Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Teknikker for utviklingen av Robust Pentose-fermen gjær for biokonversjon av lignocellulose til Etanol

Published: October 24, 2016 doi: 10.3791/54227
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Bioenergy Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 2Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 3Chemical Engineering and Material Science, Great Lakes Bioenergy Center, Michigan State University

Summary

Adaptive evolusjon og isoleringsteknikker er beskrevet og demonstrert å gi derivater av Scheffersomyces stipitis stamme NRRL Y-7124, som er i stand til hurtig å konsumere heksose- og pentose- blandede sukkerarter i enzym-saccharified undetoxified hydrolysater og for å akkumulere over 40 g / l etanol.

Introduction

Anslagsvis årlig 1,3 milliarder tørre tonn lignocellulose biomasse kunne støtte etanol produksjon og tillate USA å redusere sin oljeforbruket med 30%. 1 Selv om anlegget biomasse hydrolyse gir sukker blandinger rike på glukose og xylose, er gjæring hemmere generert av kjemisk forbehandling nødvendig å bryte ned hemicellulose og utsette cellulose for enzymatisk angrep. Eddiksyre, furfural, og hydroxymethylfurfural (HMF) er antatt å være viktige komponenter blant mange hemmere som dannes under forbehandling. For å kunne bevege det lignocelluloseholdige etanol industrien fremover, til forskning og fremgangsmåter tillate utviklingen av gjærstammer som er i stand til å overleve og effektivt virker til å bruke både heksose- og pentosesukker i nærvær av slike hemmende forbindelser er nødvendig. En vesentlig ytterligere svakhet ved tradisjonelle industrielle gjærstammer, så som Saccharomyces cerevisiae, er den manglende evne til effektivt å ferment den xylose tilgjengelige i hydrolysater av plantebiomasse.

Pichia stipitis type stamme NRRL Y-7124 (CBS 5773), nylig omdøpt Scheffersomyces stipitis, er opprinnelig pentose fermen gjær som er godt kjent for å gjære xylose til etanol. 2,3 Utviklingen av stammen NRRL Y-7124 ble forfulgt her fordi det er dokumentert å har størst potensial av innfødte gjærstammer for å samle økonomisk utvinnbare etanol stiger 40 g / L med litt xylitol biprodukt. 4,5,6 i optimal media, S. stipitis stamme NRRL Y-7124 produserer 70 g / l etanol i 40 timer (1,75 g / l / time) ved et utbytte på 0,41 ± 0,06 g / g i kulturer med høy celletetthet (6 g / l celler). 7,8 Motstand til gjæring inhibitorer etanol, furfural, og HMF er også blitt rapportert, 9 og S. stipitis har vært rangert blant de mest lovende innfødte pentose--fermen gjær tilgjengelig for kommersiell skala etanol blusern fra lignocellulose. 10 Vårt mål var å bruke ulike undetoxified lignocellulose hydrolysater og etanol seleksjonspress for å tvinge utviklingen mot en mer robust derivat av stammen NRRL Y-7124 egnet for industrielle applikasjoner. Key blant forbedrede funksjoner søkte var raskere sukker opptak priser i konsentrerte hydrolysater, redusert diauxy for mer effektiv blandet sukker utnyttelse og høyere toleranser etanol og hemmere. Anvendelsen av S. stipitis å undetoxified hydrolysater var en viktig fokus for forskning for å eliminere den ekstra driftskostnad forbundet med hydrolysat avgiftning prosesser, for eksempel overliming.

To industrielt lovende hydrolysater ble brukt for å tvinge evolusjon. Enzym saccharified ammoniakk fiber ekspansjon-forbehandlet mais Stover hydrolysat (AFEX CSH) og fortynne syre-forbehandlet switch hydrolysat brennevin (PSGHL) 11,12 AFEX forbehandling teknologi blir utviklet for åminimalisere produksjon av gjærings inhibitorer, mens fortynnet syre forbehandling representerer den aktuelle laveste kostnaden teknologi som oftest praktisert å utsette celluloseholdig biomasse for enzymatisk forsukring. PSGHL kan skilles fra cellulosen som gjenstår etter forbehandlingen, og er karakteristisk rik på xylose fra den hydrolyserte hemicellulosen, men lav i glukose. AFEX CSH og PSGHL komposisjoner skiller seg fra hverandre i viktige aspekter som ble utnyttet til å styre utviklingen prosessen. AFEX CSH er lavere i furan aldehyder og eddiksyre-inhibitorer, men høyere i aminosyrer og ammoniakk, nitrogenkilder sammenlignet med PSGHL (tabell 1). PSGHL presenterer den ekstra utfordringen med xylose å være den dominerende sukker tilgjengelig. Således PSGHL er passende for spesifikt å anrike for forbedret utnyttelse xylose i hydrolysater, en svakhet hindrer kommersiell bruk av tilgjengelig gjær. Selv blant innfødte pentose- fermen gjær, avhengigheten av den suboptimale sukker Xylose for å understøtte cellevekst og reparasjon blir enda mer utfordrende i hydrolysater på grunn av en rekke årsaker:. mangel på næringsstoffer, inhibitorer forårsaker omfattende skade på celle strukturell integritet, og forstyrrelser i stoffskifte på grunn av redoks-ubalanse 9 Nitrogen tilskudd, spesielt i form av aminosyrer, kan representere en betydelig driftskostnad for fermenteringer. Virkningen av nitrogen tilskudd på isolat screening og vurdering ble utforsket med Switch hydrolysater.

Forbedret personer ble beriket i et utviklende befolkning bruker flere seleksjonstrykk avhengige av naturlige genetiske mangfoldet i S. stipitis befolkning og mutasjoner indusert ved eksponering til to ulike hydrolysater, etanol eller UV-stråling. Seleksjonstrykk ble påført i parallell og i serie for å utforske utviklingen fremdriften av S. stipitis retning av de ønskede derivater i stand til å vokse og gjære effektivt i hydrolysater(Figur 1). Den repeterende dyrkning av funksjonelle populasjoner i stadig mer krevende hydrolysater ble oppnådd på mikroplater ved anvendelse av en fortynning serie av enten 12% glukan AFEX CSH eller annet PGSHL fremstilt ved 20% faste stoffer. Anvendelsen av etanol-utfordret vekst på xylose i kontinuerlig kultur ytterligere forbedret Afex CSH tilpasset populasjoner av berikende for fenotyper viser mindre følsomhet for etanol undertrykkelse av xylose utnyttelse. Sistnevnte funksjon ble nylig vist problematisk å pentose utnyttelse av stammen NRRL Y-7124 følgende glukose gjæring. 8 Enrichment på PSGHL ble neste utforsket å utvide hydrolysat funksjonalitet.

Antatte forbedrede derivater av S. stipitis NRRL Y-7124 ble isolert fra hver fase av utviklingen prosessen ved hjelp av målrettet anrikning i henhold til stressbetingelser og fortynning plating for å plukke kolonier fra de mest utbredte populasjonene. dimensjonsløs relativeprestasjonsindekser (RPIs) ble brukt til å rangere stammer basert på generell ytelse, hvor kinetisk atferd ble evaluert på de ulike hydrolysat typer og næringstilskudd brukt. Selv om suksesser av ulike tilpasnings prosedyrer for å forbedre funksjonaliteten til S. stipitis i lignocellulose-hydrolysater har tidligere blitt dokumentert,-stammer som viser økonomisk etanolproduksjon på undetoxified hydrolysater har ikke tidligere blitt rapportert. 13-17 Ved å bruke evolution fremgangsmåter som skal visualiseres i mer detalj her, Slininger et al. 18 utviklet belastninger som er betydelig forbedret i løpet moderstammen NRRL Y-7124 og er i stand til å produsere> 40 g / l etanol i AFEX CSH og enzym saccharified switch hydrolysat (SGH) hensiktsmessig suppleres med nitrogenkilder. Disse nye stammer er av fremtidig interesse for å utvikle lignocellulose til etanol industrien og som fag av flere genomikk studier bygningpå de av tidligere sekvensert stamme NRRL Y-11545. 19 En genomstudie av topp stammer produsert under ulike faser av utviklingen diagramed i figur 1 vil belyse historien til genetiske endringer som oppstod under utvikling som et forspill til ytterligere belastning forbedring forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered Starte Materialer og utstyr for analyser

  1. Forbered hydrolysater ved hjelp av 18 til 20% opprinnelig biomasse tørrvekt i forbehandlingen reaksjon for bruk i utviklingen, isolasjon og rangering prosedyrer. Se Slininger et al. 2015 18 for detaljerte metoder for å forberede AFEX CSH, PSGHL, og SGH med nitrogentilskudd N1 eller N2 brukes i evolusjon, isolasjon eller rangering. Se tabell 1 for sammensetningen av hvert hydrolysat type.
    MERK: Nitrogen festningsverkene SGH ble utpekt som SGH-N1 eller SGH-N2 definert som følger: SGH-N1 = SGH befestet til 42: 1 molar karbon til nitrogen ratio (C: N) med nitrogenkilder inkludert urea, vitamin-fri amino syrer fra kasein, D, L-tryptophan, L-cystein, og vitaminer fra definerte kilder (slik at ~ 15% av molar nitrogen N er primær amino- nitrogen (PAN) og ~ 85% av N er fra urinstoff); SGH-N2 = SGH befestet til 37: 1 C: N med urea og soyamel som den laveste kostnaden kommersielle kilden of aminosyrer og vitaminer, som gir ~ 12% av N fra PAN og 88% som urea.
  2. Erverve en lyofilisert kultur av opphavsstammen, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) fra ARS Culture Collection (National Center for Agricultural Utnyttelse Research, Peoria, Illinois), og forberede glyserol stamkulturer som anvist. Opprettholde stamkulturer av moder gjær og dets derivater i 10% glycerol ved -80 ° C.
    1. Streak glyserol aksjer til gjær malt pepton druesukker (YM) agar plater (3 g / l gjærekstrakt, 3 g / l maltekstrakt, 5 g / l pepton, 10 g / L dekstrose, 20 g / L agar) og inkuberes 48- 72 timer ved 25 ° C. 8 utviklede plater kan lagres i opptil en uke ved 4 ° C før bruk som flytende forkultur inokula.
  3. Forbered Optimal Definert Medium (ODM), et syntetisk medium kompatibel med industrielle formulering prosedyrer 20 som tidligere ble utviklet for optimal konvertering av xylose til etanol av morselskapet strain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. 7 Bruk definert medium i alle forkulturer og kulturer for fermentering ytelse bioassay og også for etanol utfordret, xylose-matet kontinuerlig kultur evolusjon. ODM sammensetning er oppført som referanse i Tabell 2.
  4. Som beskrevet tidligere, 18 analysere celle biomasse ved hjelp av en cuvette- eller mikro-platelese spektrofotometer, som hensiktsmessig, for å måle kultur absorbans ved 620 nm (A 620). Kvantitere sukkere, etanol, furfural, hydroxymethylfurfural (HMF), og eddiksyre i kulturprøver ved hjelp av høy ytelse væskekromatografi (HPLC) eller robot enzymatisk bestemmelse av glukose og xylose for høyere gjennomstrømning.

2. Berik Robuste Derivater under Serial Transfer på AFEX CSH

  1. Vaksinere en forkultur av stammen NRRL Y-7124. Overfør cellene fra YM-agar til 75 ml ODM + 150 g / l xylose for å opprettholde evnen til å vokse under osmotic stress. Inkuber forkulturer i 125 ml kolber lukket med silisium svamp plugger 24 timer ved 25 ° C med risting (150 rpm, en "bane).
  2. Tine frosne prøver av 6-12% glukan AFEX CSH i kaldt vann for bruk. Juster pH-verdien til 5 hvis det er nødvendig, og filtersteriliser før fremstilling av en fortynningsserie i 96-brønners mikroplater.
  3. Fyll mikro med 50 ul per brønn og 8 brønner per hydrolysat fortynning, deretter vaksinere med noen få mikroliter forkultur per brønn for å gi en innledende absorbans (620 nm) A 620 ≥0.1. Inkuber platene statisk 24-48 timer ved 25 ° C i en plastboks med et vått papirhåndkle for fuktighet.
  4. Ved å bruke den mest konsentrerte hydrolysat fortynning som synlig vokste til A 620> 1, overføring 1-5 ul til hver brønn av en ny hydrolysat fortynning serie for å oppnå innledende A 620 ≥0.1.
  5. Overvåke vekstkultur A 620 i mikroplater med et spektrofotometer. En uinokulert fortynning serien serves som en kontroll og blank. Plate lokk er igjen på under overvåking for å hindre forurensning, og målingene justeres tilsvarende.
  6. Forbered glyserol aksjer av tilpasnings kulturer regelmessig for etterfølgende isolering av forbedrede stammer eller til bruk i reinoculating den pågå hydrolysat fortynning serien. For å fremstille aksjer, basseng fire brønner (200 pl) av den største hydrolysat konsentrasjonen kolonisert. Blande 1: 1 med 20% steril glycerol i cryovials, for å fryse celler i 10% glycerol ved -80 ° C.
  7. Gjenta trinn 02.03 til 02.06 fram til vekst i 12% glukan AFEX CSH er konsekvent synlig på 24 timer.

3. Koble enkelt celle Tolerant Derivater etter Enrichment på AFEX CSH

  1. Stripe valgt glyserol bestander av tilpasnings kulturer til YM-agar, og bruke striper for å inokulere 50 ul 3% eller 6% glukan AFEX CSH (pH 5) i hver av de tre mikroplatebrønner (initial A 620 ~ 0,1). Inkuber mikroplater 24 hr som i trinn 2.3. pool replicate kolonis brønner på høyeste hydrolysat styrke med sterk vekst, og fortynning plate til YM eller 6% glukan AFEX CSH agar. Fremstille den sistnevnte som en 1: 1 blanding av filtersterilisert 12% glukan AFEX CSH med varm autoklavert 30 g / l agar-løsning.
  2. Plukk 5 enkeltkolonier fra den høyeste fortynningen plate som viser vekst etter 24-48 timers inkubasjon ved 25 ° C for å fryse som glyserol lager kulturer. Strek hver koloni til en YM plate. Inkuber 24 hr. Med en steril løkke, overføre en utviklet rekke av celler til et lite volum av 10% glycerol, blandes for å suspendere cellene, og distribuere til 2-3 cryovials for frysing ved -80 ° C.

4. evaluere resultatene av AFEX CSH Tolerant Derivater Sammenlignet Parent

  1. Test Isolerer i Enkle 6% Glucan AFEX CSH Batch kulturer.
    1. Overfør cellene fra 48 hr plater smykket fra glyserol aksjer til pH 7 kaliumfosfatbuffer (0,4 mm) for å forberede cellesuspensjoner med A 620 = 10. Bruk 1 mLhver suspensjon til vaksinere hver av fire brønner på 50 ul 3% glukan hydrolysat førstegang A 620 = 0,2. Inkuber mikroplater 24 hr som i trinn 2.3. Forbered 3% glukan AFEX CSH ved pH 5 ved å fortynne 12% glukan AFEX CSH 1: 3 med sterilt vann.
    2. Transfer to 24 timers mikroplatebrønner for å inokulere 25 ml forkulturer av pH 5 12% glukan AFEX CSH anvendt ved 50% av full styrke. Inkuber forkulturer i 50 ml kolber med silisiumsvamp lukkeanordninger i 24 timer ved 25 ° C, ~ 150 rpm (en "bane) forberede halv styrke 12% glukan AFEX CSH ved fortynning av hydrolysatet. 1: 1 med sterilt vann.
    3. Bruk halv styrke hydrolysat forkulturer å vaksinere lignende 25 ml vekstkulturer til innledende A 620 = 0,1. Inkuber vekstkulturer som ovenfor (4.1.2) og smake daglig (0,2 ml). Monitor ansamlinger av biomasse (A 620) og konsentrasjoner av sukker og gjæringsprodukter (HPLC).
  2. Alternativt repitch (dvs. høsting og reuse) bestander av 6% glukan AFEX CSH-vokst gjær for testing i 8% glukan hydrolysat batch kulturer, som beskrevet tidligere. 18
  3. Alternativt ytterligere test bestander av repitched 6% glukan Afex CSH kulturer etter fôring med 12% glukan hydrolysat, som beskrevet tidligere. 18
  4. Test diauxic lag av isolater i batch kulturer av ODM med blandede sukker.
    1. Vaksinere forkulturer av 75 ml ODM med 150 g / l xylose i 125 ml flasker med silikon svamp nedleggelser av løkke overføring fra YM glyserol striper. Inkuber 24 hr som i trinn 2.1.
    2. Bruk forkulturer å inokulere tilsvarende 75 ml testkulturene med ODM inneholdende 75 g / l glukose og 75 g / l xylose ved pH 6,5. Riste-kolber ved 25 ° C, 150 rpm. Smak daglig.
    3. Alternativt kan teste virkningen av 0-15 g / l eddiksyre på diauxy under fermentering av glukose og xylose ved anvendelse av en lignende protokoll, bortsett fra start-pH er innstilt på 6,0 ± 0,2 i testkulturene for å opprettholde pH 6-7 during eddiksyre forbruk, som tidligere beskrevet. 18

5. Påfør Kontinuerlig Kultur skal velge for Etanol-utfordret Xylose Utnyttelse

  1. Forbered ODM som den kontinuerlige kulturnæringsmedium med 60-100 g / l xylose, 20-50 g / l etanol ved pH 6,3 ± 0,2. Velge kombinasjoner av xylose og etanol for å simulere den delvise gjæring av 150 g / l xylose, forutsatt at en potensiell utbytte på ~ 0,5 g etanol / g xylose, og for å få plass til potensialet for 50-70 g / l etanol for å forekomme. 8
  2. For å fremstille den kontinuerlige kultur inokulum, overføre en representativ AFEX CSH-tolerant koloni (analogt til Colony 5 i eksempel figur 1) ved å sløyfe fra en 48 timers YM-plate for å 75 ml etanol-fri ODM (100 g / l xylose, i dette tilfellet) i 125 ml kolber. Inkuber ved 25 ° C, 150 rpm (en "bane) i 24 timer. Velg forkulturen ODM xylosekonsentrasjonen å tilpasse det til den opprinnelige kontinuerlige kultur holde volum.
  3. Inokulere en kontinuerlig kultur som holder volumet av ODM ved pH 6,3 ± 0,2 med 100 g / l xylose + 20 g / l etanol med ~ 5-10 ml av en forkultur konsentrat av en AFEX CSH-tolerant isolat (analogt til Colony 5, Figur 1 ) for å oppnå 100 ml ved innledende A 620 ~ 0,5. Opprett kulturen holdevolumet (V R), ved 25 ° C i en med kappe 100 ml spinnerflaske ble omrørt ved 200 rpm og utstyrt med steriliser pH-elektrode, pH-kontroller og temperaturkontrollert sirkulerende vannbad.
  4. I utgangspunktet, ettersom cellevekst vil være for treg på grunn av etanol eksponering, sette opp næringsmedium for å dosere ved hjelp av en pH-aktivert pumpe. Angi at pumpen for å mate pH 6,3 ODM med 100 g / l xylose og 50 g / l etanol når kulturen fermenteringen synker pH-verdien til 5,4, og dermed stoppe ytterligere pH dråpe. Opprettholde volumet på 100 ml med en avløpspumpe kontinuerlig skimming kulturen overflaten. Derfor stiger etanolkonsentrasjon med fortsatt metabolisme og fôring. Mål avløp og trekke prøver (1-2 ml) av kontinuerlige kulturer hver 48-72 timer for analyse av levedyktige cellekonsentrasjonen, produkter og substrater, slik som tidligere beskrevet. 18 For å finne levedyktig celle konsentrasjon, gjør serielle 1:10 fortynninger av prøver i buffer (se 4.1.1) og spredning plate fortynninger til YM-agar (se 1.2.1). Ut fra utstrømnings-oppsamlings satser (Q) Beregn fortynningshastigheten (D) (Q / V R), og i eksempelet på S. stipitis, det varierte 0 til 0,01 timer-1.
  5. Spar glyserol aksjer regelmessig ved å isolere fra levedyktighet plater av bufrede prøvefortynningene forming 30-100 kolonier, som representerer mest utbredte robuste kolonister på den tiden i berikelse. Flom plater med ~ 5 ml 10% glycerol for å tillate utarbeidelse av dupliserte cryovials. For vedlikehold eller et pusterom, stoppe kontinuerlig kultur og start etter behov bruker mest strøm (resistente) glyserol lager (e).
  6. For å starte på nytt, strek glyserol lager (e) mestresistente populasjoner til YM-agar og overføre 24-48 timers celler ved å sløyfe til en pre-kultur av ethanol-fri ODM for inkubasjon som ovenfor. Inokulere 100 ml holdevolum ODM til innledende A 620 0.5 ved hjelp av et konsentrat av den for-dyrket gjær, og tillate kulturen å vokse satsvis til stasjonær fase før fødemediumstrømmen startes på nytt.
  7. Dersom kulturer kan vokse jevnt ved> 0,01 t -1 på xylose i nærvær av> 25 g / l etanol, starter den kontinuerlige kultur mating (ODM + 60 g / l xylose + etanol som strekker seg 30 til 50 g / l) ved et lavt fortynningshastighet ~ 0,01 t -1 til 100 ml holdevolumet (opprinnelig ODM + 60 g / l xylose + 20 g / l etanol). Over tid, heve etanol i føde mot 50 g / l. Capture avanserte populasjoner i glyserol aksjer.
    MERK: Vedlikeholde lav fortynningsrate tillater dannelsen av et høyt nok cellekonsentrasjon for å redusere oksygen tilgjengelighet og støtte gjæring.
  8. Eventuelt bruke ultrafiolett (UV) irradiation månedlig til glyserol lager bestander som brukes til å reinoculate kontinuerlige kulturer.
    1. Resuspender kolonier fra glyserol lager striper i 10 ml ODM (som i forkulturer) med 60 g / l xylose, og basseng alle aksjer i en enkel steril flaske. Påfør samlet cellesuspensjonen på ~ 5 x 10 8 levedyktige celler / ml for å bare dekke bunnen av 4-5 Petri plater med 6 ml / plate. For å få 6 ml dekning av en standard engangspetriskål, dispensere 15 ml for å overvinne overflatespenning, og deretter fjerne 9 ml.
    2. Eksponere hver åpen kulturplate UV fra lyskilden i en biologisk sikkerhetskabinett. Juster UV-eksponering tid eller distanse for å oppnå den ønskede predasjonstakt> 90%. Her utsettes i 45 minutter ved omkring 56 cm fra kilden.
    3. Fortynn plate cellesuspensjoner før og etter bestråling. Estimat kill rate basert på kolonidannende enheter. For S. stipitis eksempel kill hastigheten var ~ 97%.
    4. Overfør UV-eksponerte kulturer (24-30 ml) til en folie-covket 50 ml kolbe, og inkuber ved 25 ° C og 150 rpm i 24 timer for å tillate den lille prosentandel av levedyktige celler til å re-populere til ~ 1 x 10 8 levedyktige S. stipitis celler / ml. Ved å hindre fotoreaktive, bevarer folie mutasjoner mens kulturer inkuberes.
    5. Bruk skar mutagenisert kultur for å vaksinere kontinuerlige kulturer til ~ 1 x 10 7 levedyktige celler / ml. Start etanol-anrikede ODM + 60 g / l xylose mediumfremføringen for å fortsette utvelgelsesprosessen.

6. Evaluere Glycerol Stock populasjoner og identifisere de med forbedret Xylose Fermentering i nærvær av etanol

  1. Streak valgt glyserol stamkulturer til YM-agar som første skritt i skjermen for beste vekst og fermentering av xylose i nærvær av etanol.
  2. Overfør hvert utviklet seg befolkning skal skjermes fra agar striper til 75 ml forkulturer i ODM med 150 g / l glukose, og inkuberes i 125 ml kolber 96hr før bruk som podestoffer for test kulturer. De store glukose vokst populasjoner vil kreve induksjon av enzymer for xylose utnyttelse.
    1. For å teste induksjon, høste hver kultur, suspendere celler til 30 ml, innledende A 620 av 40 i ODM 60 g / l xylose + 30-45 g / l etanol, og inkuber ved 25 ° C, 150 rpm (en "bane) i 50 ml kolber med silisium svamp lukninger. Tegn prøver to ganger daglig for å overvåke xylose opptak ved HPLC-analyse.
  3. Alternativt, som beskrevet i Slininger et al., 18 for å vurdere veksten på xylose i nærvær av etanol fremstille forkulturer av hvert utviklet seg populasjon av sløyfe overføring til 75 ml ODM med 150 g / l xylose i 125 ml kolber, og inkuber 96 time ved 25 ° C, 150 rpm (en "bane). Inokuler testkulturene til en lav initial A 620 på 0,1 i 25 ml ODM + 60 g / l xylose + 30-45 g / l etanol i 125 ml kolber. Inkuber kolber ved 25 ° C, 300 rpm, en "bane og prøve.

  1. Basert på resultatene fra trinn 6 ved å velge glyserol arkiv populasjoner som viser overlegen evne til å vokse på og gjære xylose i nærvær av etanol. Bruk disse til strek plater. Den stripePlate er benyttet til å fremstille tette, bufrede cellesuspensjoner av A 620 = 5. Da cellesuspensjoner blir anvendt for å inokulere forkulturer i 96 dype brønnplater i A 620 = 0,5. Inokuler 1 ml forkulturer på PSGHL blandet 1: 1 med ODM + 50 g / l xylose (uten etanol). Inkuber forkulturer i 96-brønners, dype brønnplater med utluftet lav fordampning dekker i 48 timer ved 25 ° C, 400 rpm, en "bane. Separate forskjellige glycerol arkiv populasjoner ved hjelp av tomme brønner.
  2. Ved hjelp av hver forkultur, vaksinere seksten 1 ml replikere kulturer førstegang A 620 ~ 0,5 i 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / l xylose med 20, 30 eller 40 g / l etanol for å berike tolerante kolonister. Inkuber berikelse Cultures på samme måte som forkulturer.
  3. For hver annen glyserol lager, høste kultur brønner med høyest etanolkonsentrasjon slik vekst og xylose bruk. Plate hver cellelinje til YM-agar for å oppnå utbredt enkeltkolonier for å bevare i glycerol. Plukk ti kolonier per cellelinje og strek hver til en YM agar plate for glyserol lager forberedelse.

8. Videre Berik Robust Evolved Stammer under Serial Transfer på PSGHL, som for AFEX CSH

  1. Fremstille pre-kulturer av NRRL Y-7124 (mor), AFEX CSH-tolerant utviklet seg isolere, og kontinuerlig kultur utviklet seg populasjon med forbedret evne til å bruke xylose i nærvær av etanol. Inokulere 75 ml ODM + 150 g / l xylose av sløyfe fra glycerol arkiv striper som beskrevet ovenfor (trinn 2.1) for AFEX CSH hydrolysat tilpasningsprosessen.
  2. Fortynn PSGHL med vann for å tilveiebringe en serie av økende konsentrasjoner. Fremstille en 96-brønners mikroplate for hver av de tre cellelinjer ved hjelp av hvertPSGHL fortynning for å fylle 8 brønner med 50 pl. Bruk forkultur for å vaksinere alle 50 ul mikro-kulturen i fortynning serien til innledende A 620 ~ 0,1-0,5.
    1. Fortsette utviklingen av gjær i økende styrker av PSGHL anvendelse av samme fremgangsmåte som den AFEX CSH hydrolysatet tilpasning er angitt ovenfor (trinn 2) inntil kulturene er i stand til å vokse i full styrke hydrolysat ved en stabil 14-d gjennomsnittlig forhold på Aa 620 pr Δtime som serie overføringer videreføres i ytterligere fire måneder.

9. Isolate encellede Colonies Bruke PSGHL Graderinger med eller uten Etanol Challenge

  1. Skaff encellede isolerer direkte fra full styrke PSGHL endelige tilpasningsplater ved fortynning plating til YM-agar. Plukke ti store kolonier av hver av de tre cellelinjer og tverr strek på YM-plater for å fremstille glyserol aksjer som tidligere beskrevet (trinn 3.2).
  2. Eventuelt utforske tidligere tidspunkter iutviklingen prosessen ved å isolere fra lagrede glyserol bestander av de tre cellelinjene.
    1. Inokulere en forkultur for hver cellelinje ved å sløyfe fra glycerol lager streker og inkuberes 24 timer i 30 ml ODM + 50 g / l xylose (50 ml kolber, 25 ° C, 150 rpm).
    2. Challenge celler fra forkulturer til vekst i hydrolysat av inoculating 50 ul 50% PSGHL i mikroplate brønnene til en innledende A 620 ~ 0,2 og ruger statisk 48 hr.
    3. Spre 0,1 ml av hver kultur anriket på PSGHL gradient agarplater som strekker seg fra 0 til 50% -ig hydrolysat (som leverer ~ 300-400 levedyktige celler per plate), og velge 10 enkle kolonier per cellelinje fra den høyest mulige konsentrasjon hydrolysat område av gradienten . 21 Streak plukket kolonier til YM for glyserol lager forberedelse som i trinn 3.2.
    4. Som et alternativ til punkt 9.2.3, i stedet for å inokulere det gradient agarplatene, inokuler brønnene av 96-brønners mikroplater for den initielle A 620 ~ 0,2, where brønnene er utformet for å inneholde en rekke hydrolysat-konsentrasjoner fra 50 til 100% -ig etanol og fra 10 til 40 g / l. I dette tilfellet utvikle mikroplater 72-96 timer og på annen måte som i trinn 2.3. Isoler ti enkeltkolonier fra brønner av de tøffeste hydrolysat-etanol kombinasjoner som viser vekst via fortynning plating, og forberede glyserol aksjer som i trinn 3.2.

10. I en primær skjerm, eliminere Inferior isolater ved å sammenligne og rangering forestillinger om PSGHL på to næringsforhold

  1. Påfør en høy gjennomstrømning dyp brønn plate skjermen på PSGHL ytelsen til skjermen fem sett med tretti isolater sammen med NRRL Y-7124 foreldre og AFEX CSH-tolerant isolat (analog til Colony 5 av figur 1 evolusjon eksempel) som kontroller for å velge seks topp stammer (20%) fra hvert sett for å passere til den sekundære screening nivå (trinn 12).
  2. Utfør skjermen i dypbrønnsplater fylt 1 ml per brønn og dekket with rustfritt stål lokk med svart silikon lav fordamping sel. Klem alle platene til styret i inkubatoren / shaker og opererer ved 25 ° C og 400 rpm (en "shaker bane). Design all dyp brønn plate fylle mønstre for å tillate utskilling av ulike isolater av åpne brønner.
  3. Til å begynne jordbearbeiding, plukke en perle av celler fra glyserol striper fremstilt av 30 isolater oppnådd som ovenfor (i trinn 3, 7 og 9) for å duplisere brønner på ODM + 50 g / l xylose og inkuberes 48 timer.
  4. Som en utfordring medium for preculturing isolater, forberede 50% PSGHL ved å blande PSGHL 1: 1 med ODM + 10 g / l glukose + 50 g / l xylose. For screening 30 isolater og to kontrollstammer, 2 plater med 2 brønner per hver 16 isolater er fylt opp, forlater tomme brønner mellom de ulike isolater.
  5. For utfordring kulturer, overføring, en 50 ul volum av ODM pre-kulturer (A 620 ~ 10) til hver av to 50% PSGHL utfordring dyrknings brønner for hver av isolatene og kontroller for å oppnå en tt ig ngal A 620 ~ 0,5 og inkuberes 72 timer.
  6. Bruk to test media av forskjellige ernærings rikdom for screening isolerer: 60% PSGHL + ODM næringsstoffer; og 75% PSGHL + ODM + YM næringsstoffer. Legg ODM næringsstoffer (unntatt sukker) på halvparten av styrken som standard for ODM bruke med 50 g / l sukker (trinn 1.3). Som angitt, tilsett YM-nærings (unntatt sukkere) ved halvparten av standard styrke på 3 g / l gjærekstrakt, 3 g / l maltekstrakt, 5 g / l pepton.
  7. Vaksinere testkulturer ved å overføre 50 ul 72 timer 50% PSGHL duell pre-kulturer å vaksinere 1000 mL til innledende A 620 ~ 0,5 i fem dype brønner for hver av to test medier.
  8. Smak hvert isolat daglig. Pipette innholdet i en brønn til et mikrosentrifugerør og sentrifuger (5533 xg, 15 min) for å oppnå supernatanten for etanol, glukose og xylose høy gjennomstrømning analyser. Måle biomasse som A-620 i 96-brønners mikroplater (200 ul / brønn) med et spektrofotometer.
  9. Innenfor hvert sett av 30 erolates testet (5 sett for S. stipitis NRRL Y-7124 utviklet seg stammer), beregne relative prestasjonsindekser (RPI) som beskrevet i trinn 11 nedenfor og bruke til å rangere hver stamme basert på etanol yield (maks etanol akkumulert per innledende sukker følger med) og xylose opptakshastighet (xylose konsentrasjon konsumert per første 96 timer) på begge test medier.

11. Rank Isolerer i Primær PSGHL skjermen ved hjelp Relativ Performance Index (RPI)

  1. Følgende primærscreening, beregne dimensjons relative prestasjonsindekser (RPI) for å rangere de 30 isolatene i hver av de fem forskjellige eksperimenter på skjermen isolater på PSGHL med to forskjellige nærings formuleringer per eksperiment, dvs. 60% PSGHL og 75% PSGHL.
  2. Beregn statistisk parameter F for rangering isolat ytelse innenfor en gruppe isolater testet i et gitt eksperiment: F = (XX avg) / s. Her er X måleparameter, slik som utbytte (Y)eller hastighet (R) som ble observert for hver enkelt isolat, mens X avg og s er gjennomsnittet og standardavvik, henholdsvis, av X observert for alle isolater innenfor et gitt eksperiment. For normalfordelinger, -2 <F <2.
  3. For hvert isolat i et eksperiment, beregne relative utviklingen basert på hastighet, RPI R = (2 + F R) × 100/4, og tilsvarende beregne relative utviklingen basert på yield, RPI Y = (2 + F Y) × 100/4 . Verdien av RPI varierer fra ~ 0-100 persentil (lavest til høyest). Deretter beregne RPI gjennomsnitt for hver isolere innenfor et gitt hydrolysat eksperiment som følger: RPI avg = (RPI Y + RPI R) / 2, hvor avkastning og rente bidrag er gitt lik vekting i dette programmet.
    Legg merke til at generelt, kan gi og rente parametere vektes hvis det anses ulik betydning.
  4. Beregn RPI samlet over n typer hydrolysater testet: RPI generelle i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n. Vurdere hvert isolat i en eksperimentell sett av 30 isolater og 2 kontroller. Under primær rangering av ~ 150 enkelt-koloni-isolater innrettet til xyloserike PSGHL, RPI samlede er beregnet for priser og utbytter på tvers av de to PSGHL formuleringene anvendt i skjermen, dvs. 60% PSGHL og 75% PSGHL, hvor n = 2.
  5. Basert på RPI samlet innenfor hvert forsøk, velger den øverste prosenten av isolater som skal sendes til den sekundære skjermen. I dette eksemplet er de øverste 20% av stammene valgt til å passere gjennom (dvs. 30 av 150 testet).

12. I en sekundær skjerm, kan du sammenligne Topp primære skjermen Utøvere på Multiple Komplett hydrolysater (> 100 g / L Blandede sukker) for å avsløre høyest fungerer Robuste Stammer

  1. Sammenligne topp PSGHL artister på 6% glukan AFEX CSH og SGH endret med to nivåer av nitrogen, SGH-N1 og SGH-N2 (sammensetnings som i tabell 1) for endelig rangering. Screen de 30 isolatene som var de beste utøverne i primær dyp brønn plate skjermen på PSGHL (trinn 10 og 11) og de to kontrollene (moderstammen NRRL Y-7124 og AFEX CSH-tolerant isolat (analog til Colony 5, Figur 1 eksempel ).
  2. Begynn jordbearbeiding ved å plukke en perle av celler fra glycerol striper å duplisere dype brønner av 1 ml ODM + 50 g / l xylose som før og inkuberes 48 timer i en dyp brønn plate-systemet (trinn 10.2). Deretter overfører 50 ul ODM forkulturer til 50% SGH utfordring kulturer, og inkuber i dyp brønn plate system for 72 timer for å få en 620 på ~ 10). Forbered 50% SGH ved å blande SGH 1: 1 med sukkerfri ODM + 50 g / l xylose (pH 5,6).
  3. For hver av isolatene, inokulere en 16 ml porsjon av SGH-N1 eller SGH-N2 med cellepelleten (15 min, 2711 x g) fra tre brønner på utfordring kultur for å gi innledende test kultur A 620 ~ 2,0. Inkuber testkulturer ved 25 & #176,. C, 180 rpm (en "bane) i 25 ml flasker med silikon svamp nedleggelser Eksempel kolber daglige og analysere per PSGHL skjermen.
  4. Tilsvarende isolater skjerm som i trinnene 12.2 og 12.3, men denne gang erstatning SGH-N1 og N2-SGH med 6% glukan AFEX CSH ved pH 5,2 for anvendelse ved fremstilling av utfordringen kulturmedium og prøvekulturmedium. For 50% styrke duell kulturer ved å bruke 6% AFEX CSH fortynnet 1: 1 med vann, siden det er tilstrekkelig nitrogen uten endring.
  5. Gjenta trinn 12.01 til 12.04 for å duplisere resultater.

13. Rank forestillinger av isolater i videregående skjermen ved hjelp RPI samlet for å gi din bruk av flere Komplett hydrolysater

  1. Beregn relative prestasjonsindekser (RPI) for å rangere hver av de 20% av isolatene (~ 30 av 150) fra den primære skjermen som er testet i den sekundære skjermen på enzymet saccharified hydrolysat formuleringer av varierende ernæringsmessige rikdom.
  2. Resultat hverisolat testet i den andre screening basert på xylose opptaksraten og etanolutbytte utført på tre enzym-saccharified forbehandlet hydrolysat formuleringer kjørt i duplikat, inkludert AFEX CSH (i = 1 og 2), SGH-N1 (i = 3 og 4) og SGH N2 (i = 5 og 6).
  3. Beregn RPI samlet for hvert isolat, og bruke denne rangeringen parameter for ytterligere å renske listen over overlegne isolater: RPI generelle = Σ i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n, der n = 6 .
    MERK: Demonstrere kinetikk overlegne isolater i SGH-N2 hydrolysater i kolbe kulturer ved å følge prosedyrene i Slininger et al 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

S. stipitis ble utviklet ved bruk av kombinasjoner av tre valg kulturer, som inkluderte AFEX CSH, PSGHL, og etanol-utfordret xylose-matet kontinuerlig kultur. Figur 1 viser skjematisk diagram av utviklingen eksperimenter utført sammen med isolatene finnes enten for å utføre mest effektivt samlet, eller mest effektivt på en av de hydrolysater som ble undersøkt. Tabell 3 viser de NRRL deponeringsnummer av disse overlegne isolater og oppsummerer tilpasnings belastninger som påføres i ferd med å oppnå det anrikede populasjonen som hver stamme ble isolert. Noen isolater ble sett å ha overlegen relative utviklingen på en eller to hydrolysat typer, men 7 av 11 isolater gode resultater på alle de hydrolysat typer, selv om de fleste av disse ble utsatt og utfordret av bare én type i løpet av evolusjonen. Suksesser av ulike utviklingen tilnærminger tatt her er vist i figur 2 -7 og tabell 4.

Figur 2 viser de ulike forbedring ble sett etter den første fase av tilpasning i hvilke robuste derivater av stamme NRRL Y-7124 ble anriket under seriell overføring til økende konsentrasjoner av AFEX CSH (trinn 2). I kulturer som vokser på 6% glukan AFEX CSH, demonstrerer den utviklede populasjonen mer rask akkumulering og høyere endelige titere av etanol enn moderstammen. Mer hurtig glukoseutnyttelse også sees sammen med hurtigere xylose opptak umiddelbart etter uttømming av glukose. Også i figur 3, har den stabilitet av den endrede befolkning er demonstrert i det syntetiske medium ODM med en blanding av 87 g / l glukose og 66 g / l xylose. I dette tilfelle, både anriket populasjon (figur 3B), og isolerte kolonier (koloni 1 og Colony 5, figur 3C og 3D, respectively) er i stand til å utkonkurrere moderstammen ved hjelp av xylose mer effektiv måte for å lage etanol raskere, noe som reduserer tiden til maksimal etanol med minst 4 dager. Betydelig høyere etanolkonsentrasjoner ble akkumulert av utviklet påkjenningene på ODM (55-60 g / l) i forhold til den overordnede (40-45 g / l). Mutasjonene, noe som førte til en stabil fenotype av redusert diauxy under glukose-xylose overgang og mer effektiv xylose gjæring, oppstod som gjær befolkningen utviklet seg i AFEX CSH.

Ytterligere forbedringer av Colony 5 ble forfulgt ved å sende den til naturlig utvalg i xylose-matet kontinuerlig kultur i nærvær av økende nivåer av etanol opp til 50 g / L. Under disse forhold, må gjæren populasjonen beholdes i den kontinuerlige kultur være i stand til å indusere enzymer for xylose anvendelse som eneste karbonkilde for at det skal være i stand til å vokse med en hastighet som er høy nok til å fylle fermentoren til tross for en jevn fortynningsats. I moderstammen, induksjon av xylose enzymer begynner å bli inhibert ved etanolkonsentrasjoner så lave som 15-20 g / l. 8. Derivater av Colony 5 ble fanget i glyserol aksjer ved tidlige og sene tidspunkter for drift av den kontinuerlige kultur, og Figur 4 viser den vellykkede forbedring i utnyttelsen xylose i nærvær av 40 g / l etanol ble observert i utviklet derivater av Colony 5 sammenlignet med NRRL Y-7124 ordnet og det første Colony 5 inokulert til prosessen.

Isolater som oppstår fra alle faser av tilpasning ordningen i figur 1 ble vist i PSGHL å identifisere de med overlegne evne til å gjære xylose (trinn 10.1). Isolatene er vist i figur 5 er blant de beste utøverne på PSGHL av ~ 150 rangeres i denne primære skjermen og i alle sekundære skjermer av ytelse som beskrevet nedenfor. For å indikere forbedring av utviklede isolateri forhold til den overordnede, ble resultatene for hvert isolat uttrykt som forholdet mellom kinetiske parameterverdier fra isolat til moderstammen. Ratio verdier av "en" skjedde hvis isolat resultatene tilsvarte den overordnede. Figurene 5a og 5b oppsummere toppen isolere forestillinger på 60% og 75% styrkene PSGHL med ODM eller ODM + YM næringstilskudd. Som hydrolysat konsentrasjon og hardhet ble økt, redusert ytelsesforhold. I 60% styrke PSGHL, fem av syv topp isolater utsatt for PSGHL seleksjonstrykk utført mange ganger bedre enn NRRL Y-7124 (isolere 1). Fire isolater gjorde det bedre enn Colony 5 (isolere 33), som hadde utviklet seg i løpet av eksponering for AFEX CSH men hadde ingen tidligere selektiv eksponering for PSGHL. Men i 75% styrke PSGHL, kun tre isolater betydelig overgått både foreldre og Colony 5 (isolere 33) til tross for den ekstra næringsstoffer. Av disse overlegen isolater 15 og 16 var previously utfordret med økende konsentrasjoner av PSGHL som et seleksjonstrykk førings evolusjon. Isolerer 15, 14 og 3 ble bare utsatt for PSGHL, mens 11, 13 og 16 hadde flere eksponeringer. Isolater 3, 11 og 13 var fra tidligere tidspunkter under utviklingen på PSGHL og så hadde noe mindre anledning til å utvikle toleranse sammenlignet med 14, 15 og 16. Mens det er tydelig i figur 5 som serieoverføring for å øke styrken av PSGHL servert for å utvikle stammer robuste til dets inhibitoriske omgivelser, er det også tydelig at eksponering av opphavsstammen NRRL Y-7124 for å AFEX CSH alene kan potensielt generere isolater som Colony 5 (33) med krysstoleranse til PSGHL. Således ble det indikert at robuste stammer i stand til å opptre i flere hydrolysater kan bli funnet ved anrikning av toleranse i en hydrolysat, etterfulgt av screening ytelse i en annen. Isolater oppnådd fra xylose-matet kontinuerlig kultur ble også screenet på PSGHL 60% og 75% styrke mednæringsstoffer og også lagt glukose på 75 g / L for å opprettholde etanol utfordringen og teste diauxic etterslep på xylose følgende glukose utnyttelse. Mens isolerer 27, 28 og 30 var overlegne i forhold til andre fra denne fasen av tilpasningen, både utbytte og xylose opptaksraten ytelsesforhold var lik den overordnede på 75% PSGHL med ekstra ODM og YM-næringsstoffer, som ikke nødvendigvis er overraskende i at ingen hadde tidligere eksponering for dette hydrolysat (se også Slininger et al. 18 for ytterligere data ikke vist her for kulturer gitt 75 g / l glukose).

De beste stammer valgt fra primære skjermen på xylose-rike PSGHL ble deretter screenet på tre komplette hydrolysater. Disse hydrolysater (tabell 1) inkludert AFEX CSH og fortynne syre forbehandlet SG behandlet med kommersielle cellulaser og supplert ved to forskjellige nitrogennivåer (SGH-N1 og SGH-N2) til å identifisere den mest allsidige isolates med hensyn til variasjoner i inhibitor og næringsmiljø. De relative prestasjonsindekser (RPIs) ble beregnet for gjæring av hvert isolat i hvert hydrolysat (Figur 6A). Figur 6B viser de samlede generelle ytelsen indeksene beregnes for hvert isolat. Fem isolater (3, 14, 27, 28, 33) hadde samlet RPI ovenfor 60, som rangeres dem som den mest robuste til alle varianter av hydrolysat og næringsforhold kombinert. Omgår tabell 3, både isolerer 3 og 14 ble utviklet seg i PSGHL mens 27, 28 og 33 ble utviklet seg i AFEX CSH eller AFEX CSH og etanol-utfordret kontinuerlig kultur på xylose. Ingen av de stammene som utviser overlegen flere hydrolysat bruk ble utviklet på mer enn én hydrolysat.

Noen stammer var "spesialister" gir bedre resultater på hver SGH-N1 / 2 eller AFEX CSH. Disse isolatene utfører beste spesialister på SGHhydrolysater (11, 16 og 9) ble oppnådd ved utvikling på PSGHL som det siste eller eneste utfordring. For isolerer 11 og 16, som i utgangspunktet ble beriket via økende AFEX CSH utfordring, ble muligheten til å effektivt utnytte AFEX CSH ikke valgt aktivt under lange endelige berikelse i PSGHL, og viktige genetiske faktorer som støtter bruken ble tydeligvis tapt. Omvendt, isolerer 14, 25, 27, 30 og 33 var overlegne utøvere på AFEX CSH, og alle unntatt isolat 14 ble utviklet på AFEX CSH med eller uten etanol utfordring. Så som forventet, regissert evolusjon på AFEX CSH eller PSGHL tendens til å velge for gjær godt tilpasset utvalg hydrolysat. Det eneste unntaket i denne forbindelse var isolat 14. Isolate 14 stammer fra PSGHL bare utfordre og ble isolert fra YM agar fortynning plating av den endelige PSGHL berikelse kultur. Slininger et al. 18 viste at dette isolat for å ha overlegen evne til xylose enzyminduksjon i glukose-celler dyrket i nærvær av5-15 g / l eddiksyre og redusert diauxic lag på ODM med 75 g / l hver av glukose og xylose, til tross for> 30 g / l etanol som forekommer før den glukose-xylose overgangspunktet.

De overlegne kinetikk utviklet stammer i forhold til den overordnede belastningen S. stipitis NRRL Y-7124 ble demonstrert som vist i tabell 4, som representerer resultatene av lavnivå lufting flaske-kulturer inokulert til innledende A 620 8,4 ± 2,5 75 ml SGH-N2 (pH 6,2) inkuberes i 125 ml kolber med silikon-svampstykker ved 25 ° C, 150 rpm (en "bane), og i figur 7, som representerer moderat lufting flaske-kulturer inokulert til innledende A 620 0,5 i 23 ml SGH-N2 per 50 ml kolbe. 18 Disse betingelser representerer to forskjellige typer operasjoner er foreslått av litteratur som potensielt kommersielt lovende for etanolproduksjon av S. stipitis. 8,22 i granert eksempel på lavt nivå lufting, tilveiebringer høy celletetthet for hurtig fermentering for å begynne umiddelbart. Mens i det andre tilfellet, til lav celletetthet og høyere nivå lufting fører til logaritmisk vekst bygge befolkningen og akselerere veksten-assosiert sukker omdannelse til etanol. Disse data viser at de utviklet seg stammene har betydelige kinetiske fordeler i forhold til moderstammen: hurtigere glukoseopptak hastighet (tabell 4), hurtigere spesifikk xylose opptaksraten (tabell 4), raskere produktivitet etanol på både glukose og xylose og samlet (tabell 4), for å kortere lag foregående vekst (figur 7), og kortere diauxic glukose xylose overgangs lag. Disse forbedringene tillatt etanol til å akkumulere til over 40 g / l og til peak dager tidligere (figur 7) enn det som ble sett for den overordnede NRRL Y-7124. Høyere samlet etanol produktivitet (tabell 4) ble det oppnådd 1,5 til 5 gangers av moderstammen (tabell 4), avhengig av utviklet belastning.

Figur 1
Figur 1:. Scheffersomyces stipitis tilpasning flytdiagram Den viste diagrammet viser rekkefølgen av de belastninger som påføres under tilpasningsprosessen og avreise utvinning av førsteklasses isolater (tall i parentes). Se også tabell 3 isolat tast som referanse for strekk identiteter. Å gi tid orientering, tallene i rødt angir antall dager i hver fase av tilpasning. For serieoverførings faser i AFEX CSH og xylose-rik PSGHL, hver dag av tilpasning representerer ca 2-4 generasjoner. For den kontinuerlige fase kultur (205 dager totalt), fortynningshastigheten D var variabel ~ 0-0,1 time -1 i løpet av 125 d av drift med pH påvirkede foring. I det neste80 dager, drift var ved en kontinuerlig strøm med D ved 0.012 hr -1, noe som gir en generasjonstid (ln 2) / (D) i 58 timer, eller en generasjon pr 2,4 d ved steady-state. Neste et utvalg av tilpasset befolkningen fra 205-dagers kontinuerlig kultur ble mutagenisert med UV-lys og inokulert til en kontinuerlig kultur operert med D på 0,012 timer -1. (Gjengitt fra Slininger et al. 18) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: Forbedret satsvis fermentering av 6% glukan AFEX CSH Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 moderstammen fermentering av 6% glukan AFEX CSH (A) sammenlignes med tilpasset Colony 5 fermentering av 6% glukan AFEX-forbehandlet korn Stover hydrolyzate (B). Symboler utpeke biomasse (rød firkant), glukose (svart sirkel med stiplet linje), xylose (blå sirkel med heltrukket linje), etanol (grønn trekant), og xylitol (lilla diamant). (Gjengitt fra Slininger et al. 18) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Redusert diauxic etterslep i definert medium med blandede sukker Fermentering forestillinger er sammenlignet i ODM med 66 g / l glukose og 87 g / l xylose for moderstammen S.. stipitis NRRL Y-7124 (A), den AFEX CSH tilpasset populasjon utledet fra Y-7124 (B), enkelt celle Colony 1 isoleres fra det tilpassede S. stipitis befolkningen (C), enkelt celle Colony 5 isolert fra tilpasset befolkningen (D). Symboler utpeke biomasse (rød firkant), glukose (svart sirkel med stiplet linje), xylose (blå sirkel med heltrukket linje), etanol (grønn trekant), xylitol (lilla diamant), og adonitol (gull diamant med svart kant). (Gjengitt fra Slininger et al. 18) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Etanol resistente derivater av Colony 5. hydrolysat tolerant Colony 5 ble videreutviklet av kontinuerlig kultur utvalg på ODM inneholder xylose som eneste karbonkilde og høye nivåer av etanol. To derivative glyserol lager populasjoner innhentet tidlig i utvelgelsesprosessen (2A.1.53R, oransje trekant og stiplet linje) og enfter UV-bestråling av kontinuerlig kultur inokula (2A.1.30R.2, lilla sirkel og stiplet linje) er vist i sammenligning med NRRL Y-7124 moderstammen (grønn sirkel med heltrukken linje) og AFEX CSH tolerant Colony 5 (svart trekant med solid linje). Xylose opptak i tette bestander av glukose-vokst gjær (A 620 = 50) i ODM med 40 g / l etanol indikerte at alle tilpasset stammer gått unadapted forelder i evnen til å indusere xylose metabolismen. (Gjengitt fra Slininger et al. 18) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5:. Forholdet mellom ytelsesforbedring av tolerant isolat i forhold til overordnede forestillinger av overlegne tolerante isolater er oppsummert i forhold tilstyremoderstammen NRRL Y-7124 for hver formulering av PSGHL (A, B). Forestillinger ble vurdert i form av xylose-opptaket (blå søylene representerer forholdstall på isolat til foreldre) og etanol avkastning per sukker levert (grønne søyler som representerer forholdstall på isolat til foreldre). (Gjengitt fra Slininger et al. 18) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Isoler vurdering basert på RPI. Den relative ytelse indeks (RPI) konseptet ble påført på resultatene av den andre screening for å rangere 33 isolerer innenfor hvert hydrolysat typen basert på xylose opptaksraten og etanolutbytte pr sukker som følger. (A) Den relative løpkonge av et gitt isolat avhengig av hydrolysat type (P <0,001): SGH-N1 (blå søyler), SGH-N2 (røde søyler) og AFEX CSH (grønne søyler). (B) Den samlede RPI beregnet på tvers av alle hydrolysat typer (lyseblå søyler) indikerte overlegne stammer med mest robuste resultater på tvers av ulike hydrolysat forhold. (Gjengitt fra Slininger et al. 18) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7: Sammen SGH fermentations av overlegen tilpasset isolater av S. stipitis. Superior tilpasset isolater og deres opphavsstammen NRRL Y-7124 er sammenlignet fermentering av enzymatiske hydrolysater av fortynnet syre-forbehandlet switchgrass (20% faste stoffer) ved 25 ° C og utgangs-pH 6,2 ved lav initial celletetthet. Tid kurs av biomasse (røde firkanter), glukose (svarte sirkler og stiplet linje), xylose (blå sirkler og heltrukket linje) og etanol (grønne trekanter) er vist. Feilstolpene representerer området ca. middelverdien markert med symboler. (Gjengitt fra Slininger et al. 18) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1:. Komposisjoner av hydrolysater brukes i cultivations (. Gjengitt fra Slininger et al 18) Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Optimal definert medium for Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 7tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3:. Oppsummering av førsteklasses tolerante Scheffersomyces stipitis stammer for gjæring av hydrolysater av plantebiomasse (. Gjengitt fra Slininger et al 18) Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Sammenkinetikk av isolater på switch hydrolysat SGH-N2 inokulert førstegang A 620 = 8,4 ± 2,5 Priser er normaliserte priser per enhet absorbans under glukose eller xylose forbruk.. (Gjengitt fra Slininger et al. 18) Klikk her for å laste ned dette tabart.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere trinn var avgjørende for å lykkes i utviklingen prosessen. For det første er det nøkkel for å velge hensiktsmessige seleksjonstrykk for å drive den populasjonen utviklingen mot de ønskede fenotyper som er nødvendig for vellykket bruk. De følgende selektive påkjenninger ble valgt for S. stipitis og anvendt på passende tidspunkter for å lede anrikning av de ønskede fenotyper: økende styrker av 12% glukan AFEX CSH (som tvinger vekst og fermentering av forskjellige sukkerarter i nærvær av eddiksyre og lave nivåer av furan aldehyder og andre inhibitorer); xylose matet sammenhengende kultur med økende etanolkonsentrasjon (som tvinger xylose enzyminduksjon å redusere diauxic lag); og øker styrken til 20% faststoffbelastning PSGHL (som tvinger vekst og fermentering av xylose i nærvær av høy eddiksyre, furaner, og andre inhibitorer). For det andre er det viktig å bevare et økende gjær bestander ved frysing glyserol sTocks av populasjonsprøver som berikelse prosessen skrider frem. Slike bilder av befolkningen kan lagres for periodisk funksjonell testing for å dokumentere utviklingen fremgang og å tillate etterfølgende isoleringer som ønsket, eller å starte evolution prosesser etter en pause. En tredje viktig steg i utviklingen prosedyren var å gjenopprette eksepsjonell isolater ved berikende utvalg kultur populasjoner eller glyserol lager bestander på en praktisk selektive medier (for eksempel agar eller mikroplater som inneholder en stress gradient presentere en serie av hydrolysat og / eller etanolkonsentrasjoner) . Deretter overlevende kolonier som vokser under de mest stressende tilstand kan plukkes å bevare for karakterisering senere. Disse tre grunnleggende trinn kan gjentas for å forfølge hver ytterligere ønsket fenotype seleksjonstrykk, eller alternativt flere presset i en enkelt syklus dersom det er hensiktsmessig. Når den innfødte forelder gjær befolkningen er eksponert for ulike påkjenninger, er genetisk mangfold forventes å oppstå th grove fysiske eller induserte mutasjoner, og fortsatt eksponering vil tillate naturlig utvalg for å berike for personer med de mest fordelaktige mutasjoner som støtter konkurranse overlevelse. Det er forventet at den er valgt fenotype vil oppstå som et resultat av flere genetiske mutasjoner. I protokollen ovenfor, kan mutasjoner bli indusert ved UV-behandling eller potensielt under eksponering av gjær til hydrolysater. Hydrolysater er kjent for å inneholde tre klasser av forbindelser skadelig for mikroorganismer:. Karboksylsyrer, aldehyder og fenoler 22 Reaktive aldehyder, slik som furfural og 5-hydroxymethylfurfural, kan skade cellene og bevirke en forhøyelse av reaktive oksygenarter (ROS), genereres typisk i mitokondrier. ROS er godt kjent for å forårsake DNA mutasjoner i eukaryote celler. 23,24 De fenoler som er tilstede i hydrolysater, selv om det ikke tidligere er kjent for å være genotoksiske, kan fremme og synergistisk på den mutagene effekter av aldehyder og mutagene ROS. 25

jove_content "> Den trinnvise formasjonen stadig mer krevende miljøer er forventet å bygge utviklede stammer med en serie av fenotype forbedringer, både målrettede og også ikke-målrettede. Det er mulig at det kan oppstå visse ikke-målrettede fenotyper som er uønsket eller ustabil. For å fange opp de mest velfungerende og robuste stammer, en ekstra viktig skritt som må tas er å evaluere og sammenligne utvalgte isolater for kommersielt relevante egenskaper, nå for både målrettede og ikke-målrettede fenotyper. for å gjøre dette, må du isolere forestillinger bør sammenlignes i en rekke applikasjonsorienterte spenningstilstander, for eksempel i hydrolysater med forskjellige inhibitor utfordringer og næringsformuleringer, slik at valg av beste samlede stammer som er stabile og robuste til å bred industriell lignocellulose substrat variasjon. i tillegg kan en belastning stabilitet utfordring skal innlemmes i skjermen slik det ble gjort i eksempelet ved å inkludere preculturing trinn involving opprinnelige gjær vekst på to selektive medier, YM agar for flere generasjoner etterfulgt av den syntetiske ODM med 50 g / l xylose i ytterligere 6-7 generasjoner, noe som gir mulighet for destabilisering av ønskede kulturtrekk før eksponering til utfordringen med ytelse i hydrolysat. Basert på betydelige ytelsesfunksjoner, for eksempel etanol yield og xylose-opptaket, blir isolater deretter rangert på hver annen stresset tilstand, for eksempel hver hydrolysat miljø testet, som kan være forskjellig fra isolatet er berikelse dyrkingsmedium. Den dimensjons RPI kan brukes til å beregne den gjennomsnittlige samlede relative utviklingen og graden av isolater som sammenlignes. En dimensjonsløs faktor er hensiktsmessig å reflektere den relative utviklingen i forskjellige typer av hydrolysater og basert på forskjellige ytelsesanalyser, for eksempel utbytter versus priser. Denne rangeringen prosedyre identifiserer stammer som en jevnt god over brede variasjoner i vekstbetingelser og hydrolyzates og er tilbøyelig til å være både robust og genetisk stabil.

Forskjellige iterasjoner og modifikasjoner av denne grunnleggende trinnene kan være nødvendig for å få plass til utviklingen av en hvilken som helst mikrobiell stamme er i stand til spesifikke eller unike ytelsesegenskaper for lignocellulose-hydrolysater eller andre substrater av interesse. I S. stipitis eksempel, er det viktig å merke seg at tilskudd av næringsstoffer, herunder lavkost kommersielle kilder, for å hydrolysater fremstilt ved høye faststoff-fyllinger er nøkkelen til å kontrollere den dynamiske rekkevidden til isolat forestillinger for forbedret statistisk separasjon i løpet av screening. Viktigheten av næringsstoffer til vellykket fermentering av konsentrerte hemmende hydrolysater har også blitt rapportert tidligere, og er antatt å skyldes en forhøyet behov for aminosyrer og andre næringsstoffer som kreves for celle vedlikehold, redoks balansering, og reparasjon som følge av slike stressbetingelser, spesielt under xylose utnyttelse. 9,26,27I tillegg, hvis næringsstoffer er for tynt eller for rikelig, forskjeller i isolat forestillinger, kan være vanskelig å detektere statistisk grunn av alle isolater gjøre over dårlig, eller alt gjør det meget bra, respektivt. Isolater stand til å utføre godt under ulike forhold er forventet å være pålitelig, eller robust overfor variasjoner i industrimiljøer.

Den viktigste begrensning av denne protokollen er at adaptiv evolusjon og screening er veldig bokstavelig i utfallet, ved at "man får hva man beriker og skjermer for". Dermed blir berikelse og skjerm betingelser må være utformet for å forsterke og identifisere enkeltpersoner, henholdsvis med de ønskelige endringer i fenotyper samtidig beholde attraktive eksisterende egenskaper. Evolution kan påvirke ikke-valgt for egenskaper som er avgjørende for industriell ytelse (f.eks vekstfaktor krav). Av denne grunn populasjonen anrikning fremdrift for en egenskap som må periodisk å overvåkeed for andre egenskaper som en metode for feilsøking for uønskede endringer. For eksempel, en av de unike egenskaper av S. stipitis er dens opprinnelige evne til å vokse på og gjære xylose. Alle berikelse og screening substrater inkludert i xylose som eneste eller nøkkel medvirkende karbonkilde i nærvær av inhibitorer. Følgelig er et felles trekk ved alle de berikelse kulturer i dette eksempel var at de direkte valgt for raskere xylose anvendelse av stammer, hvis populasjoner ble mer og mer anriket i serie eller kontinuerlig dyrking fordi de var bedre konkurrenter. Som et ønsket resultat, forbedret stammer var alle i stand til hurtigere xylose opptak, men forbedringer i etanolutbytte var mye mindre dramatisk enn forbedringer i xylose opptakshastighet. Den sistnevnte tendens sannsynligvis skjedde siden etanolutbytte av moderstammen var relativt høy på rundt 0,3 g / g, eller 60% av det teoretiske (0,51 g / g), som cellevekst ble stasjonær i hydrolysater, og etterlater mindre plass forforbedring. I kulturer, kan høyere etanol avkastning være muligens valgt mot fordi etanol er en vekst-hemmer, som nødvendig ytelse overvåking av den utviklede befolkningen for denne egenskapen. Etanolkonsentrasjoner holdt under nivået for vekstinhibering ville ha en tendens til å nøytralisere dette som et utvalg faktor. For S. stipitis NRRL Y-7124, 40 g / l etanol halvdeler spesifikk veksthastighet, mens 64 g / l hindrer veksten fullstendig. 28 I etanol utfordret kontinuerlige kulturer tilføres xylose, lufting ble holdt lav og utvanningsrater ble også holdt lav nok med rikelig xylose til stede i fosterhjem gjæring snarere enn respirasjon av etanol og hindre berikelse for en uønsket etanolbruk eiendom. I tillegg næringstilskudd til hydrolysater som brukes i ytelses skjermene ble nøye utformet for å unngå å velge for stammer som trenger en kostbar rik næringstilgang, slik som gjærekstrakt. Kosttilskudd alltid inkludert laveste kostnads ​​kommersielle kilder tilgjengelig påe, slik som soyamel og urea, selv om rikere komponenter som i YM ble anvendt i tandem kulturer for sammenlignende testing, for eksempel i formuleringene ifølge 60% og 75% PSGHL som normalt er utarme av nitrogen. ODM syntetisk medium, som brukes i forkultur og ytelse kultur skjermer, ble opprinnelig utviklet for optimal ytelse av opphavsstammen S. stipitis NRRL Y-7124 7 i samsvar med kulturmediet optimaliseringsrutinen beskrevet av Traders Protein 20 som anbefaler definerte ingredienser, inkludert vitaminer, mineraler, puriner og pyrimidiner, og aminosyre kilder for å tilføre næringsmidler som er kompatible med kostnadseffektive industriell skala ved å benytte kommersielle kilder. En endelig anbefaling i utformingen av relevante belastninger, er å holde utformingen av berikelse og skjerm forhold som er relevante som mulig til de forventede industriell prosessbetingelser.

Konkurransedyktige på fornybar etanol har lenge vært forfulgt til reduce avhengighet av fossilt brensel. For å bedre evnen til S. stipitis NRRL Y-7124 å tolerere, vokse og gjære hemmende hydrolysater av lignocellulose, har flere forskere brukt repetitive dyrkning i xylose rike brennevin som følge av fortynnet syre-forbehandling av lignocellulose biomasse. 13,14,16,17 Over-kalking å avgifte hemmere var fortsatt behov for å gi en rimelig grad av ytelse av tidlig tilpasset belastning på hardtre og halm forbehandling brennevin. 13,14 Flere gjentatte runder med UV mutagenese og genomet stokking har blitt brukt til å utvikle derivater av S. stipitis NRRL Y-7124 med forbedret inhibitor toleranse og vekst i løvtre brukt sulfitt- lut (HWSSL). 16,17 Imidlertid etanolkonsentrasjoner som er produsert av disse stammer i HWSSL var under 10 g / l etter 6 til 7 dager. Ved hjelp av teknikker vist og beskrevet her, nye utviklet stammer av S. stipitis NRRL Y-7124 ble utviklet for å møte phenotype målene som trengs for økonomisk kommersiell bruk: gjæring av hydrolysater ved pH 5-6 uten forutgående avrusningstiltak, for eksempel over-kalking, noe som fører til kostbare avfallshåndtering; sterkt redusert vekst og diauxic etterslep; etanol ansamlinger høye nok for kommersiell destillasjon (> 40 g / l etanol); raskere vekst og etanol produktivitet enn tidligere rapportert for native gjærstammer fermen undetoxified hydrolysater; og ytelse i ulike hydrolysater ved høy lasting av faste stoffer, inkludert riktig soya nitrogen-supplert SGH (som ellers er nitrogen dårlig) og usupplerte AFEX CSH. De forbedrede stammer utviklet ved hjelp romanen aggressive tilnærminger til utvikling som er nedfelt i de viktigste trinnene oppsummert ovenfor, forventes å dra økonomien i å produsere etanol fra landbruket biomasse ved å redusere driftskostnader, kapitalkostnader, og energi- og vann innganger. Dette er den første belastningen utviklingen plan rapportert å gi tilpasset stammer av S. stipiter å demonstrere økonomisk utvinnbare etanolproduksjon på undetoxified hydrolysater.

De nye stammer av S. stipitis oppstår fra hver fase av utviklingen prosessen (figur 1) er kandidater for fremtidige studier for å fastslå den genetiske endringer knyttet til spesifikke valg press brukt og hvilke mekanismer underliggende hovedfordelene med forbedret hydrolysat gjæring, som hemmer toleranse og redusert diauxic lag. En slik verdifull ny kunnskap vil hjelpe prosjektering av neste generasjons gjær biocatalysts og prosesser for konvertering av lignocellulose til biodrivstoff og andre produkter. Etter hvert som nye stammer er avledet, vil det sannsynligvis være fordelaktig å på nytt passere derivatet populasjonen gjennom en belastning evolusjon protokoll som ligner den som er beskrevet her for å velge de mest nyttige transformantene for kommersiell bruk i hydrolysater. På samme måte som nye mikrobielle stammer oppdages med potensial for å lage en mittriad av nyttige produkter fra fornybare biomasse, kan utviklingen prosessen videre anvendes til å forbedre strekk robusthet og produktivitet i hydrolysater, noe som muliggjør nye bio- katalytiske prosesser og produkter som skal gjøres tilgjengelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour Archer Daniels Midland Co. (ADM) 63160 ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant) Sigma-Aldrich P1300 Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids Becton Dickinson and Company 228830 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan  Sigma-Aldrich T3300 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine  Sigma-Aldrich C7352 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar Becton Dickinson and Company 214010 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract Becton Dickinson and Company 218630 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract Becton Dickinson and Company 212750 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean Fluka P0521-500g multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder Sigma-Aldrich A8626 CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99% Sigma-Aldrich C3506 CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra Sigma-Aldrich G6779 CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99% Sigma-Aldrich T0376 CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99% Sigma-Aldrich U0750 CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS Fisher Chemical D16-500 CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99% Sigma-Aldrich X1500 CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates Becton Dickinson Falcon 351172 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper Kimberly-Clark towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) Corning Life Science Glass 4980-125 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) M1335-0016 multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates Applikon Biotechnology Z365001700 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates Applikon Biotechnology Z365001296 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover Applikon Biotechnology V0W1040027 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover Applikon Biotechnology V0W1040001 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene Applikon Biotechnology ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks Bellco 1924-00032 Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. Bellco 1968-00100 (original Cat. No.) Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven MathisAg Typ-Nbr BFA12 215307 Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer YSI Life Sciences 2900D-UP www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer Bio-Tek Instruments, Inc MQX200R www.biotek.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
  3. Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
  4. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
  5. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
  6. Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
  7. Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
  8. Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
  9. Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
  10. Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
  11. Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).
  12. Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
  13. Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
  14. Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
  15. Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
  16. Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
  17. Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
  18. Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
  19. Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
  20. Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
  21. Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
  22. Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
  23. Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
  24. Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
  25. Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
  26. Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
  27. Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
  28. Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).

Tags

Bioteknologi , Diauxic lag xylose gjæring hemmere relative utviklingen indeks hurtigvoksende gress mais Stover hydrolysat furfural eddiksyre hydroxymethylfurfural
Teknikker for utviklingen av Robust Pentose-fermen gjær for biokonversjon av lignocellulose til Etanol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M.… More

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter