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Bioengineering

Tecniche per l'evoluzione della robusta lievito Pentoso-fermentazione per bioconversione della lignocellulosa a etanolo

Published: October 24, 2016 doi: 10.3791/54227
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Bioenergy Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 2Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 3Chemical Engineering and Material Science, Great Lakes Bioenergy Center, Michigan State University

Summary

Tecniche di evoluzione e di isolamento Adaptive sono descritti e hanno dimostrato di produrre derivati di tensione Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 che sono in grado di consumare rapidamente esosi e zuccheri misti pentosi in enzima saccarificato idrolizzati undetoxified e di accumulare più di 40 g / L di etanolo.

Introduction

Un 1,3 miliardi di tonnellate a secco annuo stimato di biomassa lignocellulosica potrebbero sostenere la produzione di etanolo e consentire agli Stati Uniti di ridurre il consumo di petrolio del 30%. 1 Sebbene impianto a biomasse miscele rendimenti idrolisi zucchero ricchi di glucosio e xilosio, inibitori della fermentazione sono generati dal pretrattamento chimico necessario per abbattere emicellulosa ed esporre la cellulosa per l'attacco enzimatico. L'acido acetico, furfurolo, e idrossimetilfurfurale (HMF) si pensa di essere componenti chiave tra molti inibitori che si formano durante il pretrattamento. Per spostare l'industria dell'etanolo lignocellulosiche avanti, ricerca e procedure per consentire l'evoluzione di ceppi di lievito in grado di sopravvivere ed efficiente funzionamento di utilizzare sia esosi e pentosi in presenza di tali composti inibitori sono necessari. Una significativa debolezza aggiuntiva di ceppi di lievito industriali tradizionali, come Saccharomyces cerevisiae, è l'incapacità di fer efficientet il xilosio disponibile in idrolizzati di biomassa vegetale.

Pichia stipitis ceppo NRRL Y-7124 (CBS 5773), recentemente rinominato stipitis Scheffersomyces, è un lievito di fermentazione pentoso nativa che è ben noto a fermentare xilosio in etanolo. 2,3 L'evoluzione del ceppo NRRL Y-7124 è stato perseguito qui perché è stato documentato per hanno il maggiore potenziale di ceppi autoctoni di lievito di accumulare etanolo economicamente recuperabili superiore a 40 g / L con poco sottoprodotto xilitolo. 4,5,6 In mezzi ottimale, S. ceppo stipitis NRRL Y-7124 produce 70 g / L di etanolo a 40 ore (1,75 g / L / hr) con una resa di 0,41 ± 0,06 g / g in colture ad alta densità cellulare (cellule 6 g / L). 7,8 Resistenza agli inibitori di fermentazione etanolo, furfurale e HMF è stata riportata anche, 9 e S. stipitis è stato classificato tra i più promettenti lieviti indigeni pentoso-fermentazione disponibili per scala commerciale di etanolo production da lignocellulosa. 10 Il nostro obiettivo era di applicare diverse idrolizzati lignocellulosici undetoxified e pressioni selettive etanolo per forzare evoluzione verso un derivato più robusta di ceppo NRRL Y-7124 adatto per applicazioni industriali. Chiave tra caratteristiche migliorate ricercati erano i tassi più veloci di zucchero di assorbimento in idrolizzati concentrati, ridotto diauxy per un utilizzo misto di zucchero più efficiente e più elevati tolleranze di etanolo e inibitori. L'applicazione di S. stipitis a idrolizzati undetoxified era un obiettivo chiave della ricerca per eliminare le spese di funzionamento aggiunto associati ai processi di disintossicazione idrolizzato, come overliming.

Due idrolizzati industrialmente promettenti sono state applicate per forzare l'evoluzione:. Enzima saccarificato espansione pretrattati paglia del mais idrolizzato fibra di ammoniaca (AFEX CSH) e diluire l'acido-pretrattati panico verga idrolizzato liquore (PSGHL) 11,12 tecnologia di pretrattamento AFEX è stato sviluppato perminimizzare la produzione di inibitori della fermentazione, mentre diluito pretrattamento acido rappresenta la tecnologia minor costo corrente più comunemente praticato per esporre biomassa cellulosica per saccarificazione enzimatica. PSGHL è separabile dalla cellulosa che rimane dopo pretrattamento ed è tipicamente ricco di xilosio dal emicellulosa idrolizzato, ma a basso contenuto di glucosio. AFEX CSH e composizioni PSGHL differiscono l'uno dall'altro in aspetti chiave che sono stati sfruttati per gestire il processo di evoluzione. AFEX CSH è inferiore in aldeidi furano e inibitori dell'acido acetico ma superiore di aminoacidi e fonti di azoto ammoniacale rispetto PSGHL (Tabella 1). PSGHL presenta la sfida aggiuntiva di xilosio essere lo zucchero predominante disponibile. Così PSGHL è opportuno arricchire specificatamente per una migliore utilizzazione xilosio in idrolizzati, una debolezza prevenire l'uso commerciale di lievito disponibili. Anche tra i lieviti di fermentazione pentosi autoctoni, la dipendenza dal xylo zucchero non ottimalese per sostenere la crescita cellulare e la riparazione diventa ancora più impegnativo in idrolizzati a causa di una serie di motivi:. carenze nutrizionali, inibitori causando danni alla cella integrità strutturale e disagi per il metabolismo dovuti a squilibri redox 9 supplementazione azoto, in particolare sotto forma di aminoacidi, possono rappresentare un costo di esercizio significativo per fermentazioni. L'impatto della supplementazione di azoto sullo screening isolare e la classifica è stata esplorata con idrolizzati panico verga.

Individui migliorati sono stati arricchiti in una popolazione in continua evoluzione utilizzando più pressioni selettive affidamento sulla naturale diversità genetica del S. popolazione stipitis e mutazioni indotte da esposizioni a due idrolizzati diverse, etanolo o radiazioni UV. Pressioni di selezione sono stati applicati in parallelo ed in serie ad esplorare il progresso evoluzione S. stipitis verso derivati desiderati in grado di crescere e fermentare in modo efficiente in idrolizzati(Figura 1). La coltura ripetitivo delle popolazioni funzionali in idrolizzati sempre più difficili è stato realizzato in micropiastre utilizzando una serie di diluizioni di entrambi il 12% glucano CSH AFEX oppure PGSHL preparati al 20% di solidi di carico. L'applicazione di una crescita etanolo-sfidato il xilosio in coltura continua ulteriormente migliorata Afex CSH adattato popolazioni, arricchendo di fenotipi che dimostrano meno suscettibilità a etanolo repressione di utilizzo xilosio. Quest'ultima caratteristica è stata recentemente dimostrato problematico l'utilizzo pentoso dal ceppo NRRL Y-7124 dopo la fermentazione del glucosio. 8 Arricchimento su PSGHL è stato accanto esplorata per ampliare la funzionalità idrolizzato.

Derivati putativi migliorate di S. stipitis NRRL Y-7124 sono stati isolati da ogni fase del processo di evoluzione utilizzando arricchimento mirato in condizioni di stress e la placcatura di diluizione a raccogliere le colonie dalle popolazioni più diffuse. relativa adimensionaleindici di performance (RPI) sono stati utilizzati per classificare ceppi sulla base di prestazioni complessive, in cui il comportamento cinetico è stata valutata su diversi tipi idrolisati e supplementi nutrizionali applicate. Anche se i successi di varie procedure di adattamento per migliorare la funzionalità di S. stipitis in idrolizzati lignocellulosici sono stati precedentemente documentato, i ceppi che dimostrano la produzione di etanolo economica su idrolizzati undetoxified non sono stati precedentemente riportati. 13-17 Utilizzando le procedure evoluzione da visualizzare in dettaglio qui, Slininger et al. 18 hanno sviluppato ceppi che sono notevolmente migliorate nel corso ceppo NRRL Y-7124 e sono in grado di produrre> 40 g / L di etanolo in AFEX CSH ed enzimi saccarificato idrolizzato panico verga (SGH) opportunamente integrato con le fonti di azoto. Questi nuovi ceppi sono di futuro interesse per la lignocellulosa in via di sviluppo per l'industria dell'etanolo e come soggetti di genomica ulteriori studi edificiosu quelli di ceppo precedentemente sequenziato NRRL Y-11545. 19 Uno studio di genomica dei migliori ceppi di prodotti durante le varie fasi di evoluzione diagramed nella figura 1 sarebbe chiarire la cronologia delle modifiche genetiche che si sono verificati durante lo sviluppo come un preludio ad ulteriori ricerche miglioramento ceppo.

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Protocol

1. Preparare Avvio di materiali e attrezzature per saggi

  1. Preparare idrolizzati utilizzano da 18 a 20% peso secco biomassa iniziale nella reazione pretrattamento per uso nell'evoluzione, isolamento e procedure ranking. Vedere Slininger et al. 2015 18 per i metodi dettagliati per preparare AFEX CSH, PSGHL, e SGH con supplementi di azoto N1 o N2 utilizzati in evoluzione, l'isolamento o la classifica. Vedere la Tabella 1 per la composizione di ogni tipo idrolizzato.
    NOTA: fortificazioni azoto di SGH stati designati come SGH-N1 o SGH-N2 definiti come segue: SGH-N1 = SGH fortificato a 42: 1 molare carbonio rapporto azoto (C: N) con fonti di azoto tra cui urea, ammino libero-vitamina acidi da caseina, D, L-triptofano, L-cisteina, e vitamine da fonti definiti (tale che ~ 15% molare di azoto N è azoto amminico primario (PAN) e ~ 85% di N è da urea); SGH-N2 = SGH fortificato a 37: 1 C: N con urea e farina di soia come il più basso costo fonte commerciale oaminoacidi e vitamine F, fornendo ~ 12% di N dal PAN e 88% come l'urea.
  2. Acquisire una cultura liofilizzata del ceppo, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) dalla Culture Collection ARS (Centro Nazionale per la Ricerca utilizzo agricolo, Peoria, Illinois), e preparare glicerolo colture di come diretto. Mantenere culture azionari del lievito madre e dei suoi derivati ​​in 10% glicerolo a -80 ° C.
    1. scorte consecutive glicerolo al lievito malto peptone destrosio (YM) piastre di agar (3 g / l estratto di lievito, 3 g / L estratto di malto, 5 g / l peptone, 10 g / L di destrosio, 20 g / l di agar) ed incubare 48- 72 ore a 25 ° C. 8 piastre sviluppati può essere conservato fino ad una settimana a 4 ° C prima dell'utilizzo come liquido di pre-coltura inoculi.
  3. Preparare definite in modo ottimale Media (ODM), un terreno sintetico compatibile con le procedure di formulazione industriali 20 che è stato precedentemente sviluppato per la conversione ottimale di xilosio in etanolo dalla str genitoreain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. 7 Utilizzare il supporto definito in tutte le precultures e culture per il test biologici prestazioni di fermentazione e anche per l'etanolo in discussione, l'evoluzione della cultura continua xilosio-fed. Composizione ODM è elencato per riferimento nella tabella 2.
  4. Come descritto in precedenza, 18 analizzare biomassa cellulare utilizzando uno spettrofotometro lettura cuvette- o micro-piastra, a seconda dei casi, per misurare la cultura di assorbanza a 620 nm (A 620). Quantificare zuccheri, etanolo, furfurale, idrossimetilfurfurale (HMF), e acido acetico in campioni di coltura mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) o robotizzato determinazione enzimatica di glucosio e xilosio per una maggiore produttività.

2. Arricchisci Derivati ​​robusti durante il trasferimento seriale su AFEX CSH

  1. Seminare un precoltura di ceppo NRRL Y-7124. Trasferire le cellule da YM agar a 75 ml ODM + 150 g / L xilosio per mantenere la capacità di crescere sotto olo stress smotic. Incubare precultures in 125 ml flaconi chiusi con la spugna in silicone spine 24 ore a 25 ° C con agitazione (150 rpm, 1 "orbita).
  2. Scongelare aliquote congelate del 6-12% glucano CSH AFEX in acqua fredda per l'uso. Regolare il pH a 5, se necessario e filtro sterilizzare prima di preparare una serie di diluizioni in 96 pozzetti.
  3. Riempire micropiastre con 50 pl per pozzetto e 8 pozzetti per la diluizione idrolizzato, poi inoculare con pochi microlitri di precoltura per pozzetto per consentire una assorbanza iniziale (620 nm) A 620 ≥0.1. Incubare le piastre staticamente 24-48 ore a 25 ° C in una scatola di plastica con un tovagliolo di carta bagnata per l'umidità.
  4. Usando la diluizione idrolizzato più concentrata che visibilmente cresciuto a A 620> 1, trasferimento 1-5 microlitri a ciascun pozzetto di una nuova serie di diluizione idrolizzato per ottenere iniziale A 620 ≥0.1.
  5. Monitorare la cultura della crescita Una 620 in micropiastre con uno spettrofotometro. Una serie di diluizioni non inoculato serves come controllo e vuoto. coperchi piastre vengono lasciati durante il monitoraggio per evitare la contaminazione, e le letture adeguati di conseguenza.
  6. Preparare le scorte glicerolo di culture adattamento regolarmente per il successivo isolamento di ceppi migliorati o per l'uso in reinoculating la serie di diluizioni idrolizzato di continuare. Per preparare le scorte, piscina quattro pozzi (200 ml) della maggiore concentrazione idrolizzato colonizzato. Mescolare 1: 1 con il 20% glicerolo sterile in cryovials, per congelare le cellule in 10% glicerolo a -80 ° C.
  7. Ripetere i passaggi 2,3-2,6 fino a una crescita nel 12% glucano CSH AFEX è costantemente visibile a 24 ore.

3. cellulari Isolare singolo tolleranti Derivati ​​dopo arricchimento AFEX CSH

  1. Streak selezionato scorte glicerolo di culture di adattamento ai YM agar e utilizzare strisce per inoculare 50 ml di 3% o 6% glucano AFEX CSH (pH 5) in ciascuno dei tre pozzetti (iniziale A 620 ~ 0,1). Incubare micropiastre 24 ore come al punto 2.3. Pool replicate colonizzato pozzi alla massima resistenza idrolizzato con una forte crescita, e piastra di diluizione a YM o 6% glucano AFEX CSH agar. Preparare il secondo come un 1: 1 mix di filtro sterilizzato il 12% glucano CSH AFEX con caldo soluzione / L agar 30 g autoclave.
  2. Scegliere 5 singole colonie dalla più alta piastra di diluizione che mostra una crescita dopo incubazione di 24-48 ore a 25 ° C per congelare come glicerolo colture di. Streak ogni colonia ad una piastra YM. Incubare 24 ore. Con un'ansa sterile, trasferire una striscia sviluppato di cellule ad un piccolo volume di 10% glicerolo, miscela di sospendere le cellule, e distribuire a 2-3 cryovials per congelamento a -80 ° C.

4. valutare le prestazioni di AFEX CSH derivati ​​tolleranti Rispetto a Parent

  1. Prova Isolati in semplici Culture 6% glucano AFEX CSH batch.
    1. Trasferire le cellule provenienti da 48 piastre hr striati dalle scorte glicerolo a pH tampone fosfato di potassio 7 (0,4 mm) per preparare sospensioni cellulari con A 620 = 10. Usare 1 ml diogni sospensione per inoculare ciascuno dei quattro pozzi di 50 ml 3% idrolizzato glucano a siglare A 620 = 0,2. Incubare micropiastre 24 ore come al punto 2.3. Preparare il glucano CSH 3% AFEX a pH 5 diluendo 12% glucano AFEX CSH 1: 3 con acqua sterile.
    2. Trasferimento due pozzi 24 ore micropiastre per inoculare 25 ml precultures di pH 5 al 12% glucano CSH AFEX utilizzati al 50% del fondo di forza. Incubare precultures in beute da 50 ml con silicio chiusure spugna per 24 ore a 25 ° C, ~ 150 rpm (1 "orbita) Preparare la mezza forza 12% glucano AFEX CSH diluendo l'idrolizzato 1:. 1 con acqua sterile.
    3. Utilizzare mezza forza precultures idrolizzato per inoculare 25 ml simili culture di crescita a siglare A 620 = 0,1. Incubare le culture di crescita come sopra (4.1.2) e assaggiare tutti i giorni (0,2 ml). Accumuli Monitor di biomassa (A 620) e le concentrazioni di zuccheri e prodotti di fermentazione (HPLC).
  2. Alternativamente, repitch (cioè, raccolta e reuse) popolazioni di 6% glucano AFEX lievito CSH-produzione di test a 8% glucano culture lotti idrolizzato, come descritto in precedenza. 18
  3. In alternativa, altre popolazioni di prova delle repitched 6% glucano culture CSH Afex alimentando con il 12% idrolizzato glucano, come descritto in precedenza. 18
  4. Prova ritardo diauxic degli isolati in colture lotti di ODM con zuccheri misti.
    1. Seminare precultures di 75 ml ODM con 150 g / L xilosio in 125 ml boccette con chiusure spugna silicone per trasferimento ad anello da YM striature glicerolo. Incubare 24 ore come al punto 2.1.
    2. Utilizzare precultures inoculare simili culture 75 ml di prova con ODM contenente 75 g / L di glucosio e 75 g / L di xilosio a pH 6,5. Agitare beute a 25 ° C, 150 rpm. Esempio di tutti i giorni.
    3. In alternativa, testare l'impatto di acido / L acetico 0-15 g su diauxy durante la fermentazione di glucosio e xilosio utilizzando un protocollo simile, tranne pH iniziale è fissato a 6,0 ± 0,2 in colture di prova per mantenere il pH 6-7 duanello consumo di acido acetico, come descritto in precedenza. 18

5. Applicare cultura continua a selezionare per l'etanolo-sfidato xilosio utilizzo

  1. Preparare ODM come mezzo di alimentazione coltura continua con 60-100 g / L xilosio, 20-50 g / L di etanolo a pH 6,3 ± 0,2. Scegliere combinazioni di xilosio ed etanolo per simulare la fermentazione parziale di 150 g / l xilosio, ipotizzando un potenziale resa di ~ 0,5 g etanolo / g xilosio, e ad accogliere il potenziale di 50-70 g / L di etanolo a verificarsi. 8
  2. Per preparare l'inoculo coltura continua, trasferire un rappresentante AFEX CSH-tolerant colonia (analogo a Colony 5 in esempio, la Figura 1) dal ciclo da un piatto YM 48 hr a 75 ml del ODM libera-etanolo (100 g / l xilosio, in questo caso) in 125 ml flaconi. Incubare a 25 ° C, 150 giri al minuto (1 "orbita) per 24 ore. Scegliere la precoltura concentrazione ODM xilosio che corrisponda a quello del volume iniziale tenendo coltura continua.
  3. Seminare un volume di coltura continua ODM tiene a pH 6.3 ± 0.2 con 100 g / L xilosio + 20 g / L di etanolo con ~ 5-10 ml di un concentrato precoltura di un isolato AFEX CSH-tolerant (analogo a Colony 5, Figura 1 ) per ottenere 100 ml a iniziale a 620 ~ 0.5. Mantenere la cultura trattenere volume (V R), a 25 ° C in un matraccio incamiciata filatore 100 ml agitazione a 200 rpm e provvisto di sterilizzabile elettrodo pH, regolatore di pH e di circolazione bagno d'acqua a temperatura controllata.
  4. Inizialmente, poiché la crescita cellulare sarà lenta a causa della esposizione etanolo, impostare il mezzo di alimentazione di dosare utilizzando una pompa pH azionato. Impostare la pompa per alimentare pH 6.3 ODM con 100 g / L xilosio e 50 g / L di etanolo durante la fermentazione cultura scende il pH a 5,4, fermando così ulteriormente goccia pH. Mantenere il volume a 100 ml con una pompa effluente schiumando continuamente la superficie cultura. Di conseguenza, la concentrazione di etanolo aumenta con il metabolismo e l'alimentazione continua. Misurare effluenti e prelevano campioni (1-2 ml) da colture continue ogni 48-72 ore per l'analisi della concentrazione di cellule vitali, prodotti e substrati, come precedentemente descritto. 18 Per trovare la concentrazione di cellule vitali, rendere seriali 1:10 diluizioni dei campioni tampone (vedi 4.1.1) e la piastra di diffusione le diluizioni a YM agar (vedi 1.2.1). Sulla base di tassi di raccolta degli effluenti (Q), calcolare il tasso di diluizione (D) (Q / V R), e, nell'esempio di S. stipitis, che variava dallo 0 al 0.01 h -1.
  5. Salvare le scorte glicerolo regolarmente isolando dai piatti di fattibilità di diluizioni del campione buffered formando 30-100 colonie, che rappresenta i coloni robusti più diffuse a quel tempo in arricchimento. piastre inondazione con ~ 5 ml di glicerolo al 10% per permettere la preparazione di cryovials duplicati. Per la manutenzione o per una pausa, fermare la cultura continua e riavviare, se necessario utilizzando più recente (resistente) stock di glicerolo (s).
  6. Per riavviare, striscia lo stock di glicerolo (s) di piùpopolazioni resistenti a YM agar e il trasferimento di 24-48 cellule hr per ciclo per una pre-cultura del ODM libera-etanolo per l'incubazione come sopra. Seminare i 100 ml in possesso di volume di ODM per iniziale A 620 0.5 utilizzando un concentrato di lievito precultured, e consentire la cultura di crescere batch saggio fase stazionaria prima che il flusso medio di alimentazione viene riavviato.
  7. Se culture possono crescere costantemente a> 0,01 ore -1 xilosio in presenza di> 25 g / L di etanolo, avviare l'alimentazione continua coltura (ODM + 60 g / L xilosio + etanolo vanno 30 a 50 g / L) a bassa tasso di diluizione ~ 0,01 hr -1 a 100 ml in possesso del volume (inizialmente ODM + 60 g / L xilosio + 20 g / L di etanolo). Nel corso del tempo, aumentare l'etanolo nel mangime verso 50 g / L. Cattura popolazioni avanzate in scorte glicerolo.
    NOTA: Mantenere il tasso di diluizione basso permette la formazione di una concentrazione elevata di cellule sufficiente per ridurre la disponibilità di ossigeno e il supporto di fermentazione.
  8. Opzionalmente, si applicano ultravioletta (UV) irradiatione mensile per glicerolo popolazioni azionari utilizzati per reinoculate culture continui.
    1. colonie Risospendere da stock di glicerolo striature in 10 ml di ODM (come in precultures) con 60 g / L xilosio e una piscina per tutti gli stock in un unico pallone sterile. Applicare la sospensione cellulare in pool a ~ 5 x 10 8 vitali cellule / ml per coprire solo il fondo di 4-5 piastre di Petri con 6 ml / piastra. Per ottenere una copertura 6 ml di una piastra standard di Petri usa e getta, a meno di 15 ml di superare la tensione superficiale, e quindi rimuovere 9 ml.
    2. Esporre ogni piatto cultura aperta ai raggi UV dalla fonte di luce in un armadio di sicurezza biologica. Regolare il tempo di esposizione ai raggi UV o la distanza per ottenere il tasso di uccidere desiderato> 90%. Qui, esporre per 45 min a circa 56 cm dalla sorgente.
    3. Diluire sospensioni cellulari piastra prima e dopo l'irraggiamento. Stima tasso di uccidere sulla base di unità formanti colonie. Per la S. stipitis esempio, il tasso di uccidere era ~ 97%.
    4. Trasferire le culture UV-esposti (24-30 ml) di una lamina-CoVEred 50 beuta ml, e incubare a 25 ° C e 150 rpm per 24 ore per permettere la piccola percentuale di cellule vitali per ripopolare a ~ 1 x 10 8 praticabile S. stipitis cellule / ml. Impedendo riattivazioni di foto, la pellicola di copertura conserva mutazioni mentre colture sono incubate.
    5. Utilizzare la cultura mutagenizzato ripopolata per inoculare culture continui a ~ 1 x 10 7 cellule / ml vitali. Riavviare il ODM + 60 g / L di avanzamento medio xilosio etanolo arricchito per continuare il processo di selezione.

6. Valutare stock di glicerolo Popolazioni e individuare quelli con una migliore xilosio fermentazione in presenza di etanolo

  1. Streak selezionato glicerolo colture stock di YM agar come il primo passo nella schermata migliore per la crescita e la fermentazione dello xilosio in presenza di etanolo.
  2. Trasferire ogni popolazione evoluta per essere schermato da striature di agar a 75 ml precultures in ODM con 150 g / L di glucosio, e incubare in 125 ml palloni 96hr prima dell'uso come inoculi per colture di prova. Le grandi popolazioni di glucosio-grown richiederanno l'induzione di enzimi per l'utilizzo xilosio.
    1. Per testare induzione, raccogliere ogni cultura, sospendere le cellule a 30 ml, iniziale A 620 di 40 in ODM +60 g / L xilosio + 30-45 g / L di etanolo, e incubare a 25 ° C, 150 rpm (1 "orbita) in 50 ml boccette con silicio chiusure spugna. Disegnare campioni due volte al giorno per il monitoraggio xilosio assorbimento mediante analisi HPLC.
  3. In alternativa, come descritto in Slininger et al., 18 per valutare la crescita su xilosio in presenza di etanolo, preparare precultures di ciascuna popolazione evoluto dal trasferimento ad anello a 75 ml di ODM con 150 g / l xilosio in 125 ml boccette, e incubare 96 hr a 25 ° C, 150 rpm (1 "orbita). Seminare colture di prova ad un livello basso iniziale a 620 0,1 in 25 ml di ODM + 60 g / L xilosio + 30-45 g / L di etanolo in 125 ml flaconi. Incubare fiaschi a 25 ° C, 300 rpm, 1 "orbita e campione.

  1. Sulla base dei risultati della fase 6, selezionare azionari popolazioni glicerolo che mostrano capacità superiore di crescere su e fermentare xilosio in presenza di etanolo. Utilizzare questi per piastre striscia. Le piastre a scansione vengono utilizzati per preparare dense, sospensioni cellulari tamponate di A 620 = 5. Poi sospensioni cellulari vengono usati per inoculare precultures in pozzetti 96-profonde A 620 = 0,5. Inoculare 1 ml precultures su PSGHL miscelati 1: 1 con ODM + 50 g / L xilosio (senza etanolo). Incubare precultures a 96 pozzetti, piatti e profondi con ventilato bassa evaporazione copertine per 48 ore a 25 ° C, 400 rpm, 1 "orbita. Separare diversi stock di glicerolo popolazioni di pozzi vuoti.
  2. Utilizzando ogni precoltura, inoculare sedici 1 ml replicano culture iniziale A 620 ~ 0,5 a 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L xilosio con il 20, 30, o 40 g / L di etanolo per arricchire coloni tolleranti. Incubare cultu arricchimentores in modo simile a precultures.
  3. Per ogni glicerolo diverso magazzino, raccogliere i pozzi di cultura con la più alta concentrazione di etanolo permettendo l'uso di crescita e xilosio. Piatto ciascuna linea cellulare di YM agar per ottenere singole colonie prevalenti conservare in glicerolo. Raccogliere dieci colonie per linea cellulare e striscia ciascuna ad una piastra di agar YM per stock di glicerolo preparazione.

8. Ulteriori Arricchisci robusta Evolved Ceppi durante il trasferimento seriale su PSGHL, come per AFEX CSH

  1. Preparare pre-culture di NRRL Y-7124 (genitore), AFEX CSH-tolerant evoluta isolare, e la cultura continua evoluzione della popolazione con una maggiore capacità di utilizzare xilosio in presenza di etanolo. Seminare 75 ml di ODM + 150 g / L xilosio dal loop dal glicerolo archivi striature come descritto sopra (passo 2.1) per il processo di adattamento idrolizzato AFEX CSH.
  2. Diluire PSGHL con acqua per fornire una serie di concentrazioni crescenti. Preparare una micropiastra a 96 pozzetti per ciascuna delle tre linee cellulari utilizzando ciascundiluizione PSGHL per riempire 8 pozzetti con 50 microlitri. Utilizzare precoltura per inoculare ogni 50 ml di micro-cultura delle serie di diluizione a siglare un 620 ~ 0,1-0,5.
    1. Continuare l'evoluzione del lievito in aumento punti di forza di PSGHL utilizzando la stessa procedura del adattamento idrolizzato AFEX CSH sopra descritto (punto 2), fino a quando le culture sono in grado di crescere nel idrolizzato piena forza in una stalla 14-d rapporto medio di ΔA 620 per Δtime i trasferimenti seriali sono proseguiti ulteriori quattro mesi.

9. singole colonie di cellule isolarli utilizzando PSGHL Sfumature con o senza etanolo sfida

  1. Ottenere cella singola isola direttamente dalla piena forza PSGHL piastre di adattamento finali per la placcatura di diluizione per YM agar. Raccogliere dieci grandi colonie per ciascuna delle tre linee cellulari e bar consecutive a piastre YM preparare scorte glicerolo come precedentemente descritto (passo 3.2).
  2. Facoltativamente, esplorare precedenti punti temporali inprocesso evolutivo isolando dalle scorte glicerolo memorizzati delle tre linee cellulari.
    1. Seminare una precoltura per ciascuna linea cellulare da loop dal glicerolo archivi striature e incubare 24 ore su 30 ml ODM + 50 g / L xilosio (beute da 50 ml, 25 ° C, 150 rpm).
    2. Cellule sfida di precultures alla crescita idrolizzato inoculando 50 ml di 50% PSGHL in pozzetti a un iniziale A 620 ~ 0.2 e incubando staticamente 48 ore.
    3. Distribuire 0,1 ml di ciascuna coltura arricchita su piastre di agar PSGHL pendenza che varia da 0 a 50% idrolizzato forza (consegna ~ 300-400 cellule vitali per piastra), e raccogliere 10 singole colonie per linea cellulare dalla superficie più alta possibile concentrazione idrolizzato del gradiente . 21 Streak scelto colonie di YM per stock di glicerolo preparazione come al punto 3.2.
    4. In alternativa al punto 9.2.3, invece di inoculare le piastre di agar gradiente, inoculare pozzetti di 96 pozzetti micro-piastre a siglare A 620 ~ 0.2, where i pozzetti sono progettati per contenere un intervallo di concentrazioni idrolizzato dal 50 al 100% forza ed etanolo da 10 a 40 g / L. In questo caso, sviluppare micropiastre 72-96 hr e altrimenti come al punto 2.3. Isolare dieci singole colonie da pozzi dei più difficili combinazioni idrolizzato-etanolo che mostrano la crescita tramite diluizione in piastra, e preparare le scorte glicerolo come al punto 3.2.

10. In una schermata primaria, eliminare le Gli isolati inferiori confrontando e Ranking performance su PSGHL a due condizioni di nutrienti

  1. Applicare uno schermo piatto fondo ben throughput elevato di prestazioni PSGHL allo schermo cinque serie di trenta isolati con NRRL Y-7124 genitori e isolare AFEX CSH-tolerant (analogo a Colonia 5 dell'esempio evoluzione figura 1) come controlli di scegliere sei migliori ceppi (20%) da ogni set per passare al livello di screening secondario (punto 12).
  2. Effettuare lo schermo in pozzetti profondi pieni 1 ml per bene e wi coperteth coperchi in acciaio inox con silicone nero bassi sigilli evaporazione. Bloccare tutte le piastre al consiglio di amministrazione della incubatore / shaker e far funzionare a 25 ° C e 400 giri al minuto (1 "shaker orbita). Progettare tutto profondo pozzetti modelli di riempimento per consentire la separazione di diversi isolati dai pozzi aperti.
  3. Per iniziare coltivazioni, scegliere una goccia di cellule provenienti da striature glicerolo preparati da 30 isolati ottenuti come sopra (nei punti 3, 7 e 9) ai pozzetti delle ODM + 50 g / L xilosio e incubare 48 ore.
  4. Come mezzo sfida per preculturing isolati, preparare 50% PSGHL mescolando PSGHL 1: 1 con ODM + 10 g / L di glucosio + 50 g / L xilosio. Per lo screening 30 isolati e due ceppi di controllo, 2 piastre con 2 pozzetti per ciascuno dei 16 isolati sono pieni, lasciando pozzi vuoti tra i diversi isolati.
  5. Per colture sfida, trasferimento, un volume di 50 ml di ODM pre-colture (A 620 ~ 10) a ciascuno dei due pozzetti di coltura sfida PSGHL 50% per ciascuno degli isolati e controlli per ottenere un initiAl A 620 ~ 0.5 e incubare 72 ore.
  6. Utilizzare due mezzi di prova dei diversi ricchezza nutrizionale per lo screening isola: 60% PSGHL + ODM sostanze nutritive; e il 75% PSGHL + nutrienti ODM + YM. Aggiungere nutrienti ODM (esclusi zuccheri) a metà della forza di serie per ODM usare con 50 g / L di zucchero (passo 1.3). Come indicato, aggiungere sostanze nutrienti YM (esclusi zuccheri) a metà della concentrazione standard di 3 g / L di estratto di lievito, 3 g / L estratti di malto, 5 g / L peptone.
  7. Seminare colture di prova con il trasferimento di 50 ml di 72 ore il 50% delle Sfide PSGHL pre-culture per inoculare 1.000 ml a siglare A 620 ~ 0,5 in cinque pozzi profondi per ciascuno dei due mezzi di prova.
  8. Campionare ciascuna isolare tutti i giorni. Pipettare il contenuto di un pozzo ad una provetta per microcentrifuga e centrifugare (5.533 xg, 15 min) per ottenere supernate per l'etanolo, il glucosio e xilosio analisi high throughput. Misurare biomassa come 620 a 96 pozzetti micro-piastre (200 pl / pozzetto) con uno spettrofotometro.
  9. All'interno di ciascun gruppo di 30 èolates testato (5 set per S. stipitis NRRL Y-7124 evoluti ceppi), calcolare indici di performance relativi (RPI) come descritto al punto 11 qui di seguito e utilizzare per classificare ogni ceppo sulla base di produzione di etanolo (massimo di etanolo accumulato per lo zucchero iniziale in dotazione) e velocità di assorbimento xilosio (concentrazione xilosio consumata per iniziale a 96 ore) su entrambi i mezzi di prova.

11. Classifica Isolati nella schermata principale PSGHL Utilizzando Performance Index relativa (RPI)

  1. A seguito di screening primario, calcolare indici di performance relativi adimensionali (RPI), al fine di classificare il 30 isolati in ciascuno dei cinque diversi esperimenti per schermo isolati su PSGHL con due diverse formulazioni di nutrienti per esperimento, vale a dire, il 60% PSGHL e il 75% PSGHL.
  2. Calcolare il parametro statistico F per l'uso in classifica prestazioni isolare all'interno di un gruppo di isolati testati in un dato esperimento: F = (XX avg) / s. Qui, X è il parametro prestazioni, quali la resa (Y)o il tasso di (R), osservato per ogni individuo isolato, mentre X AVG e s sono la media e deviazione standard, rispettivamente, di X osservata per tutti gli isolati all'interno di un dato esperimento. Per le distribuzioni normali, -2 <F <2.
  3. Per ogni isolato in un esperimento, calcolare la performance relativa in base alla frequenza, RPI R = (2 + F R) × 100/4, e allo stesso modo di calcolare la performance relativa sulla base di rendimento, RPI Y = (2 + F Y) × 100/4 . Il valore di RPI va da 0 a 100 ~ percentile (più basso al più alto). Poi calcolare le medie RPI per ogni isolato all'interno di un dato esperimento idrolizzato come segue: RPI avg = (RPI Y + RPI R) / 2, in cui i contributi di rendimento e di tasso sono dati lo stesso peso in questa applicazione.
    Si noti che, in generale, i parametri di rendimento e di tasso possono essere ponderati se ritenuto disuguale importanza.
  4. Calcolare RPI generale tra i tipi di n idrolizzati testati: RPI generale i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n. Considerate ogni isolato in una serie sperimentale di 30 isolati e 2 controlli. Durante la classifica principale del ~ 150 single-colonia isolati adattato alle xilosio-ricchi PSGHL, l'RPI globale è calcolato per i tassi e rendimenti attraverso le due formulazioni PSGHL applicati nello schermo, vale a dire, il 60% PSGHL e il 75% PSGHL, dove n = 2.
  5. Sulla base di RPI complessiva all'interno di ogni esperimento, scegliete la percentuale superiore di isolati di passare alla schermata secondaria. In questo esempio, il 20% dei ceppi sono scelti per passare attraverso (cioè, 30 di 150 testato).

12. In una schermata secondaria, confrontare Top Performers schermo primario su più idrolizzati completa (> 100 g / l Zuccheri misti) per rivelare più alto Funzionamento ceppi robusti

  1. Confronto performer PSGHL top il 6% glucano CSH AFEX e SGH modificata con due livelli di azoto, SGH-N1 e N2 SGH-(composiziones come nella Tabella 1) per la classifica finale. Schermo 30 isolati che sono stati i top performer nella schermata ben piatto fondo primario di PSGHL (punti 10 e 11) e le due controlli (ceppo NRRL Y-7124 e isolare AFEX CSH-tolerant (analogo a Colony 5, Figura 1 Esempio ).
  2. Iniziare coltivazioni scegliendo una goccia di cellule da striature glicerolo duplicare pozzi profondi da 1 ml ODM + 50 g / l xilosio come prima e incubare 48 ore nel profondo sistema di pozzetti (passo 10.2). Poi il trasferimento 50 ml di precultures ODM al 50% culture sfida SGH, e incubare al sistema ben piatto fondo per 72 ore per ottenere un 620 a ~ 10). Preparare la SGH 50% mescolando SGH 1: 1 con sugarless ODM + 50 g / L xilosio (pH 5,6).
  3. Per ciascuno degli isolati, inoculare una aliquota di SGH-N1-N2 o SGH 16 ml con il pellet cellulare (15 min, 2.711 xg) da tre pozzetti di coltura sfida per produrre cultura prova iniziale A 620 ~ 2,0. Incubare colture di prova a 25 & #176;. C, 180 giri al minuto (1 "orbita) in palloni da 25 ml con chiusure spugna silicone fiaschi campione quotidiane e analizzare per lo schermo PSGHL.
  4. Analogamente, schermo isolati come nei passaggi 12.2 e 12.3, ma questa volta sostituto SGH-N1 e N2 SGH-con 6% glucano CSH AFEX a pH 5,2 per l'uso nella preparazione del terreno di coltura sfida medio e coltura di prova. Per i 50% culture sfida la forza, usare il 6% AFEX CSH diluito 1: 1 con acqua in quanto è sufficiente l'azoto senza emendamenti.
  5. Ripetere i passaggi 12,1-12,4 per duplicare i risultati.

13. Classifica le performance degli isolati nella schermata secondario con RPI complessivo per votare utilizzo di più idrolizzati Complete

  1. Calcolare indici di performance relativi (RPI) al fine di rango ciascuno dei top 20% degli isolati (~ 30 su 150) dalla schermata principale che sono stati testati nella schermata secondaria sul enzima saccarificato formulazioni idrolizzato di varia ricchezza nutrizionale.
  2. Punteggio ogniisolare testato nella schermata secondaria sulla base di velocità di assorbimento xilosio e resa di etanolo eseguita su tre formulazioni idrolizzato da enzimi saccarificato pretrattata eseguito in duplicato, compreso AFEX CSH (i = 1 e 2), SGH-N1 (i = 3 e 4) e SGH -n2 (i = 5 e 6).
  3. Calcolare il RPI complessiva per ogni isolato, e applicare questo parametro classifica a vagliare ulteriormente l'elenco degli isolati superiori: RPI complessivo = Σ i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n, dove n = 6 .
    NOTA: Dimostrare cinetica di isolati superiori a idrolizzati SGH-N2 in culture pallone seguendo le procedure descritte in Slininger et al 18.

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Representative Results

S. stipitis stata evoluto utilizzando combinazioni di tre culture di selezione, che comprendeva AFEX CSH, PSGHL e xilosio-fed coltura continua etanolo-sfidato. Figura 1 mostra lo schema degli esperimenti evoluzione eseguiti insieme gli isolati pensa sia per eseguire più efficacemente complesso, o più efficacemente su una delle testate idrolizzati. Tabella 3 mostra i numeri NRRL adesione di questi isolati superiori e riassume le sollecitazioni applicate adattamento nel processo di realizzazione popolazione arricchita dal quale è stato isolato ciascun ceppo. Alcuni isolati sono stati visti per avere prestazioni superiori rispetto a uno o due tipi idrolizzato, ma 7 su 11 isolati ottenuto buoni risultati su tutti i tipi idrolizzato, anche se la maggior parte di questi sono stati esposti e verificate da un solo tipo durante l'evoluzione. I successi dei vari evoluzione approcci qui sono dimostrato nelle figure 2 -7 e Tabella 4.

Figura 2 illustra i miglioramenti distinti osservati dopo la prima fase di adattamento in cui sono state arricchite derivati robusti ceppo NRRL Y-7124 durante il trasferimento seriale concentrazioni crescenti di AFEX CSH (Fase 2). Nelle culture in crescita del 6% glucano CSH AFEX, la popolazione evoluta dimostra più accumulo rapida e più elevati titoli finali di etanolo rispetto al ceppo parentale. Più rapida utilizzazione del glucosio inoltre è visto insieme a più rapida diffusione xilosio subito dopo l'esaurimento del glucosio. Inoltre nella figura 3, la stabilità della popolazione modificato caratteristiche è illustrato nel mezzo ODM sintetico con una miscela di 87 g / L di glucosio e 66 g / L xilosio. In questo caso, sia la popolazione arricchita (Figura 3B) e colonie isolate (Colony 1 e Colony 5, Figura 3C e 3D, respectively) sono in grado di sovraperformare il ceppo utilizzando il xilosio in modo più efficiente per produrre etanolo più rapidamente, riducendo i tempi di picco di etanolo da almeno 4 giorni. Significativamente le concentrazioni di etanolo superiori sono stati accumulati da ceppi evoluti su ODM (55-60 g / L) rispetto al genitore (40-45 g / L). Le mutazioni, che ha portato ad un fenotipo stabile di riduzione diauxy durante la transizione di glucosio-xilosio e più efficiente la fermentazione dello xilosio, sono sorte come la popolazione di lieviti si è evoluta in AFEX CSH.

Ulteriori miglioramenti a Colony 5 sono stati perseguiti da sottoporlo alla selezione naturale in coltura continua xilosio-fed in presenza di livelli crescenti di etanolo fino a 50 g / l. In questa condizione, la popolazione di lievito mantenuto in coltura continua deve essere in grado di indurre enzimi per l'utilizzo xilosio come unica fonte di carbonio in modo che esso sia in grado di crescere a una velocità sufficientemente elevata per popolare fermentatore nonostante una diluizione costantetasso. Nel ceppo parentale, l'induzione di enzimi xilosio comincia ad essere inibita a concentrazioni di etanolo a partire da 15-20 g / L. 8 Derivati di Colony 5 sono stati catturati scorte glicerolo al precoci e tardivi punti di tempo di funzionamento della coltura continua, e la figura 4 mostra il miglioramento successo nell'utilizzo xilosio in presenza di 40 g / L di etanolo osservato in derivati evolute di Colony 5 rispetto al NRRL Y-7124 genitore e il Colony iniziale 5 inoculato al processo.

Gli isolati derivanti da tutte le fasi del piano di adeguamento della figura 1 sono stati proiettati in PSGHL per identificare quelli con capacità superiore a fermentare xilosio (passo 10.1). Gli isolati mostrate in Figura 5 sono tra i migliori esecutori PSGHL su ~ 150 ordinati in questa schermata principale e in tutti gli schermi secondari di prestazioni come descritto di seguito. Per indicare il miglioramento degli isolati evolutirispetto al loro genitore, le prestazioni di ogni isolato è stata espressa come rapporto tra i valori dei parametri cinetici di isolare al ceppo parentale. Valori del rapporto di "uno" si è verificato se le prestazioni isolato era equivalente al genitore. Figure 5a e 5b riassumere superiore isolare le performance sul 60% e il 75% di forza di PSGHL con ODM o ODM + YM integratori nutrizionali. Come la concentrazione idrolizzato e la durezza è stata aumentata, i rapporti di prestazione diminuita. Nella forza PSGHL 60%, cinque dei sette top gli isolati esposto a PSGHL pressione selettiva tenuto numerosi volte meglio di NRRL Y-7124 (isolare 1). Quattro isolati risultati migliori rispetto Colony 5 (isolare 33), che si era evoluto durante l'esposizione al AFEX CSH ma non aveva alcuna esposizione selettiva precedente PSGHL. Tuttavia, nella forza del 75% di PSGHL, solo 3 gli isolati significativamente superato sia il genitore e Colony 5 (isolare 33), nonostante i nutrienti aggiunti. Di questi, superiore isolati 15 e 16 sono stati precedente ay sfidato con concentrazioni crescenti di PSGHL come pressione selettiva guida evoluzione. Isolati 15, 14 e 3 sono stati esposti solo per PSGHL, mentre l'11, 13 e 16 avevano esposizioni multiple. Isolati 3, 11, e 13 erano da punti temporali precedenti durante l'evoluzione sulla PSGHL e quindi aveva un po 'meno opportunità di sviluppare la tolleranza rispetto a 14, 15 e 16. Mentre è evidente nella figura 5 che il trasferimento seriale crescente forza di PSGHL servita per sviluppare ceppi resistenti al suo ambiente inibitorio, è anche evidente che l'esposizione del ceppo NRRL Y-7124 per AFEX CSH solo potrebbe potenzialmente generare isolati come Colony 5 (33) con tolleranza croce PSGHL. Così, è stato indicato che i ceppi robusti in grado di svolgere in più idrolizzati possono essere trovati arricchimento di tolleranza in un idrolizzato seguita dalla proiezione prestazioni in un altro. Isolati ottenuti dalla cultura continuo xilosio-alimentati sono stati anche proiettati su PSGHL 60% e il 75% di forza consostanze nutritive e di glucosio aggiunto anche a 75 g / L, al fine di sostenere la sfida di etanolo e testare lag diauxic su xilosio dopo l'utilizzazione del glucosio. Mentre isolati 27, 28 e 30 erano superiori agli altri da questa fase di adattamento, entrambi indici di performance velocità di assorbimento di rendimento e xilosio erano simili al genitore il 75% PSGHL con sostanze nutritive ODM e YM aggiunto, che non è necessariamente sorprendente in quanto nessuno aveva precedente esposizione a questo idrolizzato (vedi anche Slininger et al. 18 per i dati aggiuntivi non mostrati qui per le culture fornito 75 g / L di glucosio).

Le migliori ceppi selezionati dalla schermata principale sul PSGHL ricco di xilosio sono stati successivamente proiettati su tre idrolizzati completi. Questi idrolizzati (Tabella 1) inclusi AFEX CSH e diluire acido SG pretrattati trattati con cellulasi commerciali e integrati a due diversi livelli di azoto (SGH-N1 e SGH-N2) per identificare l'iso più versatiletardive rispetto alle variazioni inibitore e ambiente nutrizionale. Gli indici di performance relative (RPI) sono stati calcolati per la fermentazione di ogni isolare all'interno di ogni idrolizzato (figura 6A). La figura 6B mostra gli indici di prestazioni complessive combinati calcolati per ogni isolano. Cinque isolati (3, 14, 27, 28, 33) hanno RPI complessiva superiore a 60, che li classificato come il più robusto per tutte le variazioni di idrolisati e condizioni di nutrienti combinate. Revisione Tabella 3, sia isolati 3 e 14 sono stati evoluti in PSGHL mentre il 27, 28, e 33 sono stati evoluti in AFEX CSH o AFEX CSH ed etanolo-sfidato la cultura continua su xilosio. Nessuno dei ceppi espositrici uso idrolizzato multiplo superiore sono stati evoluta su più di un idrolizzato.

Alcuni ceppi erano "specialisti" di eseguire meglio su entrambi i SGH-N1 / 2 o AFEX CSH. Quei isolati che svolgono meglio come specialisti sulla SGHidrolizzati (11, 16 e 9) sono stati ottenuti evoluzione sulla PSGHL come la sfida finale o soltanto. Per isolati 11 e 16, che sono state inizialmente arricchita attraverso l'aumento AFEX sfida CSH, la capacità di utilizzare efficacemente AFEX CSH non è stata selezionata attivamente durante l'arricchimento finale lungo in PSGHL e principali fattori genetici che sostengono il suo uso sono stati evidentemente perso. Al contrario, gli isolati 14, 25, 27, 30 e 33 erano esecutori superior AFEX CSH, e tutti tranne isolato 14 sono stati evoluti su AFEX CSH con o senza sfida etanolo. Così come previsto, diretto evoluzione sulla AFEX CSH o PSGHL tendeva a selezionare per il lievito ben adattato alla idrolizzato selezione. L'unica eccezione a questo proposito è stato isolato 14. Isolare 14 origine dalla PSGHL sfidare solo ed è stato isolato da YM agar diluizione in piastra della cultura finale PSGHL arricchimento. Slininger et al. 18 hanno mostrato Questo isolato di avere capacità superiori di xilosio induzione enzimatica nelle cellule del glucosio coltivate in presenza di5-15 g / L di acido acetico e ridotti lag diauxic sulla ODM con 75 g / L rispettivamente di glucosio e xilosio, nonostante> 30 g / L di etanolo che si verificano prima del punto di transizione glucosio-xilosio.

La cinetica superiori di ceppi evoluti rispetto al ceppo S. stipitis NRRL Y-7124 è stata dimostrata come illustrato nella Tabella 4, che rappresentano i risultati di basso livello culture pallone aerazione inoculate a siglare A 620 8,4 ± 2,5 75 ml SGH-N2 (pH 6.2) incubato in 125 ml flaconi con i tappi di spugna silicone a 25 ° C, 150 rpm (1 "orbita), in figura 7, che rappresenta moderati culture boccetta aerazione inoculate a iniziale Un pallone 620 0,5 in 23 ml SGH-N2 per 50 ml. 18 Queste condizioni rappresentano due differenti tipi di operazioni suggerite dal letteratura come potenzialmente commercialmente promettente per la produzione di etanolo da S. stipitis. 8,22 Nei abetit istanza di basso aerazione livello, l'alta densità di cellule prevede una rapida fermentazione per iniziare immediatamente. Mentre nel secondo caso, la densità cellulare basso e più alto di piombo aerazione livello di crescita logaritmica per costruire la popolazione e accelerare la conversione di zucchero di crescita associata ad etanolo. Questi dati dimostrano che i ceppi evoluti hanno notevoli vantaggi cinetici sopra il ceppo: più rapido di glucosio velocità di assorbimento (Tabella 4), più rapida velocità di assorbimento specifico xilosio (tabella 4), la produttività etanolo più rapida sia glucosio e xilosio e nel complesso (Tabella 4), più breve ritardo che precede la crescita (figura 7), e più breve di glucosio diauxic di xilosio ritardo di transizione. Questi miglioramenti hanno permesso di accumulare etanolo a più di 40 g / L e a picco giorni prima (Figura 7) rispetto a quanto visto per il genitore NRRL Y-7124. Maggiore produttività complessiva etanolo (Tabella 4) è stato ottenuto a 1.5 a 5 tempos che del ceppo (Tabella 4), a seconda del ceppo evoluto.

Figura 1
Figura 1:. Diagramma di flusso adattamento Scheffersomyces stipitis Il diagramma mostrato indica l'ordine delle sollecitazioni applicate durante il processo di adattamento e dei punti di recupero degli isolati superiori (numeri tra parentesi). Si veda anche la tabella 3 chiave isolato come riferimento per le identità di deformazione. Per fornire orientamenti tempo, i numeri in rosso indicano il numero di giorni in ogni fase di adattamento. Per le fasi di trasferimento seriali in AFEX CSH e PSGHL ricchi di xilosio, ogni giorno di adattamento rappresenta circa 2-4 generazioni. Per la fase coltura continua (205 giorni totale), il tasso di diluizione D è variabile a ~ 0-0,1 hr -1 durante 125 d di funzionamento con alimentazione pH-azionato. Nel prossimo80 giorni, il funzionamento sia a flusso continuo con D a 0.012 hr -1, fornendo un tempo di generazione (ln 2) / (D) di 58 ore, o 1 generazione l'2,4 d allo stato stazionario. Avanti un campione della popolazione adattato dalla cultura continuo 205 giorni è stato mutagenizzato con luce UV ed inoculato in una coltura continua operato con D a 0.012 hr -1. (Tratto da Slininger et al. 18) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Migliorata lotto fermentazione del 6% glucano CSH AFEX Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 ceppo fermentazione del 6% glucano AFEX CSH (A) viene confrontato con adattato Colony 5 fermentazione del 6% glucano AFEX pretrattati paglia del mais hydrolyzate (B). Simboli designano biomassa (quadrato rosso), glucosio (cerchio nero con linea tratteggiata), xilosio (cerchio blu con linea continua), etanolo (triangolo verde), e xilitolo (diamante viola). (Tratto da Slininger et al. 18) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Ridotto ritardo diauxic in media definita con zuccheri misti performance di fermentazione sono confrontati in ODM con 66 g / L di glucosio e 87 g / L xilosio per ceppo S.. stipitis NRRL Y-7124 (A), il AFEX CSH adattato popolazione derivato da Y-7124 (B), singola colonia cella 1 isolato dal S. adattato popolazione stipitis (C), cellula singola Colony 5 isolato dalla popolazione adattato (D). Simboli designano biomassa (quadrato rosso), glucosio (cerchio nero con linea tratteggiata), xilosio (cerchio blu con linea continua), etanolo (triangolo verde), xilitolo (diamante viola), e adonitolo (diamante oro con bordo nero). (Tratto da Slininger et al. 18) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: L'etanolo derivati resistenti di Colonia 5. Hydrolyzate Colony tollerante 5 è stato ulteriormente sviluppato da selezione cultura continuo ODM contenente xilosio come unica fonte di carbonio e alti livelli di etanolo. Due stock di glicerolo popolazioni derivati ​​ottenuti nelle prime fasi del processo di selezione (2A.1.53R, triangolo arancione e la linea tratteggiata) e unaopo irradiazione UV di inoculi coltura continua (2A.1.30R.2, cerchio viola e la linea tratteggiata) sono mostrati in confronto con il ceppo NRRL Y-7124 genitore (cerchio verde con linea continua) e AFEX CSH Colony tollerante 5 (triangolo nero con linea continua). Xilosio assorbimento da dense popolazioni di lievito glucosio-grown (A 620 = 50) in ODM con 40 g / L di etanolo ha indicato che tutti i ceppi adattati superato il genitore inadatto nella capacità di indurre il metabolismo xilosio. (Tratto da Slininger et al. 18) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Rapporto di miglioramento delle prestazioni di isolare tolleranti rispetto al genitore Le prestazioni di isolati tolleranti superiori sono riassunti relativi allail controllo ceppo NRRL Y-7124 per ciascuna formulazione di PSGHL (A, B). Le prestazioni sono state valutate in termini di tasso di assorbimento xilosio (barre blu che rappresentano i rapporti di isolare al padre) e la resa di etanolo per zucchero fornito (barre verdi che rappresentano rapporti di isolare al genitore). (Tratto da Slininger et al. 18) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: Isolare graduatoria stilata in base RPI. Il concetto relativo indice di prestazione (RPI) è stato applicato ai risultati delle prestazioni dello schermo secondario al fine di rango 33 isolati all'interno di ogni tipo idrolizzato in base a velocità di assorbimento xilosio e la resa di etanolo per ogni zucchero fornito. (A) Il parente Ranre di un dato isolato dipendeva dal tipo di idrolizzato (P <0.001): SGH-N1 (barre blu), SGH-N2 (barre rosse) e AFEX CSH (barre verdi). (B) L'RPI complessivo calcolato per tutti i tipi idrolizzato (barre azzurre) indicato ceppi superiori con più robusta performance tra le diverse condizioni di idrolizzato. (Tratto da Slininger et al. 18) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7: fermentazioni SGH comparativi di isolati adattati superiori di S. stipitis. Superior adattato isolati e la loro ceppo NRRL Y-7124 vengono confrontati fermentazione idrolizzati enzimatici di acido pretrattati diluito switchgrass (20% di solidi di carico) a 25 ° C e pH 6,2 iniziale a bassa iniziale densità cellulare. sono mostrati andamento nel tempo della biomassa (quadrati rossi), glucosio (cerchi neri e linea tratteggiata), xilosio (cerchi blu e linea continua), e l'etanolo (triangoli verdi). Le barre di errore rappresentano la gamma per il valore medio contrassegnato da simboli. (Tratto da Slininger et al. 18) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1:. Composizioni di idrolizzati utilizzati nelle coltivazioni (. Tratto da Slininger et al 18) Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: media definito ottimale per Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 7TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3:. Sintesi dei ceppi Scheffersomyces tolleranti superiori stipitis per la fermentazione di idrolizzati di biomassa vegetale (. Tratto da Slininger et al 18) Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Cinetica comparativi di isolati su switchgrass idrolizzato SGH-N2 inoculato a siglare A 620 = 8.4 ± 2.5 Le tariffe sono tariffe normalizzati per unità di assorbanza durante il glucosio o il consumo xilosio.. (Tratto da Slininger et al. 18) Clicca qui per scaricare table.

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Discussion

Diversi passaggi sono stati fondamentali per il successo del processo di evoluzione. Innanzitutto, è fondamentale scegliere adeguate pressioni selettive a guidare l'evoluzione della popolazione verso i fenotipi desiderati che sono necessari per una corretta applicazione. I seguenti sollecitazioni selettivi sono stati scelti per S. stipitis sviluppo e applicata in tempi opportuni per guidare arricchimento per i fenotipi desiderati: crescente forza del 12% glucano AFEX CSH (che costringe la crescita e la fermentazione di diversi zuccheri in presenza di acido acetico e bassi livelli di aldeidi furani e altri inibitori); xilosio alimentato culture in continuo con l'aumentare della concentrazione di etanolo (che costringe l'induzione enzimatica xilosio per ridurre il ritardo diauxic); e aumentando forza del 20% di solidi loading PSGHL (che costringe la crescita e la fermentazione dello xilosio in presenza di elevata acido acetico, furani e altri inibitori). In secondo luogo, è importante preservare le popolazioni di lievito evoluzione mediante congelamento glicerolo stocks di campioni di popolazione come il processo di arricchimento progredisce. Tali istantanee della popolazione possono essere conservati per il test funzionale periodico di documentare i progressi evoluzione e permettere isolamenti successive, se lo desideri, o per riavviare i processi di evoluzione dopo una pausa. Un terzo passaggio chiave nella procedura evoluzione era recuperare isolati eccezionali arricchendo popolazioni cultura selezione o glicerolo fornito popolazioni a terreni selettivi conveniente (come agar o micro-piastre contenenti un gradiente di stress che presenta una serie di idrolizzato e / o di concentrazioni di etanolo) . Poi colonie sopravvissute crescono sotto la condizione più stressanti possono essere raccolti per preservare per la caratterizzazione più tardi. Questi tre passaggi fondamentali possono essere ripetute per perseguire ogni ulteriore pressione selettiva fenotipo desiderato, o, in alternativa, pressioni multiple in un singolo ciclo se del caso. Quando la popolazione genitore lievito nativa è esposto alle varie sollecitazioni, la diversità genetica è prevista per sorgere ° mutazioni naturali o indotte grezzi, e l'esposizione continuata permetteranno la selezione naturale per arricchire per gli individui con le mutazioni più favorevoli sostengono la sopravvivenza competitiva. Si prevede che il fenotipo selezionato verificarsi come risultato di molteplici mutazioni genetiche. Nel protocollo di cui sopra, le mutazioni possono essere indotte durante il trattamento UV o potenzialmente durante l'esposizione di lievito per idrolizzati. Idrolizzati sono noti per contenere tre classi di composti dannosi per i microrganismi:. Acidi carbossilici, aldeidi e fenoli 22 aldeidi reattive, come furfurale e 5-idrossimetilfurfurale, possono danneggiare le cellule e causare un aumento di specie reattive dell'ossigeno (ROS), generato tipicamente mitocondri. ROS sono ben noti per causare mutazioni del DNA nelle cellule eucariotiche. 23,24 I composti fenolici presenti nel idrolizzati, anche se non precedentemente noti per essere genotossico, può promuovere e sinergizzare gli effetti mutageni di aldeidi e mutageno ROS. 25

jove_content "> La strategia graduale di ambienti progressivamente difficili si prevede di costruire ceppi evoluto con una serie di miglioramenti fenotipo, sia mirati e anche non mirati. E 'possibile che alcuni fenotipi non mirati possono sorgere che sono indesiderabili o instabile. Al fine per catturare i ceppi più altamente funzionanti e robusti, un passaggio chiave aggiuntiva che deve essere preso è quello di valutare e confrontare gli isolati selezionati per tratti commercialmente rilevanti, raggiungendo per entrambi i fenotipi mirati e non mirati. per fare questo, isolare le prestazioni devono essere confrontati in una varietà di condizioni di stress orientati all'applicazione, come in idrolizzati con diverse sfide inibitori e formulazioni di nutrienti, che permettono una selezione delle migliori ceppi complessive che sono stabili e robusto per un'ampia variazione substrato lignocellulosici industriale. Inoltre, una sfida stabilità ceppo può essere incorporato nel schermo come è stato fatto l'esempio includendo passi preculturing involving crescita iniziale del lievito su due terreni non selettivi, YM agar per diverse generazioni seguito dal ODM sintetico con 50 g / L xilosio per altri 6-7 generazioni, dando opportunità di destabilizzazione di tratti culturali desiderati prima dell'esposizione alla sfida di prestazioni in idrolizzato. In base a caratteristiche di prestazioni significative, come ad esempio la produzione di etanolo e velocità di assorbimento xilosio, isolati vengono poi classificati in ogni condizione di stress diverso, come ogni ambiente idrolizzato testata, che può essere diversa da terreno di coltura di arricchimento del isolato. L'RPI adimensionale può essere usata per calcolare la media performance relativa complessiva e rango di isolati a confronto. Un fattore adimensionale è opportuno riflettere la performance relativa in diversi tipi di idrolizzati e sulla base di diverse valutazioni di prestazioni, come ad esempio i rendimenti rispetto tassi. Questa procedura classifica identifica ceppi che eseguono costantemente e attraverso ampie variazioni delle condizioni di crescita e hydrolyzates e sono suscettibili di essere sia robusta e geneticamente stabili.

Diverse iterazioni e modifiche di questi passaggi fondamentali possono essere necessari per accogliere l'evoluzione di qualsiasi ceppo microbico capace di caratteristiche specifiche o uniche prestazioni sul idrolizzati lignocellulosici o altri substrati di interesse. Nella S. stipitis esempio, è importante notare che la supplementazione di nutrienti, tra cui fonti commerciali a basso costo, per idrolizzati preparati in alto contenuto di solidi di carico è stata la chiave per il controllo della gamma dinamica di performance isolare per una migliore separazione statistico durante lo screening. L'importanza di nutrienti della fermentazione successo idrolizzati inibitori concentrati stato anche segnalato in precedenza e si pensa che sia dovuto ad un bisogno elevato per aminoacidi e altre sostanze nutritive necessarie per la manutenzione delle cellule, bilanciamento redox, e la riparazione a seguito di tali condizioni di stress, soprattutto durante l'utilizzo xilosio. 9,26,27Inoltre, se i nutrienti sono troppo scarse o troppo abbondanti, le differenze di prestazioni isolare possono essere difficili da individuare statisticamente a causa di tutti gli isolati di fare eccessivamente male, o tutti facendo estremamente bene, rispettivamente. Isolati in grado di svolgere bene in condizioni diverse dovrebbero essere affidabile, robusto o alle variazioni delle condizioni industriali.

Il limite principale di questo protocollo è che l'evoluzione adattativa e lo screening sono molto letterale nel risultato, nel senso che "si otterrà ciò che si arricchisce e schermi per". Pertanto, devono essere progettati per amplificare e identificare gli individui, rispettivamente, con i cambiamenti desiderabili in fenotipi pur mantenendo desiderabili caratteristiche preesistenti condizioni arricchimento e schermo. L'evoluzione può influenzare non selezionati per i tratti che sono critici per le prestazioni industriali (ad esempio, i requisiti di fattore di crescita). Per questo motivo, il progresso arricchimento di popolazione per un tratto necessario monitorare periodicamenteED per altri tratti come metodo di risoluzione dei problemi per i cambiamenti indesiderati. Ad esempio, una delle caratteristiche uniche di S. stipitis è la sua capacità nativa di crescere su e fermentare xilosio. Tutti i supporti di arricchimento e di screening inclusi xilosio come unica o chiave fonte che contribuisce carbonio in presenza di inibitori. Di conseguenza, una caratteristica comune di tutte le colture di arricchimento in questo esempio era che direttamente selezionati per xilosio utilizzando ceppi più rapide, la cui popolazione è diventato sempre più arricchito in coltura seriale o continuo perché erano concorrenti migliori. Come un risultato previsto, ceppi migliorate erano tutti in grado di più rapido assorbimento xilosio, ma miglioramenti alla produzione di etanolo sono stati molto meno drammatico di miglioramenti nella velocità di assorbimento xilosio. Quest'ultima tendenza probabile è nata da etanolo resa dal ceppo era relativamente elevato a circa 0,3 g / g, o il 60% del teorico (0,51 g / g), come la crescita cellulare è diventato stazionario in idrolizzati, lasciando meno spazio permiglioramento. Nelle culture, i rendimenti di etanolo superiori potrebbero essere eventualmente selezionati contro perché l'etanolo è un inibitore della crescita, che ha reso necessario il monitoraggio delle prestazioni della popolazione evoluta per questa caratteristica. Le concentrazioni di etanolo mantenuto sotto del livello di inibizione della crescita tenderebbero a neutralizzare questo come un fattore di selezione. Per S. stipitis NRRL Y-7124, 40 g / l di etanolo metà tasso specifico di crescita, mentre 64 g / L impedisce la crescita del tutto. 28 In etanolo sfidati culture continui alimentati xilosio, aerazione è stata mantenuta bassa e tassi di diluizione sono stati anche mantenuto sufficientemente basso con ampio xilosio presente per favorire la fermentazione piuttosto che la respirazione di etanolo e prevenire arricchimento per una proprietà di uso di etanolo indesiderato. Inoltre, gli integratori nutrizionali alle idrolizzati utilizzati nelle schermate di performance sono stati studiati in modo da evitare la selezione per i ceppi che hanno bisogno di un costoso ricco apporto di sostanze nutritive, come ad esempio estratto di lievito. I supplementi inclusi sempre fonti commerciali più basso costo dispone, come la farina di soia e urea, anche se i componenti ricchi come in YM sono stati applicati in colture tandem per le prove comparative, come nelle formulazioni di 60% e il 75% PSGHL normalmente deplezione di azoto. Il mezzo sintetico ODM, utilizzato in schermi precoltura e cultura della performance, è stato originariamente progettato per ottimizzare le prestazioni del ceppo S. stipitis NRRL Y-7124 7 secondo la routine di ottimizzazione di coltura descritto da operatori Protein 20 che raccomanda ingredienti definiti, tra cui vitamine, minerali, purine e pirimidine, e fonti di amminoacidi per fornire nutrienti compatibili con conveniente industriale scale-up utilizzando fonti commerciali. Una raccomandazione finale nella progettazione ceppi pertinenti, è quello di mantenere il design delle condizioni arricchimento e schermo possibile pertinenti alle condizioni di processo industriale attesi.

etanolo rinnovabile a costi competitivi è stato a lungo perseguito per restrarre la dipendenza dai combustibili fossili. Per migliorare la capacità di S. stipitis NRRL Y-7124 a tollerare, crescere e fermentare idrolizzati inibitori della lignocellulosa, diversi ricercatori hanno utilizzato coltura ripetitivo nel liquore ricco di xilosio derivante dalla diluita di acido-pretrattamento della biomassa lignocellulosica. 13,14,16,17 Over-calcinazione per disintossicare inibitori è stato ancora necessari per consentire un ragionevole livello di prestazioni di ceppi presto adattati su legno duro e paglia di grano liquori di pretrattamento. 13,14 più turni ripetuti di mutagenesi UV e genoma rimescolamento sono stati applicati per sviluppare derivati di S. stipitis NRRL Y-7124 con una migliore tolleranza inibitore e la crescita in legno speso liquore solfito (HWSSL). 16,17 Tuttavia, le concentrazioni di etanolo prodotto da questi ceppi in HWSSL erano sotto i 10 g / L dopo 6 a 7 giorni. Utilizzando le tecniche illustrate e descritte qui, nuovi ceppi di S. evoluti stipitis NRRL Y-7124 sono stati sviluppati per soddisfare phenotyobiettivi pe necessari per uso commerciale economico: fermentazione di idrolizzati a pH 5-6 senza misure disintossicazione precedenti, come over-calcinazione, che conduce allo smaltimento dei rifiuti costosa; notevolmente ridotto la crescita e ritardi diauxic; accumuli di etanolo abbastanza alti per la distillazione commerciale (> 40 g / l di etanolo); più rapida crescita e la produttività di etanolo di quanto precedentemente riportato per i ceppi di lieviti autoctoni che fermentano idrolizzati undetoxified; e le prestazioni in diversi idrolizzati a solidi alto carico, tra cui SGH opportunamente soia azoto integrato (che altrimenti l'azoto poveri) e senza supplementi CSH AFEX. I ceppi migliorati sviluppati utilizzando il romanzo approcci aggressivi per l'evoluzione come incarnata nei passaggi chiave sopra sintetizzate, sono tenuti a beneficiare l'economia di produzione di etanolo da biomasse agricole, abbassando i costi operativi, costi di capitale e gli ingressi di energia e acqua. Questo è il primo piano di ceppo evoluzione segnalato per produrre ceppi adattati di S. stipitè la dimostrazione la produzione di etanolo economicamente recuperabili su idrolizzati undetoxified.

I nuovi ceppi di S. stipitis derivanti da ogni fase del processo di evoluzione (Figura 1) sono candidati per studi futuri per determinare i cambiamenti genetici associati a specifiche pressioni selettive applicate ei meccanismi attributi chiave alla base di una migliore fermentazione idrolizzato, come la tolleranza inibitore e ridotto ritardo diauxic. Tale nuova preziose conoscenze aiuterà l'ingegnerizzazione di biocatalizzatori lievito di nuova generazione e processi per la conversione di lignocellulosa in biocarburanti e altri prodotti. Come nuovi ceppi derivano, probabilmente sarà vantaggioso per ripassare popolazione derivata attraverso un protocollo evoluzione ceppo simile a quella descritta qui per selezionare i trasformanti più utili per uso commerciale in idrolizzati. Allo stesso modo, come nuovi ceppi microbici sono scoperti con il potenziale per fare una miaRiad di utili nuovi prodotti da biomassa rinnovabile, il processo di evoluzione potrebbe essere ulteriormente applicato per migliorare ceppo robustezza e la produttività in idrolizzati, potenzialmente permettendo processi e prodotti bio-catalitico nuovi da mettere a disposizione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour Archer Daniels Midland Co. (ADM) 63160 ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant) Sigma-Aldrich P1300 Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids Becton Dickinson and Company 228830 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan  Sigma-Aldrich T3300 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine  Sigma-Aldrich C7352 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar Becton Dickinson and Company 214010 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract Becton Dickinson and Company 218630 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract Becton Dickinson and Company 212750 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean Fluka P0521-500g multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder Sigma-Aldrich A8626 CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99% Sigma-Aldrich C3506 CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra Sigma-Aldrich G6779 CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99% Sigma-Aldrich T0376 CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99% Sigma-Aldrich U0750 CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS Fisher Chemical D16-500 CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99% Sigma-Aldrich X1500 CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates Becton Dickinson Falcon 351172 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper Kimberly-Clark towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) Corning Life Science Glass 4980-125 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) M1335-0016 multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates Applikon Biotechnology Z365001700 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates Applikon Biotechnology Z365001296 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover Applikon Biotechnology V0W1040027 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover Applikon Biotechnology V0W1040001 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene Applikon Biotechnology ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks Bellco 1924-00032 Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. Bellco 1968-00100 (original Cat. No.) Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven MathisAg Typ-Nbr BFA12 215307 Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer YSI Life Sciences 2900D-UP www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer Bio-Tek Instruments, Inc MQX200R www.biotek.com

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Bioingegneria Numero 116, Lag diauxic xilosio inibitori della fermentazione indice di performance relativa erba interruttore paglia del mais idrolizzato furfurolo acido acetico idrossimetilfurfurale
Tecniche per l&#39;evoluzione della robusta lievito Pentoso-fermentazione per bioconversione della lignocellulosa a etanolo
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Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).

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