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Bioengineering

Técnicas para a Evolução da levedura Pentose-fermentação robusta para bioconversão de transformação de lignocelulose em etanol

Published: October 24, 2016 doi: 10.3791/54227
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Bioenergy Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 2Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 3Chemical Engineering and Material Science, Great Lakes Bioenergy Center, Michigan State University

Summary

Evolução e isolamento de técnicas adaptativas são descritos e demonstrados para se obter derivados de Scheffersomyces stipitis estirpe NRRL Y-7124 que é capaz de consumir rapidamente de hexoses e pentoses em açúcares mistos enzima sacarificado hidrolisados undetoxified e a acumular-se sobre 40 g / L de etanol.

Introduction

Estima-se que 1,3 bilhões de toneladas secas anuais de biomassa lignocelulósica poderia apoiar a produção de etanol e permitir que os EUA a reduzir o seu consumo de petróleo em 30%. 1 Embora biomassa vegetal misturas de açúcar rendimentos de hidrólise ricos em glicose e xilose, inibidores da fermentação são gerados pelo pré-tratamento químico necessário para quebrar hemicelulose e celulose para expor ataque enzimático. ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural (HMF) são considerados os principais componentes entre muitos inibidores que se formam durante o pré-tratamento. A fim de mover a indústria de etanol lignocelulósico para a frente, a investigação e procedimentos para permitir a evolução de estirpes de leveduras capazes de sobreviver e funcionar eficazmente para usar tanto hexoses e pentoses, na presença de tais compostos inibidores são necessários. Um ponto fraco adicional significativo de estirpes de leveduras industriais tradicionais, tais como Saccharomyces cerevisiae, é a incapacidade de fermen eficientementet a xilose disponíveis em hidrolisados ​​de biomassa vegetal.

Pichia stipitis estirpe NRRL Y-7124 (CBS 5773), recentemente renomeado stipitis Scheffersomyces, é uma levedura de fermentação pentose nativa que é bem conhecido para fermentar a xilose em etanol. 2,3 A evolução da estirpe NRRL Y-7124 foi prosseguido aqui porque tem sido documentada a têm o maior potencial de linhagens de leveduras nativas para acumular etanol economicamente recuperável superior a 40 g / L com pouco subproduto xilitol. 4,5,6 na mídia ideal, S. stipitis estirpe NRRL Y-7124 produz 70 g / L de etanol, em 40 h (1,75 g / L / h), com um rendimento de 0,41 ± 0,06 g / g em culturas de elevada densidade celular (células de 6 g / l). 7,8 Resistência para inibidores da fermentação etanol, furfural, e HMF também tem sido relatado, 9 e S. stipitis foi classificado entre mais promissores pentoses-fermentação de leveduras nativas disponíveis para productio etanol em escala comercialn de lignocelulose. 10 O nosso objectivo era aplicar diversas hidrolisados lignocelulósicos undetoxified e pressões de seleção de etanol para forçar evolução em direção a um derivado mais robusto da estirpe NRRL Y-7124 adequada para aplicações industriais. Chave entre características melhoradas procurados eram taxas mais rápidas de açúcar de absorção em hidrolisados ​​concentrados, reduzida diauxy para uma utilização mais eficiente de açúcar misturado, e tolerâncias mais elevadas de etanol e inibidores. A aplicação de S. stipitis para hidrolisados undetoxified foi um dos principais focos da pesquisa para eliminar a despesa operacional adicional associado com processos de desintoxicação hidrolisado, como calagem excessiva.

Dois hidrolisados industrialmente promissores foram aplicadas para forçar evolução:. Enzima Sacarificada fibra de amônia pré-tratados com expansão hidrolisado de palha de milho (AFEX CSH) e diluir o licor switchgrass hidrolisado pré-tratadas com ácido (PSGHL) 11,12 tecnologia de pré-tratamento AFEX está sendo desenvolvido paraminimizar a produção de inibidores de fermentação, enquanto que o pré-tratamento com ácido diluído representa o menor custo actual tecnologia mais comumente praticado para expor biomassa celulósica para sacarificação enzimática. PSGHL é separável a partir da celulose remanescente após pré-tratamento e é tipicamente rica em xilose a partir do hidrolisado hemicelulose, mas pobre em glucose. AFEX CSH e composições PSGHL diferem uns dos outros em aspectos-chave que foram exploradas para gerenciar o processo de evolução. AFEX CSH é menor em aldeídos furano e inibidores do ácido acético, mas superior em aminoácidos e as fontes de azoto, quando comparada com amoníaco PSGHL (Tabela 1). PSGHL apresenta o desafio adicional de xilose sendo o açúcar predominante disponível. Assim PSGHL é apropriado para enriquecer especificamente para melhor utilização xilose na hidrolisados, uma fraqueza prevenção do uso comercial de levedura disponíveis. Mesmo entre leveduras de fermentação de pentoses nativas, a dependência em relação à xilo açúcar abaixo do idealse a apoiar o crescimento celular e reparação torna-se ainda mais desafiador na hidrolisados por causa de uma variedade de razões:. deficiências de nutrientes, inibidores causando danos generalizados para a célula integridade estrutural, e as perturbações do metabolismo devido a desequilíbrios redox 9 suplementação de nitrogênio, especialmente na forma de aminoácidos, pode representar um custo operacional significativa para as fermentações. O impacto da suplementação de nitrogênio sobre o rastreio isolado e ranking foi explorada com hidrolisados ​​switchgrass.

Indivíduos melhoradas foram enriquecidos em uma população evoluindo usando várias pressões de seleção dependente de diversidade genética natural do S. população e as mutações stipitis induzida pela exposição a dois hidrolisados diversas, etanol ou radiação UV. Pressões de selecção foram aplicados em paralelo e em série para explorar o progresso evolução de S. stipitis para derivados desejados capazes de crescer e fermentar eficientemente hidrolisados em(Figura 1). A cultura repetitivo de populações funcionais hidrolisados ​​em cada vez mais difíceis foi realizado em microplacas utilizando uma série de diluições de 12%, quer CSH AFEX glucano ou então PGSHL preparado em 20% de carga de sólidos. A aplicação de crescimento desafiou-etanol em xilose em cultura contínua melhorou ainda mais CSH adaptada populações AFEX, através do enriquecimento de fenótipos que demonstram menor suscetibilidade ao etanol repressão da utilização de xilose. A última característica foi recentemente mostrado problemática à utilização das pentoses pela estirpe NRRL Y-7124 após fermentação da glicose. 8 Enriquecimento em PSGHL foi próxima explorado para ampliar a funcionalidade hidrolisado.

Derivados melhorados putativos de S. stipitis NRRL Y-7124 foram isolados de cada fase do processo de evolução usando enriquecimento alvo sob condições de estresse e à diluição em placas para escolher colónias a partir das populações mais prevalentes. relativa adimensionalíndices de desempenho (RPIS) foram usadas para classificar estirpes com base no desempenho global, em que o comportamento cinético foi avaliada sobre os diferentes tipos de hidrolisados ​​e suplementos nutrientes aplicados. Embora os sucessos de vários procedimentos de adaptação para melhorar a funcionalidade do S. stipitis na hidrolisados lignocelulósicos foram documentados anteriormente, as estirpes que demonstram a produção de etanol econômica na hidrolisados undetoxified não tenham sido previamente relatado. 13-17 Utilizando os processos de evolução para ser visualizado em mais detalhes aqui, Slininger et al. 18 cepas que são significativamente aprimorados em relação desenvolvido a estirpe-mãe NRRL Y-7124 e são capazes de produzir> 40 g / L de etanol em AFEX CSH e enzima hidrolisado virgatum sacarificado (SGH) adequadamente complementada com fontes de azoto. Estas novas estirpes são de futuro interesse para a lignocelulose em desenvolvimento para a indústria de etanol e como sujeitos de genômica adicionais estudos edifícionaqueles de tensão previamente sequenciado NRRL Y-11545 19. Um estudo da genómica das principais linhagens produzidas durante as várias fases de evolução diagramado na Figura 1 poderia elucidar a história de mudanças genéticas que ocorreram durante o desenvolvimento como um prelúdio para novas pesquisas de melhoria estirpe.

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Protocol

1. Prepare Começando Materiais e Equipamentos para Ensaios

  1. Prepare hidrolisados ​​usando 18 a 20% de biomassa inicial de peso seco na reacção de pré-tratamento para utilização na evolução, o isolamento e a procedimentos de classificação. Veja Slininger et al. 2015 18 para os métodos detalhados para preparar AFEX CSH, PSGHL e SGH com suplementos de nitrogênio N1 ou N2 utilizados em evolução, isoladamente ou ranking. Ver Tabela 1 para composição de cada tipo de hidrolisado.
    NOTA: fortificação de azoto de SGH foram designados como SGH-N1 ou SGH-N2 definidos como se segue: SGH-N1 = SGH fortificada a 42: carbono 1 molar em relação ao rácio de azoto (C: N), com fontes de azoto, incluindo ureia, amino livre de vitamina ácidos de caseína, D, L-triptofano, L-cisteína, e vitaminas a partir de fontes definidos de tal modo que (~ 15% molar de N azoto é azoto amino primário (PAN) e ~ 85% de N é de ureia); SGH-N2 = SGH fortificada para 37: 1 C: N com uréia e farinha de soja como o menor custo fonte comercial oaminoácidos de f e vitaminas, proporcionando ~ 12% do N do PAN e 88% na forma de uréia.
  2. Adquirir uma cultura liofilizada da estirpe, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) do Culture Collection ARS (Centro Nacional de Pesquisa Agrícola Utilização, Peoria, Illinois), e preparar culturas de glicerol como indicado. Manter culturas de levedura da mãe e seus derivados em 10% de glicerol a -80 ° C.
    1. estoques de glicerol a sequência de dextrose de levedura de malte, peptona (YM) placas de agar (3 g / l de extracto de levedura, 3 g / l de extracto de malte, 5 g / l de peptona, 10 g / L de dextrose, 20 g / l de agar) e incubar 48- 72 h a 25 ° C. 8 placas desenvolvida pode ser armazenado até uma semana a 4 ° C antes de ser utilizado como líquido de inóculos de pré-cultura.
  3. Prepare óptimas definidas Médio (ODM), um meio sintético compatível com procedimentos de formulação industriais 20 que anteriormente foi desenvolvido para a conversão óptima de xilose em etanol pela str paiain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. 7 Use o meio definido em todas as pré-culturas e culturas para bioensaios de desempenho de fermentação e também para o etanol desafiado, evolução cultura contínua xilose-fed. Composição ODM está listado para referência na Tabela 2.
  4. Como descrito anteriormente, 18 analisar biomassa celular utilizando um espectrofotómetro de leitura de cuvette- ou de micro-placa, se for caso disso, para medir a absorvência da cultura a 620 nm (A 620). Quantificar açúcares, etanol, furfural, hidroximetilfurfural (HMF), e ácido acético em amostras de cultura utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou a determinação enzimática robótico de glicose e xilose por um maior rendimento.

2. Enriqueça Derivados robustos durante a transferência de série na AFEX CSH

  1. Inocular uma pré-cultura da estirpe NRRL Y-7124. Transferência de células de agar YM a 75 ml ODM + 150 g / L de xilose para manter a capacidade de crescer sob oestresse smotic. Incubar pré-culturas em frascos de 125 ml fechado com esponja de silicone tampões 24 h a 25 ° C com agitação (150 rpm, uma "órbita).
  2. alíquotas congeladas descongelamento de 6-12% CSH AFEX glucana em água fria para o uso. Ajustar o pH a 5 e se necessário filtro de esterilizar antes da preparação de uma série de diluição em microplacas de 96 poços.
  3. Encha microplacas com 50 jil por poço e 8 poços por diluição hidrolisado, em seguida, com inocular alguns microlitros de pré-cultura por poço para permitir que uma absorvância inicial (620 nm) A 620 ≥0.1. Incubar as placas estaticamente 24-48 horas a 25 ° C em uma caixa de plástico com uma toalha de papel molhada para umidade.
  4. Usando o hidrolisado de diluição mais concentrada que visivelmente cresceu a A 620> 1, a transferência de 1-5 ul a cada poço de uma nova série de diluição hidrolisado para atingir inicial A 620 ≥0.1.
  5. Monitorar a cultura de crescimento A 620 em microplacas com um espectrofotômetro. Uma série de diluições Ser não inoculadoves como um controlo e branco. tampas de placa são deixados no durante o monitoramento para evitar a contaminação, e as leituras ajustados em conformidade.
  6. Preparar stocks de glicerol de culturas de adaptação regularmente para o isolamento subsequente das estirpes melhoradas ou para utilização em reinoculating diluições em série do hidrolisado contínua. Para preparar stocks, piscina quatro poços (200? L) de maior concentração de hidrolisado colonizado. Mistura 1: 1 com glicerol a 20% estéril em criotubos, para congelar as células em 10% de glicerol a -80 ° C.
  7. Repita os passos 2,3-2,6 até que o crescimento em 12% CSH AFEX glucano é sempre visível em 24 horas.

3. Isolar única célula Derivados tolerantes após enriquecimento em AFEX CSH

  1. Streak selecionado stocks de glicerol de culturas de adaptação para agar YM e usar raias para inocular 50 mL de 3% ou 6% glucana AFEX CSH (pH 5) em cada um dos três poços (Initial A 620 ~ 0,1). Incubar microplacas de 24 horas como no passo 2.3. réplica piscinate colonizado poços na maior força hidrolisado com um forte crescimento, e placa de diluição para ym ou 6% glucana agar CSH AFEX. Prepara-se o último como uma mistura 1: 1 de filtro esterilizado 12% CSH AFEX glucano com solução / L de agar morno autoclavada 30 g.
  2. Escolha 5 colónias isoladas a partir da placa de diluição mais elevada que mostra o crescimento após 24-48 h de incubação a 25 ° C para congelar como culturas de stock de glicerol. Streak cada colônia para uma placa de YM. Incubar 24 horas. Com uma ansa estéril, transferir uma sequência de células desenvolvidas para um pequeno volume de glicerol a 10%, mistura a suspender as células, e para distribuir 2-3 criotubos por congelação a -80 ° C.

4. Avaliar o desempenho da AFEX CSH Derivados tolerantes Comparado ao Pai

  1. Teste isolados no Simples culturas 6% Glucan AFEX CSH lote.
    1. Transferência de células de placas de 48 hr riscado dos estoques de glicerol a pH tampão fosfato 7 de potássio (0,4 mm) para preparar suspensões de células com A 620 = 10. Use 1 ml decada suspensão para inocular cada um dos quatro poços de 50 ul de 3% de hidrolisado de glucano de inicial A 620 = 0,2. Incubar microplacas de 24 horas como no passo 2.3. Prepara-se o 3% CSH AFEX glucano a pH 5 por diluição de 12% glucano AFEX CSH 1: 3 com água estéril.
    2. Transferência de dois poços de 24 horas de microplacas para inocular 25 ml pré-culturas de pH 5 a 12% CSH AFEX glucana utilizados em 50% da força total. Incubar pré-culturas em frascos de 50 mL com tampas de esponja de silicone durante 24 horas a 25 ° C, ~ 150 rpm (1 "órbita) Preparar a meia-força 12% glucano AFEX CSH diluindo o hidrolisado. 1: 1 com água estéril.
    3. Use meia-força pré-culturas hidrolisado para inocular 25 ml culturas de crescimento semelhante à inicial de um 620 = 0,1. Incubam-se as culturas de crescimento como acima (4.1.2) e amostra diária (0,2 ml). Acumulações de monitor de biomassa (620) e as concentrações de açúcares e de produtos de fermentação (HPLC).
  2. Alternativamente, repitch (isto é, R e colheitaeuse) populações de 6% de glucano de levedura crescido AFEX-CSH para testes em 8% de glucano culturas em lotes de hidrolisado, como descrito anteriormente. 18
  3. Em alternativa, ainda mais as populações de ensaio de 6% de glucano repitched culturas CSH AFEX por alimentação com 12% de hidrolisado de glucano, tal como descrito anteriormente. 18
  4. Teste lag diauxic de isolados em culturas de lote de ODM com açúcares mistos.
    1. Inocular 75 ml de pré-culturas ODM com 150 g / L de xilose em 125 mL de frascos com tampas de esponja de silicone por transferência de malha a partir de faixas de glicerol YM. Incubar 24 horas como no passo 2.1.
    2. Use pré-culturas para inocular culturas de 75 ml de teste semelhantes com ODM contendo 75 g / L de glucose e 75 g / L de xilose, a pH 6,5. Frascos de agitação a 25 ° C, 150 rpm. Amostra diária.
    3. Alternativamente, testar o impacto de 0-15 g de ácido / L acético em diauxy durante a fermentação da glucose e xilose, utilizando um protocolo semelhante, com excepção do pH inicial é ajustado a 6,0 ± 0,2 em culturas de teste para manter o pH 6-7 dutocar o consumo de ácido acético, tal como descrito anteriormente. 18

5. Aplique cultura contínua selecionar para utilização xilose desafiou-etanol

  1. Prepare ODM como o meio de alimentação de cultura contínua com 60-100 g / L de xilose, 20-50 g / L de etanol a pH 6,3 ± 0,2. Escolha de combinações de xilose e etanol para simular a fermentação parcial de 150 g / L de xilose, assumindo um rendimento potencial de ~ 0,5 g de etanol / g de xilose, e para acomodar o potencial de 50-70 g / L de etanol a ocorrer. 8
  2. Para preparar o inoculo de cultura contínua, transferir um representante AFEX colónia CSH-tolerantes (análogo ao Colony 5 no exemplo, a Figura 1) por ciclo a partir de uma placa de YM 48 h, para 75 ml da ODM isento de etanol (100 g / L de xilose, neste caso) em frascos de 125 ml. Incubar a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita) durante 24 h. Escolher a concentração de xilose ODM pré-cultura para corresponder ao do volume inicial segurando cultura contínua.
  3. Inocular um volume de cultura contínua realização de ODM a pH 6,3 ± 0,2 com 100 g / L de xilose + 20 g / L de etanol com ~ 5-10 mL de um concentrado de pré-cultura de um isolado AFEX CSH-tolerantes (análogo ao Colony 5, Figura 1 ) para obtenção de 100 ml a 620 inicial a ~ 0,5. Manter o volume segurando cultura (V R), a 25 ° C num frasco com agitação de 100 ml com camisa agitado a 200 rpm e equipado com eléctrodo de pH esterilizável, controlador de pH e banho de água circulante de temperatura controlada.
  4. Inicialmente, uma vez que o crescimento celular será lento devido à exposição ao etanol, configure o meio de alimentação à dose usando uma bomba accionada do pH. Definir a bomba para alimentar pH 6,3 ODM com 100 g / L de xilose e 50 g / L de etanol, quando a cultura de fermentação o pH cai para 5,4, parando, assim, ainda mais queda do pH. Manter o volume a 100 ml com uma bomba de desnatação efluente continuamente a superfície de cultura. Por conseguinte, a concentração de etanol aumenta com o metabolismo continuado e alimentação. Medir efluente e extrair amostras (1-2 ml) a partir de culturas contínuas a cada 48-72 horas, para a análise da concentração de células viáveis, os produtos e os substratos, como anteriormente descrito. 18 Para encontrar a concentração de células viáveis, fazer série de diluições 1:10 em amostras tampão (ver 4.1.1) e de espalhamento em placa as diluições de agar YM (ver 1.2.1). Com base em taxas de recolha do efluente (Q), calcular a taxa de diluição (D) (Q / V R), e, no exemplo de S. stipitis, variou 0-0,01 hr -1.
  5. Salve stocks de glicerol regularmente isolando a partir de placas de viabilidade de diluições de amostras tamponadas formando 30-100 colônias, representando colonos robustos mais prevalentes na época em enriquecimento. placas de inundação com ~ 5 ml de 10% de glicerol para permitir a preparação de cryovials duplicados. Para manutenção ou uma pausa, parar a cultura contínua e reiniciar conforme necessário usando a maior parte da (s) atual (resistente) de glicerol.
  6. Para reiniciar, raia o estoque (s) de glicerol da maioriapopulações resistentes a agar YM e transferir 24-48 células hr por loop para um pré-cultura de ODM livre de etanol para a incubação como acima. Inocular 100 ml de volume que prendem de ODM a inicial 620 0,5 Um usando um concentrado de levedura pr�cultivado, e permitir a cultura a crescer por lotes até à fase estacionária antes de o fluxo de meio de alimentação é reiniciado.
  7. Se as culturas podem crescer constantemente a> 0,01 h -1 em xilose, na presença de> 25 g / L de etanol, inicia a alimentação contínua de cultura (ODM + 60 g / L de xilose + etanol variando de 30 a 50 g / L) a uma baixa taxa de diluição de 0,01 h -1 ~ de 100 ml de volume que prendem (inicialmente ODM + 60 g / L de xilose + 20 g / L de etanol). Ao longo do tempo, levantar o etanol na alimentação para 50 g / L. Capturar populações avançadas nos estoques de glicerol.
    NOTA: A manutenção da taxa de diluição de baixo permite a formação de uma concentração de células suficientemente elevado para reduzir a disponibilidade de oxigênio e fermentação apoio.
  8. Opcionalmente, aplicar ultra-violeta (UV) irradiation mensal para glicerol populações de ações utilizadas para reinoculate culturas contínuas.
    1. colónias Ressuspender de estrias estoque de glicerol em 10 ml de ODM (como em pré-culturas) com 60 g / L de xilose e piscina todas as ações em um único frasco estéril. Aplicar a suspensão de células reunidas em ~ 5 x 10 8 células viáveis / ml para apenas cobrir o fundo de 4-5 placas de Petri com 6 ml / placa. Para obter 6 ml cobertura de uma placa de Petri descartável padrão, dispensar 15 ml de superar a tensão superficial, e em seguida, remover 9 ml.
    2. Expor cada placa de cultura aberta aos raios UV da fonte de luz em uma cabine de segurança biológica. Ajustar o tempo de exposição aos raios UV ou a distância para obter a taxa de mortalidade desejada> 90%. Aqui, expor durante 45 min a cerca de 56 cm da fonte.
    3. Dilui-se suspensões de células de placa antes e após a irradiação. taxa de matar estimativa baseada em unidades formadoras de colónias. Para o S. stipitis exemplo, a taxa de mortalidade foi de ~ 97%.
    4. Transferir as culturas expostas aos UV (24-30 mL) a uma folha-CoVrado frasco de 50 ml, e incuba-se a 25 ° C e 150 rpm durante 24 horas para permitir que a pequena percentagem de células viáveis para repovoar a ~ 1 x 10 8 S. viável stipitis células / ml. Ao impedir reativações de fotografias, a cobertura de alumínio preserva mutações, enquanto culturas são incubadas.
    5. Utilizar a cultura mutagenizada repovoada para inocular culturas contínuas de ~ 1 x 10 7 células viáveis / ml. Reiniciar o ODM + 60 g / L de xilose meio de alimentação enriquecida em etanol para continuar o processo de selecção.

6. Avalie glicerol de Stock Populações e identificar aqueles com melhor fermentação da xilose na presença de etanol

  1. Streak seleccionado culturas stock de glicerol de ágar YM como o primeiro passo na tela para melhor crescimento e fermentação de xilose na presença de etanol.
  2. Transferir cada população evoluído para ser conferido a partir de faixas de agar de 75 ml pré-culturas em ODM com 150 g / L de glucose, e incuba-se em 125 ml de frascos de 96h antes da utilização como inóculos para culturas de ensaio. As grandes populações cultivadas em glucose exigirá indução de enzimas para utilização xilose.
    1. Para testar a indução, recolher cada cultura, de suspensão de células para 30 ml, 620 Uma inicial de 40 em ODM 60 g / L de xilose + 30-45 g / L de etanol, e incuba-se a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita) em frascos de 50 mL com tampas de esponja de silicone. desenhar amostras duas vezes diariamente para monitorar a absorção de xilose por análise de HPLC.
  3. Alternativamente, tal como descrito em Slininger et al., 18 para avaliar o crescimento em xilose, na presença de etanol, preparar pré-culturas de cada população evoluiu por transferência de malha de 75 ml de ODM com 150 g / L de xilose em 125 mL de frascos, e incubar 96 h a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita). inocular culturas de teste para uma baixa inicial a 620 de 0,1 em 25 ml de ODM + 60 g / L de xilose + 30-45 g / L de etanol em frascos de 125 ml. Incubar frascos a 25 ° C, 300 rpm, uma "órbita e de amostra.

  1. Com base nos resultados do passo 6, seleccionar populações de glicerol que mostram uma capacidade superior para crescer em e fermentar xilose, na presença de etanol. Use-os para placas raia. As placas raia são usados para preparar, suspensões de células em buffer densas de A 620 = 5. Em seguida, suspensões de células foram usadas para inocular pré-culturas em placas de 96 poço profundo a A 620 = 0,5. Inocular 1 ml de pré-culturas em PSGHL misturado 1: 1 com ODM + 50 g / L de xilose (sem etanol). Incubar em pré-culturas de 96 cavidades, placas de poços profundos com evaporação baixo ventilada cobre por 48 horas a 25 ° C, 400 rpm, uma "órbita. Separar diferentes populações stock de glicerol de poços vazios.
  2. A utilização de cada pré-cultura, inoculo dezasseis 1 ml de culturas para replicar inicial Um 620 ~ 0,5 em 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L de xilose com 20, 30, ou 40 g / L de etanol para enriquecer colonos tolerantes. Incubar cultu enriquecimentores de forma semelhante à pré-culturas.
  3. Para cada estoque de glicerol diferente, colher os poços de cultura com maior concentração de etanol permitindo o crescimento e xilose uso. Placa cada linha de células de agar YM para obter colónias individuais prevalentes para preservar em glicerol. Escolha dez colônias por linha celular e raia cada um para uma placa de agar YM para a preparação de glicerol.

8. Além do mais Enriqueça Robust Evolved Cepas durante a transferência de série na PSGHL, como por AFEX CSH

  1. Preparar pré-culturas de NRRL Y-7124 (ião molecular), AFEX CSH-tolerantes evoluiu isolar, e cultura contínua evoluiu população com maior capacidade de utilizar xilose na presença de etanol. Inocular 75 ml de ODM + 150 g / L de xilose por ciclo de estrias stock de glicerol tal como descrito acima (passo 2.1) para o processo de adaptação hidrolisado AFEX CSH.
  2. Diluir PSGHL com água para proporcionar uma série de concentrações cada vez maiores. Prepara-se uma de 96 cavidades de micro-placa para cada uma das três linhas de células, utilizando de cadadiluição PSGHL para encher 8 poços com 50 ul. Use pré-cultura para inocular cada um 50 ul de micro-cultura de diluições em série de 620 ~ inicial Um 0,1-0,5.
    1. Continuar a evolução de levedura para aumentar a força de PSGHL usando o mesmo procedimento que a adaptação hidrolisado AFEX CSH descrito acima (passo 2) até que as culturas são capazes de crescer no hidrolisado força total a uma proporção média de 14-d estável de Aa 620 por Δtime como transferências de série são continuou mais quatro meses.

9. As colónias de células único isolado Usando PSGHL gradientes com ou sem Etanol Desafio

  1. Obter unicelular isolados directamente a partir de força total PSGHL placas de adaptação finais por diluição em placas de agar YM. Escolha dez grandes colónias de cada uma das três linhas de células e raia bar para placas YM para preparar stocks de glicerol tal como descrito anteriormente (passo 3.2).
  2. Opcionalmente, explorar pontos de tempo mais iniciais doprocesso de evolução por meio do isolamento dos estoques de glicerol armazenados das três linhas celulares.
    1. Inocular uma pré-cultura para cada linha celular pelo circuito de estrias stock de glicerol e incubar 24 horas em 30 ml ODM + 50 g / L de xilose (50 ml frascos, 25 ° C, 150 rpm).
    2. Células desafio de pré-culturas para o crescimento no hidrolisado por inoculação de 50 ul de 50% PSGHL em poços a uma inicial A 620 ~ 0,2 e incubação estaticamente 48 horas.
    3. Espalhe 0,1 ml de cada cultura em placas de ágar enriquecido gradiente PSGHL que variam de 0 a 50% de hidrolisado de força (~ 300-400 entregar células viáveis ​​por placa), e pegar 10 colónias individuais por linha de células a partir da maior área possível hidrolisado concentração do gradiente . 21 Streak escolheu colônias para YM para a preparação de glicerol como no passo 3.2.
    4. Como uma alternativa para o passo 9.2.3, em vez de inocular as placas de agar de gradiente, inocular cavidades de 96 poços de micro-placas de inicial Um 620 ~ 0,2, wheRE Os poços são concebidos para conter uma gama de concentrações de hidrolisado de 50 a 100% da força de etanol e de 10 a 40 g / L. Neste caso, o desenvolvimento de micro-placas de 72-96 horas e de outra forma como no passo 2.3. Isolar dez colónias isoladas a partir de poços dos mais severos combinações hidrolisado a etanol que mostram o crescimento através de diluição em placas, e preparar stocks de glicerol como no passo 3.2.

10. Em uma tela primária, eliminar Isolados inferiores comparando e Ranking Performances sobre PSGHL em duas condições de nutrientes

  1. Aplicar uma tela placa poço profundo alto rendimento de desempenho PSGHL para a tela cinco conjuntos de trinta isolados juntamente com NRRL Y-7124 pai e isolado AFEX CSH-tolerantes (análoga à Colony 5 do exemplo evolução Figura 1) como controles para escolher seis linhagens superiores (20%) de cada conjunto para passar para o nível de triagem secundária (passo 12).
  2. Realizar a tela em placas de poços profundos cheios de 1 ml por poço e cobertos witampas de aço inoxidável th com silicone preto selos evaporação baixos. Fixe todas as placas para o conselho da incubadora / agitador e operar a 25 ° C e 400 rpm (1 "órbita shaker). Design tudo que poço profundo placa enchendo padrões para permitir a separação de diferentes isolados por poços abertos.
  3. Para começar cultivos, escolher um cordão de células de estrias glicerol preparados a partir de 30 isolados obtidos como acima (nas etapas 3, 7 e 9) para duplicar poços de ODM + 50 g / L de xilose e incubar 48 horas.
  4. Como um meio de desafio para preculturing isolados, preparar 50% PSGHL PSGHL misturando 1: 1 com ODM + 10 g / L de glucose + 50 g / L de xilose. Para o rastreio de 30 isolados e duas estirpes de controlo 2, 2 placas com poços por cada um dos 16 isolados são preenchidos, deixando poços vazios entre os diferentes isolados.
  5. Para as culturas de desafio, de transferência, num volume de 50 ul de ODM pré-culturas (A 620 ~ 10) para cada um dos dois poços de cultura PSGHL desafio de 50% para cada um dos isolados e controla a obtenção de uma initial A 620 ~ 0,5 e incubar 72 horas.
  6. Usar dois meios de teste de diferentes riqueza nutritiva para o rastreio isolados: 60% PSGHL + ODM nutrientes; e os nutrientes ODM + YM 75% PSGHL +. Adicionar nutrientes ODM (excluindo açúcares) na metade da força como padrão para ODM usar com 50 g / L de açúcar (passo 1.3). Como designado, adicionar nutrientes YM (excluindo açúcares) na metade da resistência padrão de 3 g / L de extracto de levedura, 3 g / L de extracto de malte, 5 g / L de peptona.
  7. Inocular culturas de teste, transferindo 50 ul de 72 horas 50% PSGHL desafio pré-culturas para inocular 1.000 ul a inicial de um 620 ~ 0,5 em cinco poços profundos para cada um dos dois meios de teste.
  8. Amostra cada isolado diária. Pipetar o conteúdo de um poço para um tubo de microcentrifugação e centrifuga-se (5533 xg, 15 min) para obter o sobrenadante de etanol, glucose e xilose análises de elevado rendimento. Medir biomassa como 620 em 96 poços de micro-placas (200 ul / poço) com um espectrofotómetro.
  9. Dentro de cada conjunto de 30 éolates testado (5 conjuntos de S. stipitis NRRL Y-7124 evoluiu cepas), calcular índices de desempenho relativos (RPI), conforme descrito na etapa 11 abaixo e usam para classificar cada linhagem com base no rendimento de etanol (etanol máxima acumulada por açúcar inicial fornecido) e taxa de absorção de xilose (concentração de xilose consumida por 96 horas inicial) em ambos os meios de teste.

11. Posto Isolados na tela primária PSGHL Usando Índice de Desempenho Relativo (RPI)

  1. Na sequência de rastreio primário, calcular índices de desempenho relativos adimensionais (RPI), a fim de classificar a 30 isolados de cada uma das cinco experiências diferentes para a tela isolados no PSGHL com duas formulações diferentes de nutrientes por experimento, ou seja, 60% PSGHL e 75% PSGHL.
  2. Calcular o parâmetro estatística F para uso na classificação do desempenho do isolado dentro de um grupo de isolados testados numa dada experiência: F = (XX AVG) / s. Aqui, X é o parâmetro de desempenho, tais como o rendimento (Y)ou taxa (R), observada para cada isolado do indivíduo, enquanto X AVG e s são a média eo desvio padrão, respectivamente, de X observou em todos os isolados de dentro de uma dada experiência. Para distribuições normais, -2 <F <2.
  3. Para cada isolado em um experimento, calcule o desempenho relativo com base na taxa, RPI R = (2 + F R) × 100/4, e da mesma forma calcular o desempenho relativo com base no rendimento, RPI Y = (2 + F Y) × 100/4 . O valor do RPI varia de 0 a 100 ~ percentil (menor para o maior). Em seguida, calcular médias RPI para cada isolado dentro de um determinado experimento hidrolisado como se segue: RPI avg = (RPI Y + RPI R) / 2, em que as contribuições de rendimento e de taxa são dadas igual ponderação nesta aplicação.
    Note-se que, em geral, os parâmetros de rendimento e de taxa pode ser ponderada, se for considerado desigual em importância.
  4. Calcule RPI global entre os n tipos de hidrolisados testados: RPI geral i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n. Considere cada isolado em um conjunto experimental de 30 isolados e 2 controles. Durante classificação primária do ~ 150 única colónia isolados adaptado para xilose-rico PSGHL, RPI global é calculada para as taxas e os rendimentos através das duas formulações PSGHL aplicados no ecrã, isto é, 60% PSGHL e 75% PSGHL, onde n = 2.
  5. Com base na RPI geral dentro de cada experimento, escolha a percentagem superior de isolados para passar para o ecrã secundário. Neste exemplo, a parte superior 20% de estirpes são escolhidos para passar através (isto é, 30 de 150 testado).

12. Em uma tela secundária, Compare Performers de tela principal Top em vários hidrolisados ​​completas (> 100 g / L Sugars mistos) para revelar Máximas Funcionamento Cepas robustos

  1. Compare melhores desempenhos PSGHL em 6% glucana CSH AFEX e SGH alterada com dois níveis de nitrogênio, SGH-N1 e SGH-N2 (composiçãos como na Tabela 1) para a classificação final. Peneirar os 30 isolados que foram os melhores desempenhos na tela bem prato fundo principal de PSGHL (etapas 10 e 11) e os dois controles (estirpe progenitora NRRL Y-7124 e isolado AFEX CSH-tolerantes (análoga à Colony 5, Figura 1 exemplo ).
  2. Comece cultivos escolhendo um grânulo de células a partir de faixas de glicerol para duplicar os poços profundos de 1 ml ODM + 50 g / L de xilose como antes e incubar 48 h no sistema bem placa de profundidade (passo 10.2). Em seguida, transferir 50 ul de pré-culturas ODM para 50% culturas SGH desafio, e incubar no sistema bem prato fundo durante 72 horas para se obter um 620 no ~ 10). Prepara-se o SGH 50% por mistura de SGH 1: 1 com ODM sem açúcar + 50 g / L de xilose (pH 5,6).
  3. Para cada um dos isolados, inocular uma aliquota de SGH-N1 ou N2 SGH-16 ml com o sedimento de células (15 minutos, 2711 xg) a partir de três poços de cultura de desafio para se obter a cultura de teste inicial A 620 ~ 2,0. Incubar culturas de ensaio a 25 & #176;. C, 180 rpm (1 "órbita) em frascos de 25 ml com tampas de esponja de silicone frascos de amostra diária e analisar por a tela de PSGHL.
  4. De modo semelhante, a tela isolados como nos passos 12.2 e 12.3, mas desta vez substituto SGH-N1 e N2 com SGH-6% CSH AFEX glucano a pH 5,2 para utilização na preparação do meio de cultura de desafio meio de cultura e de ensaio. Para as culturas de desafio a 50%, 6% usar AFEX CSH diluída 1: 1 com água, uma vez que é suficiente de azoto, sem alteração.
  5. Repita os passos 12,1-12,4 para duplicar os resultados.

13. Posto as Performances de isolados na tela secundária usando RPI geral para avaliar uso de múltiplos hidrolisados completa

  1. Calcular índices de desempenho relativo (RPI), a fim de classificar cada um dos top 20% dos isolados (~ 30 dos 150) a partir da tela principal que foram testados na tela secundária na enzima Sacarificada formulações hidrolisado de diferentes graus de riqueza nutricional.
  2. pontuação de cadaisolados testados no ecrã secundário com base na taxa de absorção de xilose e rendimento de etanol realizada em três formulações de hidrolisado previamente tratado sacarificado com enzimas testadas em duplicado, incluindo AFEX CSH (i = 1 e 2), SGH-N1 (i = 3 e 4) e SGH -N2- (i = 5 e 6).
  3. Calcule o RPI global para cada isolado, e aplicar esse parâmetro de classificação para peneirar ainda mais a lista de isolados superiores: RPI geral = Σ i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n, onde n = 6 .
    NOTA: Demonstrar cinética de isolados superiores na hidrolisados SGH-N2 em culturas em frascos seguindo os procedimentos em Slininger et al 18.

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Representative Results

S. stipitis foi desenvolvido usando combinações de três culturas de selecção, que incluíram AFEX CSH, PSGHL, e cultura contínua xilose-Fed desafiou-etanol. A Figura 1 mostra o diagrama esquemático da evolução das experiências realizadas juntamente com os isolados encontrados tanto para executar mais eficazmente em geral, ou de forma mais eficaz em um dos hidrolisados testadas. a Tabela 3 mostra os números de acesso NRRL destes isolados superiores e resume as tensões de adaptação aplicadas no processo de conseguir a população enriquecida a partir do qual cada estirpe foi isolada. Alguns isolados foram observados para ter um desempenho superior em relação a um ou dois tipos de hidrolisados, mas 7 de 11 isolados um bom desempenho em todos os tipos de hidrolisado, embora a maioria destes foram expostas e desafiados por apenas um único tipo durante a evolução. Os sucessos dos vários evolução abordagens tomadas aqui são demonstrados nas Figuras 2 -7 e Tabela 4.

A Figura 2 mostra as melhorias distintas observadas após a primeira fase de adaptação em que derivados robustas de estirpe NRRL Y-7124 foram enriquecidos durante a transferência de série a concentrações crescentes de AFEX CSH (Passo 2). Nas culturas que crescem em 6% CSH AFEX glucana, a população evoluída demonstra mais rápida acumulação e superior títulos finais de etanol do que a cepa parental. Mais rápida utilização de glucose também é visto, juntamente com mais rápida absorção de xilose imediatamente após o esgotamento da glucose. Além disso na Figura 3, a estabilidade da população modificada características é demonstrado no ODM meio sintético com uma mistura de 87 g / L de glucose e 66 g / L de xilose. Neste caso, tanto a população enriquecida (Figura 3B) e as colónias isoladas (Colony 1 e Colony 5, Figura 3C e 3D, respectivamente) é capaz de superar a estirpe-mãe, usando a xilose mais eficiente para a produção de etanol mais rapidamente, reduzindo o tempo para atingir o pico de etanol por pelo menos 4 dias. Significativamente as concentrações mais elevadas de etanol, foram acumulados por estirpes evoluíram no ODM (55-60 g / l) em relação ao progenitor (40-45 g / L). As mutações, o que levou a um fenótipo estável de diauxy reduzida durante a transição glucose-xilose e fermentação de xilose mais eficiente, surgiu como a população de leveduras evoluiu em AFEX CSH.

Outras melhorias para Colony 5 foram perseguidos por submetê-lo à seleção natural na cultura contínua xilose-fed na presença de níveis crescentes de etanol até 50 g / L. Sob esta condição, a população de levedura retidas na cultura contínua deve ser capaz de induzir enzimas para utilização xilose como fonte única de carbono, a fim de que ele seja capaz de crescer a uma taxa elevada o suficiente para preencher o fermentador, apesar de uma diluição constantetaxa. Na estirpe-mãe, a indução das enzimas xilose começa a ser inibida a concentrações de etanol tão baixo quanto 15-20 g / L. 8 Derivados de Colony 5 foram capturados em estoques de glicerol a precoces e tardios pontos de tempo de operação contínua da cultura, e a Figura 4 mostra a melhoria no bem-sucedida utilização xilose na presença de 40 g / L de etanol observada em derivados evoluíram de Colony 5 em comparação com o NRRL Y-7124-mãe e a Colony inicial 5 inoculado com o processo.

Os isolados resultantes de todas as fases do esquema de adaptação da Figura 1 foram rastreados para identificar aqueles PSGHL com uma capacidade superior para fermentar xilose (Passo 10.1). Os isolados mostrados na Figura 5 encontram-se entre os melhores desempenhos em PSGHL fora de ~ 150 classificados neste ecrã primário e secundário em todas as telas de desempenho, tal como descrito abaixo. Para indicar a melhoria dos isolados evoluídosem relação à sua mãe, o desempenho de cada isolado foi expressa como a razão entre os valores dos parâmetros cinéticos de isolado a estirpe progenitora. Valores da relação de "um" ocorrido se o desempenho isolado foi equivalente ao pai. Figuras 5A e 5B resumir superior isolar performances em 60% e 75% forças de PSGHL com ODM ou ODM + YM suplementos nutricionais. À medida que a concentração de hidrolisado de dureza e foi aumentado, os índices de desempenho reduzido. No PSGHL força 60%, cinco dos sete principais isolados expostos a pressão de seleção PSGHL realizado muitas vezes melhor do que NRRL Y-7124 (isolado 1). Quatro isolados desempenho melhor do que Colony 5 (isolar 33), que tinham evoluído durante a exposição a AFEX CSH mas não tiveram uma exposição selectiva anterior para PSGHL. No entanto, a resistência em 75% de PSGHL, apenas 3 isolados superou significativamente tanto o pai e a Colony 5 (isolar 33), apesar de os nutrientes adicionados. Destes, superiores isolados de 15 e 16 foram previouslY desafiados com concentrações crescentes de PSGHL como uma pressão de selecção guiando a evolução. Isola 15, 14 e 3 só foram expostos a PSGHL, enquanto 11, 13 e 16 teve várias exposições. Isola 3, 11, e 13 eram de pontos de tempo anteriores, durante a evolução em PSGHL e tiveram pouco menos oportunidade para desenvolver a tolerância em comparação com 14, 15 e 16. Embora seja evidente na figura 5 que a transferência de série para forças crescentes de PSGHL servido para desenvolver estirpes robustas para o seu ambiente inibidora, é também evidente que a exposição da estirpe NRRL Y-7124 a AFEX CSH por si só poderia potencialmente gerar isolados como Colony 5 (33), com tolerância cruzada a PSGHL. Assim, foi indicado que estirpes robusto, capaz de executar em vários hidrolisados ​​poderia ser encontrado por enriquecimento de tolerância em um hidrolisado seguindo-se o rastreio desempenho no outro. Os isolados obtidos a partir da cultura contínua alimentado-xilose foram também analisadas em PSGHL 60% e 75% com forçasnutrientes e também acrescentou glucose a 75 g / L, a fim de sustentar o desafio etanol e testar defasagem diauxic em xilose seguinte utilização da glicose. Enquanto os isolados 27, 28 e 30 foram superiores aos outros a partir desta fase de adaptação, ambos os rácios de desempenho da taxa de absorção de rendimento e xilose foram semelhantes aos do pai em 75% PSGHL com adição de nutrientes ODM e YM, que não é necessariamente surpreendente na medida em que nenhum tinha exposição prévia a este hidrolisado (ver também Slininger et al. 18 para dados adicionais não mostrados aqui para as culturas desde 75 g / L de glicose).

Os melhores estirpes seleccionadas a partir do ecrã principal no PSGHL rica em xilose foram subsequentemente pesquisados ​​em três hidrolisados ​​completos. Estes hidrolisados (Tabela 1) incluiu AFEX CSH e diluir-ácido SG pré-tratados tratado com celulases comerciais e completada em dois níveis de nitrogênio diferentes (SGH-N1 e SGH-N2) para identificar o iso mais versátillates com respeito a variações de inibidor e o ambiente nutricional. Os índices relativos de desempenho (RPIS) foram calculados para a fermentação de cada isolado no interior de cada hidrolisado (Figura 6A). A Figura 6B mostra os índices de desempenho globais combinadas calculados para cada isolado. Cinco isolados (3, 14, 27, 28, 33) teve RPI geral acima de 60, que os classificou como a mais robusta para todas as variações de hidrolisado e condições nutricionais combinadas. Revendo Tabela 3, ambos os isolados 3 e 14 foram evoluiu em PSGHL enquanto 27, 28 e 33 foram evoluiu em AFEX CSH ou AFEX CSH e cultura contínua desafiou-etanol em xilose. Nenhuma das cepas exibindo uso hidrolisado múltiplos superiores foram evoluiu em mais de um hidrolisado.

Algumas cepas eram "especialistas" um desempenho melhor em ambos SGH-N1 / 2 ou AFEX CSH. Esses isolados apresentam melhor desempenho como especialistas em SGHhidrolisados ​​(11, 16 e 9) foram obtidos através da evolução no PSGHL como o desafio final ou única. Para os isolados 11 e 16, que foram inicialmente enriquecida através do aumento AFEX desafio CSH, a capacidade de utilizar eficientemente AFEX CSH não foi selecionada ativamente durante o enriquecimento última longa em PSGHL, e os principais fatores genéticos que apoiam seu uso evidentemente foram perdidos. Por outro lado, os isolados 14, 25, 27, 30 e 33 foram performers superiores em AFEX CSH, e todos, exceto isolado 14 foram evoluiu em AFEX CSH com ou sem desafio etanol. Assim, como esperado, directed evolution em AFEX CSH ou PSGHL tendiam a seleccionar para levedura bem adaptado para o hidrolisado de selecção. A única exceção a este respeito foi isolado 14. Isolar 14 originou-se do PSGHL único desafio e foi isolado a partir de agar YM chapeamento diluição da cultura final enriquecimento PSGHL. Slininger et al. 18 mostraram que este isolado de ter capacidade superior de indução da enzima xilose em células cultivadas em glucose, na presença de5-15 g / L de ácido acético e reduzido desfasamento diauxic em ODM com 75 g / L de cada um de glucose e xilose, apesar> 30 g / L de etanol que ocorrem antes do ponto de transição de glucose-xilose.

A cinética superiores de estirpes evoluídos relativos à estirpe parental S. stipitis NRRL Y-7124 foi demonstrada como se mostra na Tabela 4, que representa os resultados de baixo nível de culturas em frascos de aeração inoculados com inicial A 620 8,4 ± 2,5 75 ml SGH-N2 (pH 6,2) incubadas em 125 ml de frascos com tampas de esponja de silicone a 25 ° C, 150 rpm (1 "órbita), e na Figura 7, representando culturas em balão de arejamento moderadas inoculados com inicial Um balão de 620 0.5 em 23 ml de SGH-N2 por 50 ml. 18 Estas condições representam dois tipos diferentes de operação sugeridas pela literatura como sendo potencialmente comercialmente promissora para a produção de etanol por S. stipitis. 8,22 nos abetost instância de baixa aeração nível, a alta densidade celular prevê rápida fermentação para começar imediatamente. Considerando que, no segundo exemplo, a baixa densidade celular mais elevada e chumbo arejamento nível de crescimento logarítmica para construir a população e acelerar a conversão de açúcar associada ao crescimento de etanol. Estes dados demonstram que as estirpes evoluídos têm vantagens cinéticas significativas sobre a estirpe-mãe: a taxa mais rápida absorção da glucose (Tabela 4), da taxa de absorção mais rápida xilose específico (Tabela 4), a produtividade de etanol mais rápida em ambos glucose e xilose e global (Tabela 4), mais curto atraso anterior de crescimento (Figura 7), e mais curto glicose diauxic a xilose desfasamento de transição. Estas melhorias permitiram etanol acumular-se a mais de 40 g / L e para o pico dias antes (Figura 7) do que foi visto pela mãe NRRL Y-7124. Maior produtividade global etanol (Tabela 4) foi obtida em 1,5 a 5 horas da estirpe-mãe (Tabela 4), dependendo da estirpe evoluída.

figura 1
Figura 1:. Scheffersomyces stipitis fluxograma adaptação O diagrama apresentado indica o fim das tensões aplicadas durante o processo de adaptação e os pontos de recuperação dos isolados superiores (números em parênteses). Veja também Tabela 3 key isolado como referência para as identidades de tensão. Para proporcionar orientação no tempo, os números em vermelho indicam o número de dias em cada fase de adaptação. Para as fases de transferência de série em AFEX CSH e PSGHL rica em xilose, cada dia de adaptação representa aproximadamente 2-4 gerações. Para a fase de cultura contínua (205 dias total), a taxa de diluição D foi variável em ~ 0-0,1 hr -1 durante 125 d de operação com alimentação-atuado pH. Na próxima80 dias, a operação foi uma fluxo contínuo com D a 0,012 h -1, proporcionando um tempo de geração (LN 2) / (D) de 58 horas, ou por uma geração 2,4 d no estado estacionário. Em seguida uma amostra da população adaptada a partir da cultura contínua 205-dias foi mutagenizado com luz UV e inoculado com uma cultura em contínuo, operado com D a 0,012 h -1. (Reproduzido de Slininger et al. 18) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Melhorado de fermentação em lotes de 6% CSH AFEX glucano Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 estirpe-mãe de fermentação de 6% glucano AFEX CSH (A) é comparado com adaptado Colony 5 fermentação de 6% glucano AFEX pré-tratamento e palha de milho hydrolyzate (B). Símbolos designar biomassa (quadrado vermelho), glicose (círculo preto com linha pontilhada), xilose (círculo azul com linha sólida), etanol (triângulo verde), e xilitol (diamante roxo). (Reproduzido de Slininger et al. 18) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Redução lag diauxic em meio definido com açúcares mistos performances de fermentação são comparados em ODM com 66 g / L de glicose e 87 g / L de xilose para a cepa parental S.. stipitis NRRL Y-7124 (A), o AFEX CSH adaptado população derivada de Y-7124 (B), de colónias de células única 1 isolado a partir da S. adaptado população stipitis (C), célula única ColoNY 5 isolado a partir da população adaptada (D). Símbolos designar biomassa (quadrado vermelho), glicose (círculo preto com linha pontilhada), xilose (círculo azul com linha sólida), etanol (triângulo verde), xilitol (diamante roxo) e adonitol (diamantes em ouro com borda preta). (Reproduzido de Slininger et al. 18) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Etanol derivados resistentes de Colony 5. Hidrolisado Colony tolerante 5 foi desenvolvida por selecção cultura contínua em ODM contendo xilose como fonte única de carbono e elevados níveis de etanol. Duas populações de glicerol derivado obtido no início do processo de selecção (2A.1.53R, triângulo laranja e linha a tracejado) e umirradiação UV epois de inóculos cultura contínua (2A.1.30R.2, círculo roxo e linha tracejada) são mostrados em comparação com a estirpe NRRL Y-7124-mãe (círculo verde com linha sólida) e AFEX CSH Colony tolerantes 5 (triângulo preto com linha sólida). Absorção de xilose por densas populações de leveduras cultivadas em glucose (A 620 = 50) em ODM com 40 g / L de etanol indicaram que todas as estirpes adaptadas ultrapassado o pai não adaptadas na capacidade para induzir o metabolismo de xilose. (Reproduzido de Slininger et al. 18) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5:. Rácio de melhoria de desempenho do isolado tolerante em relação ao pai As performances de isolados tolerantes superiores são resumidos em relação aoo controlo estirpe progenitora NRRL Y-7124 para cada formulação de PSGHL (A, B). Performances foram avaliados em termos de taxa de absorção de xilose (barras azuis representam rácios de isolado para o pai) e produção de etanol por açúcar fornecido (barras verdes representam rácios de isolado para o pai). (Reproduzido de Slininger et al. 18) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Isolar classificação com base em RPI. O conceito índice de desempenho relativo (RPI) foi aplicada aos resultados do ecrã secundário de desempenho a fim de classificar isolados 33 dentro de cada tipo hidrolisado com base na taxa de absorção de xilose e rendimento de etanol por açúcar fornecido. (A) A RAN relativarei de qualquer dado isolado dependia do tipo hidrolisado de (P <0,001): SGH-N1 (barras a azul), SGH-N2 (barras vermelhas) e AFEX CSH (barras verdes). (B) O RPI global calculada em todos os tipos de hidrolisado (luz barras azuis) indicou linhagens superiores com mais desempenho robusto em diferentes condições de hidrolisado. (Reproduzido de Slininger et al. 18) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7: fermentações SGH comparativos de isolados adaptados superiores de S. stipitis. Superior adaptadas isolados e a sua estirpe progenitora NRRL Y-7124 são comparadas fermentar hidrolisados enzimáticos de diluído virgatum pré-tratada com ácido (carga de 20% de sólidos) a 25 ° C e pH 6,2 inicial a baixa inicial densidade celular. os períodos de biomassa (quadrados vermelhos), glicose (círculos pretos e linhas tracejadas), xilose (círculos azuis e linha contínua) e etanol (triângulos verdes) são mostrados. As barras de erro representam o intervalo sobre o valor médio marcado por símbolos. (Reproduzido de Slininger et al. 18) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1:. Composições de hidrolisados utilizados em cultivos (. Reproduzido de Slininger et al 18) Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: meio definido Optimal para Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 7tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3:. Síntese das linhagens superiores Scheffersomyces tolerantes stipitis para a fermentação de hidrolisados de biomassa vegetal (. Reproduzido de Slininger et al 18) Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: cinética comparativos de isolados sobre switchgrass hidrolisado SGH-N2 inoculado para rubricar A 620 = 8,4 ± 2,5 As taxas são taxas normalizados por unidade de absorbância durante períodos de glicose ou consumo de xilose.. (Reproduzido de Slininger et al. 18) Por favor, clique aqui para baixar esse table.

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Discussion

Vários passos eram críticos para o sucesso do processo de evolução. Em primeiro lugar, é fundamental para escolher pressões de seleção apropriadas para impulsionar a evolução da população para com os fenótipos desejados que são necessários para a aplicação bem-sucedida. As seguintes tensões seletivos foram escolhidos para S. stipitis desenvolvimento e aplicados em alturas apropriadas para guiar o enriquecimento para os fenótipos desejados: forças crescentes de 12% glucano AFEX CSH (o que obriga o crescimento e fermentação de diversos açúcares, na presença de ácido acético e baixos níveis de aldeídos furano e outros inibidores); xilose alimentado cultivos contínuos com o aumento da concentração de etanol (o que obriga indução da enzima xilose para reduzir lag diauxic); e as forças de 20% de sólidos PSGHL carga (o que obriga o crescimento e fermentação de xilose na presença de ácido acético alta, furanos, e outros inibidores) aumentando. Em segundo lugar, é importante preservar as populações de levedura evolução por congelação glicerol stocks de amostras populacionais como o processo de enriquecimento progride. Esses instantâneos da população podem ser armazenadas para testes funcionais periódicas para documentar o progresso evolução e para permitir isolamentos subsequentes, conforme desejado, ou para reiniciar processos de evolução após um hiato. Um terceiro passo fundamental no processo de evolução era recuperar isolados excepcionais, enriquecendo as populações de cultura selecção ou populações de glicerol abastecido em um meio selectivo conveniente (tais como ágar ou micro-placas contendo um gradiente de estresse apresentando uma série de hidrolisado e / ou concentrações de etanol) . Em seguida, as colónias sobreviventes que crescem sob a condição mais estressante pode ser escolhido para preservar para a caracterização mais tarde. Estes três passos básicos pode ser repetido para cada exercer pressão adicional desejado a selecção fenótipo, ou, alternativamente, múltiplas pressões num único ciclo, se apropriado. Quando a população de levedura-mãe nativa é exposto às várias tensões, a diversidade genética é esperado que surjam th mutações naturais ou induzidos ásperas e exposição continuada permitirá a seleção natural para enriquecer os indivíduos com mutações mais benéficas de apoio sobrevivência competitiva. Espera-se que o fenótipo seleccionado irá ocorrer como resultado de mutações genéticas múltiplas. No protocolo anterior, as mutações podem ser induzidas durante o tratamento com UV durante a exposição ou potencialmente de levedura para hidrolisados. Hidrolisados são conhecidas por conter três classes de compostos prejudiciais para os microrganismos:. Ácidos carboxílicos, aldeídos e fenóis 22 aldeídos reactivos, tais como furfural e 5-hidroximetilfurfural, pode danificar as células e provocar um aumento de espécies de oxigénio reactivas (ROS), gerada tipicamente mitocôndria. ROS são bem conhecidos por causar mutações de ADN em células eucarióticas. 23,24 Os compostos fenólicos presentes em hidrolisados, embora não seja conhecido previamente para ser genotóxico, pode promover e sinergizar os efeitos mutagénicos e de aldeídos mutagénico ROS. 25

é esperado jove_content "> A estratégia gradual de ambientes progressivamente desafiadoras para construir estirpes evoluiu com uma série de melhorias fenótipo, ambos alvo e também não-alvo. É possível que certos fenótipos não-alvo podem surgir que são indesejáveis ​​ou instável. A fim para capturar as cepas mais alto nível de funcionamento e robustos, uma etapa chave adicional que deve ser tomada é a de avaliar e comparar isolados selecionados para características comercialmente relevantes, chegando para ambos os fenótipos alvo e não-alvo. para fazer isso, isolar performances devem ser comparados em uma variedade de condições de stress voltadas para as aplicações, tais como em hidrolisados ​​com diferentes desafios inibidor e formulações de nutrientes, permitindo a seleção das melhores estirpes globais que são estáveis ​​e robustos a ampla variação substrato lignocelulósico industrial. Além disso, um desafio estabilidade estirpe pode ser incorporada no tela, como foi feito no exemplo pela inclusão de passos preculturing involvção inicial de crescimento de levedura em meio não selectivo, dois ágar YM por várias gerações seguido pela ODM sintético com 50 g / L de xilose por mais 6-7 gerações, dando oportunidade para a desestabilização das características de cultura desejadas antes da exposição ao desafio de desempenho em hidrolisado. Com base em características de desempenho significativos, tais como o rendimento de etanol e a taxa de absorção de xilose, em seguida, os isolados são classificados em cada condição de stress diferente, tal como cada ambiente hidrolisado testado, o qual pode ser diferente do meio de cultura de enriquecimento do isolado. O RPI adimensional pode ser usado para calcular o desempenho global média relativa e classificação de isolados que estão sendo comparados. Um fator adimensional é apropriado para reflectir o desempenho relativo em diferentes tipos de hidrolisados ​​e com base em diferentes avaliações de desempenho, tais como os rendimentos em relação às taxas. Este procedimento de classificação identifica cepas que executam consistentemente bem em frente variações amplas nas condições de crescimento e hydrolyzates e estão aptos para ser robusto e geneticamente estável.

Vários iterações e modificações destes passos básicos podem ser necessárias para acomodar a evolução de qualquer estirpe microbiana capaz de características específicas ou únicas de desempenho em hidrolisados ​​lignocelulósicos ou outros substratos de interesse. No S. stipitis exemplo, é importante notar que a suplementação de nutrientes, incluindo fontes comerciais de baixo custo, para os hidrolisados preparados a carga elevada de sólidos foi chave para controlar a gama dinâmica dos desempenhos de isolamento de separação estatística melhorou durante o rastreio. A importância de nutrientes para a fermentação bem sucedida de hidrolisados ​​inibidores concentrados também foi relatado anteriormente e pensa-se ser devido a uma necessidade elevada de ácidos aminados e outros nutrientes necessários para a manutenção das células, equilíbrio redox, e reparação, como resultado de tais condições de stress, especialmente durante a utilização xilose 9,26,27.Além disso, se os nutrientes são muito escassos ou muito abundante, as diferenças de performances isolar pode ser difícil de detectar estatisticamente, devido a todos os isolados fazendo muito mal, ou todos fazendo extremamente bem, respectivamente. Isola capaz de executar bem sob são esperadas diversas condições para ser confiável, ou robusta para variações em condições industriais.

A principal limitação deste protocolo é que a evolução adaptativa e rastreio são muito literal no resultado, na medida em que "um vai obter o que se enriquece e telas para". Assim, as condições de enriquecimento e de tela devem ser concebidos para amplificar e identificar os indivíduos, respectivamente, com as alterações desejáveis ​​na fenótipos mantendo características desejáveis ​​pré-existentes. A evolução pode afetar não selecionados para características que são críticas para o desempenho industrial (por exemplo, requisitos de fator de crescimento). Por esta razão, o progresso enriquecimento da população para uma característica precisa de ser periodicamente monitorizared para outras características como método de solução de problemas para alterações indesejáveis. Por exemplo, uma das características únicas de S. stipitis é a sua capacidade nativa para crescer em e fermentar a xilose. Todos os substratos de enriquecimento e de rastreio incluiu a xilose como único ou chave contribuindo fonte de carbono na presença de inibidores. Consequentemente, uma característica comum de todas as culturas de enriquecimento neste exemplo foi que eles diretamente selecionados para as estirpes de xilose utilizando mais rápidas, cujas populações se tornou mais e mais enriquecido na cultura de série ou contínua, porque eles eram melhores concorrentes. Como um resultado pretendido, linhagens melhoradas foram todos capazes de absorção de xilose mais rápida, mas melhorias para produção de etanol foram muito menos dramático do que melhorias na taxa de absorção de xilose. Esta última tendência provável surgiu uma vez que o rendimento de etanol por a estirpe-mãe foi relativamente elevada em cerca de 0,3 g / g, ou 60% do teórico (0,51 g / g), tal como o crescimento celular tornou-se estacionária em hidrolisados, deixando menos espaço paramelhoria. Em culturas, a produção de etanol mais elevados poderiam ser eventualmente seleccionado contra porque o etanol é um inibidor do crescimento, o que exigiu a monitorização da população evoluída desempenho para esta característica. As concentrações de etanol mantido abaixo do nível de inibição de crescimento tende a neutralizar isso como um factor de selecção. Para S. stipitis NRRL Y-7124, 40 g metades / L de etanol taxa específica de crescimento, enquanto 64 g / L impede o crescimento por completo. 28 Em etanol desafiou cultivos contínuos alimentados xilose, aeração foi mantida baixa e taxas de diluição também foram mantidos baixos o suficiente com amplo xilose presente para fomentar a fermentação em vez de respiração de etanol e impedir o enriquecimento de uma propriedade de uso do etanol indesejada. Além disso, os suplementos de nutrientes para os hidrolisados ​​utilizados em telas de desempenho foram cuidadosamente concebidas, de modo a evitar a selecção de estirpes que necessitam de um fornecimento rico em nutrientes dispendiosos, como extracto de levedura. Suplementos sempre incluído fontes comerciais menor custo de available, tais como farinha de soja e ureia, apesar de componentes ricos como em YM foram aplicadas em culturas em tandem para testes comparativos, tais como nas formulações de 60% e 75% PSGHL que são normalmente esgotar de azoto. O meio sintético ODM, usado em telas de pré-cultura e cultura de desempenho, foi originalmente concebido para um desempenho ideal da estirpe S. stipitis NRRL Y-7124 7 de acordo com a rotina de otimização meio de cultura descrito por Traders Protein 20, que recomenda ingredientes definidos, incluindo vitaminas, minerais, purinas e pirimidinas, e fontes de aminoácidos para fornecer nutrientes compatíveis com o custo-benefício scale-up industrial usando fontes comerciais. A recomendação final na concepção cepas relevantes, é manter a concepção das condições de enriquecimento e de tela tão relevante quanto possível as condições do processo industrial esperados.

etanol renovável custo competitivo tem sido perseguido até reduce dependência dos combustíveis fósseis. Para melhorar a capacidade de S. stipitis NRRL Y-7124 de tolerar, crescer e fermentar hidrolisados inibitórios de lignocelulose, vários pesquisadores têm utilizado cultura repetitivo no licor rico em xilose resultante diluída de ácido-pré-tratamento da biomassa lignocelulósica. 13,14,16,17 Over-calagem para desintoxicar inibidores ainda era necessária para permitir um nível razoável de desempenho de estirpes início adaptados em madeira e palha de trigo licores de pré-tratamento. 13,14 múltiplos ciclos repetidos de mutagénese UV e baralhar genoma têm sido aplicados para desenvolver derivados de S. stipitis NRRL Y-7124 com a tolerância inibidor melhorado e crescimento em madeira de lei licor de sulfito (HWSSL) 16,17. No entanto, as concentrações de etanol produzidos por essas cepas em HWSSL estavam sob 10 g / L após 6 a 7 dias. Usando as técnicas apresentadas e descritas aqui, novas cepas evoluídas de S. stipitis NRRL Y-7124 foram desenvolvidos para atender phenotymetas pe necessário para uso comercial econômico: fermentação de hidrolisados ​​a pH 5-6, sem medidas de desintoxicação anteriores, tal como excesso de calagem, o que leva à eliminação de resíduos caro; bastante reduzido crescimento e defasagens diauxic; acumulações de etanol elevados o suficiente para destilação comercial (> 40 g / L de etanol); mais rápido crescimento e produtividade em etanol do que anteriormente relatados para cepas de leveduras nativas fermentação hidrolisados ​​undetoxified; e desempenho em diversos hidrolisados ​​a alta carga de sólidos, incluindo SGH adequadamente soja nitrogênio-suplementado (que é de outra maneira pobre de azoto) e não suplementado CSH AFEX. As linhagens melhoradas desenvolvidos usando a novela abordagens agressivas para a evolução como consubstanciado nas principais passos anteriormente descritos, são esperados para beneficiar a economia da produção de etanol a partir da biomassa agrícola, reduzindo os custos operacionais, custos de capital e insumos de energia e água. Este é o primeiro plano de evolução da estirpe relatado para produzir linhagens adaptadas de S. stipité demonstrar a produção de etanol economicamente recuperável na hidrolisados undetoxified.

As novas estirpes de S. stipitis decorrentes de cada fase do processo de evolução (Figura 1) são candidatos para futuros estudos para determinar as alterações genéticas associadas a pressões de seleção específicos aplicados e os mecanismos principais atributos subjacentes à melhoria da fermentação de hidrolisado, como a tolerância inibidor e reduziu lag diauxic. Esse novo conhecimento valioso ajudará a engenharia de biocatalisadores levedura próxima geração e processos de conversão de lignocelulose em biocombustíveis e outros produtos. À medida que novas estirpes são derivadas, será provavelmente benéfico para passar novamente a população derivado através de um protocolo de evolução estirpe semelhante ao descrito aqui, a fim de seleccionar os transformantes mais úteis para uso comercial em hidrolisados. Da mesma forma, à medida que novas estirpes microbianas são descobertos com o potencial de fazer uma minhariad de novos produtos úteis a partir de biomassa renovável, o processo de evolução poderia ser mais utilizada para melhorar a robustez tensão e produtividade na hidrolisados, potencialmente permitindo que novos processos e produtos bio-catalítica a ser disponibilizado.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour Archer Daniels Midland Co. (ADM) 63160 ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant) Sigma-Aldrich P1300 Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids Becton Dickinson and Company 228830 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan  Sigma-Aldrich T3300 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine  Sigma-Aldrich C7352 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar Becton Dickinson and Company 214010 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract Becton Dickinson and Company 218630 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract Becton Dickinson and Company 212750 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean Fluka P0521-500g multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder Sigma-Aldrich A8626 CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99% Sigma-Aldrich C3506 CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra Sigma-Aldrich G6779 CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99% Sigma-Aldrich T0376 CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99% Sigma-Aldrich U0750 CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS Fisher Chemical D16-500 CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99% Sigma-Aldrich X1500 CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates Becton Dickinson Falcon 351172 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper Kimberly-Clark towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) Corning Life Science Glass 4980-125 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) M1335-0016 multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates Applikon Biotechnology Z365001700 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates Applikon Biotechnology Z365001296 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover Applikon Biotechnology V0W1040027 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover Applikon Biotechnology V0W1040001 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene Applikon Biotechnology ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks Bellco 1924-00032 Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. Bellco 1968-00100 (original Cat. No.) Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven MathisAg Typ-Nbr BFA12 215307 Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer YSI Life Sciences 2900D-UP www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer Bio-Tek Instruments, Inc MQX200R www.biotek.com

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