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Bioengineering

Techniques pour l'évolution de la levure robuste Pentose-fermentation pour la bioconversion de lignocellulose en éthanol

Published: October 24, 2016 doi: 10.3791/54227
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Bioenergy Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 2Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 3Chemical Engineering and Material Science, Great Lakes Bioenergy Center, Michigan State University

Summary

Techniques d'évolution et d' isolement adaptatifs sont décrits et démontrés pour produire des dérivés de la souche Scheffersomyces de NRRL Y-7124 qui sont en mesure de consommer rapidement hexose et les sucres mixtes pentoses en enzyme saccharifiées hydrolysats undetoxified et d'accumuler plus de 40 g / L d' éthanol.

Introduction

On estime à 1,3 milliards de tonnes sèches annuelles de la biomasse lignocellulosique pourraient soutenir la production d'éthanol et de permettre aux États - Unis de réduire sa consommation de pétrole de 30%. 1 Bien que la biomasse végétale mélanges rendements d'hydrolyse de sucre riches en glucose et xylose, des inhibiteurs de fermentation sont générés par le prétraitement chimique nécessaire pour briser l'hémicellulose et d'exposer la cellulose pour l'attaque enzymatique. L'acide acétique, furfural et hydroxyméthylfurfural (HMF) sont considérés comme des éléments clés parmi beaucoup d'inhibiteurs qui se forment pendant le prétraitement. Afin de déplacer l'industrie de l'éthanol lignocellulosique avant, la recherche et les procédures pour permettre l'évolution des souches de levures capables de survivre et efficacement fonctionner à utiliser à la fois hexose et les sucres pentoses en présence de ces composés inhibiteurs sont nécessaires. Une faiblesse supplémentaire significative des souches de levures industrielles traditionnelles, telles que Saccharomyces cerevisiae, est l'incapacité de Fermen efficacementt le xylose disponible en hydrolysats de la biomasse végétale.

La souche de type de Pichia NRRL Y-7124 (CBS 5773), récemment rebaptisé stipitis Scheffersomyces, est une levure de fermentation des pentoses native qui est bien connu pour fermenter le xylose en éthanol. 2,3 L'évolution de la souche NRRL Y-7124 a été poursuivi ici parce qu'il a été documenté pour ont le plus grand potentiel de souches de levures indigènes d'accumuler l' éthanol économiquement récupérables supérieure à 40 g / l avec peu de sous - produits de xylitol. 4,5,6 Dans les médias optimal, S. souche stipitis NRRL Y-7124 produit 70 g / L d' éthanol dans 40 heures (1,75 g / l / h) à un rendement de 0,41 ± 0,06 g / g dans des cultures de haute densité cellulaire (cellules 6 g / L). 7,8 Résistance à des inhibiteurs de fermentation de l' éthanol, le furfural, et HMF a également été rapportée, 9 et S. stipitis a été classé parmi les levures pentoses fermentant indigènes les plus prometteurs disponibles pour productio d'éthanol à l'échelle commercialen à partir de lignocellulose. 10 Notre objectif était d'appliquer divers hydrolysats lignocellulosiques undetoxified et des pressions de sélection de l' éthanol pour forcer l' évolution vers un dérivé plus robuste de la souche NRRL Y-7124 adapté aux applications industrielles. Key parmi les fonctionnalités améliorées recherchées étaient plus rapides taux de sucre d'absorption dans les hydrolysats concentrés, réduite diauxy pour une utilisation plus efficace mixte de sucre, et des tolérances plus élevées d'éthanol et d'inhibiteurs. L'application de S. stipitis à hydrolysats undetoxified était un élément clé de la recherche pour éliminer les charges d'exploitation ajoutée associés aux processus de désintoxication hydrolysats, tels que surchaulage.

Deux hydrolysats industriellement prometteuses ont été appliquées pour forcer l' évolution:. Enzyme saccharifié fibres d'ammoniac tiges de maïs hydrolysat d'expansion prétraité (AFEX CSH) et diluer l' acide prétraité panic hydrolysat liqueur (PSGHL) 11,12 technologie de prétraitement AFEX est développé àminimiser la production d'inhibiteurs de fermentation, alors que le prétraitement de l'acide dilué représente la technologie actuelle la plus économique la plus couramment pratiquée pour exposer la biomasse cellulosique pour la saccharification enzymatique. PSGHL peut être séparée de la cellulose restant après le prétraitement, et est typiquement riche en xylose à partir de l'hémicellulose hydrolysée, mais pauvre en glucose. AFEX CSH et compositions PSGHL diffèrent les unes des autres aspects clés qui ont été exploitées pour gérer le processus d'évolution. AFEX HCS est plus faible dans les aldéhydes furaniques et des inhibiteurs de l' acide acétique , mais plus élevé en acides aminés et des sources d'azote ammoniacal par rapport PSGHL (tableau 1). PSGHL présente le défi supplémentaire de xylose étant le sucre prédominant disponible. Ainsi PSGHL convient d'enrichir spécifiquement pour une meilleure utilisation de xylose dans hydrolysats, une faiblesse empêchant l'utilisation commerciale de la disposition de la levure. Même parmi les levures de fermentation de pentoses indigènes, le recours à la xylo du sucre suboptimalese pour soutenir la croissance cellulaire et la réparation devient encore plus difficile dans les hydrolysats en raison d'une variété de raisons:. carences en éléments nutritifs, les inhibiteurs causant des dommages étendus à la cellule intégrité structurelle, et la perturbation du métabolisme en raison de déséquilibres redox 9 azote supplémentation, en particulier sous la forme de les acides aminés, peuvent représenter un coût d'exploitation important pour fermentations. L'impact de la supplémentation en azote sur le dépistage isolat et le classement a été exploré avec hydrolysats panic.

Individus améliorés ont été enrichies dans une population en évolution en utilisant de multiples pressions de sélection dépendent de la diversité génétique naturelle du S. la population et des mutations induites par une exposition stipitis deux divers hydrolysats, l' éthanol ou le rayonnement UV. Des pressions de sélection sont appliqués en parallèle et en série pour étudier la progression de l' évolution de S. stipitis vers les dérivés souhaités capables de croître et de fermenter efficacement des hydrolysats(Figure 1). La mise en culture des populations répétitives fonctionnelles dans les hydrolysats de plus en plus difficiles a été réalisée en microplaques en utilisant une série de dilutions de 12%, soit glucane HCS AFEX ou bien PGSHL préparé à 20% de solides chargement. L'application de la croissance de l'éthanol-contestée sur xylose en culture continue d'améliorer encore les populations de CSH adaptée AFEX en enrichissant des phénotypes démontrant moins de sensibilité à l'éthanol répression de l'utilisation de xylose. Cette dernière caractéristique a été récemment montré problématique à l' utilisation des pentoses par la souche NRRL Y-7124 après la fermentation du glucose. 8 Enrichissement sur PSGHL a ensuite été explorée pour élargir la fonctionnalité hydrolysat.

Des dérivés améliorés putatifs de S. stipitis NRRL Y-7124 ont été isolés à partir de chaque phase du processus d'évolution en utilisant l' enrichissement ciblé dans des conditions de stress et dilution placage pour prélever des colonies de populations les plus répandues. Dimensionless par rapportindices de performance (RPI) ont été utilisés pour classer les souches en fonction de la performance globale, où le comportement cinétique a été évaluée sur les différents types d'hydrolysat et suppléments nutritifs appliqués. Bien que les succès de diverses procédures d'adaptation pour améliorer la fonctionnalité de S. stipitis dans hydrolysats lignocellulosiques ont déjà été documentés, les souches démontrant la production d'éthanol économique sur hydrolysats undetoxified ont pas été signalés précédemment. 13-17 En utilisant les procédures d'évolution à visualiser plus en détail ici, Slininger et al. 18 souches qui sont significativement améliorées par rapport élaboré la souche mère NRRL Y-7124 et sont en mesure de produire> 40 g / l d'éthanol dans AFEX CSH et hydrolysat enzymatique de panic saccharifié (SGH) complété de manière appropriée avec des sources d'azote. Ces nouvelles souches sont des intérêts futurs à la lignocellulose en développement à l'industrie de l'éthanol et en tant que sujets de la génomique supplémentaires d'études bâtimentsur ceux de souche séquencées précédemment NRRL Y-11545. 19 Une étude de la génomique des meilleures souches produites au cours des différentes phases de l' évolution schématisé à la figure 1 serait d' élucider l'historique des modifications génétiques qui ont eu lieu au cours du développement en tant que prélude à d' autres recherches sur l'amélioration de la souche.

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Protocol

1. Préparer à partir de matériaux et de l'équipement pour des essais

  1. Préparer des hydrolysats à l'aide de 18 à 20% en poids sec de la biomasse initiale dans la réaction de pré-traitement destiné à être utilisé dans l'évolution, l'isolement et les procédures de classement. Voir Slininger et al. 2015 18 pour les méthodes détaillées pour préparer AFEX CSH, PSGHL et SGH avec des suppléments d'azote N1 ou N2 utilisés dans l' évolution, l' isolement ou le classement. Voir le tableau 1 pour la composition de chaque type hydrolysat.
    REMARQUE: fortification d'azote du SGH ont été désignés comme SGH-N1 ou SGH-N2 défini comme suit: SGH-N1 = SGH enrichi à 42: Carbone 1 molaire au rapport de l'azote (C: N) avec des sources d'azote, y compris l'urée, un groupe amino libre de vitamine Les acides de caséine, de D, L-tryptophane, la L-cystéine et de vitamines à partir de sources définies (telle que ~ 15% molaire de l'azote N est l'azote amino primaire (PAN) et ~ 85% de l'azote est de l'urée); SGH-N2 = SGH enrichi à 37: 1 C: N avec de l'urée et de la farine de soja comme le plus faible coût source commerciale of acides aminés et des vitamines, fournissant environ 12% de N à partir de PAN et de 88% sous forme d'urée.
  2. Acquérir une culture lyophilisée de la souche mère, NRRL Y-7124 de de Scheffersomyces (CBS 5773) de la Culture Collection ARS (Centre national de la recherche agronomique d'utilisation, Peoria, Illinois), et préparer les cultures de glycérol d'achat d'actions selon les directives. Maintenir cultures stock de la levure mère et de ses dérivés dans 10% de glycérol à -80 ° C.
    1. les stocks Streak de glycérol à la levure de malt peptone dextrose (YM) gélose (3 g / L extrait de levure, 3 g / L d'extrait de malt, 5 g / L de peptone, 10 g / L de dextrose, 20 g / L d'agar) et incuber 48- 72 h à 25 ° C. 8 plaques développés peut être stocké jusqu'à une semaine à 4 ° C avant l'utilisation en tant que liquide inoculum pré-culture.
  3. Préparer Optimal Défini Medium (ODM), un milieu synthétique compatible avec les procédures de formulation industrielle 20 qui a déjà été mis au point pour la conversion optimale de xylose en éthanol par la str mèreain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. 7 Utilisez le milieu défini dans toutes les précultures et cultures pour la fermentation bioessais de performance et aussi pour l' éthanol en cause, l' évolution de la culture continue xylose nourris. Composition ODM est répertorié pour référence dans le tableau 2.
  4. Comme décrit précédemment, 18 analyser la biomasse cellulaire à l' aide d' un spectrophotomètre de lecture cuvette- ou micro-plaque, le cas échéant, pour mesurer la culture de l' absorbance à 620 nm (A 620). Quantifier les sucres, l'éthanol, le furfural, l'hydroxyméthylfurfural (HMF) et de l'acide acétique dans des échantillons de culture en utilisant une Chromatographie haute performance en liquide (HPLC) ou la détermination enzymatique du glucose robotique et le xylose pour un débit plus élevé.

2. Enrichir Dérivés robustes lors du transfert de série sur AFEX CSH

  1. Inoculer une préculture de la souche NRRL Y-7124. Transfert des cellules de gélose YM à 75 ml ODM + 150 g / L de xylose pour maintenir la capacité de croître sous ole stress smotic. Incuber précultures dans 125 ml des flacons fermés avec une éponge de silicium bouchons 24 h à 25 ° C sous agitation (150 tours par minute, 1 orbite ").
  2. aliquotes Décongeler de 6-12% glucane CSH AFEX dans l'eau froide pour l'utilisation. Ajuster le pH à 5 en cas de besoin et stériliser par filtration avant de préparer une série de dilutions dans 96 puits.
  3. Remplissez microplaques avec 50 pi par puits et 8 puits par dilution hydrolysat, puis ensemencer avec quelques microlitres de préculture par puits pour permettre une absorption initiale (620 nm) A 620 ≥0.1. Incuber plaques statiquement 24-48 h à 25 ° C dans une boîte en plastique avec une serviette en papier humide pour l'humidité.
  4. Utilisation de la dilution hydrolysat la plus concentrée qui visiblement a grandi à A 620> 1, le transfert 1-5 ul à chaque puits d'une nouvelle série de dilution hydrolysat pour atteindre initiale A 620 ≥0.1.
  5. Surveiller la croissance de la culture de 620 A en microplaques avec un spectrophotomètre. Une série de dilution non ensemencé serfs comme un contrôle et vierge. couvercles de plaques sont laissés sur pendant la surveillance pour prévenir la contamination, et les lectures ajustées en conséquence.
  6. Préparer des stocks de glycerol de cultures d'adaptation régulière pour l'isolement subséquent de souches améliorées ou pour une utilisation dans reinoculating la série de dilutions hydrolysat continue. Pour préparer les stocks, piscine quatre puits (200 pi) de la plus grande concentration d'hydrolysat colonisé. Mélanger 1: 1 avec 20% de glycérol stérile dans cryotubes, de geler les cellules dans 10% de glycérol à -80 ° C.
  7. Répétez les étapes 2.3-2.6 jusqu'à la croissance de 12% glucane CSH AFEX est toujours visible à 24 h.

3. Isoler seule cellule Dérivés tolérantes après enrichissement sur AFEX CSH

  1. Streak choisi stocks de glycérol de cultures d'adaptation à la gélose YM, et l' utilisation des stries pour inoculer 50 pi de 3% ou 6% glucane AFEX CSH (pH 5) dans chacun des trois puits de microplaques (initiale A 620 ~ 0,1). Incuber microplaques 24 heures comme à l'étape 2.3. Piscine répliquete colonisée puits à la plus grande force hydrolysat avec une forte croissance, et la plaque de dilution à YM ou 6% glucane CSH agar AFEX. Préparer celui-ci comme un mélange 1: 1 de 12% stérilisé par filtration glucane HCS AFEX avec une solution chaude / L d'agar-agar 30 g autoclavée.
  2. Choisissez 5 colonies isolées de la plus haute plaque de dilution montrant la croissance après 24-48 heures d'incubation à 25 ° C pour congeler sous forme de cultures de glycérol d'actions. Streak chaque colonie à une plaque de YM. Incuber 24 h. Avec une boucle stérile, transférer une série développée de cellules à un petit volume de 10% de glycérol, mélanger de suspendre les cellules, et distribuer à 2-3 cryovials pour la congélation à -80 ° C.

4. Évaluer le rendement des AFEX CSH Derivatives tolérantes par rapport au parent

  1. Test de Isole en simples Cultures 6% glucane AFEX CSH Batch.
    1. Cellules de transfert de 48 plaques h striés de stocks de glycérol à pH tampon phosphate 7 de potassium (0,4 mM) pour préparer des suspensions cellulaires avec A 620 = 10. Utiliser 1 pl dechaque suspension pour inoculer chacun des quatre puits de 50 ul 3% hydrolysat glucane initiale A 620 = 0,2. Incuber microplaques 24 heures comme à l'étape 2.3. Préparer le glucane CSH 3% AFEX à pH 5 par dilution de 12% glucane CSH AFEX 1: 3 avec de l'eau stérile.
    2. Transfert deux puits 24 heures de microplaques pour inoculer 25 ml précultures de pH 5 à 12% glucane CSH AFEX utilisés à 50% de la pleine puissance. Incuber précultures dans 50 ml flacons avec silicium fermetures d'éponge pour 24 heures à 25 ° C, ~ 150 rpm (1 orbite ") Préparer la demi-force 12% glucane CSH AFEX en diluant l'hydrolysat 1: 1. Avec de l'eau stérile.
    3. Utilisez demi-force précultures hydrolysat pour inoculer 25 ml de cultures de croissance similaires à initiale A 620 = 0,1. Incuber les cultures en croissance comme ci-dessus (4.1.2) et l'échantillon par jour (0,2 ml). Les accumulations de moniteur de biomasse (A 620) et les concentrations des sucres et des produits de fermentation (HPLC).
  2. Alternativement, repitch (ie, la récolte et reuse) populations de 6% glucane AFEX levure CSH cultivées pour les tests dans 8% glucane cultures par lots hydrolysat, comme décrit précédemment. 18
  3. En variante, d' autres populations d'essai de 6% repitched glucane cultures de CSH AFEX en alimentant avec 12% d' hydrolysat glucane, comme décrit précédemment. 18
  4. Testez lag diauxic des isolats dans des cultures discontinues de ODM avec des sucres mixtes.
    1. Inoculer 75 ml précultures de l'ODM avec 150 g / L de xylose dans des flacons de 125 ml avec des fermetures en silicone éponge par transfert en boucle à partir YM stries de glycérol. Incuber 24 h comme dans l'étape 2.1.
    2. Utiliser précultures pour inoculer des cultures de 75 ml d'essais similaires avec l'ODM contenant 75 g / L de glucose et 75 g / L de xylose à un pH de 6,5. Agiter les flacons à 25 ° C, 150 tours par minute. Exemple de tous les jours.
    3. En variante, tester l'impact de 0-15 g / acide acétique à L diauxy lors de la fermentation du glucose et du xylose en utilisant un protocole similaire, à l'exception du pH initial est réglé à 6,0 ± 0,2 dans des cultures d'essai pour maintenir le pH du 7/6sonner la consommation d'acide acétique, comme décrit précédemment. 18

5. Appliquer la culture continue à sélectionner pour l'éthanol contesté xylose Utilisation

  1. ODM préparer le milieu d'alimentation de culture en continu avec de 60 à 100 g / L de xylose, de 20 à 50 g / l d'éthanol à un pH de 6,3 ± 0,2. Choisir des combinaisons de xylose et de l' éthanol pour simuler la fermentation partielle de 150 g / L de xylose, en supposant un rendement potentiel de ~ 0,5 g d' éthanol / g de xylose et pour tenir compte du potentiel de 50 à 70 g / l d' éthanol à se produire. 8
  2. Afin de préparer l'inoculum de culture en continu, le transfert d' un représentant colonie HCS tolérant AFEX (analogue à la colonie 5 dans l' exemple, la figure 1) en boucle d'une plaque de YM 48 h à 75 ml de l'ODM exempt d' éthanol (100 g / L de xylose, dans ce cas) dans 125 ml flacons. Incuber à 25 ° C, 150 tours par minute (1 "orbite) pendant 24 heures. Choisissez la concentration de xylose ODM préculture pour correspondre à celle du volume de maintien de la culture continue initiale.
  3. Inoculer une culture en continu du volume de maintien de l' ODM à un pH de 6,3 ± 0,2 avec 100 g / L de xylose + 20 g / L d' éthanol avec ~ 5 à 10 ml d'un concentré de pré - culture d'un isolât AFEX tolérant HCS (analogue à Colony 5, la Figure 1 ) pour obtenir 100 ml lors de la première A 620 ~ 0,5. Maintenir la culture de maintien du volume (V R), à 25 ° C dans une centrifugeuse chemisé 100 ml ballon agité à 200 tours par minute , et équipé d' une électrode de pH stérilisable, régulateur de pH et de faire circuler le bain d'eau à température contrôlée.
  4. Dans un premier temps, étant donné que la croissance des cellules sera lente en raison de l'exposition à l'éthanol, mis en place le moyen d'alimentation à la dose en utilisant une pompe à pH actionné. Régler la pompe pour alimenter pH 6,3 ODM avec 100 g / L de xylose et 50 g / L d'éthanol lorsque la fermentation de la culture chute du pH à 5,4, ce qui arrête en outre la chute du pH. Maintenir le volume à 100 ml avec une pompe d'effluent en continu d'écrémage de la surface de culture. Par conséquent, la concentration en éthanol augmente avec le métabolisme et la poursuite de l'alimentation. Mesurer l' effluent et prélever des échantillons (1-2 ml) à partir de cultures en continu toutes les 48-72 heures pour l' analyse de la concentration de cellules viables, des produits et des substrats, comme décrit précédemment. 18 Pour trouver la concentration de cellules viables, faire des dilutions en série 1:10 d'échantillons dans tampon (voir 4.1.1) et la plaque de propagation des dilutions à la gélose YM (voir 1.2.1). Sur la base des taux de collecte des effluents (Q), calculer le taux de dilution (D) (Q / V R), et, dans l'exemple de S. stipitis, elle varie de 0 à 0,01 h -1.
  5. Enregistrer les stocks de glycérol régulièrement en isolant à partir de plaques de viabilité des dilutions d'échantillons tamponnés formant 30-100 colonies, ce qui représente les colons robustes les plus répandues à l'époque de l'enrichissement. plaques d'inondation avec ~ 5 ml de glycérol à 10% pour permettre la préparation des cryotubes en double. Pour l'entretien ou un répit, arrêter la culture continue et redémarrez au besoin en utilisant la plus récente (résistant) stock de glycérol (s).
  6. Pour redémarrer, série du stock de glycérol (s) de la plupartpopulations résistantes à la gélose YM et transférer 24-48 cellules h par boucle à une pré-culture de l'ODM exempt d'éthanol pour l'incubation comme ci-dessus. Inoculer les 100 ml de maintien du volume d'ODM initiale A 620 0,5 en utilisant un concentré de la levure précultivé, et permettre à la culture de se développer en discontinu jusqu'à la phase stationnaire avant que le flux de milieu d'alimentation est redémarré.
  7. Si les cultures peuvent croître de façon constante à> 0,01 h -1 sur xylose en présence de> 25 g / L d' éthanol, commencer l'alimentation continue de la culture (ODM + 60 g / L xylose + éthanol allant de 30 à 50 g / L) à un faible taux de dilution ~ 0,01 h -1 à 100 ml de volume de retenue (initialement ODM + 60 g / L de xylose + 20 g / l d' éthanol). Au fil du temps, augmenter l'éthanol dans l'alimentation vers 50 g / L. Capturez populations avancées dans les stocks de glycérol.
    NOTE: Le maintien du taux de dilution faible permet la formation d'une concentration cellulaire suffisamment élevée pour réduire la disponibilité de l'oxygène et le soutien fermentation.
  8. Eventuellement, appliquer ultra-violet (UV) irradiation mensuelle de glycérol populations d'actions utilisées pour reinoculate cultures continues.
    1. colonies Resuspendre de glycérol disponible stries dans 10 ml d'ODM (comme dans précultures) avec 60 g / L de xylose, et mettre en commun tous les stocks dans un seul flacon stérile. Appliquer la suspension de cellules regroupées à ~ 5 x 10 8 cellules viables / ml pour couvrir tout le fond des boîtes de Pétri 4-5 avec 6 ml / plaque. Pour obtenir 6 ml couverture d'une plaque de Pétri jetable standard, passer de 15 ml pour surmonter la tension de surface, puis retirez 9 ml.
    2. Exposer chaque plaque de culture ouverte aux UV de la source lumineuse dans une enceinte de sécurité biologique. Réglez le temps d'exposition aux UV ou de distance pour obtenir le taux de destruction souhaité> 90%. Ici, exposer pendant 45 min à environ 56 cm de la source.
    3. Diluer des suspensions cellulaires de la plaque avant et après irradiation. taux de destruction d'estimation basée sur les unités formant colonie. Pour le S. stipitis exemple, le taux de destruction était ~ 97%.
    4. Transférez les cultures exposées aux UV (24-30 ml) à une feuille-covEred ballon de 50 ml, et incuber à 25 ° C et 150 rpm pendant 24 heures pour permettre le faible pourcentage de cellules viables à repeupler à ~ 1 x 10 8 S. viable stipitis cellules / ml. En empêchant les réactivations de photos, le couvercle de la feuille conserve les mutations alors que les cultures sont incubées.
    5. Utiliser la culture mutagénisé repeuplée pour inoculer des cultures en continu à 1 x 10 ~ 7 cellules viables / ml. Redémarrez l'ODM + 60 g / L milieu xylose alimentation en éthanol enrichi pour poursuivre le processus de sélection.

6. Évaluer Glycerol Stock populations et identifier ceux qui ont amélioré xylose Fermentation en présence d'éthanol

  1. Streak sélectionné cultures glycérol sur actions à l'agar YM comme la première étape dans l'écran pour une meilleure croissance et la fermentation de xylose en présence d'éthanol.
  2. Transfert chaque population a évolué à cribler de stries de gélose à 75 ml précultures dans ODM avec 150 g / L de glucose, et incuber dans 125 ml flacons 96h avant l'utilisation comme inoculum pour des cultures d'essai. Les grandes populations de glucose cultivées nécessiteront l'induction d'enzymes pour l'utilisation de xylose.
    1. Pour tester l' induction, la récolte de chaque culture, de suspendre les cellules à 30 ml, initiale A 620 de 40 ODM +60 g / L xylose + 30-45 g / L d' éthanol, et incuber à 25 ° C, 150 rpm (1 orbite ") dans des flacons de 50 ml avec du silicium fermetures d'éponges. prélever des échantillons deux fois par jour pour le suivi de l'absorption du xylose par analyse HPLC.
  3. En variante, comme décrit dans Slininger et al., 18 pour évaluer la croissance sur du xylose en présence d'éthanol, de préparer précultures de chaque population élaborée par transfert en boucle à 75 ml d'ODM avec 150 g / L de xylose dans 125 ml en flacons, et incuber 96 h à 25 ° C, 150 tours par minute (1 "orbite). inoculer des cultures d'essai à une première basse A620 de 0,1 dans 25 ml d'ODM + 60 g / L de xylose + 30 à 45 g / L d' éthanol dans des flacons de 125 ml. On incube flacons à 25 ° C, 300 rpm, 1 orbite "et de l'échantillon.

  1. Sur la base des résultats de l'étape 6, sélectionnez glycérol populations d'actions montrant une capacité supérieure à croître sur et fermenter le xylose en présence d'éthanol. Utilisez-les pour plaques streak. Les plaques de balayage sont utilisées pour préparer des suspensions denses de cellules mises en tampon de A = 620 5. Ensuite les suspensions de cellules sont utilisées pour inoculer des précultures dans des plaques de 96 puits profonds à A 620 = 0,5. Inoculer 1 ml précultures sur PSGHL mélangés 1: 1 avec de l'ODM + 50 g / L de xylose (pas d'éthanol). Incuber précultures dans 96 puits, des plaques à puits profonds avec faible évaporation ventilée couvre pendant 48 heures à 25 ° C, 400 rpm, 1 orbite ". Différentes séparées populations de glycérol d'actions par puits vides.
  2. En utilisant chaque préculture, inoculer seize 1 ml répliquent cultures initiale A 620 ~ 0,5 à 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L de xylose avec 20, 30 ou 40 g / L d' éthanol pour enrichir les colons tolérantes. Incuber cultu enrichissementres est similaire à précultures.
  3. Pour chaque glycérol stock différent, récolter les puits de culture avec une concentration d'éthanol plus élevée permettant l'utilisation de la croissance et le xylose. Plate chaque lignée cellulaire à la gélose YM pour obtenir des colonies isolées prévalentes pour préserver dans le glycérol. Choisissez dix colonies par lignée cellulaire et chaque série à une plaque de gélose YM pour la préparation de glycérol stock.

8. Enrichissez plus robuste Evolved Souches lors du transfert de série sur PSGHL, comme pour AFEX CSH

  1. Préparer des pré-cultures de NRRL Y-7124 (parent), AFEX tolérant HCS a évolué d'isoler et de culture en continu évolué population ayant une capacité accrue à utiliser le xylose en présence d'éthanol. Inoculer 75 ml d'ODM + 150 g / L de xylose par boucle à partir de glycérol disponible stries comme décrit ci-dessus (étape 2.1) pour le processus d'adaptation hydrolysat AFEX CSH.
  2. PSGHL diluer avec de l'eau pour fournir une série de concentrations croissantes. Préparer un 96 puits de micro-plaques pour chacune des trois lignées cellulaires en utilisant chaquedilution PSGHL pour remplir 8 puits avec 50 ul. Utiliser chaque préculture pour inoculer 50 ul de micro-culture de la série de dilution initiale A 620 ~ 0,1 à 0,5.
    1. Continuer l'évolution de la levure dans l' augmentation des forces de PSGHL en utilisant la même procédure que l'adaptation hydrolysat AFEX CSH détaillé ci - dessus (étape 2) jusqu'à ce que les cultures sont capables de croître dans l'hydrolysat pleine puissance à un niveau stable ratio moyen 14-d de AA 620 par Δtime que les transferts en série se poursuivent quatre mois supplémentaires.

9. Isoler colonies de cellules uniques Utilisation PSGHL Dégradés avec ou sans éthanol Défi

  1. Obtenir une seule cellule isole directement de pleine PSGHL résistance finale plaques d'adaptation par dilution et étalement de gélose YM. Choisissez dix grandes colonies pour chacune des trois lignées cellulaires et bar série à plaques YM pour préparer des stocks de glycérol comme décrit précédemment (étape 3.2).
  2. Eventuellement, explorer des points de temps plus tôt dans leprocessus d'évolution, en isolant à partir des stocks de glycerol stockées des trois lignées cellulaires.
    1. Inoculer une préculture pour chaque lignée cellulaire par boucle à partir du stock de glycérol stries et incuber 24 h sur 30 ml ODM + 50 g / L de xylose (50 ml flacons, 25 ° C, 150 rpm).
    2. Les cellules du Défi de précultures à la croissance en hydrolysat par inoculer 50 ul de 50% PSGHL dans les puits de microplaques à une première A 620 ~ 0,2 et incubation statiquement 48 h.
    3. Étaler 0,1 ml de chaque culture enrichi sur des plaques de gélose de gradient de PSGHL allant de 0 à 50% d'hydrolysat de force (délivrant ~ 300-400 cellules viables par plaque), et ramasser 10 colonies isolées par la lignée cellulaire de la possible zone la plus élevée de concentration hydrolysat du gradient . 21 Streak choisi colonies à YM pour la préparation du glycérol boursier comme dans l' étape 3.2.
    4. Comme une alternative à l' étape 9.2.3, au lieu d'inoculer des plaques de gélose à gradient, inoculer des puits de 96 puits de micro-plaques initiale A 620 ~ 0,2, WHEre les puits sont conçus pour contenir une gamme de concentrations d'hydrolysat de 50 à 100% Résistance à l'éthanol et entre 10 et 40 g / l. Dans ce cas, développer des micro-plaques 72-96 h et autrement que dans l'étape 2.3. Isoler dix colonies isolées dans des puits les plus difficiles combinaisons hydrolysat-éthanol montrant la croissance par dilution et étalement, et de préparer des stocks de glycérol comme dans l'étape 3.2.

10. Dans un écran primaire, Eliminate isolements Inferior en comparant et classement Performances sur PSGHL à deux conditions nutritives

  1. Appliquer un puits profond écran de plaque à haut débit de performances PSGHL à l' écran cinq ensembles de trente isolats avec NRRL Y-7124 parent et isolat AFEX CSH tolérantes (analogue à Colony 5 de l'exemple de la figure 1 de l' évolution) en tant que témoins de choisir six premières souches (20%) à partir de chaque jeu pour passer au niveau de criblage secondaire (étape 12).
  2. Effectuer l'écran dans des plaques de puits profonds remplis 1 ml par puits et wi couvertse couvercles en acier inoxydable avec silicone noir bas joints par évaporation. Fixer toutes les plaques à la carte de l'incubateur / agitateur et fonctionner à 25 ° C et 400 tours par minute (1 "orbite shaker). Conception tout puits profond assiette de remplissage des modèles pour permettre la séparation des différents isolats par des puits ouverts.
  3. Pour commencer les cultures, choisir un cordon de cellules de stries de glycérol préparées à partir de 30 isolats obtenu comme ci-dessus (dans les étapes 3, 7 et 9) pour doubler les puits des ODM + 50 g / L de xylose et incuber 48 h.
  4. En tant que moyen pour préculture isolats de défi, préparer 50% PSGHL en mélangeant PSGHL 1: 1 avec ODM + 10 g / L de glucose + 50 g / L xylose. Pour le dépistage de 30 isolats et deux souches de contrôle, 2 plaques avec 2 puits par chacun des 16 isolats sont remplis, laissant des puits vides entre les différents isolats.
  5. Pour les cultures de provocation, de transfert, d' un volume de 50 ul d'ODM précultures (A 620 ~ 10) à chacune des deux 50% des puits de culture de provocation PSGHL pour chacun des isolats et des contrôles afin d' obtenir un initial A 620 ~ 0,5 et incuber 72 h.
  6. Utilisez deux milieux d'essai de différentes richesse nutritionnelle pour le dépistage des isolats: 60% PSGHL + ODM nutriments; et 75% PSGHL + nutriments ODM + YM. Ajouter les éléments nutritifs ODM (à l'exclusion des sucres) à la moitié de la force en tant que norme pour les ODM utiliser avec 50 g / L de sucre (étape 1.3). Désigné, ajouter des éléments nutritifs YM (à l'exclusion des sucres) à la moitié de la dose standard de 3 g / l d'extrait de levure, 3 g / l d'extrait de malt, 5 g / l de peptone.
  7. Inoculer cultures d'essai en transférant 50 ul de 72 h 50% challenge PSGHL pré-cultures pour inoculer 1000 pi à initiale A 620 ~ 0,5 dans cinq puits profonds pour chacun des deux milieux de test.
  8. Échantillon chaque isolat quotidienne. Pipeter le contenu d'un puits dans un tube microfuge et centrifugeuse (5533 x g, 15 min) pour obtenir le surnageant pour l'éthanol, le glucose et le xylose analyse à haut débit. Mesurer la biomasse comme 620 dans 96 puits de micro-plaques (200 pl / puits) avec un spectrophotomètre.
  9. Au sein de chaque ensemble de 30 estolates testé (5 sets pour NRRL Y-7124 de S. évolué souches), calculer des indices de performance relatifs (RPI) , comme décrit dans l' étape 11 ci - dessous et utiliser pour classer chaque souche basée sur le rendement de l' éthanol (éthanol maximale cumulée par le sucre initial fourni) et taux d'absorption du xylose (concentration de xylose consommé par initial 96 h) sur les deux supports de test.

11. Rang Isole dans l'écran PSGHL primaire Utilisation Indice de Performance relative (RPI)

  1. Après le dépistage primaire, calculer les indices de performance relatifs adimensionnels (RPI) afin de classer les 30 isolats dans chacune des cinq expériences différentes à l' écran isole sur PSGHL avec deux formulations différentes de nutriments par expérience, à savoir, 60% PSGHL et 75% PSGHL.
  2. Calculer le paramètre statistique F pour une utilisation dans le classement des performances isolat au sein d' un groupe d'isolats testés dans une expérience donnée: F = (XX moyenne) / s. Ici, X est le paramètre de performance, telles que le rendement (Y)ou le taux (R), observé pour chaque isolat individuel, tandis que X avg et s sont l'écart moyen et standard, respectivement, de X observée pour tous les isolats dans une expérience donnée. Pour les distributions normales, -2 <F <2.
  3. Pour chaque isolat dans une expérience, calculer la performance relative en fonction du taux, RPI R = (2 + F R) × 100/4, et calculer de la même performance relative en fonction du rendement, RPI Y = (2 + F Y) × 100/4 . La valeur de RPI varie de ~ 0 à 100 percentile (plus bas au plus élevé). Ensuite , calculer les moyennes RPI pour chaque isolat au sein d' une expérience hydrolysat donnée comme suit: RPI = avg (RPI Y + RPI R) / 2, où les contributions de rendement et de taux sont donnés pondération égale dans cette application.
    Notez que, en général, les paramètres de rendement et de taux peuvent être pondérés si elle est jugée inégale importance.
  4. Calculer RPI globale à travers les n types d'hydrolysats testés: RPI globale i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n. Considérez chaque isolat dans un ensemble expérimental de 30 isolats et 2 contrôles. Au cours de classement primaire du ~ 150 unique colonie isolats adaptés aux xylose riches PSGHL, le RPI global est calculé pour les taux et les rendements à travers les deux formulations de PSGHL appliquées dans l'écran, soit 60% PSGHL et 75% PSGHL, où n = 2.
  5. Sur la base de RPI globale dans chaque expérience, choisissez le pourcentage supérieure des isolats de passer à l'écran secondaire. Dans cet exemple, les 20% des souches sont choisies pour passer à travers (soit 30 de 150 testés).

12. Dans un écran secondaire, Comparer les artistes interprètes ou exécutants d'écran primaire Top sur plusieurs hydrolysats complète (> 100 g / L de sucres mixtes) pour révéler le plus haut Fonctionnement Souches robustes

  1. Comparez les plus performants de PSGHL sur 6% glucane CSH AFEX et SGH modifiée avec deux niveaux d'azote, SGH-N1 et SGH-N2 (compositions comme dans le tableau 1) pour le classement final. Tamiser les 30 isolats qui ont été les plus performants dans l'écran de plaque de puits profond primaire de PSGHL (étapes 10 et 11) et les deux contrôles (souche mère NRRL Y-7124 et isolat AFEX CSH tolérantes (analogue à Colony 5, Figure 1 exemple ).
  2. Commencer les cultures en choisissant une bille de cellules à partir des stries de glycérol à reproduire des puits profonds de 1 mL ODM + 50 g / L de xylose comme précédemment et incuber pendant 48 heures dans le système de plaques à puits profonds (étape 10.2). Puis transférer 50 pi de précultures ODM à 50% des cultures de provocation SGH, et incuber dans le système de plaque de puits profond pendant 72 heures pour obtenir A 620 à ~ 10). Préparer les 50% SGH en mélangeant SGH 1: 1 avec de l'ODM sans sucre + 50 g / L de xylose (pH 5,6).
  3. Pour chacun des isolats inoculer une aliquote de SGH-N1 ou SGH-N2 16 ml avec le culot cellulaire (15 min, 2711 x g) à partir de trois puits de culture de provocation pour donner culture d'essai initiale A 620 ~ 2,0. Incuber cultures d'essai à 25 ans & #176;. C, 180 rpm (1 «orbite) dans 25 ml flacons avec fermeture silicone éponge flacons exemples quotidiens et d'analyser par l'écran PSGHL.
  4. De même, l'écran isole comme dans les étapes 12.2 et 12.3, mais cette fois substitut SGH-N1 et SGH-N2 avec 6% glucane CSH AFEX à pH 5,2 pour une utilisation dans la préparation du milieu de milieu de culture de défi et de la culture d'essai. Pour les cultures de provocation de la force 50%, utiliser 6% AFEX CSH dilué 1: 1 avec de l'eau, car il est suffisamment d'azote sans amendement.
  5. Répétez les étapes de 12,1 à 12,4 pour reproduire les résultats.

13. Classement des performances des isolements dans l'écran secondaire Utilisation RPI globale à taux d'utilisation multiple hydrolysats complète

  1. Calculer les indices de performance relatifs (RPI) afin de classer chacun des 20% des isolats (~ 30 sur 150) à partir de l'écran principal qui ont été testés dans l'écran secondaire sur enzyme saccharifié formulations hydrolysat de différentes richesse nutritionnelle.
  2. Note chaqueisolat testé dans l'écran secondaire sur la base du taux d'absorption du xylose et le rendement en éthanol effectué sur trois formulations d'hydrolysats enzymatiques-saccharifié prétraité exécuter en double exemplaire, y compris AFEX CSH (i = 1 et 2), SGH-N1 (i = 3 et 4) et SGH -N2- (i = 5 et 6).
  3. Calculer le RPI global pour chaque isolat, et appliquer ce paramètre classement pour vanner davantage la liste des isolats supérieurs: RPI globale = Σ i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n, où n = 6 .
    NOTE: Démontrer la cinétique d'isolats supérieurs dans hydrolysats SGH-N2 dans des cultures en flacons en suivant les procédures décrites dans Slininger et al 18.

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Representative Results

S. stipitis a évolué en utilisant des combinaisons de trois cultures de sélection, qui comprenait AFEX CSH, PSGHL et culture continue xylose-fed éthanol contesté. La figure 1 montre le schéma des expériences d'évolution réalisées avec les isolats trouve soit d'effectuer le plus efficacement dans l' ensemble, ou plus efficacement sur l' un des hydrolysats testés. le tableau 3 présente les numéros d'accession NRRL de ces isolats supérieurs et résume les contraintes d'adaptation appliquée dans le procédé de réalisation de la population enrichie à partir de laquelle chaque souche a été isolée. Certains isolats ont été considérés comme ayant la performance relative supérieure sur un ou deux types d'hydrolysat, mais 7 sur 11 isolats obtenu de bons résultats sur tous les types d'hydrolysat, même si la plupart d'entre eux ont été exposés et contesté par un seul type au cours de l'évolution. Les succès des différentes approches évolution prises ici sont démontrées dans les figures 2 -7 et dans le tableau 4.

La figure 2 illustre les améliorations distinctes observées après la première phase d'adaptation dans laquelle les dérivés solides de la souche NRRL Y-7124 ont été enrichis pendant le transfert de série à des concentrations de AFEX CSH (étape 2) de plus en plus. Dans les cultures en croissance à 6% glucane HCS AFEX, la population évoluée montre plus rapide accumulation et les titres définitifs plus élevés d'éthanol que la souche mère. Plus l'utilisation du glucose rapide est également vu le long avec plus l'absorption de xylose rapide immédiatement après l'épuisement du glucose. En outre sur la figure 3, la stabilité de la population fonctionnalités modifiées est démontrée dans le milieu ODM synthétique avec un mélange de 87 g / L de glucose et 66 g / L de xylose. Dans ce cas, à la fois la population enrichie (figure 3B) et des colonies isolées (Colony 1 et Colony 5, la figure 3C et 3D, respectivement) sont en mesure de surperformer la souche mère en utilisant le xylose plus efficacement pour faire de l'éthanol plus rapidement, ce qui réduit le temps de pic d'éthanol d'au moins 4 jours. De manière significative des concentrations d'éthanol plus élevés ont été accumulés par les souches évoluées sur ODM (55-60 g / L) par rapport à la société mère (40-45 g / L). Les mutations, qui ont conduit à un phénotype stable de diauxy réduite lors du passage du glucose-xylose et le xylose plus efficace fermentation, se levèrent comme la population de levure a évolué en AFEX CSH.

D'autres améliorations à Colony 5 ont été poursuivis en le soumettant à la sélection naturelle en culture continue xylose nourri en présence d'augmenter les niveaux d'éthanol jusqu'à 50 g / L. Sous cette condition, la population de levure retenue dans la culture continue doit être capable d'induire des enzymes pour l'utilisation de xylose comme seule source de carbone afin qu'elle soit en mesure de croître à un rythme suffisamment élevé pour remplir le fermenteur en dépit d'une dilution constantetaux. Dans la souche mère, l'induction d'enzymes xylose commence à être inhibée à des concentrations d'éthanol aussi bas que 15-20 g / L. 8 dérivés de Colony 5 ont été capturés dans les stocks de glycérol à des points au début et à la fin de temps de fonctionnement de la culture continue, et la figure 4 montre l'amélioration de l'utilisation réussie du xylose en présence de 40 g / l d' éthanol observée dans des dérivés évolués de colonies 5 par rapport à la NRRL Y-7124 parent et la colonie initiale 5 inoculé dans le procédé.

Les isolats provenant de toutes les phases du schéma d'adaptation de la figure 1 ont été criblées en PSGHL pour identifier ceux qui ont une capacité supérieure à fermenter le xylose (étape 10.1). Les isolats représentés sur la figure 5 sont parmi les plus performants sur PSGHL sur ~ 150 classés dans cet écran primaire et dans tous les écrans secondaires de performance tel que décrit ci - dessous. Pour indiquer l'amélioration des isolats évoluéspar rapport à son parent, la performance de chaque isolât a été exprimé par le rapport des valeurs des paramètres cinétiques de l'isolât de la souche mère. Valeurs de rapport de «un» se sont produits si la performance de l' isolat était équivalente à la mère. Les figures 5a et 5b résument top isoler des performances sur 60% et 75% des forces de PSGHL avec ODM ou ODM + YM suppléments nutritifs. Comme la concentration hydrolysat et la dureté a été augmenté, les ratios de performance ont diminué. Dans la force PSGHL 60%, cinq des sept isolats top exposés à la pression de sélection PSGHL effectuée plusieurs fois mieux que NRRL Y-7124 (isoler 1). Quatre isolats de meilleurs résultats que Colony 5 (isolat 33), qui avait évolué au cours de l'exposition à AFEX CSH mais n'a eu aucune exposition sélective antérieure à PSGHL. Cependant, dans la force de 75% des PSGHL, seulement 3 isolats ont dépassé de manière significative à la fois la mère et Colony 5 (isolat 33) malgré les éléments nutritifs ajoutés. Parmi ceux-ci, supérieur isolats 15 et 16 étaient previously provoqué avec des concentrations croissantes de PSGHL comme une pression de sélection de guidage d'évolution. Isole 15, 14 et 3 ont été seulement exposés à PSGHL, tandis que 11, 13 et 16 avaient des expositions multiples. Isole 3, 11, et 13 étaient des points de temps antérieurs au cours de l'évolution sur PSGHL et avait donc un peu moins de chance de développer la tolérance par rapport à 14, 15 et 16. Bien qu'il soit évident à la figure 5 que le transfert série de forces croissantes de PSGHL servi de développer des souches robustes à son environnement inhibitrice, il est également évident que l'exposition de la souche mère NRRL Y-7124 à AFEX CSH seul pourrait potentiellement générer des isolats tels que Colony 5 (33) avec une tolérance croisée à PSGHL. Ainsi, il a été indiqué que les souches solides capables d'effectuer en plusieurs hydrolysats peuvent être trouvées par l'enrichissement de la tolérance dans un hydrolysat suivie par un criblage de la performance dans une autre. Les isolats obtenus à partir de la culture continue xylose nourris ont également été projetés sur PSGHL 60% et 75% avec les forcesnutriments et de glucose également ajouté à 75 g / L dans le but de soutenir le défi de l'éthanol et de tester lag diauxic sur xylose suivant l'utilisation du glucose. Alors que les isolats 27, 28 et 30 étaient supérieurs aux autres de cette phase d'adaptation, les deux ratios de performance taux d'absorption de rendement et de xylose étaient semblables à la société mère sur 75% PSGHL additionnés de nutriments ODM et YM, ce qui est pas nécessairement surprenant qu'aucun avait exposition antérieure à cet hydrolysat (voir aussi Slininger et al. 18 pour les données supplémentaires non représentés ici pour les cultures a fourni 75 g / L de glucose).

Les meilleures souches sélectionnées à partir de l'écran principal sur xylose riche PSGHL ont ensuite été projetés sur trois hydrolysats complets. Ces hydrolysats (tableau 1) inclus AFEX CSH et diluer l' acide-SG prétraité traités avec des cellulases commerciales et complétées à deux niveaux d'azote différents (SGH-N1 et SGH-N2) pour identifier le plus polyvalent isoLates par rapport aux variations de l'inhibiteur et de l'environnement nutritionnel. Les indices de performance relative (RPI) ont été calculées pour la fermentation de chaque isoler l' intérieur de chaque hydrolysat (figure 6A). La figure 6B montre les indices de performance globale combinées calculées pour chaque isolat. Cinq isolats (3, 14, 27, 28, 33) avaient RPI global supérieur à 60, ce qui leur est classé comme le plus robuste pour toutes les variations de l'hydrolysat et les conditions nutritives combinées. Revoir le tableau 3, les deux isolats 3 et 14 ont été évolué dans PSGHL tandis que 27, 28, et 33 ont été évolué dans AFEX CSH ou AFEX CSH et de la culture continue d' éthanol contestée sur xylose. Aucune des souches présentant une utilisation hydrolysat multiple supérieur ont évolué sur plus d'un hydrolysat.

Certaines souches étaient "spécialistes" de meilleures performances de chaque SGH-N1 / 2 ou AFEX CSH. Ces isolats du spectacle mieux que des spécialistes sur SGHhydrolysats (11, 16 et 9) ont été obtenus par l'évolution sur PSGHL que le dernier défi ou seulement. Pour les isolats 11 et 16, qui ont été initialement enrichi par l'utilisation défi CSH AFEX, la capacité d'utiliser efficacement AFEX CSH n'a pas été sélectionné activement pendant l'enrichissement finale longue en PSGHL, et les facteurs génétiques clés à l'appui de son utilisation ont été évidemment perdu. A l'inverse, les isolats 14, 25, 27, 30 et 33 étaient des artistes supérieurs sur AFEX CSH, et tous sauf isolat 14 ont été évolué sur AFEX CSH avec ou sans problème de l'éthanol. Donc, comme prévu, évolution dirigée sur AFEX CSH ou PSGHL tendait à sélectionner pour la levure bien adaptée à l'hydrolysat de sélection. La seule exception à cet égard était isolat 14. Isoler 14 provient du PSGHL seulement au défi et a été isolé à partir de gélose YM dilution et étalement de la culture d'enrichissement d'PSGHL final. Slininger et al. 18 montre cet isolat d'avoir une capacité supérieure de xylose induction enzymatique dans les cellules cultivées de glucose en présence de5 à 15 g / L d'acide acétique et réduit le retard diauxique ODM avec 75 g / L de chacun de glucose et du xylose, en dépit de> 30 g / L d'éthanol se produisant avant le point de transition du glucose et du xylose.

La cinétique supérieures des souches évoluées par rapport à la souche parente de S. stipitis NRRL Y-7124 a été démontrée comme montré dans le tableau 4, qui représente les résultats des cultures d' aération de la fiole de niveau bas inoculées initiale A 620 8,4 ± 2,5 75 ml SGH-N2 (pH 6,2) , incubée dans 125 ml de flacons avec des bouchons en silicone éponge à 25 ° C, 150 tours par minute (1 orbite »), et sur la figure 7, représentant des cultures d' aération du ballon modéré inoculées initiale dans un ballon 620 0,5 dans 23 ml SGH-N2 pour 50 ml. 18 Ces conditions représentent deux types de fonctionnement différents proposés par le la littérature comme étant potentiellement commercialement prometteuse pour la production d'éthanol par S. stipitis. 8,22 Dans les sapinst instance de faible aération de niveau, la densité cellulaire élevée prévoit une fermentation rapide pour commencer immédiatement. Considérant que, dans le second cas, la faible densité cellulaire et plus d'aération niveau conduisent à une croissance logarithmique pour construire la population et d'accélérer la conversion du sucre croissance associée à l'éthanol. Ces données démontrent que les souches évoluées ont des avantages cinétiques significatifs par rapport à la souche mère: plus le taux d'absorption de glucose rapide (tableau 4), taux d'absorption du xylose spécifique plus rapide (tableau 4), la productivité de l' éthanol plus rapide à la fois sur le glucose et le xylose et dans l' ensemble (tableau 4), délai plus court croissance précédente (figure 7), et plus court glucose diauxic à xylose retard de transition. Ces améliorations ont permis d'accumuler de l' éthanol à plus de 40 g / L et à crête jours plus tôt (figure 7) que ce qui était vu pour le parent NRRL Y-7124. Productivité d'éthanol global plus élevé (tableau 4) a été obtenue à 1,5 à 5 foiss celle de la souche mère (Tableau 4), selon la souche évoluée.

Figure 1
Figure 1:. L'organigramme d'adaptation Scheffersomyces Le schéma ci indique l'ordre des contraintes appliquées au cours du processus d'adaptation et les points de récupération des isolats supérieurs (numéros entre parenthèses). Voir également le tableau 3 Touche isolat comme référence pour les identités de contrainte. Pour fournir une orientation de temps, les chiffres en rouge indiquent le nombre de jours dans chaque phase d'adaptation. Pour les phases de transfert série dans AFEX CSH et riche en xylose PSGHL, chaque jour de l'adaptation représente environ 2-4 générations. Pour la phase de culture continue (205 jours au total), le taux de dilution D est variable à ~ 0 à 0,1 h -1 pendant 125 j de fonctionnement avec l' alimentation du pH actionné. Ensuite80 jours, l' opération était à un flux continu avec D à 0,012 h -1, fournissant un temps de génération (ln 2) / (D) de 58 h, ou 1 génération par 2,4 d à l' état stable. Ensuite , un échantillon de la population adaptée de la culture continue de 205 jours a été mutagénisé avec de la lumière UV et inoculé à une culture continue actionnée par D à 0,012 h -1. (Reproduit de Slininger et al. 18) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Amélioration de la fermentation de 6% glucane CSH AFEX batch Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 souche mère fermentation de 6% glucane AFEX CSH (A) est comparée à adaptée Colony 5 fermentation de 6% glucane AFEX-prétraités tiges de maïs hydrolyzate (B). Symboles désignent la biomasse (carré rouge), glucose (cercle noir avec une ligne en pointillés), le xylose (cercle bleu avec trait plein), l'éthanol (triangle vert), et le xylitol (losange violet). (Reproduit de Slininger et al. 18) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Réduction lag diauxic dans un milieu défini avec des sucres mixtes performances fermentaires sont comparées dans ODM avec 66 g / L de glucose et 87 g / L de xylose pour la souche mère S.. stipitis NRRL Y-7124 (A), l'AFEX CSH adaptée population dérivée de Y-7124 (B), Colony cellulaire unique 1 isolé du S. adapté population stipitis (C), une cellule unique Colony 5 isolé de la population adaptée (D). Symboles désignent la biomasse (carré rouge), glucose (cercle noir avec une ligne en pointillés), le xylose (cercle bleu avec trait plein), l'éthanol (triangle vert), le xylitol (losange violet), et adonitol (diamant d'or avec bord noir). (Reproduit de Slininger et al. 18) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Ethanol dérivés de colonies résistantes à tolérance Colony 5. Hydrolysat 5 a encore été mis au point par la sélection d' une culture continue sur l' ODM contenant du xylose comme seule source de carbone et des niveaux élevés d'éthanol. Deux populations de glycérol sous licence dérivé obtenu au début du processus de sélection (2A.1.53R triangle orange et ligne pointillée) et d'unirradiation UV des inoculums près avoir de culture continue (2A.1.30R.2, cercle violet et une ligne pointillée) sont présentés en comparaison avec la souche NRRL Y-7124 parent (cercle vert avec une ligne solide) et Colony tolérantes AFEX CSH 5 (triangle noir avec ligne continue). Xylose absorption par les populations denses de levure cultivée en glucose (A 620 = 50) dans l' ODM avec 40 g / L d' éthanol a indiqué que toutes les souches adaptées ont dépassé le parent non adapté à la capacité d'induire le métabolisme du xylose. (Reproduit de Slininger et al. 18) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. Ratio d'amélioration des performances de l' isolat de tolérance par rapport à la société mère Les performances des isolats tolérantes supérieurs résumé par rapport àla souche parente de commande NRRL Y-7124 pour chaque formulation de PSGHL (A, B). Les performances ont été évaluées en termes de taux d'absorption du xylose (barres bleues représentant des rapports d'isolat parent) et le rendement en éthanol par sucre fourni (barres vertes représentant des rapports d'isolat parent). (Reproduit de Slininger et al. 18) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Isoler classement basé sur RPI. Le concept indice relatif de la performance (RPI) a été appliquée aux résultats de la performance de l'écran secondaire afin de classer 33 isolats dans chaque type hydrolysat basé sur le taux d'absorption du xylose et le rendement en éthanol par sucre fourni. (A) Le rapport ranroi de tout isolat donné dépendait du type hydrolysat (P <0,001): SGH-N1 (barres bleues), SGH-N2 (barres rouges) et AFEX CSH (barres vertes). (B) Le RPI global calculé pour tous les types d' hydrolysat (barres bleu clair) indiqué souches supérieures à la plupart des performances robustes dans les différentes conditions d'hydrolysat. (Reproduit de Slininger et al. 18) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: fermentations SGH comparatifs des isolats adaptés supérieurs de S. stipitis. Supérieur adapté isolats et leur souche mère NRRL Y-7124 sont comparées fermenter hydrolysats enzymatiques de panic diluée d'acide prétraité (20% de matières solides chargement) à 25 ° C et pH initial de 6,2 à basse initiale la densité cellulaire. les temps de la biomasse (carrés rouges), glucose (cercles noirs et la ligne en pointillés), xylose (cercles bleus et trait plein) et l'éthanol (triangles verts) sont présentés. Les barres d'erreur représentent la gamme de la valeur moyenne marquée par des symboles. (Reproduit de Slininger et al. 18) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1:. Compositions d'hydrolysats utilisés dans les cultures (. Reproduit de Slininger et al 18) S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2: milieu défini Optimal pour NRRL Y-7124 de Scheffersomyces 7tp: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3:. Résumé des souches Scheffersomyces tolérantes supérieures de la fermentation des hydrolysats de la biomasse végétale (. Reproduit de Slininger et al 18) S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4: cinétiques comparatifs des isolats sur panic hydrolysat SGH-N2 inoculée initiale A 620 = 8,4 ± 2,5 Les taux sont des taux normalisés par unité d' absorbance au cours du glucose ou de la consommation de xylose.. (Reproduit de Slininger et al. 18) S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce table.

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Discussion

Plusieurs étapes ont été essentiels à la réussite du processus d'évolution. Tout d'abord, il est essentiel de choisir des pressions de sélection appropriés pour entraîner l'évolution de la population vers les phénotypes souhaités qui sont nécessaires pour une application réussie. Les contraintes sélectives suivantes ont été choisies pour S. stipitis développement et appliqué à des moments appropriés pour guider l' enrichissement pour les phénotypes souhaités: les forces croissantes de 12% glucane AFEX HCS ( ce qui force la croissance et la fermentation des sucres divers , en présence d'acide acétique et de faibles taux d'aldéhydes et d' autres inhibiteurs de furane); xylose introduit des cultures en continu avec une concentration croissante d'éthanol (qui force xylose induction enzymatique pour réduire le lag diauxic); et en augmentant les forces de 20% de solides chargement PSGHL (ce qui force la croissance et la fermentation de xylose en présence d'acide acétique élevée, furanes et autres inhibiteurs). En second lieu, il est important de préserver les populations de levures évoluant par congélation de glycéroltocks des échantillons de population que le processus d'enrichissement progresse. Ces instantanés de la population peuvent être stockées pour des tests fonctionnels périodiques pour documenter les progrès de l'évolution et pour permettre à des isolements ultérieures comme souhaité, ou pour redémarrer les processus d'évolution après une interruption. Une troisième étape clé dans le processus d'évolution était de récupérer des isolats exceptionnels en enrichissant les populations de culture de sélection ou de populations de glycérol stocké sur un milieu sélectif convenable (tel que l'agar ou de micro-plaques contenant un gradient de contrainte présentant une série d'hydrolysat et / ou des concentrations d'éthanol) . Puis colonies survivantes qui poussent sous la condition la plus stressante peuvent être ramassés à préserver pour la caractérisation plus tard. Ces trois étapes de base peuvent être répétées pour poursuivre chaque pression supplémentaire souhaité de sélection phénotypique, ou, alternativement, des pressions multiples en un seul cycle, le cas échéant. Lorsque la population parent de levure native est exposée aux diverses contraintes, la diversité génétique devrait survenir e mutations naturelles ou induites rugueuses, et une exposition continue permettra la sélection naturelle pour enrichir les individus avec les mutations les plus bénéfiques à l'appui de survie compétitive. Il est prévu que le phénotype choisi se produit en raison de mutations génétiques multiples. Dans le protocole ci-dessus, des mutations peuvent être induites pendant le traitement UV ou potentiellement lors de l'exposition de la levure à hydrolysats. Hydrolysats sont connus pour contenir trois classes de composés nuisibles sur les microorganismes:. Les acides carboxyliques, les aldéhydes et les composés phénoliques 22 aldéhydes réactifs, tels que le furfural et le 5-hydroxyméthylfurfural, peuvent endommager les cellules et provoquer une élévation d'espèces réactives de l' oxygène (ROS), produit typiquement mitochondries. ROS sont bien connus pour provoquer des mutations de l' ADN dans les cellules eucaryotes. 23,24 Les composés phénoliques présents dans les hydrolysats, mais pas auparavant connu pour être génotoxique, peuvent promouvoir et en synergie les effets mutagènes des aldéhydes et mutagène ROS. 25

jove_content "> La stratégie progressive des environnements progressivement difficiles devrait construire des souches évoluées avec une série d'améliorations phénotypiques, à la fois ciblées et aussi non-ciblée. Il est possible que certains phénotypes non ciblés peuvent survenir qui sont indésirables ou instables. Pour pour capturer les souches les plus fonctionnels et robustes, une étape clé supplémentaire qui doit être prise est d'évaluer et de comparer les isolats sélectionnés pour les caractères commercialement pertinents, atteignant pour les deux phénotypes ciblées et non ciblées. pour ce faire, isoler les performances devraient être comparés une variété de conditions de contrainte orientées vers l'application, par exemple dans des hydrolysats avec des problèmes différents inhibiteurs et des formulations nutritives, ce qui permet la sélection des meilleures souches globales qui sont stables et solides à large industrielle variation du substrat lignocellulosique. en outre, un problème de stabilité de la souche peut être incorporée dans le écran comme cela a été fait dans l'exemple en incluant les étapes de préculture connexes impliquanting croissance de la levure initiale sur deux milieux non sélectifs, agar YM depuis plusieurs générations, suivie par l'ODM synthétique avec 50 g / L xylose pendant 6-7 générations supplémentaires, donnant la possibilité de déstabilisation des traits de culture désirées avant l'exposition au défi de la performance hydrolysat. Basé sur des caractéristiques de performance significatifs, tels que le rendement de l'éthanol et le taux d'absorption du xylose, les isolats sont ensuite classés dans chaque état de stress différent, comme chaque environnement hydrolysat testé, ce qui peut être différent du milieu de culture d'enrichissement de l'isolat. Le RPI adimensionnel peut être utilisé pour calculer la performance moyenne globale par rapport et le rang des isolats comparés. Un facteur sans dimension est appropriée pour refléter la performance relative dans différents types d'hydrolysats et sur la base des évaluations de performance différents, tels que les rendements par rapport aux taux. Cette procédure identifie le classement des souches qui effectuent toujours bien sur de larges variations dans les conditions de croissance et hydrolyzates et sont susceptibles d'être à la fois robuste et génétiquement stable.

Diverses itérations et des modifications de ces étapes de base peuvent être nécessaires pour tenir compte de l'évolution de toute souche microbienne capable de fonctionnalités spécifiques ou uniques performance sur hydrolysats lignocellulosiques ou d'autres substrats d'intérêt. Dans le S. stipitis exemple, il est important de noter que la supplémentation en nutriments, y compris les sources commerciales à faible coût, à des hydrolysats préparés à haute teneur en solides de chargement a été clé pour contrôler la plage dynamique des performances isolat pour une meilleure séparation statistique au cours du dépistage. L'importance des substances nutritives à une bonne fermentation d'hydrolysats inhibiteurs concentrés a également été rapportée précédemment et on pense qu'elle est due à un besoin élevé en acides aminés et d'autres nutriments nécessaires à l'entretien des cellules, le potentiel redox d'équilibrage et la réparation en raison de ces conditions de stress, en particulier lors de l' utilisation de xylose. 9,26,27En outre, si les nutriments sont trop rares ou trop abondantes, les différences de performances isolés peuvent être difficiles à détecter statistiquement en raison de tous les isolats faire très mal, ou tout faire très bien, respectivement. Isole capable d'effectuer bien dans des conditions diverses devraient être fiables, ou robuste aux variations des conditions industrielles.

La principale limitation de ce protocole est que l'évolution adaptative et le dépistage sont très littérale dans le résultat, en ce que «on obtiendra ce que l'on enrichit et écrans pour". Ainsi, les conditions d'enrichissement et de l'écran doivent être conçues pour amplifier et identifier les individus, respectivement, avec les modifications souhaitables dans phénotypes tout en conservant des caractéristiques pré-existantes souhaitables. Evolution peut affecter non-sélectionné pour les caractères qui sont critiques pour la performance industrielle (par exemple, les exigences en matière de facteurs de croissance). Pour cette raison, la progression de l'enrichissement de la population pour une caractéristique doit être suivi périodiqueed pour d'autres traits comme méthode de dépannage pour les modifications indésirables. Par exemple, une des caractéristiques uniques de S. stipitis est sa capacité native de croître sur et fermenter le xylose. Tous les substrats d'enrichissement et de criblage inclus xylose comme seule touche ou source contribuant de carbone en présence d'inhibiteurs. Par conséquent, une caractéristique commune de toutes les cultures d'enrichissement dans cet exemple était qu'ils directement sélectionnés pour xylose en utilisant des souches plus rapides, dont les populations sont devenus de plus en plus enrichi en culture serial ou continue parce qu'ils étaient meilleurs concurrents. En tant que résultat escompté, souches améliorées étaient tous capables de plus l'absorption de xylose rapide, mais des améliorations au rendement en éthanol ont été beaucoup moins dramatique que l'amélioration de la vitesse d'absorption du xylose. Cette dernière tendance probable est arrivé depuis le rendement en éthanol par la souche mère était relativement élevée à environ 0,3 g / g, soit 60% de la valeur théorique (0,51 g / g), la croissance cellulaire est devenu stationnaire dans hydrolysats, laissant moins de place pouramélioration. Dans les cultures, des rendements plus élevés d'éthanol pourraient être éventuellement choisis contre parce que l'éthanol est un inhibiteur de la croissance, ce qui a nécessité le suivi des performances de la population évoluée pour ce caractère. Les concentrations d'éthanol maintenue au-dessous du niveau de l'inhibition de la croissance tendraient à neutraliser ce facteur de sélection. Pour S. stipitis NRRL Y-7124, 40 g moitiés / L d'éthanol taux spécifique de croissance alors que 64 g / L empêche la croissance tout à fait. 28 Dans l' éthanol contesté des cultures continues nourris xylose, l' aération a été maintenu faible et les taux de dilution ont également été maintenu assez bas avec un grand xylose présent pour favoriser la fermentation plutôt que la respiration d'éthanol et empêcher l'enrichissement d'une propriété non désirée utilisation de l'éthanol. En outre, des suppléments nutritionnels aux hydrolysats utilisés dans les écrans de performance ont été soigneusement conçus de manière à éviter de sélectionner des souches qui ont besoin d'une alimentation riche en nutriments coûteux, tels que l'extrait de levure. Suppléments toujours inclus sources commerciales plus bas coût available, telle que la farine de soja et l'urée, bien que les composants plus riches comme dans YM ont été appliquées dans des cultures en tandem pour des essais comparatifs, notamment dans les formulations de 60% et 75% PSGHL qui sont normalement appauvrit d'azote. Le milieu synthétique ODM, utilisé dans les écrans de préculture et de la culture de la performance, a été initialement conçu pour une performance optimale de la souche mère S. stipitis NRRL Y-7124 7 conformément à la routine d'optimisation de milieu de culture décrit par Traders Protein 20 qui recommande ingrédients définis, y compris les vitamines, les minéraux, les purines et les pyrimidines, et les sources d'acides aminés pour fournir des éléments nutritifs compatibles avec l' utilisation rentable de mise à l' échelle industrielle sources commerciales. Une recommandation finale dans la conception de souches pertinentes, est de garder la conception des conditions d'enrichissement et de l'écran aussi pertinent que possible des conditions de procédés industriels attendus.

éthanol renouvelable Coût compétitif a longtemps été poursuivi pour reduce dépendance aux combustibles fossiles. Pour améliorer la capacité de S. stipitis NRRL Y-7124 de tolérer, de grandir et fermenter hydrolysats inhibiteurs de la lignocellulose, plusieurs chercheurs ont utilisé la culture répétitive dans la liqueur riche en xylose résultant dilué acide prétraitement de la biomasse lignocellulosique. 13,14,16,17 Over-chaulage à détoxifier les inhibiteurs sont encore nécessaires pour permettre à un niveau raisonnable de la performance des souches adaptées au début sur bois et la paille de blé liqueurs de prétraitement. 13,14 cycles répétés multiples de mutagenèse UV et génome brassage ont été appliquées pour développer des dérivés de S. stipitis NRRL Y-7124 avec une meilleure tolérance de l' inhibiteur et la croissance des feuillus a passé la liqueur au sulfite (de HWSSL). 16,17 Cependant, les concentrations d'éthanol produites par ces souches en HWSSL étaient sous 10 g / L après 6 à 7 jours. En utilisant les techniques représentées et décrites ici, de nouvelles souches évoluées de S. stipitis NRRL Y-7124 ont été développés pour répondre phenotyobjectifs de pe nécessaires pour un usage commercial économique: la fermentation des hydrolysats à pH 5-6, sans mesures de désintoxication avant, comme sur-chaulage, ce qui conduit à l'élimination des déchets coûteux; considérablement réduit la croissance et les retards diauxique; l'accumulation de l'éthanol suffisamment élevées pour la distillation du commerce (> 40 g / l d'éthanol); croissance plus rapide et la productivité de l'éthanol que précédemment pour les souches de levure de fermentation indigènes hydrolysats undetoxified; et la performance dans divers hydrolysats à haute teneur en solides de chargement, y compris SGH convenablement soja azote complété (qui est par ailleurs l'azote pauvres) et non supplémenté CSH AFEX. Les souches améliorées développées en utilisant la nouvelle approche agressive à l'évolution comme incarnée dans les principales étapes résumées ci-dessus, devraient bénéficier l'économie de la production d'éthanol à partir de la biomasse agricole en abaissant les coûts d'exploitation, les coûts en capital et les intrants de l'énergie et l'eau. Ceci est le premier plan de l' évolution de la souche rapporté pour produire des souches adaptées de S. stipitest la démonstration la production d'éthanol économiquement récupérables sur hydrolysats undetoxified.

Les souches nouvelles de S. stipitis découlant de chaque phase du processus d'évolution (figure 1) sont des candidats pour les études futures afin de déterminer les changements génétiques associés à des pressions de sélection spécifiques appliqués et les mécanismes d'attributs clés sous - jacents de l' amélioration de la fermentation hydrolysat, telles que la tolérance de l' inhibiteur et lag diauxic réduit. Ces nouvelles connaissances précieuses aidera l'ingénierie de la prochaine génération biocatalyseurs et processus levure pour la conversion de la lignocellulose en biocarburants et autres produits. Alors que de nouvelles souches sont dérivées, il sera probablement bénéfique de passer à nouveau la population dérivée par un protocole de contrainte d'évolution similaire à celle décrite ici afin de sélectionner les transformants les plus utiles pour une utilisation commerciale dans hydrolysats. De même, comme de nouvelles souches microbiennes sont découverts avec le potentiel de faire une mariad de nouveaux produits utiles à partir de la biomasse renouvelable, le processus d'évolution pourrait encore être appliquée pour améliorer la souche robustesse et la productivité dans des hydrolysats, permettant potentiellement de nouveaux procédés et produits bio-catalytique pour être mis à disposition.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour Archer Daniels Midland Co. (ADM) 63160 ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant) Sigma-Aldrich P1300 Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids Becton Dickinson and Company 228830 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan  Sigma-Aldrich T3300 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine  Sigma-Aldrich C7352 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar Becton Dickinson and Company 214010 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract Becton Dickinson and Company 218630 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract Becton Dickinson and Company 212750 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean Fluka P0521-500g multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder Sigma-Aldrich A8626 CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99% Sigma-Aldrich C3506 CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra Sigma-Aldrich G6779 CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99% Sigma-Aldrich T0376 CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99% Sigma-Aldrich U0750 CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS Fisher Chemical D16-500 CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99% Sigma-Aldrich X1500 CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates Becton Dickinson Falcon 351172 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper Kimberly-Clark towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) Corning Life Science Glass 4980-125 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) M1335-0016 multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates Applikon Biotechnology Z365001700 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates Applikon Biotechnology Z365001296 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover Applikon Biotechnology V0W1040027 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover Applikon Biotechnology V0W1040001 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene Applikon Biotechnology ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks Bellco 1924-00032 Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. Bellco 1968-00100 (original Cat. No.) Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven MathisAg Typ-Nbr BFA12 215307 Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer YSI Life Sciences 2900D-UP www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer Bio-Tek Instruments, Inc MQX200R www.biotek.com

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Techniques pour l&#39;évolution de la levure robuste Pentose-fermentation pour la bioconversion de lignocellulose en éthanol
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Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).

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