Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol

Summary

Adaptieve evolutie en isolatietechnieken worden beschreven en aangetoond dat derivaten van Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 die in staat zijn om snel te consumeren hexose en pentose gemengde suikers in enzym versuikerd undetoxified hydrolysaten en te accumuleren meer dan 40 g / l ethanol opleveren.

Introduction

Naar schatting jaarlijks 1,3 miljard droge ton lignocellulose kunnen ondersteunen de productie van ethanol en laat de VS om zijn verbruik van aardolie te verminderen met 30%. ¹ Hoewel plantaardige biomassa hydrolyse opbrengst suiker mengsels rijk aan glucose en xylose, fermentatie-remmers worden gegenereerd door de chemische voorbehandeling nodig af te breken hemicellulose en bloot cellulose voor enzymatische aanval. Azijnzuur, furfural en hydroxymethylfurfural (HMF) wordt gedacht dat de belangrijkste onderdelen van de vele remmers die zich vormen tijdens de voorbehandeling zijn. Om de lignocellulosische ethylalcoholindustrie vooruit, onderzoek en procedures voor de ontwikkeling van giststammen staat te overleven en goed functionerende zowel hexose en pentose suikers in aanwezigheid van dergelijke remmende verbindingen nodig mogelijk. Een aanzienlijke extra zwakke traditionele industriële giststammen zoals Saccharomyces cerevisiae, is het onvermogen om efficiënt ferment de xylose in hydrolysaten van plantaardige biomassa.

Pichia stipitis type stam NRRL Y-7124 (CBS 5773), onlangs omgedoopt tot Scheffersomyces stipitis, is een inwoner pentose gistende gist die bekend is om xylose fermenteren tot ethanol. ^2,3 De evolutie van de stam NRRL Y-7124 werd hier voortgezet omdat het is gedocumenteerd hebben het grootste potentieel van de inheemse giststammen economisch realiseerbare ethanol accumuleren van meer dan 40 g / l met weinig xylitol bijproduct. ^4,5,6 bij optimale media, S. stipitis NRRL Y-7124 produceert 70 g / l ethanol in 40 uur (1,75 g / l / uur) Opbrengst 0,41 ± 0,06 g / g in hoge celdichtheid cultures (6 g / L-cellen). ^7,8 Resistance gisting remmers ethanol, furfural, HMF en is ook gemeld, ⁹ en S. stipitis is gerangschikt onder de meest veelbelovende inheemse pentose-fermenteren gisten beschikbaar voor commerciële schaal ethanol production uit lignocellulose. ¹⁰ Ons doel was om diverse undetoxified lignocellulose hydrolysaten en ethanol selectie druk van toepassing zijn op de evolutie te dwingen in de richting van een meer robuuste derivaat van stam NRRL Y-7124 geschikt voor industriële toepassingen. Key onder zocht verbeterde functies waren sneller suiker opnamesnelheden in geconcentreerde hydrolysaten, verminderd diauxy efficiënter gemengd gebruik suiker, en hogere toleranties van ethanol en remmers. De toepassing van S. stipitis om undetoxified hydrolysaten was een belangrijk aandachtspunt van het onderzoek naar de toegevoegde operationele kosten in verband met hydrolysaat detoxificatie processen, zoals overliming elimineren.

Twee industrieel veelbelovende hydrolysaten werden toegepast op de evolutie van kracht:. Enzym versuikerde ammoniak fiber-uitbreiding voorbehandelde maïsstro hydrolysaat (AFEX CSH) en verdunde zuur voorbehandeld switchgrass hydrolysaat drank (PSGHL) ^11,12 AFEX voorbehandeling technologie wordt ontwikkeld omhet minimaliseren van de productie van fermentatie-remmers, terwijl verdund zuur voorbehandeling vertegenwoordigt de huidige laagste kosten-technologie het meest beoefend om cellulosehoudende biomassa bloot voor enzymatische versuikering. PSGHL kan worden gescheiden van de na voorbehandeling cellulose en is karakteristiek rijk aan xylose uit de gehydrolyseerde hemicellulose, maar weinig glucose. AFEX CSH en PSGHL composities van elkaar verschillen op essentiële aspecten die werden benut om de evolutie te beheren. AFEX CSH is lager in furan aldehyden en azijnzuur inhibitoren maar hoger in aminozuren en ammoniak stikstofbronnen opzichte PSGHL (tabel 1). PSGHL presenteert de extra uitdaging van xylose zijn de belangrijkste suiker beschikbaar. Aldus is PSGHL geschikt specifiek verrijken verbeterde xylose gebruik bij hydrolysaten, zwakte voorkomen commercieel gebruik van beschikbare gist. Zelfs onder autochtone pentose gisting gisten, de afhankelijkheid van de suboptimale xylo suikerse celgroei ondersteunen en reparatie wordt nog grotere uitdaging in hydrolysaten vanwege verschillende redenen. voedingsdeficiënties, remmers die grote schade aan structurele integriteit en verstoring metabolisme cel door redox onbalans ⁹ Stikstof suppletie, vooral in de vorm van aminozuren, kan een aanzienlijke bedrijfskosten voor fermentaties vertegenwoordigen. De impact van stikstof suppletie op isolate screening en ranking werd onderzocht met switchgrass hydrolysaten.

Verbeterde individuen werden verrijkt in een zich ontwikkelende bevolking met behulp van meerdere selectie druk afhankelijk van natuurlijke genetische diversiteit van de S. stipitis bevolking en mutaties geïnduceerd door blootstelling aan twee verschillende hydrolysaten, ethanol of UV-straling. Selectiedruk werden parallel en in serie toegepast om de evolutie voortgang van S. staand stipitis in de richting van de gewenste derivaten kunnen groeien en efficiënt te gisten in hydrolysaten(Figuur 1). Het repetitieve kweken van functionele bevolking in toenemende mate uitdagende hydrolysaten werd bereikt in microplaten gebruik van een verdunningsreeks van een van beide 12% glucan AFEX CSH of anders PGSHL bereid bij 20% vaste stof belading. De toepassing van ethanol uitgedaagd groei op xylose in continue kweek verder verbeterd AFEX CSH deze populaties door verrijkend fenotypen tonen minder gevoeligheid voor onderdrukking van xylose gebruik ethanol. Deze laatste functie werd onlangs problematisch pentose gebruik getoond door stam NRRL Y-7124 na glucose fermentatie. ⁸ Verrijking op PSGHL werd vervolgens onderzocht om hydrolysaat functionaliteit uit te breiden.

Vermeende verbeterde derivaten van S. stipitis NRRL Y-7124 werd geïsoleerd uit elke fase van het evolutieproces via gerichte verrijking onder stressomstandigheden en verdunningsuitplatingstechniek kolonies kiezen de meest voorkomende populaties. dimensieloze relatievekengetallen (RPIs) werden gebruikt om stammen te scoren op basis van prestaties, waarbij kinetisch gedrag werd beoordeeld op verschillende hydrolysaat en voedingssupplementen toegepast. Hoewel het succes van verschillende procedures aangepast om de functionaliteit van S. verbeteren stipitis in lignocellulose hydrolysaten zijn eerder beschreven, stammen waaruit economische ethanolproductie op undetoxified hydrolysaten niet eerder gerapporteerd. ^13-17 De evolutie procedures gevisualiseerd in meer detail hier Slininger et al. ¹⁸ ontwikkelde stammen die significant verbeterd de stam NRRL Y-7124 en kunnen produceren> 40 g / l ethanol in AFEX CSH en enzym versuikerde hydrolysaat vingergras (SGH) aangevuld met geschikte stikstofbronnen. Deze nieuwe stammen zijn van toekomstige belang zijn voor de ontwikkeling van lignocellulose ethanol industrie en onderwerpen van extra genomics studies gebouwop die van eerder gesequenced stam NRRL Y-11545. ¹⁹ A genomics onderzoek van top stammen geproduceerd tijdens de verschillende fasen van de evolutie diagramed in figuur 1 zou de geschiedenis van de genetische veranderingen die zich hebben voorgedaan tijdens de ontwikkeling als een prelude op stam verbetering onderzoek verder te ontrafelen.

Protocol

1. Bereid Uitgangsmaterialen en Apparatuur voor Testen

1. Bereid hydrolysaten gebruikt 18-20% aanvankelijke biomassa drooggewicht in de voorbehandelingsvloeistof reactie voor gebruik in de evolutie, isolatie en ranking procedures. Zie Slininger et al. 2015 ¹⁸ voor de gedetailleerde methoden om AFEX CSH, PSGHL en SGH bereiden met stikstof aanvullingen N1 of N2 gebruikt in de evolutie, isolatie of ranking. Zie tabel 1 voor samenstelling van elke hydrolysaat type.
   LET OP: SGH-N1 = SGH versterkt om 42:: 1 mol koolstof stikstof-verhouding (C: N) met stikstof bronnen, waaronder ureum, vitamine-free amino stikstof vestingwerken van SGH werden als volgt aangeduid als SGH-N1 of SGH-N2 gedefinieerd zuren uit caseïne, D, L-tryptofaan, L-cysteïne en vitaminen uit bepaalde bronnen (zodat ~ 15% molaire stikstof N primair amino stikstof (PAN) en ~ 85% N is uit ureum); SGH-N2 = SGH versterkt om 37: 1 C: N met ureum en sojameel als de laagste kosten commerciële bron of aminozuren en vitaminen, die ~ 12% stikstof van PAN en 88% ureum.
2. Schaf een gevriesdroogde cultuur van de stam, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) uit de ARS Culture Collection (National Center for Agricultural Research Utilization, Peoria, Illinois), en voor te bereiden glycerol voorraad culturen zoals aangegeven. Handhaaf stock kweken van de ouder gist en zijn derivaten in 10% glycerol bij -80 ° C.
   1. Streak glycerol voorraden mout gist pepton dextrose (YM) agarplaten (3 g / l gistextract, 3 g / l moutextract, 5 g / l pepton, 10 g / l dextrose, 20 g / l agar) en incubeer 48- 72 uur bij 25 ° C. ⁸ ontwikkelde platen kunnen tot een week bewaard bij 4 ° C voorafgaand aan vloeibare voorkweek inocula gebruikt.
3. Bereid optimaal vastgestelde Medium (ODM), een synthetisch medium compatibel is met industriële formulering procedures ²⁰ die eerder is ontwikkeld voor een optimale omzetting van xylose naar ethanol door de ouder strain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Gebruik de gedefinieerde medium in alle voorkweken en culturen voor vergisting prestaties bioassays en ook voor ethanol uitgedaagd, xylose-fed continue kweek evolutie. ODM samenstelling is te vinden voor de verwijzing in tabel 2.
4. Zoals eerder beschreven, ¹⁸ analyseren cel biomassa met behulp van een cuvette- of micro-plaat lezen spectrofotometer, in voorkomend geval, tot cultuur absorptie bij 620 nm (A ₆₂₀₎ te meten. Kwantificeren suikers, ethanol, furfural, hydroxymethylfurfural (HMF) en azijnzuur in kweek monsters met behulp van hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) of robotic enzymatische bepaling van glucose en xylose hogere doorvoer.

2. Verrijk Robuuste Derivatives tijdens Serial Transfer op AFEX CSH

1. Inoculeer een voorkweek van stam NRRL Y-7124. Transfer cellen van YM agar tot 75 ml ODM + 150 g / L xylose naar het vermogen om te groeien onder o handhavensmotic stress. Incubeer voorkweken in 125 ml kolven afgesloten met silicium spons stekkers 24 uur bij 25 ° C onder schudden (150 rpm, 1 "baan).
2. Ontdooi bevroren hoeveelheden van 6-12% glucan AFEX CSH in koud water voor gebruik. Breng de pH op 5 indien nodig en filter steriliseren alvorens met een verdunningsreeks in 96-well microtiterplaten.
3. Vul microplaten met 50 ul per putje en 8 wells per hydrolysaat verdunning, daarna te enten met een paar microliter van voorkweek per putje om een initiële absorptie mogelijk te maken (620 nm) A ₆₂₀ ≥0.1. Incubeer de platen statisch 24-48 uur bij 25 ° C in een plastic doos met een natte papieren handdoek voor vochtigheid.
4. Met de meest geconcentreerde hydrolysaat verdunning zichtbaar gegroeid tot ₆₂₀ A> 1, overdracht 1-5 ul aan elk putje van een nieuwe hydrolysaat verdunningsreeks initiële A ₆₂₀ ≥0.1 bereiken.
5. Monitor groei cultuur A ₆₂₀ in microplaten met een spectrofotometer. Een niet-geënte verdunningsreeks serves als een controle en blanco. Plate deksels worden achtergelaten tijdens de controle op om besmetting te voorkomen, en de lezingen dienovereenkomstig aangepast.
6. Bereid glycerol voorraden aanpassing culturen regelmatig voor de daaropvolgende isolatie van verbeterde stammen of voor gebruik in reinoculating de aanhoudende hydrolysaat verdunning serie. Om aandelen te bereiden, zwembad vier putten (200 pl) van de grootste hydrolysaat concentratie gekoloniseerd. Mix 1: 1 met 20% steriele glycerol in cryovials, aan cellen in 10% glycerol invriezen bij -80 ° C.
7. Herhaal stap 2,3-2,6 tot groei in 12% glucan AFEX CSH is altijd zichtbaar bij 24 uur.

3. Isoleer Single Cell Tolerant Derivaten na verrijking AFEX CSH

1. Streak geselecteerde glycerol voorraden aanpassing culturen YM agar en gebruiken stroken 50 gl 3% of 6% glucan AFEX CSH (pH 5) te inoculeren in elk van de drie putjes microplaat (aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0,1). Incubate microplaten 24 uur zoals in stap 2.3. Pool replicate gekoloniseerd putten op het hoogste hydrolysaat sterkte met een sterke groei, en verdunning plaat YM of 6% glucan AFEX CSH agar. Bereid de laatste als 1: 1 mix van filter gesteriliseerde 12% glucan AFEX CSH met warme geautoclaveerde 30 g / l agar-oplossing.
2. Pick 5 enkele kolonies van de hoogste verdunning plaat toont de groei na 24-48 uur incubatie bij 25 ° C te bevriezen als glycerol voorraad culturen. Streak elke kolonie een YM plaat. Incubeer 24 uur. Met een steriele lus overdracht een ontwikkelde reeks van cellen aan een klein volume van 10% glycerol, mixen om cellen te schorten en distribueren naar 2-3 cryovials ingevroren bij -80 ° C.

4. Evalueer prestaties van AFEX CSH Tolerant Derivaten Vergeleken met Parent

1. Test isolaten in de eenvoudige 6% glucan AFEX CSH Batch Cultures.
   1. Transfer cellen van 48 uur platen uitgestreken uit glycerol voorraden pH 7 kaliumfosfaatbuffer (0,4 mM) om celsuspensies te bereiden met A = ₆₂₀ 10. Gebruik 1 pielke suspensie aan elk van vier putjes van 50 gl 3% glucan hydrolysaat te inoculeren aanvankelijke A ₆₂₀ = 0,2. Incubate microplaten 24 uur zoals in stap 2.3. Bereid de 3% glucan AFEX CSH bij pH 5 door verdunning van 12% glucan AFEX CSH 1: 3 met steriel water.
   2. Overdracht twee 24 uur microtiterplaat wells voor het enten van 25 ml voorkweken van pH 5 12% glucan AFEX CSH gebruikt 50% van de volledige sterkte. Incubeer voorkweken in 50 ml kolven met silicium spons sluitingen voor 24 uur bij 25 ° C, ~ 150 rpm (1 'orbit) Bereid helft sterkte 12% glucan AFEX CSH door verdunning van het hydrolysaat 1:. 1 met steriel water.
   3. Gebruik van halve sterkte hydrolysaat voorkweken soortgelijke 25 ml groei culturen aanvankelijke A ₆₂₀ = 0,1 te enten. Incubeer de groei kweken zoals hierboven (4.1.2) en dagelijks monster (0,2 ml). Monitor ophopingen van biomassa (A ₆₂₀₎ en concentraties van suikers en fermentatieproducten (HPLC).
2. Als alternatief repitch (dat wil zeggen, de oogst en reuse) populaties van 6% glucan AFEX-CSH gekweekt gist voor testen in 8% glucan hydrolysaat batch kweken zoals eerder beschreven. ¹⁸
3. Anderzijds is er verder testpopulaties opnieuw gepikt van 6% glucan AFEX CSH kweken door het voeren met 12% glucan hydrolysaat, zoals eerder beschreven. ¹⁸
4. Test diauxic vertraging van de isolaten in batch culturen van ODM met gemengde suikers.
   1. Inoculeer voorkweken van 75 ml ODM met 150 g / L xylose in 125 ml kolven met siliconen spons sluitingen door lus transfer van YM glycerol strepen. Incubeer 24 uur zoals in stap 2.1.
   2. Gebruik voorkweken soortgelijke 75 ml testculturen inoculeren met ODM bevattende 75 g / l glucose en 75 g / l xylose bij pH 6,5. Schudkolven bij 25 ° C, 150 rpm. dagelijks proeven.
   3. Alternatief test de invloed van 0-15 g / l azijnzuur op diauxy tijdens fermentatie van glucose en xylose door een soortgelijk protocol, behalve begin-pH wordt ingesteld op 6,0 ± 0,2 in testkweken tot pH 6-7 du handhavenring azijnzuur consumptie, zoals eerder beschreven. ¹⁸

5. Breng Continu Cultuur om te selecteren voor-Ethanol uitgedaagd Xylose Gebruik

1. Bereid ODM als de continue cultuur toevoer medium met 60-100 g / L xylose, 20-50 g / l ethanol bij een pH van 6,3 ± 0,2. Kiezen combinaties van xylose en ethanol de gedeeltelijke fermentatie van 150 g / L xylose simuleren, uitgaande van een potentiële opbrengst van ~ 0,5 g ethanol / g xylose, en het potentieel geschikt voor 50-70 g / l ethanol optreden. ⁸
2. Om de continue cultuur entstof te bereiden, over te dragen een vertegenwoordiger AFEX CSH-tolerante kolonie (analoog aan Colony 5 in bijvoorbeeld figuur 1) van de loop van een 48 hr YM plaat tot 75 ml van de ethanol-vrije ODM (100 g / L xylose, in dit geval) in 125 ml kolven. Incubeer bij 25 ° C, 150 rpm (1 'orbit) gedurende 24 uur. Kies de voorkweek ODM xylose concentratie die van de oorspronkelijke continue kweek houden van volume.
3. Inoculeren een continue kweek die hoeveelheid ODM bij pH 6,3 ± 0,2 met 100 g / l xylose + 20 g / l ethanol ~ 5-10 ml van een voorkweek van een concentraat AFEX CSH-tolerante isolaat (analoog aan Colony 5 figuur 1 ) tot 100 ml bij de eerste A ₆₂₀ ~ 0,5 te verkrijgen. Handhaaf de kweek met volume _(VR), bij 25 ° C in een mantel 100 ml centrifugekolf geroerd bij 200 rpm en uitgerust met steriliseerbare pH-elektrode, pH regelaar en temperatuurregeling circulerend waterbad.
4. Aanvankelijk omdat celgroei maar langzaam zal als gevolg van blootstelling ethanol, opzetten van de voedingsmedium te doseren met behulp van een pH-aangedreven pomp. Stel de pomp te voeden pH 6,3 ODM met 100 g / L xylose en 50 g / l ethanol wanneer de kweek fermentatie laat de pH tot 5,4, waardoor het stoppen verder pH-daling. Handhaving van de volume van 100 ml met een effluent pomp continu het afromen van de cultuur oppervlak. Bijgevolg ethanolconcentratie stijgt met voortgezet metabolisme en voeding. Meet effluent en monsters (1-2 ml) trekken continue culturen elke 48-72 uur voor de analyse van levensvatbare celconcentratie, producten en substraten zoals eerder beschreven. ¹⁸ Om haalbare celconcentratie te maken seriële 1:10 verdunningen van monsters in buffer (zie 4.1.1) en de verspreiding van de plaat verdunningen om YM agar (zie 1.2.1). Gebaseerd op effluent inzamelingspercentages (Q) Bereken de verdunning (D) (Q / _VR), en, in het voorbeeld van S. stipitis, varieerde 0-0,01 h ^-1.
5. Spaar glycerol voorraden regelmatig door het isoleren van de levensvatbaarheid platen van gebufferde monster verdunningen vormen 30-100 kolonies, die het meest voor robuuste kolonisten op dat moment in de verrijking. Flood platen met ~ 5 ml van 10% glycerol om de bereiding van dubbele cryovials mogelijk. Voor het onderhoud of een adempauze, stop dan het continue cultuur en opnieuw op te starten als nodig is met behulp van de meest actuele (resistente) glycerol voorraad (s).
6. Opnieuw op te starten, streak de glycerol voorraad (s) van de meesteresistente populaties YM agar en overdragen 24-48 uur cellen door lus een voorkweek van ethanolvrije ODM voor incubatie zoals hierboven. Inoculeer de 100 ml met volume van ODM de initiële A ₆₂₀ 0.5 met behulp van een concentraat van de voorgekweekt gist, en laat de cultuur tot batch-gewijs naar stationaire fase groeien voordat het voer medium stroom wordt hernieuwd.
7. Als kweken gestadig> 0,01 ^uur-1 kan groeien op xylose in de aanwezigheid van> 25 g / l ethanol, start de continue kweek toevoer (ODM + 60 g / l xylose + ethanol variërend 30 tot 50 g / l) bij een lage verdunning ~ 0,01 ^h-1 tot 100 ml met volume (aanvankelijk ODM + 60 g / l xylose + 20 g / l ethanol). Na verloop van tijd, verhogen van de ethanol in het voer in de richting van 50 g / l. Leg geavanceerde bevolking in glycerol voorraden.
   NB: Het handhaven van het lage verdunning percentage kan de vorming van een voldoende hoge cel concentratie beschikbaarheid van zuurstof en ondersteuning fermentatie te verminderen.
8. Eventueel toepassing ultraviolet (UV) bestralingenion maandelijks aan glycerol voorraad populatie gebruikt om continue culturen wordt opnieuw overgeënt.
   1. Resuspendeer kolonies van glycerol voorraad strepen in 10 ml ODM (zoals in voorkweken) met 60 g / L xylose en bundelen alle bestanden in één enkele steriele kolf. Breng de gepoolde celsuspensie bij ~ 5 x 10 ⁸ levensvatbare cellen / ml tot net onder de bodems van 4-5 Petri platen met 6 ml / plaat. Om 6 ml dekking van een standaard wegwerp petrischaal te verkrijgen, afzien van 15 ml tot oppervlaktespanning overwinnen, en verwijder dan 9 ml.
   2. Expose elke open cultuur plaat UV van de lichtbron in een biologisch veiligheidskabinet. Pas de blootstelling aan UV tijd of afstand tot de gewenste kill rate> 90% te verkrijgen. Hier blootstellen gedurende 45 minuten op ongeveer 56 cm van de bron.
   3. Verdunnen plaat celsuspensies voor en na bestraling. Schatting kill tarief op basis van kolonievormende eenheden. Voor de S. stipitis bijvoorbeeld de kill bedroeg ~ 97%.
   4. Breng de UV-behandelde culturen (24-30 ml) van een folie-covEred 50 ml kolf en incubeer bij 25 ° C en 150 rpm gedurende 24 uur om het kleine percentage levensvatbare cellen herbevolking tot ~ 1 x 10 ⁸ levensvatbare S. stipitis cellen / ml. Door het voorkomen van foto reactiveringen, de folie deksel behoudt mutaties terwijl culturen worden geïncubeerd.
   5. Gebruik de herbevolkte gemutageniseerde kweek continue culturen te inoculeren ~ 1 x 10 ⁷ levensvatbare cellen / ml. Start de-ethanol verrijkte ODM + 60 g / L xylose medium toevoer naar de selectie proces voort te zetten.

6. Evalueer Glycerol Stock Populaties en te identificeren Degenen met verbeterde xylose fermentatie in de tegenwoordigheid van Ethanol

1. Streak geselecteerde glycerol stock culturen YM agar als eerste stap in het scherm voor de beste groei en fermentatie van xylose in de aanwezigheid van ethanol.
2. Transfer elke geëvolueerd populatie worden gescreend uit agar stroken tot 75 ml voorkweken in ODM met 150 g / l glucose en incubeer in 125 ml kolven 96uur vóór gebruik als inocula voor testculturen. De grote glucosegekweekte populaties inductie van enzymen voor gebruik xylose vereisen.
   1. Inductie testen, oogst elke cultuur, schorten cellen tot 30 ml, aanvankelijke A ₆₂₀ van 40 ODM 60 g / L xylose + 30-45 g / l ethanol en incubeer bij 25 ° C, 150 rpm (1 "orbit) in 50 ml kolven met silicium spons sluitingen. tekenen monsters tweemaal daags toezicht xylose opname door HPLC-analyse.
3. Alternatief, zoals beschreven in Slininger et al., ¹⁸ groei op xylose beoordelen aanwezigheid van ethanol, bereid voorkweken van elke ontwikkelde bevolking lus overdracht aan 75 ml ODM met 150 g / l xylose in 125 ml kolven, en incubeer 96 uur bij 25 ° C, 150 rpm (1 'orbit). Inoculeer testkweken een lage initiële een ₆₂₀ van 0,1 in 25 ml ODM + 60 g / l xylose + 30-45 g / l ethanol in 125 ml kolven. Incubate kolven bij 25 ° C, 300 rpm, 1 "baan en monster.

1. Uit de resultaten van stap 6 selecteert glycerol stock populaties toont superieur vermogen om te groeien en fermenteren xylose in aanwezigheid van ethanol. Gebruik deze om streak platen. De reeks platen worden gebruikt om dichte, gebufferde celsuspensies van A = ₆₂₀ 5. Daarna celsuspensies worden gebruikt om voorkweken met 96 diepe putjes inoculeren A ₆₂₀ = 0,5 te bereiden. Beënten 1 ml voorkweken op PSGHL gemengd 1: 1 met ODM + 50 g / L xylose (geen ethanol). Incubate voorkweken in 96-well, diepe put platen met geventileerde lage verdamping dekt voor 48 uur bij 25 ° C, 400 rpm, 1 "baan. Aparte verschillende glycerol voorraad bevolkingsgroepen door lege putten.
2. Gebruik van elk voorkweek Inoculeer zestien 1 ml repliceren culturen aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0,5 in 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L xylose met 20, 30 of 40 g / l ethanol tolerante kolonisten verrijken. Incubate verrijking cultures vergelijkbaar met voorkweken.
3. Voor elk verschillend glycerol voorraad, de oogst van de cultuur putten met de hoogste concentratie ethanol waardoor de groei en xylose te gebruiken. Plate elke cellijn te YM agar te heersen enkele kolonies te verkrijgen te bewaren in glycerol. Pick tien kolonies per cellijn en streak elk een YM agar plaat voor glycerol voorraad voorbereiding.

8. verder te verrijken Robuuste Evolved Stammen tijdens Serial Transfer op PSGHL, als voor AFEX CSH

1. Bereid pre-kweken van NRRL Y-7124 (ouder), AFEX CSH-tolerante geëvolueerd isoleren en continue kweek ontwikkelde populatie met verhoogd vermogen om xylose in aanwezigheid van ethanol. Wordt geënt in 75 ml van ODM + 150 g / L xylose door lus van glycerol voorraad strepen zoals hierboven beschreven (stap 2.1) voor de AFEX CSH hydrolysaat aanpassingsproces beschreven.
2. Verdun PSGHL met water om een ​​reeks van toenemende concentraties verschaffen. Bereid een 96-well microplaat voor elk van de drie cellijnen door elkePSGHL verdunning tot 8 putjes te vullen met 50 pi. Gebruik voorkweek elk 50 ul micro-cultuur van de verdunningsreeks aan aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0,1-0,5 te enten.
   1. Verdere evolutie van gist in toenemende sterktes van PSGHL volgens dezelfde procedure als AFEX CSH hydrolysaat aanpassing hierboven (stap 2) nader tot kweken kunnen groeien in de volle sterkte hydrolysaat een stabiele 14-d gemiddelde verhouding AA ₆₂₀ per Δtime als seriële transfers zijn nog eens vier maanden voortgezet.

9. Isoleer Single-cell Colonies behulp PSGHL Verlopen met of zonder Ethanol Challenge

1. Verkrijgen van single-cell isoleert rechtstreeks uit volle sterkte PSGHL laatste aanpassing platen door verdunningsuitplatingstechniek aan YM agar. Pick tien grote kolonies voor elk van de drie cellijnen en bar strook tot YM platen glycerolvoorraden bereiden zoals eerder beschreven (stap 3,2).
2. Optioneel verkennen eerder tijdstip punten in deevolutieproces door het isoleren van opgeslagen glycerol voorraden van de drie cellijnen.
   1. Inoculeer een voorkweek voor elke cellijn door lus van glycerol voorraad strepen en incubeer 24 uur op 30 ml ODM + 50 g / L xylose (50 ml flesjes, 25 ° C, 150 rpm).
   2. Uitdaging cellen van voorkweken groei in hydrolysaat door het enten van 50 pi 50% PSGHL in microtiterplaat putjes een eerste A ₆₂₀ ~ 0,2 en incubatie statisch 48 uur.
   3. Verspreid 0,1 ml van elk verrijkte kweek op agarplaten PSGHL gradiënt van 0 tot 50% sterkte hydrolysaat (~ 300-400 leveren levensvatbare cellen per plaat) en kies 10 enkele kolonies per cellijn van de hoogst mogelijke hydrolysaat concentratiegebied van de gradiënt . ²¹ Streak geplukt kolonies YM voor glycerol voorraad voorbereiding als in stap 3.2.
   4. Als alternatief voor stap 9.2.3, in plaats van enten van de gradiënt agarplaten inoculeren putjes van 96-well microplaten met aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0,2, wheopnieuw de putten zijn ontworpen om een ​​scala van concentraties hydrolysaat bevatten 50-100% 's ethanol en van 10 tot 40 g / l. In dit geval, ontwikkelen microplaten 72-96 uur en voorts in stap 2,3. Isoleer tien enkele kolonies uit putten van de zwaarste hydrolysaat-ethanol combinaties die de groei via verdunningsuitplatingstechniek, en voor te bereiden glycerol voorraden zoals in stap 3.2.

10. In een primaire scherm, Elimineer Inferior isolaten door het vergelijken en Ranking Performances op PSGHL bij Two Nutrient Voorwaarden

1. Breng een high throughput diepe put plaat scherm van PSGHL prestaties scherm vijf sets van dertig isolaten samen met NRRL Y-7124 ouder en AFEX CSH-tolerante isolaat (analoog aan Colony 5 van de figuur 1 evolutie bijvoorbeeld) als controles tot zes top stammen kiezen (20%) van elke set door te geven aan de secundaire screening niveau (stap 12).
2. Uit te voeren op het scherm in de diepe put platen gevuld 1 ml per putje en bedekt with roestvrij stalen deksels met zwarte siliconen laag verdampende zeehonden. Klem alle borden aan de raad van de incubator / shaker en werken bij 25 ° C en 400 rpm (1 "shaker baan). Ontwerp alle diepe put plaat vullen patronen om scheiding van de verschillende isolaten mogelijk door open bronnen.
3. Om teelten beginnen, kies een strook cellen uit glycerol stroken bereid uit 30 isolaten verkregen zoals hierboven (in stappen 3, 7 en 9) aan putjes van ODM + 50 g / l xylose dupliceren en incubeer 48 uur.
4. Als uitdaging medium voor preculturing isolaten bereid 50% PSGHL door mengen PSGHL 1: 1 met ODM + 10 g / l glucose + 50 g / L xylose. Voor het screenen van 30 isolaten en twee controlestammen, 2 platen met 2 wells per elke 16 isolaten worden gevuld, waardoor er lege putjes tussen de verschillende isolaten.
5. Voor challenge culturen, overdracht, een 50 ul volume ODM pre-cultures (A ₆₂₀ ~ 10) aan elk van twee 50% PSGHL uitdaging kweekputjes voor elk van de isolaten en controles om een initi verkrijgenal A ₆₂₀ ~ 0,5 en incubeer 72 uur.
6. Gebruik twee proefmedia van verschillende nutritionele rijkdom voor screening isolaten: 60% PSGHL + ODM voedingsstoffen; en 75% PSGHL + ODM + YM voedingsstoffen. Voeg ODM voedingsstoffen (exclusief suikers) en de helft van de kracht als standaard ODM gebruiken met 50 g / l suiker (stap 1,3). Zoals aangeduid, voeg YM nutriënten (exclusief suikers) en de helft van de standaard sterkte van 3 g / l gistextract, 3 g / l moutextract, 5 g / l pepton.
7. Inoculeer testculturen door de overdracht van 50 pi 72 uur 50% PSGHL uitdaging pre-culturen tot 1000 pi tot aanvankelijke A ₆₂₀ ~ 0.5 in vijf diepe putten voor elk van de twee test-media te enten.
8. Proef elk isolaat per dag. Pipetteer de inhoud van een put naar een microfugebuis en gecentrifugeerd (5533 x g, 15 min) om bovenstaande vloeistof van ethanol, glucose en xylose high throughput analyse te verkrijgen. Meet biomassa als ₆₂₀ in 96-well microplaten (200 ul / putje) met een spectrofotometer.
9. Binnen elke set van 30 isolates getest (5 sets voor S. stipitis NRRL Y-7124 geëvolueerd stammen), het berekenen van de relatieve performance indexen (RPI), zoals beschreven in stap 11 hieronder en gebruik om elke stam te rangschikken op basis van ethanol opbrengst (maximaal ethanol geaccumuleerde per initiële suiker meegeleverd) en xylose opnamesnelheid (xylose concentratie verbruikt per eerste 96 uur) aan beide testen media.

11. Rank Isoleert in de primaire PSGHL Screen Met behulp van Relative Performance Index (RPI)

1. Na primaire screening, berekenen relatieve dimensieloze kengetallen (RPI) teneinde rangschikken de 30 isolaten in elk van de vijf verschillende experimenten scherm isolaten op PSGHL twee verschillende voedingsstoffen formuleringen per experiment, dat wil zeggen, 60% en 75% PSGHL PSGHL.
2. Bereken de statistische parameter F voor gebruik in de rangschikking isolaat prestaties binnen een groep getest met een bepaalde experiment isolaten: F = (XX _avg) / s. Hier, X de prestatieparameter, zoals opbrengst (Y)of (R), waargenomen voor elk isolaat, terwijl X _avg en s de gemiddelde en de standaarddeviatie van respectievelijk X waargenomen voor alle isolaten binnen een bepaald experiment. Voor normale verdelingen, -2 <F <2.
3. Voor elk isolaat in een experiment, berekenen de relatieve prestaties op basis van snelheid, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, en op dezelfde wijze de relatieve prestaties op basis van de opbrengst, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 . De waarde van de RPI varieert van ~ 0-100 percentiel (oplopend). Bereken dan RPI gemiddelden voor elk te isoleren binnen een gegeven hydrolysaat experiment als volgt: RPI _avg = (RPI _Y + RPI _R) / 2, waar de opbrengst en tarief bijdragen gelijk gewicht worden gegeven in deze toepassing.
   Merk op dat in het algemeen kunnen de opbrengst en snelheidsparameters gewogen als ongelijke belang geacht.
4. Bereken RPI _overall over de n soorten getest hydrolysaten: RPI _algehele i = 1, n [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Beschouw elk isolaat in een experimentele set van 30 isolaten en 2 controles. Tijdens primaire ranking van de ~ 150 single-kolonie isolaten aangepast om xylose-rijke PSGHL, de RPI _totale wordt berekend voor de tarieven en rendementen over de twee PSGHL formuleringen toegepast in het scherm, dat wil zeggen 60% PSGHL en 75% PSGHL, waarbij n = 2.
5. Op basis van RPI _algehele binnen elk experiment, kiest de top percentage van de isolaten door te geven aan de secundaire scherm. In dit voorbeeld is de top 20% van de stammen worden geselecteerd door middel (bijvoorbeeld 30 of 150 getest) te passen.

12. In een tweede scherm, Vergelijk Top Primaire Screen Performers op Multiple Compleet hydrolysaten (> 100 g / l Gemengde Sugars) naar Hoogste Werking Robuuste Stammen Reveal

1. Vergelijk top PSGHL performers op 6% glucan AFEX CSH en SGH gewijzigd met twee niveaus van stikstof, SGH-N1 en SGH-N2 (samenstellingB als in tabel 1) voor eindstand. Het scherm van de 30 isolaten dat de top performers in de primaire diepe put plaat scherm van PSGHL waren (stappen 10 en 11) en de twee controles (ouderlijke stam NRRL Y-7124 en AFEX CSH-tolerante isolaat (analoog aan Colony 5, figuur 1 voorbeeld ).
2. Begin teelten door het kiezen van een kraal van cellen van glycerol stroken tot diepe putjes van 1 ml ODM + 50 g / L xylose als hiervoor dupliceren en incubeer 48 uur in de diepe well plaat systeem (stap 10.2). Vervolgens transfer 50 pi ODM voorkweken tot 50% SGH uitdaging culturen, en incubeer in het diepe well plaat voor 72 uur naar A ₆₂₀ te verkrijgen bij ~ 10). Bereid de 50% SGH door mengen SGH 1: 1 met suikervrije ODM + 50 g / L xylose (pH 5,6).
3. Voor elk van de isolaten, inoculeren een 16 ml aliquot van SGH-N1 of N2-SGH de celpellet (15 min, 2711 x g) van drie putjes van uitdaging cultuur tot cultuur beginsnelheid A ₆₂₀ ~ 2,0 verkregen. Incubeer testculturen op 25 & #176;. C, 180 rpm (1 "orbit) in 25 ml flesjes met siliconen spons sluitingen Sample kolven dagelijks en analyseren per PSGHL het scherm.
4. Op dezelfde manier, het scherm isoleert als in de stappen 12.2 en 12.3, maar dit keer vervanger SGH-N1 en SGH-N2 met 6% glucan AFEX CSH bij een pH van 5,2 voor de uitwerking van de uitdaging kweekmedium en test kweekmedium. Voor de 50% sterkte uitdaging culturen, gebruiken 6% AFEX CSH 1: 1 verdund met water omdat het stikstof voldoende ongewijzigd.
5. Herhaal stap 12,1-12,4 om resultaten te dupliceren.

13. Rank De prestaties van isolaten in de secundaire scherm Met behulp van RPI _algehele om Rate gebruik van meerdere Compleet hydrolysaten

1. Bereken relatieve prestatie indices (RPI) om elk van de top 20% van de isolaten te rangschikken (~ 30 van de 150) van de primaire scherm die zijn getest in de secundaire scherm op enzym versuikerd hydrolysaat formuleringen van verschillende nutritionele rijkdom.
2. Score elkisoleer getest in het secundaire scherm gebaseerd op xylose opnamesnelheid en ethanolopbrengst uitgevoerd op drie-enzym versuikerd voorbehandelde hydrolysaat formuleringen in duplo, waaronder AFEX CSH (i = 1 en 2), SGH-N1 (i = 3 en 4) en SGH -N2 (i = 5 en 6).
3. Bereken de RPI _globaal voor elk isolaat en passen deze rangschikking parameter verder ziften de lijst van superieure isolaten: RPI _alles = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n, waarbij n = 6 .
   LET OP: Aantonen kinetiek van superieure isolaten in SGH-N2 hydrolysaten in kolf culturen door het volgen van de procedures in Slininger et al ^18.

Representative Results

S. stipitis werd ontwikkeld met combinaties van drie selectie culturen die AFEX CSH, PSGHL en ethanol uitgedaagd xylose-fed continue kweek opgenomen. Figuur 1 toont het schema van de evolutie experimenten uitgevoerd met de isolaten hebben ofwel meest effectieve wijze overall, of het meest effectief op één van de geteste hydrolysaten. Tabel 3 toont de toegangsnummers NRRL van deze superieure isolaten en vat de aanpassing spanningen toegepast bij de werkwijze van het bereiken van de verrijkte populatie waaruit elke stam werd geïsoleerd. Isolaten werden gezien relatief betere prestaties op één of twee typen hydrolysaat, maar 7 van 11 isolaten presteerde goed op alle soorten hydrolysaat, hoewel de meeste van deze werden blootgesteld en beproefd door slechts één soort in evolutie. De successen van de verschillende evolutie benaderingen hier genomen worden gedemonstreerd in de figuren 2 -7 en Tabel 4.

Figuur 2 toont de verschillende verbeteringen gezien na de eerste fase van aanpassing waar betrouwbare derivaten van stam NRRL Y-7124 werden verrijkt tijdens seriële overdracht aan toenemende concentraties van AFEX CSH (Stap 2). In culturen groeien op 6% glucan AFEX CSH, de geëvolueerde bevolking demonstreert snellere accumulatie en hogere uiteindelijke titers van ethanol dan de stam. Snellere glucosegebruik ook gezien met snellere xylose opname onmiddellijk na uitputting van glucose. Bovendien in Figuur 3, de stabiliteit van de bevolking gewijzigde functies blijkt uit het synthetische medium ODM met een mengsel van 87 g / l glucose en 66 g / L xylose. In dit geval zijn zowel de verrijkte populatie (Figuur 3B) en geïsoleerde kolonies (Colony Colony 1 en 5, Figuur 3C en 3D, respectively) kunnen de ouderstam overtreffen met de xylose efficiënter ethanol sneller, waardoor er minder tijd ethanol piek ten minste 4 dagen. Aanzienlijk hogere concentraties ethanol opgetelde ontwikkelde spanningen op ODM (55-60 g / l) in vergelijking met de ouder (40-45 g / l). De mutaties, die tot een stabiel fenotype van verminderde diauxy tijdens de glucose-xylose overgang en efficiënter xylose fermentatie ontstaan ​​als het gistgehalte geëvolueerd AFEX CSH.

Verdere verbeteringen Colony 5 zijn door het aan natuurlijke selectie in xylose-fed continue kweek in de aanwezigheid van toenemende niveaus van ethanol tot 50 g / l nagestreefd. Onder deze voorwaarde, moet de gistpopulatie in continue kweek gehouden kunnen enzymen voor gebruik xylose als enige koolstofbron te induceren zodat zij kunnen groeien met een snelheid die hoog genoeg is om de fermentor vullen ondanks een constante verdunningrate. In de stam, begint de inductie van xylose enzymen worden geremd bij ethanol concentraties van slechts 15-20 g / l. ⁸ Derivaten van Colony 5 werden meegenomen in glycerol voorraad op vroege en late tijdstippen van de werking van de continue kweek, en Figuur 4 toont de succesvolle verbetering xylose gebruik in de aanwezigheid van 40 g / l ethanol waargenomen in geëvolueerde derivaten van Colony 5 opzichte van NRRL Y-7124 ouder en de initiële Colony 5 geïnoculeerd in het proces.

Isolaten samenhangt met alle fasen van de aanpassing schema van figuur 1 werden gescreend PSGHL die met superieur vermogen om xylose te fermenteren identificeren (stap 10.1). De in figuur 5 isolaten behoren tot de best presterende op PSGHL van ~ 150 gerangschikt in deze primaire scherm en in alle secundaire schermen van de prestaties zoals hieronder beschreven. Om verbetering van de geëvolueerde isolaten te geventen opzichte van hun ouders, de prestaties van elke isolaat werd uitgedrukt als de verhouding van kinetische parameterwaarden van isolaat tot ouderstam. Verhoudingswaarden van "één" plaatsgevonden indien het isolaat prestaties overeenkomen met de ouder was. Figuren 5a en 5b vatten top isoleren voorstellingen op 60% en 75% sterkten van PSGHL met ODM en ODM + YM voedingssupplementen. Aangezien het hydrolysaat concentratie en hardheid werd verhoogd, de prestatieverhouding afgenomen. In de 60% sterkte PSGHL, vijf van de zeven top-isolaten vele malen beter dan NRRL Y-7124 (isolaat 1) blootgesteld aan PSGHL selectiedruk uitgevoerd. Vier isolaten presteerde beter dan Colony 5 (isolaat 33), die bij blootstelling aan AFEX CSH hadden ontwikkeld, maar had geen eerdere selectieve blootstelling aan PSGHL. In de 75% sterkte PSGHL slechts 3 isolaten significant overtrof zowel de ouder en Colony 5 (isolaat 33) ondanks de extra voedingsstoffen. Hiervan superieure isolaten 15 en 16 waren previously geprikkeld met toenemende concentraties van PSGHL als selectiedruk leidend evolutie. Isolaten 15, 14 en 3 werd alleen sprake PSGHL, terwijl 11, 13 en 16 meervoudige belichting hadden. Isolaten 3, 11 en 13 waren van eerdere tijdstippen gedurende de evolutie in PSGHL en dus hadden iets minder kans op het ontwikkelen van tolerantie ten opzichte van 14, 15 en 16. Hoewel het duidelijk in figuur 5 dat seriële overdracht toenemende sterktes van PSGHL gepresenteerd stammen robuust zijn remmende omgeving te ontwikkelen, is het ook duidelijk dat de blootstelling van de stam NRRL Y-7124 op AFEX CSH alleen zou kunnen genereren isolaten zoals Colony 5 (33) met kruis tolerantie voor PSGHL. Derhalve is aangegeven dat robuuste stammen kunnen uitvoeren in verschillende hydrolysaten kunnen worden bekomen door verrijking van tolerantie in een hydrolysaat gevolgd door screening prestaties in andere. Isolaten verkregen uit de-xylose gevoed continue kweek werden ook gescreend op PSGHL 60% en 75% met sterkevoedingsstoffen en ook glucose bij 75 g / l om de ethanol uitdaging sustain en test diauxic lag op xylose volgende glucosegebruik. Terwijl isolaten 27, 28 en 30 waren superieur aan anderen uit deze fase aanpassing, zowel opbrengst en xylose opnamesnelheid prestatieverhouding waren vergelijkbaar met de bovenliggende 75% PSGHL met toegevoegde ODM en YM nutriënten die niet noodzakelijkerwijs verwonderlijk dat niemand had eerdere blootstelling aan dit hydrolysaat (ook Slininger et al. ¹⁸ additionele data hier voor het kweken niet aangegeven mits 75 g / l glucose).

De beste stammen geselecteerd uit de primaire scherm op xylose-rijke PSGHL werden vervolgens gescreend op drie volledige hydrolysaten. Deze hydrolysaten (tabel 1) opgenomen AFEX CSH en verdund zuur voorbehandeld SG behandeld met commerciële cellulasen en aangevuld op twee verschillende niveaus stikstof (SGH-N1 en N2-SGH) naar de meest veelzijdige iso identificerenlates met betrekking tot variaties in inhibitor en voedingsomgeving. De relatieve kengetallen (RPIs) werden berekend voor de fermentatie van elk isolaat binnen elk hydrolysaat (Figuur 6A). Figuur 6B toont het gecombineerde totale prestatie indicatoren berekend voor elk isolaat. Vijf isolaten (3, 14, 27, 28, 33) heeft algemene RPI boven 60, waardoor ze gerangschikt als de meest robuuste om alle variaties hydrolysaat en nutriënten gecombineerd. Herziening van Tabel 3, zowel isoleert 3 en 14 werden ontwikkeld in PSGHL terwijl 27, 28, en 33 in AFEX CSH of AFEX CSH en-ethanol uitgedaagd continue kweek op xylose werden ontwikkeld. Geen van de stammen vertoont superieure meervoudig gebruik hydrolysaat werden ontwikkeld op meerdere hydrolysaat.

Sommige stammen waren 'specialisten' beter presterende aan beide SGH-N1 / 2 of AFEX CSH. Die isolaten het best presteren als specialist op SGHhydrolysaten (11, 16 en 9) werden verkregen door evolutie in PSGHL als laatste of enige uitdaging. Voor isolaten 11 en 16, die in eerste instantie via het verhogen van AFEX CSH uitdaging werden verrijkt, werd de mogelijkheid om efficiënt te benutten AFEX CSH niet actief geselecteerd tijdens de langdurige laatste verrijking in PSGHL, en de belangrijkste genetische factoren die het gebruik ervan waren blijkbaar verloren. Daarentegen isolaten 14, 25, 27, 30 en 33 waren superieur artiesten op AFEX CSH, en alle behalve isolaat 14 werd ontwikkeld op AFEX CSH met of zonder ethanol uitdaging. Dus zoals verwacht, gerichte evolutie op AFEX CSH of PSGHL de neiging om te kiezen voor gist goed aangepast aan de selectie hydrolysaat. De enige uitzondering in dit verband was isolaat 14. Isoleer 14 is ontstaan ​​vanuit de PSGHL enige uitdaging en werd geïsoleerd uit YM agar verdunningsuitplatingstechniek van de uiteindelijke PSGHL verrijking cultuur. Slininger et al. ¹⁸ toonde dit isolaat superieur vermogen om xylose enzyminductie in glucosegekweekte cellen in de aanwezigheid van5-15 g / l azijnzuur en verminderde diauxic lag op ODM met 75 g / l elk van glucose en xylose, ondanks> 30 g / l ethanol plaatsgevonden vóór het glucose-xylose overgangspunt.

De superieure kinetiek van geëvolueerd stammen ten opzichte van de stam S. stipitis NRRL Y-7124 werd aangetoond zoals getoond in tabel 4, die de resultaten van geringe beluchting kolf kweken geïnoculeerd in een ₆₂₀ 8,4 ± 2,5 75 ml SGH-N2 initiële (pH 6,2) geïncubeerd in 125 ml kolven met siliconen spons caps 25 ° C, 150 rpm (1 'orbit) en in figuur 7, die matige beluchting kolf kweken geïnoculeerd in een ₆₂₀ 0,5 in 23 ml SGH-N2 per 50 ml kolf initiële. ¹⁸ Deze voorwaarden stellen twee verschillende soorten van de inzet van de voorgestelde literatuur als potentieel commercieel veelbelovend uit voor de productie van ethanol door S. stipitis. ^8,22 In de sparrent geval van een laag niveau beluchting, de hoge celdichtheid zorgt voor een snelle vergisting om onmiddellijk te beginnen. Overwegende dat in tweede instantie, de lage cel dichtheid en hogere beluchting leiden tot logaritmische groei van de bevolking te bouwen en te versnellen groei geassocieerd conversie suiker tot ethanol. Deze gegevens tonen aan dat de ontwikkelde stammen significante kinetische voordelen ten opzichte van de stam: sneller glucose opnamesnelheid (Tabel 4), snellere specifieke xylose opnamesnelheid (Tabel 4), snellere productiviteit ethanol zowel glucose en xylose en totale (Tabel 4), kortere lag voorafgaand aan de groei (figuur 7), en kortere diauxic glucose overgangsmaatregelen lag xylose. Deze verbeteringen mogen ethanol ophopen tot meer dan 40 g / l en de piek dagen eerder (figuur 7) dan werd waargenomen voor de ouder NRRL Y-7124. Hogere totale produktiviteit ethanol (tabel 4) werd bereikt bij 1,5 tot 5 keeris dat van de stam (Tabel 4), afhankelijk van geëvolueerde stam.

Figuur 1:. Scheffersomyces stipitis aanpassing stroomschema De getoonde diagram geeft de volgorde van de toegepaste tijdens het aanpassingsproces spanningen en de punten van het herstel van superieure isolaten (nummers tussen haakjes). Zie ook tabel 3 isolaat sleutel als referentie voor stam identiteiten. Om tijd oriëntatie bieden, de nummers in het rood geven het aantal dagen in elke fase van de aanpassing. Voor de seriële overdracht fasen in AFEX CSH en xylose-rijke PSGHL, elke dag van de aanpassing vertegenwoordigt ongeveer 2-4 generaties. Voor de continue kweek fase (205 dagen in totaal), de verdunning D was variabel bij ~ 0-0,1 uur ^-1 in 125 d bedrijf met pH-aangedreven voeding. In de volgende80 dagen operatie bij een continue stroom met D op 0,012 ^u-1, die een generatietijd (ln 2) / (D) van 58 uur of 1 generatie per 2,4 dagen bij steady state. Vervolgens wordt een monster van de aangepaste populatie van 205 dagen continue kweek werd gemutageniseerd met UV-licht en geënt in een continue kweek uitgevoerd met D op 0,012 ^h-1. (Overgenomen van Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2:. Verbeterde batch fermentatie van 6% glucan AFEX CSH Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 ouderstam fermentatie van 6% glucan AFEX CSH (A) vergeleken met aangepaste Colony 5 fermentatie van 6% glucan AFEX voorbehandelde maïsstro hydrolyzate (B). Symbolen wijzen biomassa (rood vierkant), glucose (zwarte cirkel met een stippellijn), xylose (blauwe cirkel met doorgetrokken lijn), ethanol (groene driehoek) en xylitol (paarse diamant). (Overgenomen van Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Verminderde diauxic achterstand in gedefinieerde medium met gemengde suikers Fermentation prestaties worden vergeleken in ODM met 66 g / l glucose en 87 g / L xylose voor ouder stam S.. stipitis NRRL Y-7124 (A), de AFEX CSH aangepast populatie afgeleid van Y-7124 (B) eencellige Colony 1 geïsoleerd uit de aangepaste S. stipitis populatie (C), enkele cel Colony 5 geïsoleerd van de aangepaste populatie (D). Symbolen wijzen biomassa (rood vierkant), glucose (zwarte cirkel met een stippellijn), xylose (blauwe cirkel met doorgetrokken lijn), ethanol (groene driehoek), xylitol (paars diamant), en adonitol (goud diamant met zwarte rand). (Overgenomen van Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Ethanol resistente derivaten van Colony 5. hydrolysaat tolerant Colony 5 werd verder ontwikkeld door continue kweek selectie op ODM bevattende xylose als enige koolstofbron en hoog ethanolgehalte. Twee afgeleide glycerol voorraad populatie vroeg verkregen in het selectieproces (2A.1.53R, oranje driehoek en stippellijn) en eenN a UV-bestraling van continue cultuur inocula (2A.1.30R.2, paarse cirkel en stippellijn) worden getoond in vergelijking met de NRRL Y-7124 ouder stam (groene cirkel met doorgetrokken lijn) en AFEX CSH tolerant Colony 5 (zwarte driehoek met ononderbroken lijn). Xylose opname door dichte populaties van glucosegekweekte gist (A ₆₂₀ = 50) in ODM met 40 g / l ethanol bleken allemaal aangepaste stammen overtrof de onaangepaste ouder in het vermogen om xylose metabolisme te induceren. (Overgenomen van Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5:. Ratio van prestatieverbetering van tolerante isolaat in vergelijking met ouder De prestaties van superieure tolerante isolaten samengevat ten opzichte vancontrole ouderstam NRRL Y-7124 voor elke formulering van PSGHL (A, B). Prestaties werden beoordeeld in termen van xylose opnamesnelheid (blauwe balken vertegenwoordigen verhoudingen van isolaat tot ouder) en ethanol opbrengst per suiker geleverd (groene balken vertegenwoordigen verhoudingen van isolaat tot ouder). (Overgenomen van Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Isoleer ranking op basis van RPI. Het begrip relatieve performance index (RPI) werd toegepast op de resultaten van het secundaire screening om deze site 33 isolaten binnen elke soort hydrolysaat op basis van xylose opnamesnelheid en ethanol opbrengst per suiker toegevoerd. (A) De relatieve liepkoning van een bepaald isolaat afhankelijk van het hydrolysaat type (p <0,001): SGH-N1 (blauwe balken), SGH-N2 (rode balken) en AFEX CSH (groene balken). (B) De totale RPI berekend over alle hydrolysaat types (licht blauwe balken) aangegeven superieure stammen met meest robuuste prestaties in de verschillende hydrolysaat omstandigheden. (Overgenomen van Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Vergelijkende SGH fermentaties van superieure aangepaste isolaten van S. stipitis. Superior aangepaste isolaten en hun ouderstam NRRL Y-7124 vergeleken fermenteren enzymatische hydrolysaten verdund zuur voorbehandelde switchgrass (20% vaste stof belading) bij 25 ° C en initiële pH 6,2 bij lage initiële celdichtheid. Tijdsverloop van biomassa (rode vierkanten), glucose (zwarte cirkels en stippellijn), xylose (blauwe cirkels en vaste lijn) en ethanol (groene driehoeken) getoond. Fout balken geven het bereik van de gemiddelde waarde gemarkeerd met symbolen. (Overgenomen van Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1:. Composities van hydrolysaten worden gebruikt in teelten (. Overgenomen van Slininger et al ¹⁸⁾ Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Optimaal gedefinieerde medium voor Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 ⁷TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3:. Samenvatting van superieure tolerant Scheffersomyces stipitis stammen voor vergisting van hydrolysaten van plantaardige biomassa (. Overgenomen van Slininger et al ¹⁸⁾ Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Vergelijkende kinetiek van isolaten op switchgrass hydrolysaat SGH-N2 geënt in aanvankelijke A ₆₂₀ = 8,4 ± 2,5 Prijzen zijn genormaliseerd tarieven per eenheid absorptie tijdens glucose of xylose consumptie.. (Overgenomen van Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik hier om deze te downloaden table.

Discussion

Verschillende stappen waren cruciaal voor het succes van het evolutieproces. Ten eerste is het belangrijk passende selectiedrukken kiezen om de populatie evolutie drijven naar de gewenste fenotypen die nodig zijn voor een succesvolle toepassing. De volgende selectieve spanningen werden gekozen voor S. stipitis ontwikkeling en toegepast op geschikte tijdstippen verrijking leidraad voor de gewenste fenotypen: toenemende sterkte van 12% glucan AFEX CSH (die de groei en fermentatie van verschillende suikers dwingt in aanwezigheid van azijnzuur en lage furan aldehyden en andere remmers); xylose gevoed continu culturen met toenemende ethanol concentratie (die xylose enzyminductie dwingt diauxic lag te verminderen); en toenemende sterkte van 20% vastestofbelading PSGHL (die de groei en fermentatie van xylose dwingt in de aanwezigheid van hoge azijnzuur, furanen en andere remmers). Ten tweede is het belangrijk om de veranderende gist populaties behouden bevroren glycerol stocks monsters bevolking het verrijkingsproces vordert. Dergelijke snapshots van de bevolking kan worden opgeslagen periodieke functioneel testen evolutie vooruitgang documenteren en daaropvolgende isolatie mogelijk te maken wanneer gewenst of evolutie processen herstarten na een onderbreking. Een derde belangrijke stap in de ontwikkeling procedure was uitzonderlijk isolaten herstellen door verrijken selectie cultuur populaties of glycerol opgeslagen populaties op een geschikte selectieve media (zoals agar of microplaten met een spanningsgradiënt die een reeks hydrolysaat en / of ethanol concentraties) . Dan overlevende kolonies groeien onder de meest stressvolle voorwaarde kan worden geplukt om later te bewaren voor de karakterisering. Deze drie basisstappen kunnen worden herhaald om elke extra gewenste fenotype selectiedruk uitoefenen, of, als alternatief, vele problemen in één cyclus indien nodig. Wanneer de inheemse bevolking ouder gist wordt blootgesteld aan de verschillende spanningen is de genetische diversiteit verwacht th voortvloeien ruwe natuurlijke of geïnduceerde mutaties, en bleef de blootstelling zal natuurlijke selectie te verrijken voor de personen met de meest gunstige mutaties ondersteunen concurrerende overleven. Verwacht wordt dat het geselecteerde fenotype zal optreden als gevolg van meervoudige genetische mutaties. In het bovenstaande protocol, kunnen mutaties worden geïnduceerd gedurende UV behandeling of potentieel werden blootgesteld gist hydrolysaten. Hydrolysaten is bekend dat drie klassen van verbindingen bevatten schadelijk microorganismen. Carbonzuren, aldehyden en fenolen ²² reactieve aldehyden zoals furfural en 5-hydroxymethylfurfural, kunnen cellen beschadigen en een hoogte van reactieve zuurstofsoorten (ROS), kenmerkend in gegenereerde mitochondria. ROS zijn welbekend DNA mutaties veroorzaken in eukaryote cellen. ^23,24 De fenolen aanwezig in hydrolysaten, maar niet eerder bekend genotoxisch te zijn, kunnen bevorderen en de synergie mutagene effecten van aldehyden en mutagene ROS. ²⁵

jove_content "> De stapsgewijze strategie geleidelijk moeilijke omstandigheden wordt verwacht dat geëvolueerd stammen met een reeks fenotype verbeteringen bouwen, zowel doelgerichte en ook niet-doelwit. Het is mogelijk dat bepaalde niet-gerichte fenotypen ontstaan ​​die ongewenste of instabiel zijn. Teneinde naar de meest functioneren en robuuste stammen vast te leggen, een bijkomende belangrijke stap die moet worden genomen is het evalueren en vergelijk geselecteerde isolaten voor commercieel relevante eigenschappen, voor het bereiken van zowel gerichte en niet-gerichte fenotypes. om dit te doen, isoleren prestaties moeten worden vergeleken diverse toepassingsgerichte stresscondities zoals in hydrolysaten met verschillende remmer uitdagingen en voedingsstoffen formuleringen, waardoor selectie van de beste algehele stammen die stabiel en robuust brede industriële lignocellulose substraat variatie zijn. Bovendien, een stam stabiliteit uitdaging worden in de opgenomen scherm dat werd in het voorbeeld gedaan door het opnemen van preculturing stappen betring initiële groei van gist op twee niet-selectieve media, YM agar voor meerdere generaties, gevolgd door de synthetische ODM met 50 g / L xylose voor een extra 6-7 generaties, het geven van gelegenheid tot destabilisatie van de gewenste cultuur eigenschappen voorafgaand aan blootstelling aan de uitdaging van de prestaties in hydrolysaat. Gebaseerd op belangrijke prestatiekenmerken, zoals ethanol opbrengst en xylose opnamesnelheid wordt isolaten vervolgens gerangschikt in elke verschillende stressconditie, zoals elk hydrolysaat omgeving getest, die verschillen van het isolaat is verrijkt kweekmedium zijn. De dimensieloze RPI kan worden gebruikt om de gemiddelde totale relatieve prestaties en rangschikking van isolaten vergeleken berekenen. Een dimensieloze factor is passend aan de relatieve performance in verschillende soorten van hydrolysaten en op basis van verschillende prestaties assessments, zoals opbrengsten versus weerspiegelen. Deze ranking procedure identificeert stammen die presteren constant goed over brede variaties in de groei-omstandigheden en hydrolyzates en geneigd robuust en genetisch stabiel zijn.

Verscheidene iteraties en modificaties van deze basisstappen nodig zijn om de ontwikkeling van elke microbiële stam die in staat specifieke of unieke prestatiekenmerken op lignocellulose hydrolysaten of andere substraten van belang huisvesten. In de S. stipitis voorbeeld, is het belangrijk op te merken dat supplementatie van nutriënten, waaronder goedkope commerciële bronnen, met hydrolysaten bereid bij hoge vastestofbelading is essentieel voor het bepalen van het dynamisch bereik van isolaat voorstellingen voor verbeterde statistische scheiding tijdens screening. Het belang van nutriënten succesvolle fermentatie geconcentreerd remmende hydrolysaten Ook hiervoor vermeld en zou te wijten zijn aan een verhoogde behoefte aan aminozuren en andere voedingsstoffen die nodig zijn voor celonderhoud, redox evenwicht en herstel als gevolg van dergelijke stressomstandigheden zijn, vooral tijdens xylose gebruik. ^9,26,27Bovendien, als voedingsstoffen zijn te dun of te overvloedig, verschillen in isolaat voorstellingen misschien moeilijk om statistisch te detecteren als gevolg van alle isolaten doen buitengewoon slecht, of alles doen buitengewoon goed, respectievelijk. Isolaten staat zijn goed onder uiteenlopende omstandigheden verwacht betrouwbaar en robuust variaties in industriële omstandigheden.

De belangrijkste beperking van dit protocol is dat adaptieve evolutie en screening zeer letterlijk Uitkomstenmanagement, dat "een krijgt wat men verrijkt en schermen voor". Daarom moet de verrijking en het scherm omstandigheden worden ontworpen voor het amplificeren en identificeren van individuen, respectievelijk, de gewenste veranderingen in fenotype, terwijl nog steeds wenselijk reeds bestaande eigenschappen behouden. Evolutie van invloed kunnen zijn niet-geselecteerd op eigenschappen die essentieel zijn voor de industriële prestaties (bijv groeifactor eisen) zijn. Daarom populatie verrijking vooruitgang van een eigenschap moet periodiek monitorened andere kenmerken als methode van het oplossen van problemen ongewenste veranderingen. Bijvoorbeeld, een van de unieke eigenschappen van S. stipitis is zijn native capaciteit om op te groeien en fermenteren xylose. Alle verrijking en screening substraten opgenomen xylose als enige of belangrijkste koolstofbron bijdragende in aanwezigheid van remmers. Bijgevolg is een gemeenschappelijk kenmerk van alle verrijking culturen in dit voorbeeld was dat ze direct geselecteerd snellere xylose gebruikmaking stammen, waarvan de bevolking steeds meer verrijkt in serie of continue kweek omdat ze beter concurrenten. Als beoogd resultaat, verbeterde stammen waren allemaal in staat om snellere xylose opname, maar verbeteringen aan ethanol opbrengst was veel minder dramatisch dan verbeteringen in de xylose opnamesnelheid. De laatste trend was waarschijnlijk zich sinds ethanolopbrengst door de ouderstam relatief hoog was ongeveer 0,3 g / g, of 60% van de theoretische (0,51 g / g), zoals celgroei werd stationair hydrolysaten, waardoor minder ruimte voorverbetering. In culturen, zou een hogere ethanol opbrengsten eventueel worden geselecteerd tegen omdat ethanol is een groei-remmer, die toezicht op de prestaties van de geëvolueerde bevolking noodzakelijk voor deze eigenschap. Ethanol concentraties beneden het niveau van groeiremming gehouden zouden geneigd zijn deze neutralisatie een selectiefactor. S. stipitis NRRL Y-7124, 40 g / l ethanol helften specifieke groeisnelheid terwijl 64 g / L voorkomt de groei geheel. ²⁸ In ethanol uitgedaagd continu culturen gevoed xylose, beluchting werd laag gehouden en verdunning werden ook laag gehouden genoeg met ruime xylose aanwezig foster fermentatie in plaats van de ademhaling van ethanol en verrijking te voorkomen dat voor een ongewenste ethanol gebruik eigendom. Bovendien werden voedingssupplementen de hydrolysaten uitvoering gebruikt schermen zorgvuldig ontworpen teneinde te voorkomen dat het selecteren op stammen nodig een dure rijke voedingsstoffen zoals gistextract. Supplementen opgenomen altijd de laagste kosten commerciële bronnen beschike, zoals meel en ureum soja, hoewel rijker componenten zoals in YM samen kweken werden toegepast voor vergelijkende testen, zoals in de formuleringen van 60% en 75% PSGHL die normaliter afbreken stikstof. De ODM synthetisch medium, gebruikt in voorkweek en performance cultuur schermen, werd oorspronkelijk ontworpen voor optimale prestaties van de stam S. stipitis NRRL Y-7124 ⁷ overeenkomstig het kweekmedium optimalisatieroutine beschreven door Traders Protein ²⁰ waarin bepaalde stoffen, waaronder vitaminen, mineralen, purinen en pyrimidinen en aminozuur bronnen nutriënten compatibel voorzien rendabele industriële opschaling behulp beveelt commerciële bronnen. Verder adviseren bij het ontwerpen relevante stammen, is het ontwerp van de verrijking en het scherm voorwaarden relevant mogelijk de verwachte industrieel proces omstandigheden.

Kosten concurrerend hernieuwbare ethanol is al lang nagestreefd om reduce afhankelijkheid van fossiele brandstoffen. Om het vermogen van S. te verbeteren stipitis NRRL Y-7124 te tolereren, te groeien en fermenteren remmende hydrolysaten van lignocellulose, hebben verschillende onderzoekers herhaalde kweken in de xylose-rijke drank als gevolg van verdund zuur-voorbehandeling van lignocellulose biomassa. ^13,14,16,17 gebruikt Over-kalken te ontgiften remmers was nog steeds nodig is om een redelijk niveau van de prestaties van de vroege aangepaste stammen op hardhout en tarwestro voorbehandeling likeuren mogelijk te maken. hebben ^13,14 Multiple herhaalde ronden van UV-mutagenese en genoom schuifelende toegepast op derivaten van S. te ontwikkelen stipitis NRRL Y-7124 met verbeterde inhibitortolerantie en groei in hardhout verbruikte sulfietvloeistof (HWSSL). ^16,17 echter ethanol concentraties die door deze stammen HWSSL stonden onder 10 g / l na 6-7 dagen. Met de getoonde en beschreven hier technieken ontwikkeld nieuwe stammen van S. stipitis NRRL Y-7124 zijn ontwikkeld om te voldoen phenotype doelen die nodig is voor economisch commercieel gebruik: vergisting van hydrolysaten bij een pH van 5-6, zonder voorafgaande ontgifting maatregelen, zoals over-kalken, wat leidt tot dure afvalverwijdering; sterk verminderde groei en diauxic vertragingen; ethanol voorkomens hoog genoeg voor commerciële destillatie (> 40 g / l ethanol); snellere groei en productiviteit ethanol dan eerder gerapporteerd voor inheemse giststammen fermenteren undetoxified hydrolysaten; en de prestaties in diverse hydrolysaten bij hoge vaste belasting, met inbegrip van de juiste wijze soja stikstof aangevuld SGH (die anders is stikstof slecht) en niet aangevulde AFEX CSH. De verbeterde stammen ontwikkeld met behulp van de nieuwe agressieve aanpak van evolutie als belichaamd in de belangrijkste stappen die hierboven zijn samengevat, wordt verwacht dat de economie van de productie van ethanol uit agrarische biomassa profiteren door het verlagen van de operationele kosten, kapitaalkosten, en energie en water ingangen. Dit is de eerste stam evolutieplan gerapporteerd aangepaste stammen van S. opleveren stipitis het aantonen van economisch realiseerbare productie van ethanol op undetoxified hydrolysaten.

De nieuwe stammen van S. stipitis voortvloeien uit elke fase van het evolutieproces (figuur 1) zijn kandidaten voor toekomstige studies om de genetische veranderingen geassocieerd met specifieke toegepaste selectiedrukken en de onderliggende mechanismen hoofdkenmerken van verbeterde hydrolysaat fermentatie, zoals inhibitortolerantie verkleinde diauxic lag bepalen. Dergelijke waardevolle nieuwe kennis zal de techniek van de volgende generatie gist biokatalysatoren en processen steun voor de omzetting van lignocellulose tot biobrandstoffen en andere producten. Als nieuwe stammen zijn afgeleid, zal het waarschijnlijk gunstig zijn om weer langs het derivaat bevolking via een stam evolutie protocol vergelijkbaar met die beschreven teneinde de meest bruikbare transformanten voor commercieel gebruik in hydrolysaten selecteren. Op dezelfde manier als nieuwe microbiële stammen worden ontdekt met de potentie om een ​​maak mijnriad nuttige nieuwe producten uit hernieuwbare biomassa zou het evolutieproces verder worden toegepast om spanning robuustheid en productiviteit hydrolysaten te verbeteren, het mogelijk maakt nieuwe biokatalytische processen en producten worden gemaakt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com