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Bioengineering

Las técnicas para la Evolución de la robusta levaduras que fermentan la pentosa para la bioconversión de lignocelulosa en etanol

Published: October 24, 2016 doi: 10.3791/54227
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Bioenergy Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 2Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 3Chemical Engineering and Material Science, Great Lakes Bioenergy Center, Michigan State University

Summary

Técnicas de evolución y de aislamiento de adaptación se describen y se demostraron para producir derivados de la cepa Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 que son capaces de consumir rápidamente azúcares hexosa y pentosa mixtos en enzima sacarificadas hidrolizados undetoxified y acumular más de 40 g / L de etanol.

Introduction

Se estima que 1,3 millones de toneladas secas anuales de biomasa lignocelulósica podrían apoyar la producción de etanol y permitir que los EE.UU. para reducir su consumo de petróleo en un 30%. 1 Aunque la biomasa vegetal mezclas de los rendimientos de hidrólisis de azúcar ricos en glucosa y xilosa, inhibidores de la fermentación son generados por el pretratamiento químico necesario para descomponer hemicelulosa y celulosa para exponer ataque enzimático. ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural y (HMF) se cree que son componentes clave entre muchos inhibidores que se forman durante el pretratamiento. Con el fin de mover la industria del etanol lignocelulósico hacia adelante, la investigación y los procedimientos que permiten la evolución de cepas de levadura capaces de sobrevivir y eficaz funcionamiento de usar tanto hexosa y pentosa en presencia de tales compuestos inhibidores son necesarios. Una debilidad adicional significativo de cepas de levaduras industriales tradicionales, tales como Saccharomyces cerevisiae, es la incapacidad de Fermen eficientet la xilosa disponibles en hidrolizados de biomasa vegetal.

Pichia stipitis tipo de cepa NRRL Y-7124 (CBS 5773), recientemente renombrado stipitis Scheffersomyces, es una levadura de fermentación de pentosa nativo que es bien conocido para fermentar la xilosa a etanol. 2,3 La evolución de la cepa NRRL Y-7124 fue perseguido aquí ya que se ha documentado para tienen el mayor potencial de cepas de levaduras nativas para acumular etanol económicamente recuperables inferior o igual a 40 g / L con poco subproducto xilitol. 4,5,6 En los medios de comunicación óptima, S. cepa stipitis NRRL Y-7124 produce 70 g / L de etanol en 40 hr (1.75 g / L / hr) con un rendimiento de 0,41 ± 0,06 g / g en cultivos de alta densidad celular (células 6 g / L). 7,8 Resistencia a los inhibidores de la fermentación del etanol, furfural y HMF también se ha informado, 9 y S. stipitis ha sido clasificada entre las levaduras que fermentan la pentosa nativas más prometedoras disponibles para el etanol Productio escala comercialn a partir de lignocelulosa. 10 Nuestro objetivo era aplicar diversos hidrolizados lignocelulósicos undetoxified y presiones de selección etanol para forzar la evolución hacia una más sólida derivada de la cepa NRRL Y-7124 adecuado para aplicaciones industriales. La llave entre características mejoradas solicitados son más rápidas tasas de absorción de azúcar en hidrolizados de concentrados, reducida diauxy para la utilización de azúcar mezclado más eficiente y más altas tolerancias de etanol e inhibidores. La aplicación de S. stipitis de hidrolizados undetoxified fue un elemento clave de la investigación para eliminar el gasto operativo añadido asociado a los procesos de descontaminación de hidrolizados, tales como overliming.

Dos hidrolizados industrialmente prometedores se aplicaron para forzar la evolución:. Sacarificado enzima fibra de amoniaco expansión pretratados con hidrolizado de rastrojo de maíz (AFEX CSH) y diluir el licor Panicum virgatum hidrolizado ácido pretratados (PSGHL) 11,12 tecnología de pretratamiento AFEX está siendo desarrollado paraminimizar la producción de inhibidores de la fermentación, mientras que el pretratamiento con ácido diluido representa la actual tecnología de bajo coste más comúnmente practicado para exponer la biomasa celulósica para la sacarificación enzimática. PSGHL es separable de la celulosa restante después del tratamiento previo y es característicamente rico en xilosa a partir de la hemicelulosa hidrolizada, pero bajo en glucosa. AFEX CSH y composiciones PSGHL difieren entre sí en aspectos clave que fueron explotadas para gestionar el proceso de la evolución. AFEX CSH es más bajo en aldehídos de furano y los inhibidores de ácido acético, pero más alta en aminoácidos y fuentes de nitrógeno de amoníaco en comparación con PSGHL (Tabla 1). PSGHL presenta el reto adicional de xilosa ser el azúcar predominante disponible. Por lo tanto PSGHL es apropiada para enriquecer específicamente para la mejora de la utilización de xilosa en hidrolizados, una debilidad prevenir el uso comercial de la levadura disponibles. Incluso entre las levaduras de fermentación de pentosa nativas, la dependencia de la xilo azúcar subóptimaSE para apoyar el crecimiento celular y la reparación se hace aún más difícil en los hidrolizados debido a una variedad de razones:. deficiencias de nutrientes, inhibidores causan un daño generalizado a la celda integridad estructural, y la interrupción de metabolismo debido a los desequilibrios redox 9 suplementación con nitrógeno, especialmente en la forma de aminoácidos, pueden representar un coste operativo importante para las fermentaciones. El impacto de la suplementación de nitrógeno sobre el cribado del aislamiento y la clasificación fue explorada con hidrolizados de P. virgatum.

La mejora de los individuos se enriquecieron en una población evoluciona el uso de múltiples presiones de selección dependen de la diversidad genética natural de la S. la población y las mutaciones stipitis inducida por la exposición a dos diversos hidrolizados, etanol o radiación UV. Presiones de selección se aplicaron en paralelo y en serie para explorar el progreso evolución de S. stipitis hacia derivados deseados capaces de crecer y fermentar de manera eficiente en hidrolizados(Figura 1). El cultivo repetitivo de las poblaciones funcionales en hidrolizados cada vez más desafiantes se llevó a cabo en microplacas el empleo de una serie de dilución de cualquiera de glucano CSH AFEX 12% o más preparado PGSHL a 20% de carga de sólidos. La aplicación de un crecimiento de etanol-desafió en xilosa en cultivo continuo mejorado aún más CSH adaptada poblaciones AFEX mediante el enriquecimiento de fenotipos que demuestran menor susceptibilidad a etanol represión de la utilización de xilosa. Esta última característica ha demostrado recientemente problemática de la utilización de pentosa por la cepa NRRL Y-7124 después de la fermentación de la glucosa. 8 Enriquecimiento en PSGHL se exploró junto a ampliar la funcionalidad hidrolizado.

Derivados mejorados putativa de S. stipitis NRRL Y-7124 fueron aisladas de cada fase del proceso de evolución dirigida mediante el enriquecimiento en condiciones de estrés y una dilución en placas para recoger colonias de las poblaciones de mayor prevalencia. en relación adimensionalíndices de rendimiento (RPI) se utilizaron para clasificar las cepas basado en el rendimiento general, donde se evaluó el comportamiento cinético de los diferentes tipos de hidrolizados y suplementos de nutrientes aplicados. Aunque los éxitos de diversos procedimientos de adaptación para mejorar la funcionalidad de S. stipitis en hidrolizados lignocelulósicos se han documentado anteriormente, las cepas que demuestran la producción de etanol económico en hidrolizados undetoxified no se ha informado anteriormente. 13-17 Usando los procedimientos de evolución para ser visualizado en más detalle aquí, Slininger et al. 18 cepas que se mejoran significativamente durante desarrollaron la cepa parental NRRL y-7124 y son capaces de producir> 40 g / L de etanol en AFEX CSH y la enzima hidrolizado sacarificado Panicum virgatum (SGH) debidamente complementado con fuentes de nitrógeno. Estas nuevas cepas son de interés para el futuro desarrollo de la lignocelulosa a la industria del etanol y como sujetos de la genómica estudios adicionales edificioen los de la cepa previamente secuenciados NRRL Y-11545. 19 Un estudio de la genómica de los mejores cepas producidas durante las diversas fases de la evolución esquematiza en la figura 1 sería dilucidar la historia de los cambios genéticos que ocurrieron durante el desarrollo como un preludio a seguir investigando la mejora de cepas.

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Protocol

1. Preparar los materiales de partida y Equipo para ensayos

  1. Preparar hidrolizados utilizando 18 a 20% de peso seco de biomasa inicial en la reacción de tratamiento previo para el uso en la evolución, el aislamiento y procedimientos de clasificación. Ver Slininger et al. 2015 18 para los métodos detallados para preparar AFEX CSH, PSGHL, y SGH con suplementos de nitrógeno N1 o N2 utilizados en la evolución, el aislamiento o la clasificación. Véase la Tabla 1 para la composición de cada tipo de hidrolizado.
    NOTA: fortificaciones de nitrógeno de SGH fueron designados como SGH-N1 o SGH-N2 definen como sigue: SGH-N1 = SGH fortificado a 42: carbono 1 molar a la proporción de nitrógeno (C: N) con fuentes de nitrógeno, incluyendo urea, amino libre de la vitamina ácidos de caseína, D, L-triptófano, L-cisteína, y vitaminas de fuentes definidas (tal que ~ 15% de nitrógeno molar N es nitrógeno amino primario (PAN) y ~ 85% de N es de urea); SGH-N2 = SGH fortificada a 37: 1 C: N con urea y harina de soya como el más bajo costo fuente comercial of aminoácidos y vitaminas, proporcionando ~ 12% del N de la sartén y 88% en forma de urea.
  2. Adquirir un cultivo liofilizado de la cepa madre, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) de la Colección de Cultivos ARS (Centro Nacional de Investigación de Utilización Agrícola en Peoria, Illinois), y preparar los cultivos de glicerol como se indica. Mantener los cultivos madre de la levadura de los padres y sus derivados en el 10% de glicerol a -80 ° C.
    1. stocks de glicerol a la racha de dextrosa de levadura de malta peptona (YM) placas de agar (/ l de extracto de levadura 3 g, 3 g / L de extracto de malta, 5 g / l de peptona, 10 g / l de dextrosa, 20 g / l de agar) e incubar 48- 72 horas a 25 ° C. 8 placas desarrollados se puede almacenar hasta por una semana a 4 ° C antes de su uso inóculos precultivo como líquido.
  3. Preparar definidas óptimas Medio (ODM), un medio sintético compatible con los procedimientos de formulación industriales 20 que fue desarrollado previamente para la conversión óptima de la xilosa a etanol por el padre strain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. 7 Utilice el medio definido en todos los cultivos previos y culturas a los bioensayos de rendimiento de fermentación y también para el etanol desafiado, la evolución del cultivo continuo xilosa alimentado. Composición del ODM está listada como referencia en la Tabla 2.
  4. Como se ha descrito anteriormente, 18 analizar la biomasa celular usando un espectrofotómetro de lectura cuvette- o micro-placa, según sea apropiado, para medir la absorbancia de cultivo a 620 nm (A 620). Cuantificar los azúcares, etanol, furfural, hidroximetilfurfural (HMF), y ácido acético en las muestras de cultivo utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o la determinación enzimática robótico de la glucosa y la xilosa para un mayor rendimiento.

2. Enriquecer Derivados robustas durante la transferencia serie en AFEX CSH

  1. Inocular un cultivo previo de la cepa NRRL Y-7124. La transferencia de células de agar YM a 75 ml ODM + 150 g / L de xilosa para mantener la capacidad de crecer bajo osmotic estrés. Incubar precultivos en matraces de 125 ml cerrados con la esponja de silicona tapones de 24 horas a 25 ° C con agitación (150 rpm, 1 "órbita).
  2. Descongelar las alícuotas congeladas de 6-12% glucano CSH AFEX en agua fría para el uso. Ajustar el pH a 5, si es necesario y el filtro de esterilizar antes de preparar una serie de diluciones en microplacas de 96 pocillos.
  3. Llenar microplacas con 50 l por pocillo y 8 pocillos por cada dilución hidrolizado, a continuación, inocular con unos pocos microlitros de precultivo por pocillo para permitir una absorbancia inicial (620 nm) A 620 ≥0.1. Incubar las placas estáticamente 24-48 horas a 25 ° C en una caja de plástico con una toalla de papel húmeda para la humedad.
  4. El uso de la dilución hidrolizado más concentrada que visiblemente creció a A 620> 1, la transferencia de 1-5 l a cada pocillo de una nueva serie de dilución hidrolizado para lograr inicial A 620 ≥0.1.
  5. Monitor de cultivo de crecimiento A 620 en microplacas con un espectrofotómetro. Una serie de dilución Ser sin inocularVes como un control y blanco. tapas de placas se dejan en durante la supervisión para evitar la contaminación, y las lecturas de ajustarse en consecuencia.
  6. Preparar las existencias de glicerol de las culturas de adaptación regularmente para el posterior aislamiento de cepas mejoradas o para su uso en reinoculating la continua serie de dilución hidrolizado. Para preparar las existencias, piscina cuatro pozos (200 l) de la mayor concentración de hidrolizado colonizado. Mezclar 1: 1 con 20% de glicerol estéril en crioviales, para congelar las células en 10% de glicerol a -80 ° C.
  7. Repita los pasos 2.3-2.6 hasta que el crecimiento en el 12% de glucano CSH AFEX es constantemente visible a las 24 h.

3. Aislar la célula individual Derivados tolerantes después del enriquecimiento en AFEX CSH

  1. Streak seleccionado existencias de glicerol de las culturas de adaptación a agar YM, y las rayas de uso para inocular 50 l de 3% o 6% glucano AFEX CSH (pH 5) en cada uno de tres pocillos de la microplaca (inicial A 620 ~ 0,1). Incubar las microplacas de 24 horas como en el paso 2.3. réplica de la piscinate colonizada pozos en la fuerza más alta hidrolizado con un fuerte crecimiento, y la placa de dilución para YM o 6% de agar glucano CSH AFEX. Preparar el último como una mezcla 1: 1 de filtro esterilizado 12% glucano CSH AFEX con solución / L agar 30 g en autoclave caliente.
  2. Elige 5 colonias individuales desde el más alto crecimiento que muestra la placa de dilución después de la incubación de 24-48 horas a 25 ° C para congelar como cultivos de glicerol. Racha de cada colonia a una placa YM. Incubar 24 horas. Con un asa estéril, transferir un desarrollado racha de células a un pequeño volumen de 10% de glicerol, se mezcla la suspensión de células, y distribuir a 2-3 crioviales para la congelación a -80 ° C.

4. Evaluar Rendimiento de AFEX CSH Derivados tolerantes En comparación con los Padres

  1. Aisla prueba en simples culturas 6% glucano AFEX CSH lotes.
    1. La transferencia de células a partir de las 48 hr placas estriadas de las existencias de glicerol de tampón fosfato potásico pH 7 (0,4 mM) para preparar suspensiones de células con A = 620 10. Uso 1 l decada suspensión para inocular cada uno de los cuatro pozos de 50 l 3% de hidrolizado de glucano a rubrique A 620 = 0,2. Incubar las microplacas de 24 horas como en el paso 2.3. Preparar el glucano CSH 3% AFEX a pH 5 mediante la dilución de 12% de glucano CSH AFEX 1: 3 con agua estéril.
    2. Transferencia de dos pozos de la microplaca de 24 horas para inocular 25 ml de cultivos previos pH 5 al 12% glucano CSH AFEX utilizados en el 50% de su fuerza. Incubar precultivos en matraces de 50 ml con cierres de esponja de silicona para 24 horas a 25 ° C, ~ 150 rpm (1 "órbita) Preparar el medio resistencia 12% glucano CSH AFEX diluyendo el hidrolizado de 1:. 1 con agua estéril.
    3. Use la mitad de intensidad de cultivos previos de hidrolizado para inocular 25 ml de cultivos de crecimiento similares a la administración inicial de 620 A = 0,1. Se incuban los cultivos de crecimiento que el anterior (4.1.2) y la muestra diaria (0,2 ml). Acumulaciones de monitor de biomasa (A 620) y las concentraciones de azúcares y productos de fermentación (HPLC).
  2. Alternativamente, repitch (es decir, la cosecha y la reuse) poblaciones de 6% glucano de levadura AFEX CSH-crecido de ensayos con el 8% de cultivos por lotes de hidrolizado de glucano, como se ha descrito anteriormente. 18
  3. Alternativamente, otras poblaciones de ensayo de glucano culturas CSH AFEX 6% repitched por la alimentación con 12% de hidrolizado de glucano, tal como se describe anteriormente. 18
  4. La prueba de demora diauxic de los aislamientos en cultivos discontinuos de ODM con azúcares mixtos.
    1. Inocular cultivos previos de 75 ODM ml con 150 g / L de xilosa en matraces de 125 ml con cierres de esponja de silicona mediante transferencia de lazo de rayas glicerol YM. Incubar 24 horas como en el paso 2.1.
    2. Utilice precultivos para inocular cultivos 75 ml de ensayo similares con ODM que contiene 75 g / L de glucosa y 75 g / L de xilosa a un pH de 6,5. Agitar matraces a 25 ° C, 150 rpm. Muestra todos los días.
    3. Alternativamente, probar el impacto de ácido / L acético 0-15 g en diauxy durante la fermentación de la glucosa y xilosa mediante el uso de un protocolo similar, excepto pH inicial se fija en 6,0 ± 0,2 en cultivos de ensayo para mantener el pH 6-7 duanillo consumo de ácido acético, como se describió anteriormente. 18

5. Aplicar cultivo continuo seleccionar para la utilización de xilosa etanol-desafió

  1. Preparar ODM como el medio de alimentación cultivo continuo con 60-100 g / L de xilosa, 20-50 g / L de etanol a pH 6,3 ± 0,2. Elija combinaciones de xilosa y etanol para simular la fermentación parcial de 150 g / L de xilosa, suponiendo un rendimiento potencial de ~ 0,5 g de etanol / g de xilosa, y para acomodar el potencial de 50 a 70 g / L de etanol que se produzca. 8
  2. Para preparar el inóculo de cultivo continuo, la transferencia de un representante AFEX colonia CSH-tolerante (análoga a la colonia 5 en el ejemplo, la Figura 1) por bucle de una placa de YM 48 hr a 75 ml de la ODM libre de etanol (100 g / L de xilosa, en este caso) en matraces de 125 ml. Se incuba a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita) durante 24 horas. Elige la concentración ODM xilosa cultivo previo para que coincida con la del cultivo continuo de volumen que sostiene inicial.
  3. Inocular un volumen que sostiene cultivo continuo de ODM a pH 6,3 ± 0,2 que tiene 100 g / L de xilosa + 20 g / L de etanol con ~ 5-10 ml de un concentrado de pre-cultivo de un aislado AFEX CSH-tolerante (análoga a la colonia 5, la Figura 1 ) para obtener 100 ml en el punto inicial a 620 ~ 0,5. Mantener la cultura que sostiene volumen (V R), a 25 ° C en un matraz de agitación con camisa 100 ml se agitó a 200 rpm y equipado con electrodo de pH esterilizable, controlador de pH y baño de agua circulante de temperatura controlada.
  4. En un principio, ya que el crecimiento celular será lento debido a la exposición al etanol, configurar el medio de alimentación para dosificar el uso de una bomba accionada por el pH. Establecer la bomba para alimentar a pH-6,3 ODM con 100 g / L de xilosa y 50 g / L de etanol cuando la fermentación del cultivo deja caer el pH a 5,4, deteniendo así aún más la caída del pH. Mantener el volumen a 100 ml con una bomba de efluente continuamente rozando la superficie de cultivo. En consecuencia, la concentración de etanol aumenta con el metabolismo y la alimentación continua. Medir efluente y extraer muestras (1-2 ml) de cultivos continuos de cada 48 a 72 horas para el análisis de la concentración de células viables, los productos y sustratos, como se describió previamente. 18 Para encontrar la concentración de células viables, hacer diluciones 1:10 en serie de muestras en tampón (véase 4.1.1) y la placa de propagación de las diluciones a agar YM (véase 1.2.1). Sobre la base de las tasas de recogida de efluente (Q), el cálculo de la tasa de dilución (D) (Q / V R), y, en el ejemplo de S. stipitis, que variaba desde el 0 a la 0,01 h -1.
  5. Guardar reservas de glicerina con regularidad mediante el aislamiento a partir de placas de viabilidad de las diluciones de muestras tamponadas formando 30-100 colonias, lo que representa colonos robustos más prevalentes en ese momento en el enriquecimiento. placas de inundación con ~ 5 ml de glicerol al 10% para permitir la preparación de crioviales duplicados. Para el mantenimiento o un respiro, detener el cultivo continuo y reinicie cuando sea necesario el uso de más reciente (resistente) de glicerol (s).
  6. Para reiniciar, racha de los stock (s) de glicerol de la mayoríapoblaciones resistentes a agar YM y la transferencia de células de 24-48 hr por bucle para un pre-cultivo de ODM libre de etanol para la incubación como anteriormente. Inocular los 100 ml que sostienen volumen de ODM a rubrique A 620 0,5 usando un concentrado de la levadura precultivado, y permitir que el cultivo crezca de forma discontinua hasta la fase estacionaria antes de que se reinicie el flujo medio de alimentación.
  7. Si los cultivos pueden crecer de manera constante a> 0,01 h -1 en caso de xilosa en la presencia de> 25 g / l de etanol, iniciar la alimentación continua de cultivo (ODM + 60 g / L de xilosa + etanol que van de 30 a 50 g / L) a un bajo ~ velocidad de dilución de 0,01 h -1 a los 100 ml de volumen que sostienen (inicialmente ODM + 60 g / L de xilosa + 20 g / L de etanol). Con el tiempo, elevar el etanol en la alimentación hacia 50 g / L. Capturar poblaciones avanzadas en reservas de glicerina.
    NOTA: El mantenimiento de la tasa de dilución baja permite la formación de una concentración celular lo suficientemente alto como para reducir la disponibilidad de oxígeno y el apoyo de fermentación.
  8. Opcionalmente, aplicar ultra-violeta (UV) irradiatión mensual a glicerol poblaciones de valores utilizados para renovar la siembra cultivos continuos.
    1. Volver a suspender las colonias de glicerol vetas de valores en 10 ml de ODM (como en cultivos previos) con 60 g / L de xilosa, y poner en común todas las existencias en un solo frasco estéril. Aplicar la suspensión de células agrupadas en ~ 5 x 10 8 células / ml viables para cubrir sólo las partes inferiores de 4-5 placas de Petri con 6 ml / placa. Para obtener la cobertura de 6 ml de una placa de Petri desechables estándar, dispensar 15 ml de superar la tensión superficial, y luego retire 9 ml.
    2. Exponer a cada placa de cultivo abierta a los rayos UV de la fuente de luz en una cabina de seguridad biológica. Ajustar el tiempo de exposición a rayos UV o la distancia para obtener el grado de destrucción deseada> 90%. Aquí, exponer durante 45 min a alrededor de 56 cm de la fuente.
    3. Diluir las suspensiones de células placa antes y después de la irradiación. grado de mortandad estimación basada en unidades formadoras de colonias. Para el S. stipitis ejemplo, la tasa de muerte fue de ~ 97%.
    4. La transferencia de los cultivos expuestos UV (24 a 30 ml) a una lámina-CoVEred matraz de 50 ml, y se incuba a 25 ° C y 150 rpm durante 24 horas para permitir que el pequeño porcentaje de células viables para repoblar a ~ 1 x 10 8 S. viable stipitis células / ml. Al prevenir reactivaciones de fotos, la cubierta de aluminio conserva mutaciones mientras que los cultivos se incuban.
    5. Utilizar el cultivo mutagenizado repoblada para inocular cultivos continuos de ~ 1 x 10 7 células viables / ml. Reinicie el ODM + 60 g / L de alimentación del medio xilosa en etanol enriquecida para continuar el proceso de selección.

6. Evaluar glicerol de poblaciones y determinar los que Mejora de xilosa fermentación en presencia de etanol

  1. Streak selecciona cultivos stock de glicerol de agar YM como el primer paso en la pantalla para el mejor crecimiento y la fermentación de xilosa en la presencia de etanol.
  2. Transferir cada población evolucionado a cribar de rayas de agar a 75 ml precultivos en ODM con 150 g / l de glucosa, y se incuban en matraces de 125 ml 96hr antes de su uso como inóculos para cultivos de ensayo. Las grandes poblaciones de glucosa-crecido requerirán la inducción de enzimas para la utilización de xilosa.
    1. Para probar la inducción, la cosecha de cada cultivo, suspender las células para 30 ml, inicial A 620 de 40 en ODM 60 g / L de xilosa + 30-45 g / L de etanol, y se incuba a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita) en matraces de 50 ml con cierres de esponja de silicio. Dibuje muestras dos veces al día para el control de la absorción de xilosa por análisis de HPLC.
  3. Alternativamente, como se describe en Slininger et al., 18 para evaluar el crecimiento en xilosa en la presencia de etanol, se preparan precultivos de cada población evolucionado por transferencia de bucle para 75 ml de ODM con 150 g / L de xilosa en matraces de 125 ml y se incuban 96 hr a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita). Se inoculan cultivos de ensayo a una baja inicial a 620 de 0,1 en 25 ml de ODM + 60 g / L de xilosa + 30-45 g / L de etanol en matraces de 125 ml. Incubar frascos a 25 ° C, 300 rpm, "órbita 1 y la muestra.

  1. Basándose en los resultados de la etapa 6, seleccionar poblaciones de valores de glicerol que muestran capacidad superior para crecer en y fermentar la xilosa, en presencia de etanol. Utilice estos para placas de racha. Las placas del rayado se usan para preparar las suspensiones de células, tamponadas densas de A 620 = 5. A continuación, las suspensiones de células se utilizaron para inocular cultivos previos en placas de 96 profundas así a A 620 = 0,5. Sembrar 1 ml precultivos en PSGHL mezclaron 1: 1 con ODM + 50 g / L de xilosa (sin etanol). Incubar cultivos previos en 96 pocillos, placas de pocillos profundos con baja evaporación ventilación cubre durante 48 horas a 25 ° C, 400 rpm, 1 "órbita. Separar las diferentes poblaciones de glicerol de stock por pozos vacíos.
  2. El uso de cada precultivo, se inoculan los dieciséis 1 ml replican culturas para rubrique a 620 ~ 0,5 en 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L de xilosa con 20, 30, o 40 g / l de etanol para enriquecer colonos tolerantes. Incubar cultu enriquecimientores de manera similar a precultivos.
  3. Para cada una de glicerol de valores diferentes, cosechar los pocillos de cultivo con más alta concentración de etanol que permite el crecimiento y la xilosa uso. Placa de cada línea celular de agar YM para obtener colonias individuales para preservar prevalentes en glicerol. Recoger diez colonias por línea celular y consecutivas cada uno a una placa de agar YM para la preparación de glicerol.

8. enriquecer aún más robusta Evolved cepas durante la transferencia serie en PSGHL, como para AFEX CSH

  1. Preparar pre-cultivos de NRRL Y-7124 (padre), AFEX CSH-tolerante evolucionó aislar y cultivo continuo evolucionó población con mayor capacidad de utilizar xilosa en la presencia de etanol. Inocular 75 ml de ODM + 150 g / L de xilosa por bucle de rayas stock de glicerol como se describió anteriormente (paso 2.1) para el proceso de adaptación hidrolizado de AFEX CSH.
  2. Diluir PSGHL con agua para proporcionar una serie de concentraciones crecientes. Preparar un 96 pocillos micro-placa para cada una de las tres líneas celulares mediante el uso de cadadilución PSGHL para llenar 8 pocillos con 50 l. Utilice precultivo para inocular cada 50 l micro-cultura de la serie de dilución inicial de 620 ~ Un 0,1-0,5.
    1. Continuar la evolución de la levadura en el aumento de los puntos fuertes de PSGHL usando el mismo procedimiento como la adaptación hidrolizado AFEX CSH detallado anteriormente (paso 2) hasta que los cultivos son capaces de crecer en el hidrolizado de fuerza completa en una proporción promedio de 14-d estable de? A 620 por Δtime como transferencias de serie se siguieron cuatro meses adicionales.

9. Aislar colonias de células individuales en el PSGHL degradados con o sin etanol Challenge

  1. Obtener de una sola célula aísla directamente de placas de adaptación finales PSGHL plena fuerza por dilución en placas de agar YM. Escoja diez grandes colonias para cada una de las tres líneas celulares y racha bar a placas YM para preparar stocks de glicerol como se ha descrito previamente (paso 3.2).
  2. Opcionalmente, explorar los puntos de tiempo anteriores en elproceso de evolución mediante el aislamiento de las existencias de glicerol almacenadas de las tres líneas celulares.
    1. Inocular un cultivo previo para cada línea celular por bucle de stock de glicerol rayas e incubar 24 horas en 30 ml ODM + 50 g / L de xilosa (matraces de 50 ml, 25 ° C, 150 rpm).
    2. Células reto de cultivos previos al crecimiento de hidrolizado mediante la inoculación de 50 l de 50% PSGHL en pocillos de la microplaca a una inicial A 620 ~ 0,2 e incubando estáticamente 48 h.
    3. Difundir 0,1 ml de cada cultivo en placas de agar enriquecido gradiente PSGHL que van de 0 a 50% de hidrolizado de fuerza (~ 300-400 entrega de células viables por placa), y recoger 10 colonias individuales por línea celular desde la zona más alta posible concentración hidrolizado del gradiente . 21 Streak recogió colonias de YM para la preparación de glicerol como en el paso 3.2.
    4. Como una alternativa al paso 9.2.3, en lugar de la inoculación de las placas de agar de gradiente, inocular los pocillos de 96 pocillos de micro-placas para inicial A 620 ~ 0,2, where los pozos están diseñados para contener una gama de concentraciones de hidrolizado de 50 a 100% de fuerza y ​​etanol de 10 a 40 g / L. En este caso, el desarrollo de micro-placas de 72 a 96 hr y de otra manera que en el paso 2.3. Aislar diez colonias individuales de los pozos de las combinaciones hidrolizado de etanol más duras que muestran el crecimiento a través de una dilución en placas, y preparar reservas de glicerina como en el paso 3.2.

10. En una pantalla primaria, elimina aislamientos inferiores comparando y Clasificación Actuaciones en PSGHL en dos condiciones de nutrientes

  1. Aplicar un alto rendimiento de pozo profundo pantalla plato de rendimiento PSGHL a la pantalla de cinco series de treinta aislamientos junto con NRRL Y-7124 padres y el aislado de AFEX CSH-tolerante (análoga a la colonia 5 del ejemplo de la evolución Figura 1) como controles para elegir seis mejores cepas (20%) de cada conjunto para pasar al nivel de escrutinio secundario (etapa 12).
  2. Llevar a cabo la pantalla en placas de pocillos profundos llenos de 1 ml por pocillo y wi cubiertosth tapas de acero inoxidable con silicona negro bajo los sellos por evaporación. Sujetar todas las placas a la placa de la incubadora / agitador y operar a 25 ° C y 400 rpm (1 "órbita agitador). Diseño de todo pozo profundo placa de llenado patrones para permitir la separación de los diferentes aislados por los pozos abiertos.
  3. Para empezar cultivos, recoger una capa de células de rayas glicerol preparados a partir de 30 aislamientos obtenidos como anteriormente (en los pasos 3, 7 y 9) a pocillos duplicados de ODM + 50 g / L de xilosa e incubar 48 h.
  4. Como un medio de precultivo reto para aislamientos, preparar 50% PSGHL mezclando PSGHL 1: 1 con ODM + 10 g / l de glucosa + 50 g / L de xilosa. Para el cribado de 30 aislamientos y dos cepas de control, 2 placas con 2 pocillos por cada una de las 16 cepas, se llenan, dejando pocillos vacíos entre las diferentes cepas.
  5. Para las culturas de desafío, la transferencia, un volumen de 50 l de ODM precultivosde (A 620 ~ 10) a cada uno de dos pocillos de cultivo desafío PSGHL 50% para cada uno de los aislados y los controles para obtener una iniAl A 620 ~ 0,5 e incubar 72 h.
  6. Utilizar dos medios de prueba de diferente riqueza nutritiva para el cribado aísla: nutrientes 60% PSGHL + ODM; y el 75% nutrientes ODM + YM PSGHL +. Añadir nutrientes ODM (con exclusión de los azúcares) a la mitad de la fuerza de serie para utilizar ODM con 50 g / L de azúcar (paso 1.3). Como designado, añadir nutrientes YM (con exclusión de los azúcares) a la mitad de la fuerza global de 3 g / L de extracto de levadura, 3 g / L de extracto de malta, 5 g / L de peptona.
  7. Se inoculan cultivos de ensayo mediante la transferencia de 50 l de 72 h 50% de desafío PSGHL pre-cultivos para inocular 1.000 l de rubrique a 620 ~ 0,5 en cinco pozos profundos para cada uno de dos medios de prueba.
  8. Muestra de cada aislamiento diaria. Pipetear los contenidos de un pocillo a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga (5.533 xg, 15 min) para obtener sobrenadante de etanol, glucosa y xilosa análisis de alto rendimiento. Medir la biomasa como 620 en 96 pocillos de micro-placas (200 l / pocillo) con un espectrofotómetro.
  9. Dentro de cada grupo de 30 esolates probado (5 juegos para S. stipitis NRRL Y-7124 se desarrollaron cepas), el cálculo de los índices de rendimiento relativo (RPI), como se describe en el paso 11 a continuación y utilizar para clasificar cada cepa basado en el rendimiento de etanol (etanol máxima acumulada por el azúcar inicial suministrado) y tasa de absorción de xilosa (concentración de xilosa inicial consumida por 96 horas) tanto en los medios de prueba.

11. Rango Aisla en la pantalla primaria PSGHL Utilizando el Índice de Rendimiento Relativo (RPI)

  1. Tras el cribado primario, el cálculo de los índices de rendimiento relativo sin dimensiones (RPI) con el fin de clasificar el 30 aislamientos en cada uno de los cinco experimentos diferentes a la pantalla aislados en PSGHL con dos formulaciones diferentes de nutrientes por experimento, es decir, 60% y 75% PSGHL PSGHL.
  2. Calcular el parámetro estadístico F para su uso en la clasificación de rendimiento aislado dentro de un grupo de aislados ensayados en un experimento dado: F = (XX promedio) / s. Aquí, X es el parámetro de rendimiento, como el rendimiento (Y)o tasa (R), observado para cada aislado individual, mientras que X promedio y s son el promedio y desviación estándar, respectivamente, de X observó para todos los aislados dentro de un experimento dado. Para las distribuciones normales, -2 <F <2.
  3. Para cada aislamiento en un experimento, calcular el rendimiento relativo a día, RPI R = (2 + F R) × 100/4, y calcular de manera similar el rendimiento relativo basado en el rendimiento, RPI Y = (2 + F Y) × 100/4 . El valor de RPI va de 0 a 100 ~ percentil (menor a mayor). A continuación, calcular promedios de RPI para cada aislado dentro de un experimento de hidrolizado de la forma siguiente: RPI = promedio (RPI Y + RPI R) / 2, donde las contribuciones de rendimiento y la velocidad se dio el mismo peso en esta solicitud.
    Tenga en cuenta que, en general, los parámetros de rendimiento y velocidad pueden ser ponderados si se considera desigual en importancia.
  4. Calcular IPC general en todos los n tipos de hidrolizados probados: IPC general i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n. Consideremos cada aislado en un conjunto experimental de 30 aislamientos y 2 controles. Durante la clasificación primaria de la única colonia de ~ 150 aislamientos adaptado a xilosa rica PSGHL, el RPI global se calcula para las tasas y los rendimientos a través de las dos formulaciones PSGHL aplicados en la pantalla, es decir, 60% PSGHL y 75% PSGHL, donde n = 2.
  5. Sobre la base de RPI general dentro de cada experimento, elegir el porcentaje superior de los aislados de pasar a la pantalla secundaria. En este ejemplo, el 20% superior de las cepas se eligen para pasar a través (es decir, 30 de 150 ensayadas).

12. En una pantalla secundaria, Compara Mejores rendimientos selección primaria en Multiple hidrolizados completa (> 100 g / L de azúcares mixtos) para revelar más altas cepas robustas Funcionamiento

  1. Comparación de mejor desempeño PSGHL el 6% glucano CSH AFEX y SGH modificado con dos niveles de nitrógeno, SGH-N1 y N2 SGH-(composicións que en la Tabla 1) para la clasificación final. Se tamizan los 30 aislados que eran los de mejor desempeño en la pantalla de la placa de pozo profundo primaria de PSGHL (pasos 10 y 11) y los dos controles (cepa parental NRRL Y-7124 y el aislado de AFEX CSH-tolerante (análoga a la colonia 5 de la Figura 1 Ejemplo ).
  2. Comience cultivos escogiendo un cordón de células a partir de vetas de glicerol a pocillos duplicados de profundidad de 1 ml ODM + 50 g / L de xilosa como antes y se incuba 48 hr en el sistema de placa de pozo profundo (paso 10.2). A continuación, traslado 50 l de cultivos previos ODM a 50% de cultivos de desafío SGH, e incubar en el sistema de placa de pozo profundo durante 72 horas para obtener un 620 a ~ 10). Preparar el SGH 50% mezclando SGH 1: 1 con azúcar ODM + 50 g / L de xilosa (pH 5,6).
  3. Para cada uno de los aislados, inocular un 16 ml alícuota de SGH-N1 o SGH-N2 con el sedimento de células (15 min, 2.711 xg) a partir de tres pocillos de cultivo de infección para producir cultivo de prueba inicial A 620 ~ 2,0. Incubar los cultivos de ensayo en 25 & #176;. C, 180 rpm (1 "órbita) en matraces de 25 ml con cierres de esponja de silicona matraces muestra diaria y analizan por la pantalla PSGHL.
  4. Del mismo modo, la pantalla aísla como en los pasos 12.2 y 12.3, pero esta vez sustituto SGH-N1 y N2 SGH-glucano con un 6% CSH AFEX a pH 5.2 para su uso en la preparación del medio de medio de cultivo desafío y cultivo de ensayo. Para las culturas de desafío al 50%, utilice 6% AFEX CSH diluido 1: 1 con agua, ya que es suficiente nitrógeno sin modificaciones.
  5. Repita los pasos 12.1 a 12.4 para duplicar los resultados.

13. Rango las representaciones de los aislamientos en la pantalla secundaria utilizando RPI general a la tasa de uso de múltiples hidrolizados completa

  1. Calcular los índices de rendimiento relativo (RPI) a fin de clasificar cada una de la parte superior del 20% de los aislados (~ 30 de cada 150) desde la pantalla principal que se han probado en la pantalla secundaria de la enzima sacarificado formulaciones de hidrolizado de diversa riqueza nutritiva.
  2. anotar cada unoaislado de prueba en la pantalla secundaria en base a la tasa de absorción de xilosa y el rendimiento de etanol realizado en tres formulaciones de hidrolizado con enzimas sacarificado pretratada por duplicado, incluyendo AFEX CSH (i = 1 y 2), SGH-N1 (i = 3 y 4) y SGH -N2 (i = 5 y 6).
  3. Calcular el IPC general para cada aislamiento, y aplicar este parámetro de clasificación para aventar aún más la lista de los aislamientos superiores: IPC general = Σ i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n, donde n = 6 .
    NOTA: Demostrar cinética de aislamientos superiores en hidrolizados SGH-N2 en cultivos en matraz siguiendo los procedimientos en Slininger et al 18.

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Representative Results

S. stipitis se desarrolló usando combinaciones de tres cultivos de selección, que incluían AFEX CSH, PSGHL, y cultivo continuo xilosa alimentado etanol-desafiado. La figura 1 muestra el diagrama esquemático de los experimentos de evolución realizadas junto con los aislados encontrar ya sea para realizar con mayor eficacia en general, o más eficazmente en uno de los hidrolizados de probadas. Tabla 3 muestra los números de NRRL de adhesión de estas cepas superiores y resume las tensiones de adaptación aplicadas en el proceso de consecución de la población enriquecida de la que se aisló cada cepa. Algunos aislamientos se considera que tienen el rendimiento relativo superior en uno o dos tipos de hidrolizados, pero 7 de 11 aislamientos obtenido buenos resultados en todos los tipos de hidrolizados, a pesar de que la mayoría de estos fueron expuestos y probados por un solo tipo durante la evolución. Los éxitos de los diferentes enfoques adoptados evolución aquí se demuestran en las figuras 2 -7 y en la Tabla 4.

La Figura 2 representa las mejoras distintas visto después de la primera fase de la adaptación en el que se enriquecieron derivados robustos de la cepa NRRL Y-7124 durante la transferencia en serie a concentraciones crecientes de AFEX CSH (Paso 2). En los cultivos que crecen en 6% glucano CSH AFEX, la población evolucionada demuestra más rápida acumulación y los títulos finales más altas de etanol que la cepa parental. Más utilización de la glucosa rápida también se ve a lo largo con la absorción de xilosa más rápida inmediatamente después de la disminución de la glucosa. Además en la figura 3, la estabilidad de la población cambiada características se demuestra en el ODM medio sintético con una mezcla de 87 g / l de glucosa y 66 g / L de xilosa. En este caso, tanto la población enriquecida (Figura 3B) y las colonias aisladas (Colonia 1 y Colonia 5, la Figura 3C y 3D, respectivamente) son capaces de superar la cepa parental usando la xilosa más eficazmente para hacer etanol más rápidamente, reduciendo el tiempo hasta el pico de etanol por al menos 4 días. Significativamente mayores concentraciones de etanol se acumularon por cepas evolucionadas sobre ODM (55-60 g / L) en comparación con el padre (40-45 g / L). Las mutaciones, lo que condujo a un fenotipo estable de reducción diauxy durante la transición de la glucosa-xilosa y la fermentación de xilosa más eficiente, surgieron como la población de levaduras se desarrolló en AFEX CSH.

Mejoras adicionales a Colonia 5 fueron perseguidos por someterlo a la selección natural en cultivo continuo xilosa alimentado en presencia de niveles crecientes de etanol hasta 50 g / L. Bajo esta condición, la población de levaduras retenido en el cultivo continuo debe ser capaz de inducir enzimas para la utilización de xilosa como única fuente de carbono con el fin de que sea capaz de crecer a una velocidad suficientemente alta para rellenar el fermentador a pesar de una dilución constantetarifa. En la cepa parental, la inducción de enzimas xilosa comienza a ser inhibido a concentraciones de etanol tan bajo como 15 a 20 g / L. 8 Los derivados de la colonia 5 fueron capturados en las existencias de glicerol a principios y finales de los puntos de tiempo de funcionamiento del cultivo continuo, y la Figura 4 muestra la mejora éxito en la utilización de xilosa en la presencia de 40 g / L de etanol observado en derivados evolucionadas de Colonia 5 en comparación con el padre NRRL y-7124 y la colonia inicial 5 inoculado con el proceso.

Los aislados que surge de todas las fases del esquema de adaptación de la Figura 1 fueron seleccionados en PSGHL para identificar aquellos con capacidad superior para fermentar la xilosa (paso 10.1). Los aislados que se muestran en la Figura 5 se encuentran entre los mejores ejecutantes en PSGHL fuera de ~ 150 clasificado en esta pantalla principal y en todas las pantallas secundarias de rendimiento como se describe a continuación. Para indicar una mejora de cepas evolucionadasen relación con su padre, el rendimiento de cada aislado se expresó como la relación de los valores de los parámetros cinéticos de aislado de cepa parental. Valores de la relación de "uno" se produjo cuando el rendimiento aislado era equivalente a la de los padres. Las figuras 5a y 5b resumir la parte superior aislar actuaciones en 60% y el 75% de los puntos fuertes PSGHL con suplementos nutricionales o del ODM ODM + YM. A medida que se aumentó la concentración de hidrolizado y dureza, los ratios de rendimiento reducido. En el PSGHL al 60%, cinco de los siete primeros aislamientos expuestos a PSGHL presión de selección realizado muchas veces mejor que NRRL Y-7124 (1 aislar). Cuatro aislamientos se comportaron mejor que la colonia 5 (aislar 33), que se había desarrollado durante la exposición a AFEX CSH pero no tenía exposición selectiva anterior a PSGHL. Sin embargo, en el 75% de la fuerza PSGHL, sólo el 3 aislamientos superaron significativamente tanto el padre como la colonia 5 (aislamiento 33) a pesar de los nutrientes añadidos. De éstos, superior aislamientos 15 y 16 fueron previously desafió con concentraciones crecientes de PSGHL como evolución guiar una presión de selección. Aislamientos 15, 14 y 3 sólo se expusieron a PSGHL, mientras que el 11, 13 y 16 tenían múltiples exposiciones. Aislamientos 3, 11 y 13 se encuentran en los puntos de tiempo anteriores durante la evolución de PSGHL y así tenía algo menos oportunidad de desarrollar la tolerancia frente al 14, 15 y 16. Si bien es evidente en la Figura 5 que la transferencia de serie para potenciar el peso de PSGHL sirvió para desarrollar cepas resistentes a su entorno inhibitorio, también es evidente que la exposición de la cepa parental NRRL Y-7124 a AFEX CSH por sí sola podría generar potencialmente aislados tales como Colonia 5 (33) con tolerancia cruzada a PSGHL. De este modo, se indicó que las cepas resistentes capaces de realizar en múltiples hidrolizados se pueden encontrar mediante el enriquecimiento de la tolerancia en un hidrolizado seguido por el cribado de rendimiento en otro. Los aislamientos obtenidos del cultivo continuo xilosa alimentados también fueron seleccionados en PSGHL 60% y 75% con fortalezasnutrientes y la glucosa también se agrega a 75 g / L con el fin de sostener la estimulación con etanol y la prueba de demora diauxic en xilosa siguiente utilización de la glucosa. Mientras que los aislamientos 27, 28 y 30 eran superiores a los demás de esta fase de adaptación, ambas relaciones de rendimiento del índice de absorción de rendimiento y de xilosa fueron similares a los padres en 75% PSGHL con adición de nutrientes ODM y YM, que no es necesariamente sorprendente en que ninguno tenía exposición previa a este hidrolizado (véase también Slininger et al. 18 para obtener datos adicionales que no se muestran aquí por las culturas proporciona 75 g / l de glucosa).

Los mejores cepas seleccionadas de la pantalla principal en PSGHL xilosa ricos fueron examinados posteriormente en tres hidrolizados completos. Estos hidrolizados (Tabla 1) incluyen AFEX CSH y SG pretratado con ácido diluido tratados con celulasas comerciales y complementan a dos niveles de nitrógeno diferentes (SGH-N1 y SGH-N2) para identificar el iso más versátillates con respecto a las variaciones de inhibidor y el medio ambiente nutricional. Los índices de rendimiento relativos (RPI) se calcularon para la fermentación de cada cepa aislada dentro de cada hidrolizado (Figura 6A). La Figura 6B muestra los índices de rendimiento globales combinados calculados para cada aislamiento. Cinco aislados (3, 14, 27, 28, 33) tenían RPI general por encima de 60, lo que les clasificó como el más robusto para todas las variaciones de hidrolizado y las condiciones de nutrientes combinados. Un análisis de la Tabla 3, ambos aislamientos 3 y 14 fueron evolucionado en PSGHL mientras que el 27, 28, y 33 fueron evolucionado en AFEX o CSH CSH AFEX y cultivo continuo de etanol-desafió en xilosa. Ninguna de las cepas que muestran el uso de hidrolizado de múltiples superiores se desarrolló en más de un hidrolizado.

Algunas cepas eran "especialistas" mejor desempeño en cualquiera SGH-N1 / 2 o AFEX CSH. Aquellos aislamientos que realizan mejor como especialistas en SGHhidrolizados (11, 16 y 9) se obtuvieron por la evolución en PSGHL como el desafío final o solamente. Para los aislados 11 y 16, que se enriquece inicialmente vía el aumento del desafío CSH AFEX, la capacidad de utilizar de manera eficiente AFEX CSH no se seleccionó de forma activa durante la última enriquecimiento larga en PSGHL, y los factores genéticos clave que apoyan su uso se perdieron, evidentemente. Por el contrario, los aislamientos 14, 25, 27, 30 y 33 eran trabajadores superiores en AFEX CSH, y todos, excepto aislante 14 se desempeñó en AFEX CSH con o sin estimulación con etanol. Así como se esperaba, evolución dirigida en AFEX CSH o PSGHL tendía a seleccionar para la levadura bien adaptada al hidrolizado de selección. La única excepción en este sentido fue aislado de 14. Aislar 14 se originó en el PSGHL única desafiar y se aisló de agar YM dilución en placas de cultivo final PSGHL enriquecimiento. Slininger et al. 18 mostraron este aislado para tener una capacidad superior de la inducción de la enzima xilosa en las células de glucosa-crecido en presencia de5-15 g / l de ácido acético y la reducción de lag diauxic en ODM con 75 g / L de cada uno de la glucosa y la xilosa, a pesar de> 30 g / L de etanol se produce antes del punto de transición de glucosa-xilosa.

La cinética superiores de cepas evolucionado con relación a la cepa madre S. stipitis NRRL Y-7124 se demostró como se muestra en la Tabla 4, que representa los resultados de los cultivos en matraz de aireación bajo nivel inoculados a inicial A 620 8,4 ± 2,5 75 ml SGH-N2 (pH 6,2) se incubaron en matraces de 125 ml con tapones de esponja de silicona en 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita), y en la figura 7, en representación de cultivos en matraces de aireación moderados inoculados a sus iniciales en un matraz de 620 0.5 en 23 ml SGH-N2 por 50 ml. 18 Estas condiciones representan dos tipos diferentes de funcionamiento sugeridas por el la literatura como potencialmente comercialmente prometedor para la producción de etanol por S. stipitis. 8,22 En los abetost ejemplo de la falta de ventilación nivel, la alta densidad celular prevé la fermentación rápida para comenzar inmediatamente. Mientras que en el segundo caso, la baja densidad celular y una mayor ventaja de aireación nivel de crecimiento logarítmico para construir la población y acelerar el crecimiento asociada a la conversión de azúcar a etanol. Estos datos demuestran que las cepas evolucionadas tienen ventajas cinéticas significativas sobre la cepa parental: más tasa de absorción rápida de glucosa (Tabla 4), más rápida la velocidad de absorción de xilosa específica (Tabla 4), más rápida productividad de etanol en tanto la glucosa como la xilosa y en general (tabla 4), el retraso más corto precedente crecimiento (Figura 7), y más corto glucosa diauxic a xilosa lag de transición. Estas mejoras permitieron que el etanol se acumule a más de 40 g / L y a pico días antes (Figura 7) que fue visto por los padres NRRL Y-7124. La productividad de etanol general más alto (Tabla 4) se logró a 1,5-5 horas la de la cepa parental (Tabla 4), dependiendo de la cepa evolucionada.

Figura 1
Figura 1:. Scheffersomyces stipitis diagrama de flujo adaptación El diagrama mostrado indica el orden de las tensiones aplicadas durante el proceso de adaptación y los puntos de recuperación de los aislados superiores (números en paréntesis). Véase también el cuadro 3 Tecla de aislamiento como referencia para las identidades de deformación. Proporcionar orientación del tiempo, los números en rojo indican el número de días en cada fase de adaptación. Para las fases de transferencia de serie en AFEX CSH y PSGHL xilosa ricos, cada día de la adaptación representa aproximadamente 2-4 generaciones. Para la fase de cultivo continuo (205 días en total), la tasa de dilución D fue variable en ~ 0-0,1 hr -1 durante 125 d de la operación con la alimentación pH accionado. En el proximo80 días, la operación estaba en un flujo continuo con D en 0.012 hr -1, proporcionando un tiempo de generación (ln 2) / (D) de 58 hr, o 1 generación por 2,4 d en el estado estacionario. Siguiente una muestra de la población adaptada del cultivo continuo de 205 días se mutagenizó con luz UV y se inoculó a un cultivo continuo operado con D en 0.012 -1 hr. (Reproducido de Slininger et al. 18) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Mejora de la fermentación por lotes de 6% glucano CSH AFEX Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 cepa parental fermentación de 6% glucano AFEX CSH (A) se compara con Accesibilidad Colonia 5 de fermentación de 6% glucano pretratado-AFEX rastrojo de maíz hydrolyzate (B). Símbolos designan biomasa (cuadrado rojo), glucosa (círculo negro con línea discontinua), xilosa (círculo azul con línea continua), etanol (triángulo verde), y el xilitol (púrpura del diamante). (Reproducido de Slininger et al. 18) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Reducción de retardo diauxic en medio definido con azúcares mixtos actuaciones de fermentación se comparan en el ODM con 66 g / l de glucosa y 87 g / L de xilosa de cepa parental S.. stipitis NRRL Y-7124 (A), la AFEX CSH adaptado población derivada de Y-7124 (B), de colonias de células solo 1 aislado del S. adaptado población stipitis (C), una sola célula Colony 5 aislado de la población adaptada (D). Símbolos designan biomasa (cuadrado rojo), glucosa (círculo negro con línea discontinua), xilosa (círculo azul con línea continua), etanol (triángulo verde), xilitol (púrpura del diamante), y adonitol (oro y diamantes con el borde negro). (Reproducido de Slininger et al. 18) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Etanol derivados resistentes de Colonia 5. hidrolizado colonia tolerante 5 se desarrolló aún más por la selección en cultivo continuo ODM que contiene xilosa como única fuente de carbono y altos niveles de etanol. Dos poblaciones de glicerol derivado obtenido temprano en el proceso de selección (2A.1.53R, triángulo naranja y línea de trazos) y unaespués de la irradiación UV de los inóculos de cultivo continuo (2A.1.30R.2, círculo púrpura y línea discontinua) se muestran en comparación con la cepa NRRL Y-7124 padre (círculo verde con línea continua) y AFEX CSH colonia tolerante 5 (triángulo negro con línea sólida). La absorción de xilosa por densas poblaciones de levadura glucosa-crecido (A 620 = 50) en ODM con 40 g / L de etanol indicó que todas las cepas adaptadas superaron el padre no adaptado en la capacidad de inducir el metabolismo de xilosa. (Reproducido de Slininger et al. 18) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. Relación entre la mejora del rendimiento de aislado tolerante en comparación con los padres Las actuaciones de cepas tolerantes superiores se resumen en relación conla cepa parental de control NRRL Y-7124 para cada formulación de PSGHL (A, B). Actuaciones fueron evaluados en términos de tasa de absorción de xilosa (barras azules representan proporciones de aislar a los padres) y el rendimiento de etanol por azúcar suministrado (barras verdes representan proporciones de aislar a los padres). (Reproducido de Slininger et al. 18) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Aislar la clasificación basada en RPI. El concepto de índice de rendimiento relativo (RPI) se aplicó a los resultados de rendimiento de la pantalla secundaria con el fin de clasificar a 33 aislamientos dentro de cada tipo de hidrolizado basado en la tasa de absorción de xilosa y producción de etanol por azúcar suministrado. (A) La RAN relativarey de cualquier muestra dada dependía del tipo de hidrolizado (P <0,001): SGH-N1 (barras azules), SGH-N2 (barras rojas) y AFEX CSH (barras verdes). (B) El RPI global calculado en todos los tipos de hidrolizados (barras azul claro) indicó cepas superiores con más robusto rendimiento en diferentes condiciones de hidrolizado. (Reproducido de Slininger et al. 18) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7: fermentaciones SGH comparativos de cepas adaptadas superiores de S. stipitis. Superior adaptado aislamientos y su cepa parental NRRL Y-7124 se compara la fermentación de hidrolizados enzimáticos de ácido pretratados diluida switchgrass (20% de sólidos de carga) a 25 ° C y pH 6.2 inicial a baja inicial la densidad celular. se muestran la evolución temporal de la biomasa (cuadrados rojos), glucosa (círculos negros y línea discontinua), xilosa (círculos azules y línea continua) y etanol (triángulos verdes). Las barras de error representan el intervalo de aproximadamente el valor medio marcado por símbolos. (Reproducido de Slininger et al. 18) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1:. Las composiciones de hidrolizados utilizados en los cultivos (. Reproducido de Slininger et al 18) Haga clic aquí para descargar la tabla.

Tabla 2: medio definido óptimo para Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 7TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> Haga clic aquí para descargar la tabla.

Tabla 3:. Resumen de Scheffersomyces tolerantes superiores stipitis cepas para la fermentación de hidrolizados de biomasa vegetal (. Reproducido de Slininger et al 18) Haga clic aquí para descargar la tabla.

Tabla 4: Cinética comparativos de los aislados de P. virgatum hidrolizado SGH-N2 inoculó a sus iniciales A 620 = 8.4 ± 2.5 Las tarifas son las tasas normalizadas por unidad de absorbancia durante la glucosa o el consumo de xilosa.. (Reproducido de Slininger et al. 18) Haga clic aquí para descargar la table.

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Varias medidas fueron cruciales para el éxito del proceso de la evolución. En primer lugar, es la clave para elegir las presiones de selección apropiados para conducir la evolución de la población hacia los fenotipos deseados que se necesitan para la aplicación exitosa. Los siguientes tensiones selectivos fueron elegidos para S. stipitis desarrollo y aplicado en los momentos apropiados para guiar enriquecimiento para los fenotipos deseados: el aumento de puntos fuertes de 12% glucano AFEX CSH (que fuerza el crecimiento y la fermentación de diversos azúcares en presencia de ácido acético y bajos niveles de aldehídos de furano y otros inhibidores); xilosa alimenta cultivos continuos con el aumento de la concentración de etanol (que obliga a la inducción de enzimas xilosa a reducir el retraso diauxic); y el aumento de los puntos fuertes de 20% PSGHL carga de sólidos (que fuerza el crecimiento y la fermentación de xilosa en la presencia de ácido acético alta, furanos, y otros inhibidores). En segundo lugar, es importante conservar las poblaciones de levadura en evolución mediante la congelación de glicerol stocks de muestras de población como el proceso de enriquecimiento progresa. Dichas instantáneas de la población se pueden almacenar para la prueba funcional periódica para documentar el progreso y la evolución para permitir aislamientos posteriores como se desee, o para reiniciar procesos de evolución después de un paréntesis. Una tercera etapa clave en el procedimiento de evolución era recuperar aislamientos excepcionales al enriquecer poblaciones de cultivo de la selección o poblaciones de glicerol abastecido en un medio selectivo conveniente (tal como agar o micro-placas que contienen un gradiente de tensión que presenta una serie de hidrolizado y / o concentraciones de etanol) . A continuación, las colonias supervivientes que crecen bajo la condición más estresante pueden ser recogidos para preservar para la caracterización posterior. Estos tres pasos básicos se pueden repetir para perseguir cada presión de selección fenotipo deseado adicional, o, alternativamente, múltiples presiones en un solo ciclo si es apropiado. Cuando la población de levaduras matriz nativa está expuesto a las diversas tensiones, se espera que la diversidad genética a surgir TH mutaciones naturales o inducidas en bruto, y la exposición continuada permitirán la selección natural para enriquecer a las personas con las mutaciones más beneficiosos que apoyan la supervivencia competitiva. Se espera que el fenotipo seleccionado se producirá como resultado de múltiples mutaciones genéticas. En el protocolo anterior, las mutaciones pueden ser inducidas durante el tratamiento UV o potencialmente durante la exposición de la levadura a los hidrolizados. Se conocen hidrolizados para contener tres clases de compuestos perjudiciales para los microorganismos:. Ácidos carboxílicos, aldehídos y compuestos fenólicos 22 aldehídos reactivos, tales como furfural y 5-hidroximetilfurfural, puede dañar las células y causar una elevación de especies reactivas de oxígeno (ROS), generada típicamente en mitocondrias. ROS son bien conocidos por causar mutaciones del ADN en las células eucariotas. 23,24 Los compuestos fenólicos presentes en los hidrolizados, aunque no conocido previamente como no genotóxico, puede promover y sinergizar los efectos mutagénicos de aldehídos y mutagénico ROS. 25

Se espera jove_content "> La estrategia por etapas de entornos cada vez más difíciles de construir cepas evolucionadas con una serie de mejoras fenotipo, tanto dirigidos y no dirigidos. Es posible que ciertos fenotipos que no son objeto pueden surgir que no son deseables o inestable. Con el fin para capturar las cepas más altamente funcionales y robustas, un paso clave adicional que debe tomarse es evaluar y comparar los aislamientos seleccionados para los rasgos de interés comercial, que alcanza para ambos fenotipos dirigidas y no dirigidas. para hacer esto, aislar actuaciones deben compararse en una variedad de condiciones de estrés orientados a la aplicación, tal como en los hidrolizados con diferentes retos de inhibidor y formulaciones de nutrientes, lo que permite la selección de las mejores cepas generales que son estables y robusto a la variación sustrato lignocelulósico industrial amplio. Además, un desafío estabilidad de la cepa puede ser incorporado en el pantalla como se hizo en el ejemplo mediante la inclusión de pasos de precultivo involvción inicial de crecimiento de la levadura en dos medios no selectivos, agar YM durante varias generaciones, seguido por el ODM sintética con 50 g / L de xilosa durante 6-7 generaciones adicionales, dando oportunidad para la desestabilización de los rasgos culturales deseados antes de la exposición al reto de actuación en hidrolizado. Según las características de rendimiento significativas, tales como el rendimiento de etanol y tasa de absorción de xilosa, aislamientos se clasifican en cada condición de tensión diferente, como cada entorno hidrolizado de prueba, que puede ser diferente del medio de cultivo de enriquecimiento de la cepa aislada. El RPI adimensional se puede utilizar para calcular el rendimiento medio global relativa y el rango de las cepas que se comparan. Un factor adimensional que es apropiado para reflejar el rendimiento relativo de los diferentes tipos de hidrolizados y en base a diferentes evaluaciones de desempeño, tales como los rendimientos respecto a los tipos. Este procedimiento de clasificación identifica cepas que realizan constantemente bien a través de variaciones amplias en las condiciones de crecimiento y hidrolyzates y son aptos para ser a la vez robusto y estable genéticamente.

Varias iteraciones y modificaciones de estos pasos básicos pueden ser necesarios para dar cabida a la evolución de cualquier cepa microbiana capaz de características específicas o únicas de rendimiento en hidrolizados lignocelulósicos u otros sustratos de interés. En el S. stipitis ejemplo, es importante tener en cuenta que la suplementación de nutrientes, incluyendo fuentes comerciales de bajo coste, a los hidrolizados preparados a alta carga de sólidos fue clave para controlar el rango dinámico de actuaciones aislante para mejorar la separación estadística durante el cribado. La importancia de los nutrientes a la fermentación con éxito de hidrolizados inhibidores concentradas también se ha informado anteriormente, y se cree que es debido a una necesidad elevada de aminoácidos y otros nutrientes necesarios para el mantenimiento de las células, el equilibrio redox, y reparación como consecuencia de dichas condiciones de estrés, especialmente durante la utilización de xilosa. 9,26,27Además, si los nutrientes son demasiado escasa o demasiado profusa, las diferencias en las actuaciones del aislante pueden ser difíciles de detectar estadísticamente debido a todos los aislamientos haciendo muy mal, o todos haciendo extremadamente bien, respectivamente. Los aislados capaz de realizar bien bajo diversas condiciones se espera que sea fiable, robusta o a variaciones en las condiciones industriales.

La principal limitación de este protocolo es que la evolución adaptativa y el cribado son muy literal en el resultado, en el que "uno conseguirá lo que se enriquece y pantallas para". Por lo tanto, las condiciones de enriquecimiento y de pantalla deben ser diseñados para amplificar e identificar individuos, respectivamente, con los cambios deseables en fenotipos mientras que todavía conserva rasgos preexistentes deseables. La evolución puede afectar no seleccionados para los rasgos que son críticos para el rendimiento industrial (por ejemplo, los requerimientos de factores de crecimiento). Por esta razón, el progreso de enriquecimiento de la población para un rasgo necesita ser supervisar periódicamenteed para otros rasgos, como método de resolución de problemas para cambios indeseables. Por ejemplo, uno de los rasgos únicos de S. stipitis es su capacidad nativa para crecer en y fermentar la xilosa. Todos los de enriquecimiento y detección sustratos incluyen xilosa como fuente de carbono que contribuye único o clave en la presencia de inhibidores. En consecuencia, una característica común de todos los cultivos de enriquecimiento en este ejemplo fue que se seleccionan directamente para la utilización de xilosa cepas más rápidos, cuyas poblaciones se hizo más y más enriquecida en cultivo continuo serial o porque eran mejores competidores. Como resultado pretendido, la mejora de cepas eran capaces de captar la xilosa más rápida, pero las mejoras en el rendimiento de etanol eran mucho menos espectacular que las mejoras en la velocidad de absorción de xilosa. Esta última tendencia que probablemente se produjo desde el rendimiento de etanol por la cepa parental fue relativamente alto en alrededor de 0,3 g / g, o 60% del teórico (0,51 g / g), ya que el crecimiento celular se convirtió estacionaria en hidrolizados, dejando menos espacio paramejora. En los cultivos, los rendimientos de etanol más altas podrían ser seleccionados en contra, posiblemente porque el etanol es un inhibidor del crecimiento, lo que hizo necesaria la supervisión del rendimiento de la población evolucionada para este rasgo. Las concentraciones de etanol mantenido por debajo del nivel de inhibición del crecimiento tenderían a neutralizar esto como un factor de selección. Para S. stipitis NRRL Y-7124, 40 g mitades / L de etanol tasa específica de crecimiento, mientras que 64 g / L impide el crecimiento completo. 28 en etanol desafiados cultivos continuos alimentados xilosa, la aireación se mantuvo baja y las tasas de dilución también se mantiene lo suficientemente baja con amplio xilosa presente para fomentan la fermentación en lugar de la respiración de etanol y evitar el enriquecimiento de una propiedad no deseada el uso del etanol. Además, los suplementos de nutrientes a los hidrolizados utilizados en las pantallas de rendimiento se han diseñado cuidadosamente a fin de evitar la selección para cepas que necesitan un suministro de nutrientes ricos costosos, tales como extracto de levadura. Suplementos siempre se incluyen fuentes comerciales más bajo coste available, tales como harina de soja y urea, aunque se han aplicado los componentes más ricos, como en YM en cultivos en tándem para el ensayo comparativo, como en las formulaciones de 60% y 75% PSGHL que normalmente se agotan de nitrógeno. El medio sintético ODM, usado en las pantallas de precultivo y cultivo de rendimiento, fue originalmente diseñado para un rendimiento óptimo de la cepa madre S. stipitis NRRL Y-7124 7 de acuerdo con la rutina de optimización medio de cultivo descrito por Traders Protein 20 que recomienda ingredientes definidos, incluyendo vitaminas, minerales, purinas y pirimidinas, y fuentes de aminoácidos para el suministro de nutrientes compatibles con rentable escalado industrial usando fuentes comerciales. Una recomendación final en el diseño de las cepas pertinentes, es mantener el diseño de las condiciones de enriquecimiento y la pantalla lo más relevante posible a las condiciones del proceso industrial esperados.

etanol renovable competitiva en costos mucho tiempo se ha perseguido a reducir la dependencia de los combustibles fósiles. Para mejorar la capacidad de S. stipitis NRRL Y-7124 a tolerar, crecer y fermentar hidrolizados inhibitorios de lignocelulosa, varios investigadores han utilizado el cultivo repetitivo en el líquido rico en xilosa resultante de ácido diluido-pretratamiento de la biomasa lignocelulósica. 13,14,16,17 El exceso de encalado para desintoxicar inhibidores sigue siendo necesaria para permitir un nivel razonable de rendimiento de las cepas adaptadas a principios de madera y paja de trigo licores de pretratamiento. 13,14 múltiples repetidas rondas de mutagénesis UV y aleatoria del genoma se han aplicado para desarrollar derivados de S. stipitis NRRL Y-7124 con una mejor tolerancia inhibidor y el crecimiento en la madera dura pasó licor sulfito (HWSSL) 16,17. Sin embargo, las concentraciones de etanol producidos por estas cepas en HWSSL tenían menos de 10 g / l después de 6 a 7 días. Utilizando las técnicas mostradas y descritas aquí, las nuevas cepas de S. evolucionados stipitis NRRL Y-7124 se han desarrollado para satisfacer phenotymetas PE necesarios para un uso comercial económico: fermentación de hidrolizados a pH 5-6 y sin medidas de desintoxicación anterior, tales como el exceso de encalado, que conduce a la eliminación de residuos costosos; crecimiento y retardos diauxic reducido en gran medida; acumulaciones de etanol lo suficientemente altas como para la destilación comercial (> 40 g / L de etanol); más rápido crecimiento y la productividad de etanol que se había informado anteriormente para las cepas de levadura de fermentación nativas hidrolizados undetoxified; y el rendimiento en diversos hidrolizados a alta carga de sólidos, incluyendo SGH debidamente complementado-nitrógeno de soja (que es lo contrario de nitrógeno pobres) y no complementado CSH AFEX. Las cepas mejoradas desarrolladas utilizando la novela enfoques agresivos a la evolución que se concreta en los pasos claves resumidos anteriormente, se espera que para beneficiar a la economía de producir etanol a partir de biomasa agrícola mediante la reducción de los costes de explotación, costes de inversión y los insumos de energía y agua. Esto se reportó el primer plan de evolución de la cepa para producir cepas adaptadas de S. stipites la demostración de la producción de etanol económicamente recuperables en hidrolizados undetoxified.

Las nuevas cepas de S. stipitis que surge de cada fase del proceso de evolución (Figura 1) son candidatos para futuros estudios para determinar los cambios genéticos asociados a las presiones de selección específicos aplicados y los mecanismos subyacentes atributos clave de la mejora de la fermentación hidrolizado, como la tolerancia y la reducción de inhibidor de retraso diauxic. Tan valioso nuevos conocimientos ayudará a la ingeniería de biocatalizadores y procesos de levadura de nueva generación para la conversión de lignocelulosa con los biocarburantes y otros productos. Como las nuevas cepas se derivan, es probable que sea beneficioso para pasar de nuevo la población derivado a través de un protocolo de evolución cepa similar a la descrita aquí con el fin de seleccionar los transformantes más útiles para su uso comercial en hidrolizados. Del mismo modo, como nuevas cepas microbianas se descubren con el potencial de hacer un miRiad de nuevos productos útiles a partir de biomasa renovable, el proceso de evolución podría aplicarse además a mejorar la robustez tensión y la productividad en los hidrolizados, permitiendo potencialmente nuevos procesos y productos bio-catalítico para ponerse a disposición.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour Archer Daniels Midland Co. (ADM) 63160 ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant) Sigma-Aldrich P1300 Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids Becton Dickinson and Company 228830 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan  Sigma-Aldrich T3300 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine  Sigma-Aldrich C7352 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar Becton Dickinson and Company 214010 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract Becton Dickinson and Company 218630 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract Becton Dickinson and Company 212750 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean Fluka P0521-500g multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder Sigma-Aldrich A8626 CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99% Sigma-Aldrich C3506 CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra Sigma-Aldrich G6779 CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99% Sigma-Aldrich T0376 CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99% Sigma-Aldrich U0750 CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS Fisher Chemical D16-500 CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99% Sigma-Aldrich X1500 CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates Becton Dickinson Falcon 351172 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper Kimberly-Clark towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) Corning Life Science Glass 4980-125 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) M1335-0016 multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates Applikon Biotechnology Z365001700 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates Applikon Biotechnology Z365001296 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover Applikon Biotechnology V0W1040027 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover Applikon Biotechnology V0W1040001 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene Applikon Biotechnology ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks Bellco 1924-00032 Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. Bellco 1968-00100 (original Cat. No.) Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven MathisAg Typ-Nbr BFA12 215307 Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer YSI Life Sciences 2900D-UP www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer Bio-Tek Instruments, Inc MQX200R www.biotek.com

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References

  1. Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
  3. Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
  4. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
  5. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
  6. Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
  7. Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
  8. Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
  9. Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
  10. Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
  11. Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).
  12. Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
  13. Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
  14. Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
  15. Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
  16. Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
  17. Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
  18. Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
  19. Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
  20. Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
  21. Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
  22. Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
  23. Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
  24. Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
  25. Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
  26. Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
  27. Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
  28. Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).

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Las técnicas para la Evolución de la robusta levaduras que fermentan la pentosa para la bioconversión de lignocelulosa en etanol
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