次スクリーニングの出演を比較
- 6％の窒素、SGH-N1およびSGH-N2（組成2つのレベルで修正されたグルカンAFEXのCSHとSGHをトップPSGHLパフォーマーの比較最終順位表1のよう秒）。 PSGHLの主要なディープウェルプレート画面のトップパフォーマーだった30分離株を選別コロニー5、 図1の例に類似し、2つのコントロール（親株NRRL Y-7124とAFEX CSHトレラント分離株（（10と11ステップ） ）。
- 以前のように1ミリリットルODM + 50グラム/ Lのキシロースの深井戸を複製し、ディープウェルプレートシステム（ステップ10.2）で48時間インキュベートし、グリセロール筋からの細胞のビーズを選ぶことによって栽培を開始します。その後）〜10で620を取得するために72時間、ディープウェルプレートシステムで50％SGHチャレンジ培養物にODMの前培養液50μlを転送し、インキュベートします。シュガーレスODM + 50グラム/ Lのキシロース（pHは5.6）で1：SGH 1を混合することにより、50％のSGHを準備します。
- 分離株のそれぞれについて、初期テスト文化〜2.0 A 620を得るためにチャレンジ文化の3つのウェルからの細胞ペレット（15分、2711×gで）でSGH-N1またはSGH-N2の16ミリリットルのアリコートを接種します。 25＆＃で試験培養物をインキュベート176; C、シリコーンスポンジの閉鎖と25ミリリットルフラスコ中で毎分180回転（1 "軌道）試料フラスコ毎日PSGHL画面ごとに分析します。
- 同様に、画面はチャレンジ培地および試験培地を調製する際に使用するためのpH 5.2で6％グルカンAFEXのCSHとステップ12.2と12.3のように分離し、今回代替SGH-N1およびSGH-N2。それは十分な窒素が修正なしであるため、水で1：50％強度のチャレンジの文化について、1に希釈し、6％AFEXのCSHを使用しています。
- 繰り返して、結果を再現するために12.1から12.4を繰り返します。
13.ランク全体の複数の完全な加水分解物のレート用途にRPIを使用した二次スクリーニングにおける分離株のパフォーマンス
- 酵素の二次スクリーニングで試験されている一次スクリーニングからの分離株の上位20％のそれぞれ（〜150のうち30）をランク付けするために、相対的なパフォーマンス指標（RPI）を計算するには、栄養豊かさを変化させるの加水分解物製剤を糖化しました。
- 各スコア3酵素糖化前処理加水分解物の配合物に対して行わキシロース消費速度とエタノール収率に基づいて二次スクリーニングにおいて試験分離株AFEX CSH（I = 1、2）、SGH-N1（i = 3,4）とSGHを含む、二重に実行-N2（i = 5,6）。
- I / N、N = 6 RPI 全体的 =ΣI = 1、nは [（RPI Y + RPI R）/ 2]：各単離のための全体的な RPIを計算し、さらに優れた分離株のリストを精査するために、このランキングのパラメータを適用。
注：Sliningerらの手順に従って、フラスコ培養におけるSGH-N2加水分解に優れた分離株の動態を実証する18
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Representative Results
S.のstipitisは AFEX CSH、PSGHL、およびエタノールチャレンジキシロース給電連続培養を含めた3つの選択培養液、の組み合わせを使用して発生した。 図1は、分離株と一緒に行わ進化実験の模式図は、最も効果的に実行するかがわかっ示し全体的に、または最も効果的にテストした加水分解物のいずれかで。 表3は、これらの優れた分離株のNRRL受託番号を示しており、それぞれの株が単離された濃縮された集団を達成するためのプロセスに適用される適応応力をまとめたものです。いくつかの分離株は、1つまたは2つの加水分解物のタイプに優れた相対的なパフォーマンスを持っているように見えるが、11分離株の7は、これらのほとんどは進化の過程で、単一型で公開されると攻撃したにもかかわらず、加水分解物の種類のすべてでうまく行きました。ここで撮影した様々な進化的アプローチの成功は、 図2に示されてい-図7および表4。
図2は、歪みNRRL Y-7124の堅牢な誘導体はAFEX CSH（ステップ2）の濃度の増加にシリアル転送時に富むれた適応の最初のフェーズの後に見られる明確な改善を示しています。 6％グルカンAFEXのCSHに増殖する培養物では、進化した人口は、より迅速な蓄積と親株よりもエタノールの高い最終力価を示しています。また、より迅速なグルコース利用は、直ちにグルコースの枯渇以下のより迅速なキシロースの取り込みと一緒に見られています。また、図3において、変更された集団の安定性は、特徴87のG / Lグルコース及び66グラム/ Lのキシロースの混合物を有する合成培地ODMで実証されています。この場合には、濃縮された集団（ 図3B）および単離されたコロニー（コロニー1及びコロニー5、 図3Cおよび3D、解像度の両方pectively）は、少なくとも4日間、エタノールのピークまでの時間を短縮、より迅速にエタノールを製造するために、より効率的にキシロースを用いて親株を凌駕することができます。有意に高いエタノール濃度は、親（40〜45グラム/ L）と比較して、ODM（55〜60グラム/ L）に進化した株によって蓄積されました。酵母集団がAFEX CSHで進化としてグルコース - キシロース転移とより効率的なキシロース発酵の間に減少しdiauxyの安定した表現型につながった変異は、生じました。
コロニー5への更なる改善が50グラム/ Lまでのエタノールのレベルを上昇させるの存在下でキシロース給餌連続培養で自然淘汰にそれを提出することによって追求されました。安定した希釈にもかかわらず、発酵槽を移入するのに十分に高い速度で成長できるようにするため、この条件で、連続培養で保持酵母集団を順に唯一の炭素源としてキシロースを利用するための酵素を誘導することができなければなりませんレート。親株では、キシロース酵素の誘導は、低い15〜20グラム/ Lエタノール濃度で阻害され始めている。コロニー5の8デリバティブ連続培養の操作の初期および後期の時点でグリセロールに捕獲されました、 図4は、NRRL Y-7124親とプロセスに接種し、初期コロニー5と比較してコロニー5の進化の誘導体で観察された40グラム/ Lのエタノールの存在下でのキシロース資化で成功した改善を示しています。
図1の適応方式のすべての段階から生じる分離株はキシロース（ステップ10.1）を発酵させる優れた能力を持つものを同定するためPSGHLでスクリーニングしました。 図5に示す分離株は、以下に説明するように、この一次スクリーニングにし、パフォーマンスのすべての二次スクリーニングにランク〜150のうちPSGHLで最高のパフォーマーの一つです。進化した分離株の改善を示すために、親に対して、各単離物の性能は、親株に対する分離株の動態パラメータ値の比として表しました。 「1」の比の値は、分離株のパフォーマンスは、親に相当した場合。発生した図5aおよび60％のトップ分離株のパフォーマンスを要約し、ODMまたはODM + YM栄養サプリメントとPSGHLの75％強5bは 。加水分解物濃度と厳しさが増加したように、性能比が減少しました。で60％の強度PSGHL、5 7の上部はPSGHL選択圧力にさらさ分離株（1を分離する）何回NRRL Y-7124よりも良いを行いました。四つの分離株はAFEX CSHへの曝露の間に発展したがPSGHLに以前の選択的露光を持っていなかったコロニー5（33隔離）、よりも良好に機能しました。しかし、PSGHLの75％強で、わずか3が大幅に追加された栄養素にもかかわらず、親とコロニー5（33隔離）の両方を上回った分離株。これらのうち、優れた15および16であったpreviouslを分離しますYは進化を導く選択圧としてPSGHLの濃度を増加でチャレンジ。 14、15隔離し11、13及び16は、複数の露出を有した3だけ、PSGHLに曝露しました。 3、11、および13はPSGHL上の進化の過程で、以前の時点からのものであったし、それがPSGHLの増加強みにシリアル転送が役立っていることを図5に明らかであるもののので14、15および16に比べて寛容を開発するやや少ない機会を得た分離株その阻害環境に強い株を開発するために、それだけではAFEX CSHに親株NRRL Y-7124の曝露が潜在的にPSGHLへのクロス耐性を有するようなコロニー5（33）のような分離株を生成することができることも明らかです。これにより、複数の加水分解に行うことができる頑強な株は別の性能スクリーニング続い1加水分解に耐性の濃縮によって求めることができることが示されました。キシロースを与えた連続培養から得られた分離株はまたとPSGHL 60％と75％の強みをスクリーニングしましたまた、栄養素とエタノールの挑戦を維持し、グルコースの利用以下のキシロース上diauxicラグをテストするために75グラム/ Lでグルコースを追加しました。 27、28および30は、適応のこの段階から他の人より優れていた隔離しているが、両方の収量およびキシロース吸収速度性能比は、そのいずれにおいても、必ずしも驚くべきことではないとする、追加ODMおよびYM栄養素と75％PSGHL上の親に類似していた持っていましたこの加水分解物への以前の曝露（培養は75グラム/ Lグルコースを提供するためにここには示されていない追加データのためにもSlininger ら 。18を参照のこと ）。
キシロースに富むPSGHLに一次スクリーニングから選択された最良の株は、その後3完全な加水分解物でスクリーニングしました。これらの加水分解物（ 表1）は、AFEX CSHと希薄酸を前処理したSG商業セルラーゼで処理し、最も汎用性の高いイソを識別するために、2つの異なる窒素レベル（SGH-N1およびSGH-N2）で補足を含ま阻害剤および栄養環境の変化に対して、lates。それぞれの発酵は、各加水分解物（ 図6A）内に隔離するための相対的な性能指標（RPIS）を計算した。 図6Bは 、各分離株について計算を組み合わせ、全体的な性能指標を示しています。ファイブ分離株（3、14、27、28、33）を合わせ加水分解物および栄養条件の変化のすべてに最も堅牢として、それらをランク付け60上記の全体的なRPIを、持っていました。 表3の確認、両方が3を分離し、27、28、および33は、AFEXのCSHまたはAFEXのCSHおよびキシロースに対するエタノールチャレンジ連続培養で進化している間14はPSGHLに進化しました。優れた複数の加水分解物の使用を示す株はいずれも、複数の加水分解物に発展しませんでした。
いくつかの株はSGH-N1 / 2またはAFEX CSHのいずれかのより良い行う「専門家」でした。 SGH上の専門家として最高のパフォーマンスこれらの分離株加水分解物（11、16および9）は、最終的なまたは唯一の課題としてPSGHLの進化によって得られました。最初にAFEX CSHチャレンジを増やす介して、濃縮した11と16を、隔離するために、効率的にAFEX CSHを利用する能力を積極的PSGHLで長い最終濃縮中に選択されていなかった、とその使用をサポートする重要な遺伝的要因を明らかに失われました。逆に、14、25、27、30および33は、AFEX CSHに優れたパフォーマーだった、とすべてを除いて分離株14をエタノールチャレンジの有無にかかわらずAFEX CSHに進化した隔離します。予想されるように、AFEX CSHまたはPSGHL上方向進化はよく選択加水分解物に適応した酵母を選択する傾向がありました。この点で唯一の例外は、分離株14アイソ14はPSGHLから発信されただけ挑戦し、最終的なPSGHLの集積培養のYM寒天希釈平板から単離しました。 Slininger ら 18は、の存在下でグルコース増殖細胞におけるキシロース酵素誘導の優れた能力を持っているために、この分離株を示しました。5-15 G / L酢酸およびグルコース・キシロース転移点の前に発生>は30g / Lのエタノールにもかかわらず、75グラム/ LのグルコースおよびキシロースのそれぞれとODMでdiauxicラグを減少させました。
親株S.に対する相対進化した株の優れた動力学表4に示すようにstipitis NRRL Y-7124は25でシリコンスポンジキャップで125ミリリットルのフラスコ中でインキュベート（pHは6.2）620 8.4±2.5 75ミリリットルSGH-N2を初期ために接種した低レベルの通気フラスコ培養の結果を示す、証明されました°C、150rpmで（1 "軌道）、および620 0.5 mlの23 SGH-N2 50 1ml当たりフラスコ当初接種適度な通気フラスコ培養を示す図7に18これらの条件によって示唆操作の二つの異なるタイプを表しますS.のstipitisによりエタノール生産のための潜在的に商業的に有望であるとして文学。8,22もみで迅速な発酵をすぐに開始するための低レベルの通気のトンインスタンスは、高い細胞密度が提供されます。番目のインスタンスでのに対し、低細胞密度およびより高いレベルの通気は、人口を構築し、エタノールへの成長に関連した糖の変換を加速するために対数増殖につながります。より迅速なグルコース取り込み速度（ 表4）、より迅速な特定のキシロースの取り込み速度（ 表4）、グルコース及びキシロースの両方で、より迅速なエタノール生産性と全体的な（ 表 ：これらのデータは、進化した株は、親株に対して大きな運動の利点を有することを示しています4）、成長の前の短いラグ（ 図7）、および過渡遅れをキシロースへ短いdiauxicグルコース。エタノールは親NRRL Y-7124のために見られたよりも40グラム/ Lを超えるとピークに日前（ 図7）に蓄積することが許さこれらの改善。より高い全体的なエタノールの生産性（ 表4）は、5時間1.5で達成されました進化した株に応じて、親株（ 表4）のことです。
図 1：Scheffersomyces stipitis 適応フローチャートを示す図は、適応プロセスの間に適用される応力のため、優れた分離株（括弧内の数字）のリカバリポイントを示します。また、ひずみのアイデンティティのための基準として表3分離株のキーを参照してください。時間の向きを提供するために、赤の中の数字は適応の各フェーズの日数を示しています。 AFEX CSHとキシロースに富むPSGHLでシリアル転送フェーズでは、適応のそれぞれの日は、約2〜4世代を表します。連続培養相（合計205日間）のために、希釈率Dは〜0から0.1時間-1のpH作動給紙に操作の125 Dの間で変動しました。次には80日後、動作は定常状態で（LN 2）/ 58時間の（D）、または2.4 D当たり1世代生成時刻を与える、0.012時間-1にDで連続流でした。次の205日間の連続培養から適応人口のサンプルは、UV光で突然変異を誘発し、0.012時間-1でDで操作連続培養に接種しました。 （Slininger ら 18から転載） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：6％グルカンAFEX CSH（A）の6％グルカンAFEX CSHの改善されたバッチ発酵 Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124親株の発酵は6％グルカンAFEX前処理トウモロコシ茎葉hの適応コロニー5発酵と比較され、ydrolyzate（B）。記号は、バイオマス（赤い四角）、グルコース（破線と黒丸）、キシロース（実線の青い円）、エタノール（緑色の三角形）、およびキシリトール（紫のひし形）を指定します。 （Slininger ら 18から転載） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 混合糖類と定義された培地中での減少diauxic遅れ発酵性能は66グラム/ Lのグルコースおよび親株S.のための87グラム/ LのキシロースとODMで比較されています。 stipitis NRRL Y-7124（A）は 、AFEX CSHは、Y-7124（B）に由来する人口、適応Sから単離された単一細胞コロニー1を適応しましたstipitis集団 （C）、単細胞コロラドNY 5は、適応人口（D）から単離されました。記号は、バイオマス（赤い四角）、グルコース（破線と黒丸）、キシロース（実線の青い円）、エタノール（緑色の三角形）、キシリトール（紫ダイヤモンド）、およびアドニトール（黒エッジにゴールドダイヤモンド）を指定します。 （Slininger ら 18から転載） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： コロニー5.加水分解物トレラントコロニー5 のエタノール耐性誘導体は、さらに唯一の炭素源とエタノールの高レベルとしてキシロースを含むODM上の連続培養の選択によって開発されました。二つの派生グリセロールストックの選択プロセス（2A.1.53R、オレンジ色の三角形と破線）で早期得集団と連続培養接種材料（2A.1.30R.2、紫の円破線）のFTER UV照射は、NRRL Y-7124親株（実線の緑色の円）とAFEX CSHトレラントコロニー5（黒三角と比較して示されています実線）。 40グラム/ LエタノールでODMにおけるグルコース成長した酵母の密な集団（620 = 50）によるキシロースの取り込みは、すべての適応株がキシロース代謝を誘導する能力に適合されていない親を上回っていることが示されました。 （Slininger ら 18から転載） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 親に比べトレラント分離株の性能向上の比率優れた耐性の分離株の性能をを基準に要約されています。PSGHL（A、B）の各製剤のための制御親株NRRL Y-7124。パフォーマンスは、キシロースの取り込み率（親に分離株の比率を表す青いバー）と供給砂糖あたりのエタノール収率（親に分離株の比率を表す緑色のバー）の観点から評価しました。 （Slininger ら 18から転載） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：RPI に基づいてランク付け分離します。相対的な性能指数（RPI）の概念は、33キシロースの取り込み速度及び供給糖あたりのエタノール収率に基づいて、それぞれの加水分解型内に隔離するランク付けするために、二次スクリーニングのパフォーマンス結果に適用しました。 （A）相対RANSGH-N1（青いバー）、SGH-N2（赤いバー）とAFEX CSH（緑色のバー）：任意の分離株の王は、加水分解型（P <0.001）に依存していました。 （B）すべての加水分解物の種類（ライトブルーバー）にわたって計算全体のRPIは、異なる加水分解条件を横切る最も堅牢なパフォーマンスと優れた系統を示しました。 （Slininger ら 18から転載） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7：Sの優れた適応分離株の比較SGH発酵stipitis。スーペリア分離株とその親株NRRL Y-7124は低い初期で25℃、初期pH 6.2で希釈した酸で前処理スイッチグラス（固形分20％の負荷）の酵素加水分解物を発酵比較されるように適合しました細胞密度。バイオマスのタイムコース（赤四角）、グルコース（黒丸および破線）、キシロース（青丸と実線）、およびエタノール（緑の三角形）が示されています。エラーバーは記号でマークされた平均値についての範囲を表します。 （Slininger ら 18から転載） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：栽培に使用される加水分解物の組成物 （。Sliningerら 18から転載） この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
表 2：Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 7 に最適な定義された培地TPS：//www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx ">この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
表3： 植物バイオマスの加水分解物の発酵のための 優れたトレラント Scheffersomyces stipitis 菌株 の概要 （。Sliningerら 18から転載） この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
表4：スイッチグラス加水分解物SGH-N2上の分離株の比較動態は 620 = 8.4±2.5を 初期する接種料金は、グルコースやキシロース消費時の単位吸光度あたりの正規化された料金です。 （Slininger らから再生。18） このTAをダウンロードするにはこちらをクリックしてくださいBLE。
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Discussion
いくつかのステップは、進化のプロセスの成功に不可欠でした。まず、成功したアプリケーションのために必要とされる目的の表現型に向かって人口の進化を推進するための適切な選択圧を選択するためのキーです。以下の選択応力はS.のために選択しました開発をstipitisし、所望の表現型について濃縮を導くために適切なタイミングで適用される：12％（酢酸およびフランアルデヒドおよび他の阻害剤の低レベルの存在下で成長し、多様な糖の発酵を強制的に）グルカンAFEX CSHの増加強み。キシロースは、（diauxic遅延を低減するために、キシロースの酵素誘導を強制）エタノール濃度の増加に伴って連続培養を供給する。そして、（高酢酸、フラン、および他の阻害剤の存在下でのキシロースの成長と発酵を強制的に）PSGHLをロードし、固形分20％の強度を増加させます。第二に、グリセロールの凍結によって進化酵母集団を維持することが重要です人口サンプルのtocks濃縮プロセスが進行するにつれて。人口のこのようなスナップショットは、進化の進行状況を文書化するために、必要に応じてその後の単離を可能にするために、またはぶりに進化プロセスを再起動するために定期的な機能試験のために保存することができます。進化手順の第三の重要な工程は、（例えば、加水分解物及び/又はエタノール濃度のシリーズを提示する応力勾配を含む寒天またはマイクロプレートのような）の便利な選択培地上での選択培養集団又はグリセロールストック集団を濃縮することにより、非常に優れた単離物を回収するました。そして、最も過酷な条件の下で成長している生存コロニーは、後の特徴付けのために維持するために取り出すことができます。適切な場合は、これらの3つの基本的な手順は、代替的に、1サイクルで複数の圧力をそれぞれ追加の所望の表現型の選択圧を追求するために繰り返される、またはすることができます。ネイティブ親酵母集団が様々なストレスにさらされると、遺伝的多様性は、目を生じることが期待されますラフ天然または誘導された突然変異、および継続的な暴露は、自然選択が競争力の生存を支える最も有益な変異を持つ個人のために豊かにすることができます。選択された表現型は、複数の遺伝子変異の結果として発生することが予想されます。上記のプロトコルでは、突然変異は、UV処理の間、または潜在的に加水分解する酵母の露光中に誘導することができます。加水分解物は、微生物に損傷を与える化合物の三つのクラス含むことが知られている：カルボン酸、アルデヒドとフェノールをフルフラールや5-ヒドロキシメチルなどの22の反応性アルデヒドは、細胞を損傷し、中に一般的に発生した活性酸素種（ROS）の上昇を引き起こす可能性がありますミトコンドリア。 ROSはよく、真核細胞におけるDNA変異を引き起こすことが知られている。23,24加水分解物中に存在するフェノール、以前に遺伝毒性であることが知られていないが、アルデヒドおよび突然変異誘発性ROSの変異原性効果を促進し、相乗作用することができる。25
jove_content ">次第に厳しい環境の段階的な戦略は両方を対象とし、また、非標的、表現型の一連の改良と進化した株を構築することが期待される。特定の非標的表現型は望ましくない、または不安定であることが生じる可能性がある。ためには、最も高度に機能しており、堅牢な株をキャプチャするために、注意しなければならない追加の重要なステップは、両方の標的と非標的の表現型に手を伸ばし、評価し、商業的に適切な形質について選択された分離株を比較することである。これを行うには、性能がで比較すべきである単離幅広い産業リグノセルロース基質の変動に対して安定かつ強固である最高の全体的な株の選択を可能にする、異なる阻害剤の課題および栄養処方を有する加水分解物のようなアプリケーション指向のストレス条件、種々の、また、株の安定性の課題は、中に組み込むことができますinvolvの手順を前培養を含むことにより、例で行ったとしてスクリーン、追加の6-7の世代のために50グラム/ Lのキシロースを有する合成ODM続いていくつかの世代のための2つの非選択培地、YM寒天上に初期酵母の増殖をる前でのパフォーマンスの課題への曝露に対して所望の培養特性の不安定化のための機会を与え加水分解物。エタノール収率およびキシロースの取り込み率として重要な性能特徴に基づいて、単離物は、次いで、単離物の濃縮培地は異なる場合があり、試験した各加水分解物の環境として、それぞれ異なるストレス条件にランク付けされます。無次元RPIは、比較される分離株の平均全体的な相対的パフォーマンスとランクを計算するために使用することができます。無次元の係数は、相対的な加水分解の異なる種類のパフォーマンスおよびそのような速度に対する収率として異なる性能評価に基づくを反映するために適切です。このランキングの手順では、成長条件とhydrに幅広いバリエーション間で一貫して良好に動作株を識別するolyzatesと堅牢で遺伝的に安定の両方となりやすいです。これらの基本的な手順の様々な反復回数および改変は、リグノセルロース加水分解物、または関心のある他の基板上の特定やユニークなパフォーマンス機能することが可能な任意の微生物株の進化に対応する必要があるかもしれません。 S.で例はstipitis、それは低コストの商業的供給源を含む栄養素の補給を、注意することが重要である、高固形分ローディングで調製加水分解物にスクリーニング中に改善された統計的な分離のための分離株のパフォーマンスのダイナミックレンジを制御する鍵となりました。濃縮抑制加水分解物の成功した発酵の栄養素の重要性は、また、以前に報告されており、そのようなストレス状態の結果としての細胞維持、レドックスバランス、および修復に必要なアミノ酸および他の栄養素のための高められた必要性に起因すると考えられています特にキシロース利用中。9,26,27栄養素があまりにも疎すぎたり大量である場合に加えて、分離株性能の差は、すべての分離株は極めて不十分やって、またはすべてが、それぞれ、非常によくやって統計的に検出することが難しい場合があります。多様な条件は工業的条件の変化に対して信頼性、または堅牢であることが期待されるウェルの下で実行することができる単離。
このプロトコルの主な制限は、適応進化とスクリーニングは、その中で "1は1が豊かに何を取得し、画面のために」、結果に非常にリテラルであるということです。よって、濃縮および画面条件が増幅し、依然として望ましい既存の特性を保持しながら、表現型に望ましい変化と、それぞれ、個人を識別するように設計される必要があります。進化は産業のパフォーマンス（ 例えば、成長因子の要件）にとって重要な形質について非選択に影響を及ぼす可能性があります。この理由のために、ある形質の集団の濃縮の進行を定期的に監視する必要があります望ましくない変化のためのトラブルシューティングの方法など、他の形質について編。 S.のユニークな特性の例として、一stipitisは、上に成長し、キシロースを発酵させるその本来の能力です。すべての濃縮およびスクリーニング基板は、阻害剤の存在下での唯一または主要な貢献炭素源としてキシロースを含んでいました。したがって、この例では、濃縮培養のすべての共通の特徴は、彼らが直接集団、彼らがより良い競争相手だったので、シリアルまたは連続培養でより多くの濃縮されたとなった株を利用し、より迅速なキシロースのために選択されたということでした。意図した結果、改善された株は、すべてのより迅速なキシロース摂取することができたが、エタノール収率の改善はそれほど劇的なキシロース摂取速度の向上よりもありました。親株によるエタノール収率が比較的高いため、後者の傾向はおそらく、約来た時の周りに0.3グラム/グラム、または理論値の60％（0.51グラム/グラム）、細胞増殖はのためのより少ない部屋を残して、加水分解物中の静止になったとして改善。エタノールは、この形質の進化人口のパフォーマンス監視を必要とした成長阻害剤であるため培養では、より高いエタノール収率は、おそらくに対して選択することができます。成長阻害のためのレベル以下に維持エタノール濃度は、選択因子として、これを中和する傾向があります。 S.のための64グラム/ Lが完全に成長を防止しながら、NRRL Y-7124をstipitis 40グラム/ Lのエタノール半分比増殖速度。エタノールで28はキシロースを供給し、連続的文化に挑戦し、通気が低いと、希釈率を維持したもに存在する十分なキシロースで十分に低く維持しました里親発酵ではなく、エタノールの呼吸や不要なエタノールの使用プロパティの濃縮を防ぎます。高価な豊富な栄養供給を必要とする株について選択しないように加えて、パフォーマンスの画面で使用加水分解物への栄養補助食品は、考え込むような酵母エキスとして、設計されました。サプリメントは、常にご利用でき、最も低いコスト商業的供給源を含めこのような大豆粉および尿素などの電子、そのようなYMのように豊かな構成要素は、このような通常窒素の枯渇されている60パーセントと75パーセントPSGHLの製剤のように、比較試験のためにタンデム培養に適用したが。前培養およびパフォーマンス培養画面で使用ODM合成培地は、もともと親株S.の最適なパフォーマンスのために設計されました費用対効果の高い工業スケールアップ使用してと互換性のある栄養素を供給するためにビタミン、ミネラル、プリンおよびピリミジンを含む定義された食材を、お勧めしますトレーダータンパク質20、およびアミノ酸源によって記述さ培地最適化ルーチンに従ってNRRL Y-7124 7を stipitis市販の供給源。関連株を設計する上で、最終的な勧告は、期待される産業用プロセス条件に可能な限り関連濃縮および画面条件の設計を維持することです。
コスト競争力の再生可能エタノールが長いRに進められています化石燃料への依存を引き出します。 S.の能力を向上させるためstipitis NRRL Y-7124、耐え成長し、リグノセルロースの阻害加水分解物を発酵させるには、いくつかの研究者が過石灰解毒するリグノセルロース系バイオマスの希薄酸前処理から生じるキシロース豊富な酒で繰り返し培養。13,14,16,17を使用していました阻害剤はまだ広葉樹と麦わらの前処理液に早期に適応した株のパフォーマンスの合理的なレベルを可能にするために必要であった。紫外線突然変異誘発およびゲノムシャッフリングの13,14、複数の繰り返しのラウンドは、Sの誘導体を開発するために適用されています改善された阻害剤耐性と広葉樹の成長とstipitis NRRL Y-7124は、亜硫酸酒（HWSSL）を費やした。16,17しかし 、HWSSLでこれらの株によって産生されるエタノール濃度が6〜7日後に10グラム/ Lの下にありました。ここに示されていると記載された技術、Sの新しい進化した株を用いて、 stipitis NRRL Y-7124はphenotyを満たすために開発されました経済的な商業的使用のために必要なPEの目標：このような過石灰高価な廃棄物処理につながる、などの前に解毒対策なしのpHは5-6での加水分解物の発酵;大幅に減少し、成長とdiauxicラグ。商業蒸留（> 40グラム/ Lエタノール）のために十分に高いエタノールの蓄積。以前undetoxified加水分解物を発酵させ、ネイティブ酵母株について報告されたよりも急速な成長とエタノール生産性;かつ適切大豆（そうでない場合は窒素が悪いです）窒素を補充SGHと非補充AFEX CSHを含む高固体負荷で多様な加水分解物、でのパフォーマンス。上記の要約重要なステップで具体よう進化への積極的なアプローチは、運用コスト、資本コスト、エネルギーと水の入力を低下させることにより農業バイオマスからエタノールを生産する経済に利益をもたらすことが期待されている小説を使用して開発改善した株。これはSの適応株を得るために報告された最初のひずみ進化計画でありますstipitundetoxified加水分解物に経済的に回収可能なエタノール生産を実証されています。
S.の新規株進化プロセスの各段階から生じるstipitis（ 図1）は、特定の選択圧に関連した遺伝的変化を決定するために、将来の研究のための候補で適用し、メカニズムなど寛容阻害剤として改善された加水分解物の発酵の基本キー属性を、そしてdiauxicラグを減少させました。このような貴重な新しい知識は、バイオ燃料や他の製品へのリグノセルロースの変換のための次世代の酵母生体触媒とプロセスのエンジニアリングを支援します。新しい株が誘導されるように、おそらく再び加水分解物の商業使用のために最も有用な形質転換体を選択するために、ここで説明したのと同様の歪み進化プロトコルを介して誘導体集団を通過することが有益であろう。同様に、新たな微生物株は、私を作るために潜在的に発見されるように再生可能なバイオマスから有用な新製品のリアドは、進化のプロセスはさらに、潜在的に新規のバイオ触媒プロセスと製品が利用できるようにすることができ、加水分解に歪みの堅牢性と生産性を向上させるために適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, >99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, >99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay >99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
References
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