Tekniker för evolutionen av Robust pentosjäsande jäsa Jäst för bioomvandlingen av Lignocellulosa till etanol

Summary

Adaptiva evolution och isoleringstekniker beskrivs och demonstreras för att ge derivat av Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 som är i stånd att snabbt förbruka hexos och pentos- blandade socker i enzym försockrad undetoxified hydrolysat och ackumulera över 40 g / L etanol.

Introduction

Uppskattningsvis årliga 1,3 miljarder torra ton lignocellulosa kan stödja etanolproduktionen och göra det möjligt för oss att minska sin oljeförbrukning med 30%. ¹ Även växtbiomassa hydrolys ger sockerblandningar rika på glukos och xylos, är fermentationshämmare som genereras av kemisk förbehandling nödvändig att bryta ned hemicellulosa och exponerar cellulosa för enzymatisk attack. Ättiksyra, furfural och hydroximetylfurfural (HMF) tros vara viktiga komponenter bland många hämmare som bildas under förbehandlingen. För att flytta lignocellulosa etanolindustrin framåt, forskning och förfaranden tillåta utvecklingen av jäststammar med förmåga att överleva och effektivt fungerande använda både hexos och pentossocker i närvaro av sådana hämmande föreningar behövs. En betydande ytterligare svaghet traditionella industrijäststammar, såsom Saccharomyces cerevisiae, är oförmågan att effektivt ferment är xylos finns i hydrolysat av växtbiomassa.

Pichia stipitis typstammen NRRL Y-7124 (CBS 5773), nyligen omdöpt Scheffersomyces stipitis, är en infödd pentos jäsande jäst som är väl känd för att jäsa xylos till etanol. ^2,3 Utvecklingen av stammen NRRL Y-7124 fortsatte här eftersom det har dokumenterats till har den största potentialen av inhemska jäststammar att samla ekonomiskt utvinnings etanol som överstiger 40 g / L med liten xylitol biprodukt. ^4,5,6 i optimal media, S. stipitis-stammen NRRL Y-7124 producerar 70 g / L etanol i 40 h (1,75 g / l / tim) vid ett utbyte av 0,41 ± 0,06 g / g i hög celltäthet kulturer (6 g / L-celler). ^7,8 Motstånd till fermentationshämmare etanol, furfural, och HMF har också rapporterats, ⁹ och S. stipitis har varit rankad bland de mest lovande infödda pentosjäsande jästar tillgängliga för kommersiell skala etanol production från lignocellulosa. ¹⁰ Vårt mål var att tillämpa olika undetoxified lignocellulosa hydrolysat och urvals etanol tryck för att tvinga utvecklingen mot en mer robust derivat av stammen NRRL Y-7124 lämpar sig för industriella applikationer. Key bland förbättrade funktioner söks var snabbare sockerupptagshastigheter i koncentrerade hydrolysat, minskad diauxy för effektivare blandad sockerutnyttjande och högre toleranser etanol och hämmare. Tillämpningen av S. stipitis till undetoxified hydrolysat var en central fråga i forskningen för att eliminera den extra rörelsekostnader i samband med hydrolysat avgiftningsprocesser, såsom overliming.

Två industriellt lovande hydrolysaten tillämpades för att tvinga evolution. Enzym sackarifierad ammoniak fiber expansionen förbehandlat majs Stover hydrolysat (AFEX CSH) och utspädd syra förbehandlat switch hydrolysat sprit (PSGHL) ^11,12 AFEX förbehandlingstekniken utvecklas tillminimera produktionen av jäsningshämmare, medan utspädd syra förbehandling representerar den aktuella lägsta kostnad teknik oftast praktiseras att utsätta cellulosa biomassa för enzymatisk försockring. PSGHL kan skiljas från cellulosan som återstår efter förbehandling och är karakteristiskt rik på xylos från den hydrolyserade hemicellulosa, men låg i glukos. AFEX CSH och PSGHL kompositioner skiljer sig från varandra i viktiga aspekter som utnyttjas för att hantera utvecklingen processen. AFEX CSH är lägre i furan aldehyder och ättiksyra inhibitorer men högre på aminosyror och ammoniak kvävekällor jämfört med PSGHL (tabell 1). PSGHL presenterar ytterligare en utmaning av xylos är den dominerande socker till förfogande. PSGHL är därför lämpligt att specifikt anrika förbättrad xylosanvändning i hydrolysat, en svaghet förhindrar kommersiell användning av tillgängliga jäst. Även bland infödda pentos jäsande jäst, beroendet på suboptimal socker xyloSE för att stödja celltillväxt och reparation blir ännu svårare i hydrolysat på grund av en rad olika skäl:. näringsbrister, hämmare orsakar omfattande skador på cell strukturell integritet, och störningar i ämnesomsättningen på grund av redox obalanser ⁹ Kväve tillskott, särskilt i form av aminosyror, kan utgöra en betydande driftskostnad för fermentationer. Effekten av kväve tillskott på isolat screening och ranking undersöktes med switch hydrolysat.

Förbättrade personer anrikades i en föränderlig befolkningen som använder flera selektionstryck beroende på naturlig genetisk mångfald S. stipitis befolkning och mutationer som induceras av exponering för två olika hydrolysat, etanol eller UV-strålning. Selektionstryck anbringades parallellt och i serie för att undersöka utvecklingen utvecklingen av S. stipitis mot önskade derivat som kan växa och jäsa effektivt i hydrolysat(Figur 1). Den repetitiva odling av funktionella populationer i allt mer utmanande hydrolysat åstadkoms på mikroplattor med användning av en utspädningsserie av antingen 12% glukan AFEX CSH annars PGSHL ställdes vid 20% torrhalt. Tillämpningen av etanol-utmanade tillväxt på xylos i kontinuerlig kultur förbättras ytterligare AFEX CSH anpassade populationer genom att berika för fenotyper som visar mindre känslighet för etanol förtryck av xylosanvändning. Den sistnämnda funktionen visades nyligen problematiskt att pentos utnyttjande av stammen NRRL Y-7124 efter glukosfermentering. ⁸ Anrikning på PSGHL var nästa undersökas för att bredda hydrolysat funktionalitet.

Förmodade förbättrade derivat av S. stipitis NRRL Y-7124 isolerades från varje fas av utvecklingen processen med hjälp av riktade anrikning under stressförhållanden och utspädningsplatt att plocka kolonier från de vanligaste populationer. dimensionslös relativaprestandaindex (RPIs) användes för att rangordna stammar baserade på prestanda, där kinetisk beteende utvärderades på olika hydrolysat typer och näringstillskott tillämpas. Även om framgångarna för olika förfaranden anpassning för att förbättra funktionaliteten hos S. stipitis i lignocellulosa hydrolysat har tidigare dokumenterats, stammar visar ekonomisk etanolproduktion på undetoxified hydrolysat har inte tidigare rapporterats. ^13-17 Använda evolution förfaranden som skall visualiseras i mer detalj här, Slininger et al. ¹⁸ utvecklade stammar som avsevärt förbättras under moderstammen NRRL Y-7124 och kan producera> 40 g / L etanol i AFEX CSH och enzym sackarifierad switch hydrolysat (SGH) lämpligt kompletteras med kvävekällor. Dessa nya stammar av framtida intresse för att utveckla lignocellulosa till etanolindustrin och som föremål för ytterligare genomik studier byggnadpå de tidigare sekvense stam NRRL Y-11545. ¹⁹ A genomik studie av bästa stammar som producerats under olika faser av utveckling i diagramform i figur 1 skulle belysa historien om genetiska förändringar som skett under utveckling som en upptakt till ytterligare stam förbättring forskning.

Protocol

1. Förbered utgångsmaterial och utrustning för analyser

1. Förbereda hydrolysaten med användning av 18 till 20% initial biomassa torrvikt i förbehandlingsreaktion för användning i utvecklingen, isolering och rangordningsförfaranden. Se et al. Slininger 2015 ¹⁸ för de detaljerade metoder för att framställa AFEX CSH, PSGHL och SGH med kvävetillskott N1 eller N2 används i evolutionen, isolering eller rankning. Se tabell 1 för sammansättningen av varje hydrolysat typ.
   OBS: Kväve befästningar av SGH betecknades SGH-N1 eller SGH-N2 definieras enligt följande: SGH-N1 = SGH berikade till 42: 1 molärt kol till kväveförhållande (C: N) med kvävekällor inklusive urea, vitamin-fria amino- syror från kasein, D, L-tryptofan, L-cystein, och vitaminer från definierade källor (så att ~ 15% av molära kväve N är primära aminokväve (PAN) och ~ 85% av N är från urea); SGH-N2 = SGH berikade till 37: 1 C: N med urea och sojamjöl som den lägsta kostnaden kommersiell källa of aminosyror och vitaminer, som ger ~ 12% av N från PAN och 88% såsom urea.
2. Skaffa en lyofiliserad kultur av moderstammen, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) från ARS Culture Collection (National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois), och förbereda glycerol stamkulturer enligt anvisningarna. Bibehålla stamkulturer av moder jäst och dess derivat i 10% glycerol vid -80 ° C.
   1. Strimma glycerolstamlösningar till jäst malt pepton dextros (YM) agarplattor (3 g / L jästextrakt, 3 g / L maltextrakt, 5 g / L pepton, 10 g / L dextros, 20 g / L agar) och inkubera 48- 72 h vid 25 ° C. ⁸ framkallade plattorna kan lagras upp till en vecka vid 4 ° C före användning som flytande förkulturen inokulat.
3. Förbered Optimal definierat medium (ODM), en syntetiskt medium kompatibelt med industriformuleringsförfaranden ²⁰ som tidigare utvecklats för optimal omvandling av xylos till etanol av moderbolaget strain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Använd definierat medium i alla pre-kulturer och kulturer för jäsning prestanda bioanalyser och även för etanol utmanade, xylos matade kontinuerlig odling evolution. ODM komposition tagits med som referens i tabell 2.
4. Som tidigare beskrivits, ¹⁸ analysera cellbiomassa med hjälp av en cuvette- eller mikroplattläsande spektrofotometer, i förekommande fall, för att mäta kultur absorbans vid 620 nm (A _620). Kvantifiera socker, etanol, furfural, hydroximetylfurfural (HMF), och ättiksyra i odlingsprover med hjälp av högupplösande vätskekromatografi (HPLC) eller robot enzymatisk bestämning av glukos och xylos för högre genomströmning.

2. Berika Robust Derivat under seriell överföring på AFEX CSH

1. Inokulering av en förkultur av stammen NRRL Y-7124. Överför celler från YM agar till 75 ml ODM + 150 g / L xylos för att upprätthålla förmågan att växa under osmotic stress. Inkubera förkulturer i 125 ml flaskor stängda med kisel svamp pluggar 24 timmar vid 25 ° C med skakning (150 rpm, en "bana).
2. Tina frysta portioner av 6-12% glukan AFEX CSH i kallt vatten för användning. Justera pH till 5 om det behövs och filtersterilisera före framställning av en spädningsserie i 96-brunnars mikroplattor.
3. Fyll mikro med 50 pl per brunn och 8 brunnar per hydrolysat utspädning, sedan ympa med några mikroliter förodling per brunn för att möjliggöra en initial absorbans (620 nm) A ₆₂₀ ≥0.1. Inkubera plattorna statiskt 24-48 h vid 25 ° C i en plastlåda med en våt pappershandduk för fuktighet.
4. Använda mest koncentrerade hydrolysatet utspädning som synligt växte till A _620> 1, överföring 1-5 il till varje brunn av en ny hydrolysat utspädningsserie för att uppnå inledande A ₆₂₀ ≥0.1.
5. Övervaka tillväxt kultur A ₆₂₀ i mikro med en spektrofotometer. En icke ympad utspädningsserie serves som en kontroll och blank. Plattlock är kvar på under övervakning för att förhindra kontaminering, och värdena justeras därefter.
6. Förbered glycerollager av anpassnings kulturer regelbundet för efterföljande isolering av förbättrade stammar eller för användning i reinoculating den fortsatta hydrolysatet spädningsserie. För att framställa lager, pool fyra brunnar (200 l) av den största hydrolysatet koncentration koloniserade. Blanda 1: 1 med 20% steril glycerol i kryokärl, för att frysa cellerna i 10% glycerol vid -80 ° C.
7. Upprepa steg 2,3-2,6 tills tillväxt i 12% glukan AFEX CSH är genomgående synlig vid 24 tim.

3. Isolera encelliga Tolerant Derivat efter anrikning AFEX CSH

1. Streak vald glycerol lager av anpassnings kulturer till YM agar och använda ränder att ympa 50 pl 3% eller 6% glukan AFEX CSH (pH 5) i var och en av tre brunnarna (ursprungliga A ₆₂₀ ~ 0,1). Inkubera mikro 24 timmar som i steg 2,3. pool replikate koloniserade brunnar på högsta hydrolysatet styrka med stark tillväxt, och utspädning plattan YM eller 6% glukan AFEX CSH agar. Förbereda den senare som en 1: 1 blandning av filtersteriliserad 12% glukan AFEX CSH med varmt autoklaveras 30 g / L agar-lösning.
2. Plocka 5 enstaka kolonier från den högsta utspädningen plattan som visar tillväxt efter 24-48 timmars inkubation vid 25 ° C för att frysa som glycerolstamkulturer. Strimma varje koloni till ett YM platta. Inkubera 24 tim. Med en steril ögla, överföra en utvecklad strimma av celler till en liten volym av 10% glycerol, blanda för att suspendera cellerna, och distribuera till 2-3 kryokärl för frysning vid -80 ° C.

4. Utvärdera Utförande av AFEX CSH Tolerant Derivat Jämfört med moder-

1. Test Isolat i enkla 6% glukan AFEX CSH satskulturer.
   1. Överför celler från 48 hr plattor strimmiga från glycerol lager till pH 7 kaliumfosfatbuffert (0,4 mM) för att förbereda cellsuspensioner med A ₆₂₀ = 10. Använd 1 plvarje suspension för att ympa var och en av fyra brunnar i 50 ^ 3% glukan hydrolysat initial A ₆₂₀ = 0,2. Inkubera mikro 24 timmar som i steg 2,3. Förbered 3% glukan AFEX CSH vid pH 5 genom att späda 12% glukan AFEX CSH 1: 3 med sterilt vatten.
   2. Överför två 24 hr brunnarna för att ympa 25 ml pre-kulturer av pH 5 12% glukan AFEX CSH används vid 50% av full styrka. Inkubera förkulturer i 50 ml kolvar med förslutningar kisel svamp för 24 timmar vid 25 ° C, ~ 150 rpm (en "bana) Förbered halv styrka 12% glukan AFEX CSH genom utspädning hydrolysatet 1:. 1 med sterilt vatten.
   3. Använd halv styrka hydrolysat förkulturer att ympa liknande 25 ml tillväxtkulturer att initialer a ₆₂₀ = 0,1. Inkubera tillväxtkulturer som ovan (4.1.2) och prov dagligen (0,2 ml). Övervaka ansamlingar av biomassa (A ₆₂₀₎ och koncentrationer av socker och fermentationsprodukter (HPLC).
2. Alternativt repitch (dvs, skörd och rEUSE) populationer av 6% glukan AFEX CSH odlade jäst för att testa i 8% glukan hydrolysat satskulturer, såsom beskrivits tidigare. ¹⁸
3. Alternativt, ytterligare prov populationer av repitched 6% glukan AFEX CSH kulturer genom utfodring med 12% glukan hydrolysat, såsom beskrivits tidigare. ¹⁸
4. Testa diauxic eftersläpning isolat i satskulturer av ODM med blandade sockerarter.
   1. Inokulera förkulturer av 75 ml ODM med 150 g / L xylos i 125 ml flaskor med förslutningar silikon svamp genom loop överföring från YM glycerol ränder. Inkubera 24 timmar som i steg 2,1.
   2. Använda förkulturer att inokulera liknande 75 ml testkulturer med ODM innehållande 75 g / L glukos och 75 g / L av xylos vid pH 6,5. Skakkolvar vid 25 ° C, 150 rpm. Prov dagligen.
   3. Alternativt, testa effekten av 0-15 g / L ättiksyra på diauxy under fermentering av glukos och xylos genom att använda ett liknande protokoll, utom initial pH ställs in på 6,0 ± 0,2 i testkulturer att upprätthålla pH 6-7 during ättiksyra konsumtion, såsom tidigare beskrivits. ¹⁸

5. Applicera kontinuerlig odling för att selektera för Etanol-utmanade xylosanvändning

1. Förbered ODM som kontinuerlig odling näringsmediet med 60-100 g / L xylos, 20-50 g / L etanol vid pH 6,3 ± 0,2. Välj kombinationer av xylos och etanol för att simulera partiell jäsning av 150 g / L xylos, förutsatt en potentiell avkastning på ~ 0,5 g etanol / g xylos, och för att tillgodose potentialen för 50-70 g / L etanol att ske. ⁸
2. För att framställa den kontinuerliga kulturen inokulum, överföra ett representativt AFEX CSH toleranta koloni (analogt med Colony 5 i exempel Figur 1) genom en slinga från en 48 hr YM platta till 75 ml av etanolfri ODM (100 g / L xylos, i detta fall) i 125 ml kolvar. Inkubera vid 25 ° C, 150 rpm (en "bana) under 24 h. Välj förkulturen ODM xylos koncentration så att de matchar den ursprungliga kontinuerlig kultur håller volym.
3. Inokulera en kontinuerlig kultur som håller volymen av ODM vid pH 6,3 ± 0,2 med 100 g / L xylos + 20 g / L etanol med ~ 5-10 ml av en förkultur koncentrat av en AFEX CSH-toleranta isolat (analogt med Colony 5, Figur 1 ) för att erhålla 100 ml vid första A ₆₂₀ ~ 0,5. Bibehålla odlingen håller volymen (V _R), vid 25 ° C i en mantlad 100 ml spinnkolv omrördes vid 200 rpm och utrustade med steriliserbart pH-elektrod, pH-kontroller och temperaturstyrt cirkulerande vattenbad.
4. Inledningsvis eftersom celltillväxt kommer att vara långsam på grund av etanolexponering, ställa in matningsmediet att dosera med hjälp av en pH-aktiverad pump. Ställa in pumpen för att mata pH-6,3 ODM med 100 g / L xylos och 50 g / L etanol när kulturen fermentering sjunker pH-värdet till 5,4, och således stoppar ytterligare pH droppe. Bibehålla volymen på 100 ml med en effluent pumpen kontinuerligt skumma odlingsytan. Följaktligen stiger etanolkoncentrationen med fortsatt metabolism och utfodring. Mät avloppsvatten och dra prov (1-2 ml) från kontinuerliga kulturer var 48-72 timmar för analys av livskraftiga cellkoncentration, produkter och substrat, som tidigare beskrivits. ¹⁸ att hitta livskraftiga cellkoncentration, gör seriella 1:10 utspädningar av prover buffert (se 4.1.1) och spridning platta utspädning till YM agar (se 1.2.1). Baserat på utflödesinsamlingsnivåer (Q), beräkna utspädningshastighet (D) (Q / V _R), och, i exemplet i S. stipitis, varierade det 0-0,01 h ^-1.
5. Spara glycerolstam regelbundet genom att isolera från lönsamhets plattor av buffrade provspäd bildar 30-100 kolonier, representerar de vanligaste robusta kolonisatörer på den tiden i anrikning. Översvämnings plattor med ~ 5 ml av 10% glycerol för att medge beredning av dubbletter kryokärl. För underhåll eller ett andrum, stoppa den kontinuerliga kulturen och starta vid behov med hjälp av senaste (resistenta) glycerol lager (s).
6. För att starta om, strimma glycerol lager (s) av de flestaresistenta populationer till YM-agar och överföra 24-48 hr celler genom slingan till en förodling av etanolfri ODM för inkubering som ovan. Inokulera 100 ml rymmande volym av ODM initial A ₆₂₀ 0,5 med användning av ett koncentrat av förodlad jäst, och tillåta odlingen att växa satsvis till stationär fas innan matarmediumflödet startas om.
7. Om kulturer kan växa stadigt på> 0,01 h ^-1 på xylos i närvaro av> 25 g / L etanol, starta kontinuerlig odling foder (ODM + 60 g / L xylos + etanol varierar från 30 till 50 g / L) vid en låg utspädningshastighet ~ 0,01 h ^-1 till de 100 ml rymmande volym (initialt ODM + 60 g / L xylos + 20 g / L etanol). Med tiden höja etanolen i fodret mot 50 g / L. Fånga avancerade populationer i glycerolstam.
   OBS: Att upprätthålla den låga utspädningshastighet möjliggör bildandet av en tillräckligt hög cellkoncentration för att minska syretillgången och stöd jäsning.
8. Eventuellt applicera ultraviolett (UV) irradiation månadsvis till glycerol lager populationer som används för att inokulera kontinuerliga kulturer.
   1. Resuspendera kolonier från glycerol lager ränder i 10 ml ODM (som i pre-kulturer) med 60 g / L xylos, och samla alla bestånd i en enda steril flaska. Applicera den poolade cellsuspensionen vid ~ 5 x 10 ⁸ livskraftiga celler / ml att bara täcka bottnarna av 4-5 Petri-plattor med 6 ml / platta. För att erhålla 6 ml täckning av ett standardbruk petriskål, fördela 15 ml för att övervinna ytspänningen och ta bort 9 ml.
   2. Exponera varje öppna odlingsplatta för UV från ljuskällan i ett biologiskt säkerhetsskåp. Justera tiden eller avståndet UV-exponering för att erhålla den önskade avdödningsgrad> 90%. Här, exponera under 45 minuter vid cirka 56 cm från källan.
   3. Späd plattan cellsuspensioner före och efter bestrålning. Uppskattning avdödningsgrad baserat på kolonibildande enheter. För S. stipitis exempel avdödningsgrad var ~ 97%.
   4. Överföra UV-exponerade kulturer (24-30 ml) till en folie-covEred 50 ml kolv, och inkubera vid 25 ° C och 150 rpm under 24 h för att tillåta liten andel av livsdugliga celler att återbefolka till ~ 1 x 10 ⁸ livsdugliga S. stipitis celler / ml. Genom att förhindra fotoreaktive, bevarar folie mutationer medan kulturer inkuberas.
   5. Använda den nyinsatta mutageniserades kulturen för att ympa kontinuerliga kulturer att ~ 1 x 10 ⁷ viabla celler / ml. Starta om etanol berikade ODM + 60 g / L xylos medel foder för att fortsätta urvalsprocessen.

6. Utvärdera Glycerol Stock populationer och identifiera De med förbättrad Xylos Jäsning i närvaro av etanol

1. Strimma vald glycerolstamkulturer till YM-agar som det första steget i skärmen för bästa tillväxt och fermentering av xylos i närvaro av etanol.
2. Överför varje utvecklats population som ska screenas från agar ränder till 75 ml förkulturer i ODM med 150 g / L glukos, och inkubera i 125 ml flaskor 96h före användning som inokulat för testkulturer. De stora glukosodlade populationer kommer att kräva induktion av enzymer för xylosanvändning.
   1. För att testa induktion, skörda varje kultur, suspendera celler till 30 ml, initial A ₆₂₀ av 40 i ODM 60 g / L xylos + 30-45 g / L etanol och inkubera vid 25 ° C, 150 rpm (en "bana) i 50 ml flaskor med förslutningar kisel svamp. Rita prov två gånger dagligen för att övervaka xylos upptag av HPLC-analys.
3. Alternativt, såsom beskrivs i Slininger et al., ¹⁸ för att bedöma tillväxt på xylos i närvaro av etanol, förbereda förkulturer i varje evolved befolkningen med slingöverföring till 75 ml ODM med 150 g / L xylos i 125 ml kolvar, och inkubera 96 h vid 25 ° C, 150 rpm (en "bana). Inokulera testkulturer till en låg initial A ₆₂₀ av 0,1 i 25 ml ODM + 60 g / L xylos + 30-45 g / L etanol i 125 ml kolvar. Inkubera kolvar vid 25 ° C, 300 rpm, en "bana och prov.

1. Baserat på resultaten av steg 6, välj glycerol lager populationer visar överlägsen förmåga att växa på och jäsa xylos i närvaro av etanol. Använd dessa för att strimmig plattor. Strimman plattor används för att framställa täta, buffrade cellsuspensioner av A ₆₂₀ = 5. Därefter cellsuspensioner användes för att ympa förkulturer i 96-djupa brunnsplattor till A ₆₂₀ = 0,5. Inokulera 1 ml förkulturer om PSGHL blandades 1: 1 med ODM + 50 g / L xylos (ingen etanol). Inkubera förkulturer i 96-brunnars, djupa brunnsplattor med ventilerade låg avdunstning omslag för 48 timmar vid 25 ° C, 400 rpm, 1 "omloppsbana. Separata olika glycerol stock populationer genom tomma brunnar.
2. Genom att använda varje förodling, ympa sexton 1 ml replikera kulturer initial A ₆₂₀ ~ 0,5 i 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L xylos med 20, 30, eller 40 g / L etanol för att berika toleranta kolonisatörer. Inkubera anrikning Cultures på liknande sätt som pre-kulturer.
3. För varje enskild glycerol lager, skörda odlingsbrunnarna med högsta etanolkoncentrationen möjliggör tillväxt och xylos användning. Plate varje cellinje för YM agar för att erhålla vanligaste enskilda kolonier för att bevara i glycerol. Plocka tio kolonier per cellinje och strimma vardera till en YM agarplatta för glycerol mäldberedningen.

8. ytterligare berika Robust Evolved Stammar under seriell överföring på PSGHL, som för AFEX CSH

1. Förbered pre-kulturer av NRRL Y-7124 (förälder), AFEX CSH-tolerant utvecklats isolera och kontinuerlig odling utvecklats befolkning med förbättrad förmåga att använda xylos i närvaro av etanol. Inokulera 75 ml ODM + 150 g / L xylos genom slingan från glycerol stock strimmor såsom beskrivits ovan (steg 2,1) för hydrolysat anpassningsprocessen den AFEX CSH.
2. Späd PSGHL med vatten för att ge en serie av ökande koncentrationer. Bered en 96-brunnars mikroplatta för var och en av de tre cellinjema med hjälp av varjePSGHL utspädning för att fylla 8 brunnar med 50 ^. Använd förodling för att ympa var 50 pl mikro kultur utspädnings serien inledande A ₆₂₀ ~ 0,1-0,5.
   1. Fortsätta utvecklingen av jäst i ökande styrka av PSGHL användning av samma procedur som den AFEX CSH hydrolysatet anpassning i detalj ovan (steg 2) tills kulturerna har möjlighet att växa i full styrka hydrolysatet på en stabil 14-d medelförhållande av AA ₆₂₀ per Δtime som serieöverföringar fortsätter ytterligare fyra månader.

9. Isolera Encelliga Kolonier Använda PSGHL övertoningar med eller utan etanol Challenge

1. Skaffa encelliga isolerar direkt från full styrka PSGHL slutliga anpassningsplattor av utspädningsplatt till YM agar. Plocka tio stora kolonier för var och en av de tre cellinjer och bar strimma till YM-plattor för att förbereda glycerolstam som tidigare beskrivits (steg 3,2).
2. Eventuellt utforska tidigare tidpunkter ievolution process genom isolering från lagrade glycerollager av de tre cellinjer.
   1. Ympa en förodling för varje cellinje genom loop från glycerol lager ränder och inkubera 24 tim på 30 ml ODM + 50 g / L xylos (50 ml flaskor, 25 ° C, 150 rpm).
   2. Challenge celler från pre-kulturer till tillväxt i hydrolysat genom ympning 50 pl 50% PSGHL i brunnarna till en initial A ₆₂₀ ~ 0,2 och inkubation statiskt 48 timmar.
   3. Sprid 0,1 ml av varje berikad kultur på PSGHL gradient agarplattor som sträcker sig från 0 till 50% styrka hydrolysat (leverera ~ 300-400 viabla celler per platta), och plocka 10 enstaka kolonier per cellinje från den högsta möjliga hydrolysatet koncentrationen området av gradienten . ²¹ Streak plockade kolonier till YM för glycerolstamberedning som i steg 3,2.
   4. Som ett alternativ till steg 9.2.3, i stället för att ympa gradienten agarplattor, inokulera brunnar av 96-brunnars mikroplattor av initialt A ₆₂₀ ~ 0,2, where brunnarna är utformade för att innehålla ett intervall av hydrolysat koncentrationer från 50 till 100% styrka och etanol från 10 till 40 g / I. I det här fallet, utveckla mikroplattor 72-96 timmar och i övrigt som i steg 2,3. Isolera tio enstaka kolonier från brunnar i de tuffaste hydrolysat-etanolkombinationer som visar tillväxt genom utspädningsplatt, och förbereda glycerol bestånd i steg 3,2.

10. I en primär screening, eliminera Sämre Isolat genom att jämföra och rankning Föreställningar om PSGHL på två näringsförhållanden

1. Tillämpar en hög genomströmning djup brunnar skärm PSGHL prestanda skärmen fem uppsättningar av trettio isolat tillsammans med NRRL Y-7124 förälder och AFEX CSH-tolerant isolat (analogt med Colony 5 i figur 1 evolution exempel) som kontroller för att välja sex bästa stammar (20%) från varje uppsättning att passera till den sekundära screeningnivå (steg 12).
2. Utför skärmen i djupa brunnsplattor fyllda 1 ml per brunn och täckta with lock av rostfritt stål med svart silikon låg avdunstnings tätningar. Kläm alla plåtar till styrelsen i inkubatorn / shaker och arbeta vid 25 ° C och 400 rpm (en "shaker bana). Design alla djupa brunnar fylla mönster för att möjliggöra separation av olika isolat av öppna brunnar.
3. Att påbörja odlingar, plocka en sträng av celler från glycerol strimmor framställda från 30 isolat som erhållits enligt ovan (i steg 3, 7 och 9) till dubbla brunnar i ODM + 50 g / L xylos och inkubera 48 timmar.
4. Som en utmaning medium för preculturing isolat, förbereda 50% PSGHL genom blandning PSGHL 1: 1 med ODM + 10 g / L glukos + 50 g / L xylos. För screening 30 isolat och två kontrollstammar, 2 plattor med 2 brunnar per var och en av 16 isolat är fyllda, lämnar tomma brunnar mellan de olika isolaten.
5. För utmaning kulturer, överföring, en 50 pl volym ODM pre-kulturer (A ₆₂₀ ~ 10) till var och en av två 50% PSGHL utmaning odlingsbrunnar för varje isolat och kontroller för att erhålla en initial A ₆₂₀ ~ 0,5 och inkubera 72 timmar.
6. Använd två testmedier vid olika näringsrikedom för screening isolat: 60% PSGHL + ODM näringsämnen; och 75% PSGHL + ODM + YM näringsämnen. Lägg ODM näringsämnen (exklusive socker) på halva styrkan som standard för ODM användning med 50 g / L socker (steg 1,3). Såsom anges, tillsätt YM näringsämnen (exklusive sockerarter) på halva standardhållfasthet av 3 g / L jästextrakt, 3 g / L maltextrakt, 5 g / L pepton.
7. Ympa testkulturer genom att överföra 50 | il 72 timmar 50% PSGHL utmaning pre-kulturer för att ympa 1000 il till initialer a ₆₂₀ ~ 0,5 fem djupa brunnar för vart och ett av två testmedier.
8. Prov varje isolat dagligen. Pipettera innehållet i en brunn till en mikrofugrör och centrifugera (5533 xg, 15 min) för erhållande av supernatanten för etanol, glukos och xylos hög genomströmning analyser. Mäta biomassa som A ₆₂₀ i 96-brunnars mikroplattor (200 | il / brunn) med en spektrofotometer.
9. Inom varje uppsättning av 30 ärolates testas (5 set för S. stipitis NRRL Y-7124 utvecklades stammar), beräkna relativa prestandaindex (RPI) som beskrivs i steg 11 nedan och använda för att rangordna varje stam baserad på etanolutbytet (maximalt etanol ackumulerats per inledande socker medföljer) och xylos upptagningshastigheten (xylos koncentration som förbrukas per inledande 96 timmar) på båda testmedier.

11. Placering isolat i primär PSGHL duken Användning Relativ Performance Index (RPI)

1. Efter primärscreening, beräkna dimensions relativa prestandaindex (RPI) för att rangordna 30 isolat i vart och ett av de fem olika experiment för att screena isolat på PSGHL med två olika näringsämnen formuleringar per experiment, det vill säga, 60% PSGHL och 75% PSGHL.
2. Beräkna den statistiska parametern F för användning i rankning isolat prestanda inom en grupp av isolat testades i ett givet experiment: F = (XX _avg) / s. Här är X den prestandaparameter, såsom utbyte (Y)eller hastigheten (R), observerades för varje individuellt isolat, medan X _avg och s är den genomsnittliga och standardavvikelsen, respektive av X observerades för alla isolat inom en given experiment. För normalfördel, -2 <F <2.
3. För varje isolat i ett experiment, beräkna relativa resultatet baserat på hastighet, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, och på samma sätt beräkna relativ resultat baserat på avkastningen, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 . Värdet av RPI varierar från ~ 0-100 percentilen (lägsta till högsta). Sedan beräkna RPI medelvärden för varje isolat inom en given hydrolysat experiment enligt följande: RPI _avg = (RPI _Y + RPI _R) / 2, där avkastning och ränta bidrag ges lika vikt i denna ansökan.
   Notera att i allmänhet kan parametrarna avkastning och ränta viktas om det bedöms vara olika i betydelse.
4. Beräkna RPI _{övergripande} över n typer av hydrolysat testade: RPI _{övergripande} i = 1, n [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Överväga varje isolat i en experimentell uppsättning av 30 isolat och 2 kontroller. Under primär rangordning av ~ 150 enda koloni isolat anpassat till xylos rika PSGHL, RPI _{övergripande} beräknas för priser och avkastning över de två PSGHL formuleringar som används i skärmen, det vill säga 60% PSGHL och 75% PSGHL, där n = 2.
5. Baserat på RPI _{övergripande} inom varje experiment, väljer den översta andelen isolat att passera till den sekundära skärmen. I detta exempel, är den övre 20% av stammar som valts för att passera genom (dvs 30 av 150 testade).

12. I en sekundär skärm, Jämför de bästa primär screening Modellerna på flera Complete hydrolysat (> 100 g / L Blandade socker) att avslöja Högsta Fungerande Robusta stammar

1. Jämför Top PSGHL artister på 6% glukan AFEX CSH och SGH ändras med två nivåer av kväve, SGH-N1 och SGH-N2 (kompositions såsom i tabell 1) för slutliga rangordningen. Sikta de 30 isolaten som var de mest produktiva i den primära djupa brunnar skärm PSGHL (steg 10 och 11) och de två kontroller (moderstammen NRRL Y-7124 och AFEX CSH-tolerant isolat (analogt med Colony 5, figur 1 exempel ).
2. Börja odlingar genom att plocka en vulst av celler från glycerol strimmor att duplicera djupa brunnar i en ml ODM + 50 g / L xylos som tidigare och inkubera 48 h i den djupa brunnar systemet (steg 10.2). Sedan överföra 50 pl ODM förkulturer till 50% SGH utmaning kulturer och inkubera i djupa brunnar system för 72 timmar för att få en ₆₂₀ på ~ 10). Förbered 50% SGH genom blandning av SGH 1: 1 med sockerfria ODM + 50 g / L xylos (pH 5,6).
3. För vart och ett av isolaten, ympa en 16 ml portion av SGH-N1 eller SGH-N2 med cellpelleten (15 min, 2711 x g) från tre brunnar på utmaning kultur för att ge första test kultur A ₆₂₀ ~ 2,0. Inkubera testkulturer vid 25 & #176;. C, 180 rpm (en "bana) i 25 ml flaskor med förslutningar silikon svamp Exempel flaskor dagligen och analysera per PSGHL skärmen.
4. På samma sätt, isolerar skärmen som i steg 12.2 och 12.3, men den här gången substitut SGH-N1 och SGH-N2 med 6% glukan AFEX CSH vid pH 5,2 för användning vid framställning av utmaningen odlingsmedium och provodlingsmedium. För 50% styrka utmaning kulturer, använda 6% AFEX CSH utspädd 1: 1 med vatten eftersom det är kväve tillräckligt utan ändringar.
5. Upprepa steg från 12,1 till 12,4 för att duplicera resultaten.

13. Placering prestanda isolat i den sekundära skärmen med RPI _{övergripande} att betygsätta Användning av flera färdiga hydrolysat

1. Beräkna relativa prestandaindex (RPI) för att rangordna varje topp 20% av isolaten (~ 30 150) från den primära skärmen som har testats i den sekundära skärmen på enzym försockrats hydrolysat formuleringar av varierande näringsrikedom.
2. score varjeisolat testas i den sekundära skärmen baserat på xylos upptagningshastighet och etanolutbytet utförs på tre enzym försockrats förbehandlade hydrolysat formuleringar köras i två exemplar, inklusive AFEX CSH (i = 1 och 2), SGH-N1 (i = 3 och 4) och SGH -N2 (i = 5 och 6).
3. Beräkna RPI _totalt för varje isolat, och tillämpa denna rangordning parameter för att ytterligare sålla listan över överlägsna isolat: RPI _totala = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n, där n = 6 .
   OBS: Demonstrera kinetik överlägsna isolat i SGH-N2 hydrolysat i flaskkulturer genom att följa instruktionerna i Slininger et al ^18.

Representative Results

S. stipitis utvecklades med användning av kombinationer av tre urvalskulturer, som inkluderade AFEX CSH, PSGHL, och etanol-utmanade xylos matad kontinuerlig odling. Figur 1 visar schematiskt diagram över de evolution experiment utförda tillsammans med isolaten finns antingen att utföra mest effektivt övergripande, eller mest effektivt på en av de testade hydrolysaten. Tabell 3 visar NRRL accessionsnummer av dessa överlägsna isolat och sammanfattas de anpassningsspänningar som tillämpas i processen för att uppnå den anrikade populationen från vilken varje stam isolerades. Vissa isolat anses ha överlägsen relativ prestanda på en eller två hydrolysat typer, men 7 av 11 isolat utvecklades väl på alla hydrolysatet typer, även om de flesta av dessa exponerades och utmanas av endast en enda typ under evolutionen. Framgångarna i de olika utvecklingstillvägagångssätten här demonstreras i figurerna 2 -7 och tabell 4.

Figur 2 visar tydliga förbättringar ses efter den första fasen av anpassning där robusta derivat av stammen NRRL Y-7124 anrikades under seriell överföring till ökande koncentrationer av AFEX CSH (steg 2). I kulturer som växer på 6% glukan AFEX CSH, visar det utvecklade befolkningen snabbare ackumulation och högre slutliga titer etanol än moderstammen. Snabbare glukosutnyttjande också ses tillsammans med snabbare xylos upptag omedelbart efter utarmning av glukos. Dessutom i fig 3, vilka funktioner som stabiliteten hos den ändrade populationen demonstreras i syntetiskt medium ODM med en blandning av 87 g / L glukos och 66 g / L xylos. I detta fall, både den anrikade populationen (Figur 3B) och isolerade kolonier (Colony 1 och Colony 5, figur 3C och 3D, respectively) har möjlighet att överträffa moderstammen med hjälp av xylos mer effektivt att göra etanol snabbare, vilket minskar tiden till maximal etanol genom åtminstone 4 dagar. Betydligt högre koncentrationer etanol ackumulerades genom utvecklade påfrestningar på ODM (55-60 g / L) jämfört med moder (40-45 g / L). Mutationerna, vilket ledde till en stabil fenotyp med reducerad diauxy under glukos-xylos övergång och effektivare xylos jäsning, uppstod som jästen befolkningen utvecklats i AFEX CSH.

Ytterligare förbättringar Colony 5 förföljdes genom att skicka in den till det naturliga urvalet i xylos matade kontinuerlig odling i närvaro av ökande halter av etanol upp till 50 g / L. Under detta tillstånd, måste jästen befolkningen kvar i kontinuerlig odling kunna framkalla enzymer för xylosanvändning som enda kolkälla för att den ska kunna växa i en takt tillräckligt hög för att fylla fermen trots en stadig utspädningBetygsätta. I moderstammen börjar induktion av xylos enzymer inhiberas på etanol så låga koncentrationer som 15 till 20 g / L. ⁸ Derivat av Colony 5 fångades i glycerolstam på tidiga och sena punkter drift av kontinuerlig odling tid, och Figur 4 visar den framgångsrika förbättringen i xylosanvändning i närvaro av 40 g / L etanol observerades i evolved derivat av Colony 5 jämfört med NRRL Y-7124 förälder och den initiala Colony 5 ympades till processen.

Isolat som härrör från alla faser av anpassning systemet i figur 1 screenades i PSGHL att identifiera de med överlägsen förmåga att jäsa xylos (steg 10,1). Isolaten som visas i figur 5 är bland de bästa resultaten om PSGHL av ~ 150 rankat i denna primära skärmen och i alla sekundära skärmar av prestanda, såsom beskrivs nedan. För att indikera en förbättring av Evolved isolati förhållande till sin förälder, var resultatet för varje isolat uttryckt som förhållandet av kinetiska parametervärdena för isolat som moderstammen. Förhållandevärden av "en" inträffat om isolatet prestanda motsvarar föräldern. Figurerna 5a och 5b sammanfatta topp isolera föreställningar på 60% och 75% styrkor PSGHL med ODM eller ODM + YM näringstillskott. Som hydrolysatet koncentration och hårdhet ökades, minskade prestandaförhållande. I 60% -ig PSGHL, fem av sju topp isolat utsätts för PSGHL selektionstryck utförs många gånger bättre än NRRL Y-7124 (isolera en). Fyra isolat utvecklades bättre än Colony 5 (isolat 33), som hade utvecklats vid exponering för AFEX CSH men hade ingen tidigare selektiv exponering för PSGHL. Men i styrkan 75% av PSGHL, endast tre isolat betydligt överträffade både förälder och Colony 5 (isolat 33) trots de tillsatta näringsämnen. Av dessa överlägsen isolat 15 och 16 var previously utmanades med ökande koncentrationer av PSGHL som ett selektionstryck leds evolutionen. Isolat 15, 14 och 3 endast utsätts för PSGHL, medan 11, 13 och 16 hade flera exponeringar. Isolat 3, 11 och 13 var från tidigare tidpunkter under utvecklingen på PSGHL och så hade något mindre möjlighet att utveckla tolerans jämfört med 14, 15 och 16. Även om det är uppenbart i figur 5 att seriell överföring till ökande styrkor PSGHL eras att utveckla stammar robusta till sin hämmande miljö, är det också uppenbart att exponering av moderstammen NRRL Y-7124 till AFEX CSH ensam skulle kunna generera isolat såsom Colony 5 (33) med tvär tolerans mot PSGHL. Således angavs att robusta stammar som kan utföra i flera hydrolysat kunde hittas genom anrikning av tolerans i ett hydrolysat följt av prestanda screening i en annan. Isolat erhålls från xylos matad kontinuerlig odling screenades även på PSGHL 60% och 75% styrka mednäringsämnen och även tillsatt glukos vid 75 g / L för att upprätthålla etanol utmaning och testa diauxic eftersläpning på xylos efter glukosutnyttjande. Medan isolat 27, 28 och 30 var överlägsen andra från denna fas av anpassning, både yield och xylos upptagningshastigheten prestanda nyckeltal liknade föräldern på 75% PSGHL med tillsats av ODM och YM näringsämnen, som inte nödvändigtvis är överraskande att ingen hade tidigare exponering för detta hydrolysat (se även Slininger et al. ¹⁸ för ytterligare uppgifter som inte visas för kulturerna här tillhandahålls 75 g / L glukos).

De bästa stammarna valda från den primära skärmen på xylos rika PSGHL screenades därefter på tre kompletta hydrolysat. Dessa hydrolysat (tabell 1) ingår AFEX CSH och späd-syra förbehandlad SG behandlas med kommersiella cellulaser och kompletteras på två olika kvävehalter (SGH-N1 och SGH-N2) för att identifiera den mest mångsidiga isolates med avseende på variationer i inhibitor och näringsmiljö. De relativa prestandaindex (RPIs) beräknades för fermentering av varje isolat inom varje hydrolysat (figur 6A). Figur 6B visar de kombinerade totala prestandaindex beräknas för varje isolat. Fem isolat (3, 14, 27, 28, 33) hade övergripande RPI över 60, som rankas dem som den mest robusta till alla varianter av hydrolysat och näringsförhållanden i kombination. Reviewing Tabell 3, både isolerar 3 och 14 var evolved i PSGHL medan 27, 28, och 33 har utvecklats i AFEX CSH eller AFEX CSH och etanol-utmanade kontinuerlig odling på xylos. Ingen av stammarna uppvisar överlägsen flera hydrolysat användning har utvecklats på mer än ett hydrolysat.

Vissa stammar var "specialister" som utför bättre på antingen SGH-N1 / 2 eller AFEX CSH. Dessa isolat utför bäst som specialister på SGHhydrolysat (11, 16 och 9) erhölls genom utveckling på PSGHL som den sista eller enda utmaningen. För isolat 11 och 16, som ursprungligen anrikades genom att öka AFEX CSH utmaning, var förmågan att effektivt utnyttja AFEX CSH inte aktivt valt under långa slutanrikning i PSGHL och viktiga genetiska faktorer som stöder dess användning var tydligen förlorat. Omvänt isolat 14, 25, 27, 30 och 33 var överlägsna artister på AFEX CSH, och alla utom isolat 14 ades utvecklats på AFEX CSH med eller utan etanol utmaning. Så som förväntat, riktad evolution på AFEX CSH eller PSGHL tenderade att selektera för jäst väl anpassad till valet hydrolysatet. Det enda undantaget i detta avseende var isolat 14. Isolera 14 härstammar från PSGHL bara utmana och isolerades från YM agar utspädning plätering av den slutliga PSGHL anrikningskultur. Al. Slininger et ¹⁸ visade att detta isolat som har överlägsen förmåga att xylos enzyminduktion i glukosodlade celler i närvaro av5-15 g / L ättiksyra och minskad diauxic eftersläpning på ODM med 75 g / L vardera av glukos och xylos, trots> 30 g / L etanol inträffar före glukos-xylos övergångspunkten.

Den överlägsna kinetiken för utvecklade stammar i förhållande till moderstammen S. stipitis NRRL Y-7124 demonstrerades som visas i Tabell 4, som representerar resultaten av lågnivå luftning flaskkulturer ympade initial A ₆₂₀ 8,4 ± 2,5 75 ml SGH-N2 (pH 6,2) inkuberades i 125 ml kolvar med silikon svamp lock vid 25 ° C, 150 rpm (en "bana), och i figur 7, vilket motsvarar moderata luftningsflaskkulturer ympade initial A ₆₂₀ 0,5 i 23 ml SGH-N2 per 50 ml flaska. ¹⁸ Dessa villkor representerar två olika typer av insatser som föreslagits av litteratur som potentiellt kommersiellt lovande för etanolproduktion av S. stipitis. ^8,22 I granarnat ex av låg nivå luftning ger hög celltäthet för snabb jäsning inledas omedelbart. Medan i andra hand, att det låg celltäthet och högre luftning leder till logaritmisk tillväxt bygga befolkningen och påskynda tillväxten associerade socker omvandling till etanol. Dessa data visar att de utvecklade stammar har betydande kinetiska fördelar jämfört med moderstammen: snabbare glukosupptag hastighet (tabell 4), snabbare specifik xylos upptagningshastigheten (tabell 4), snabbare etanol produktivitet på både glukos och xylos och övergripande (Tabell 4), till kortare fördröjning före tillväxt (figur 7), och kortare diauxic glukos xylos övergångs eftersläpning. Dessa förbättringar är tillåtna etanol ackumuleras till över 40 g / L och topp dagar tidigare (Figur 7) än vad som ses för den överordnade NRRL Y-7124. Högre total etanolproduktivitet (tabell 4) uppnåddes vid 1,5 till 5 tidär den för moderstammen (tabell 4), beroende på utvecklade stammen.

Figur 1:. Scheffersomyces stipitis anpassning flödesschema Diagrammet visas anger ordningen på påkänningar som under anpassningsprocessen och de punkter av återvinning av överlägsna isolat (siffrorna inom parentes). Se även tabell 3 isolat nyckel som referens för stam identiteter. Att ge tid orientering, siffrorna i rött indikerar antalet dagar i varje fas av anpassning. För serieöverföringsfaserna i AFEX CSH och xylos rika PSGHL, varje dag anpassning representerar ca 2-4 generationer. För kontinuerlig odling fas (205 dagar totalt), varierade på ~ 0-0,1 timmar utspädningshastighet D ^-1 under 125 d drift med pH-aktiverad utfodring. I nästa80 dagar, drift var ett kontinuerligt flöde med D på 0,012 h ^-1, vilket ger en generationstid (ln 2) / (D) av 58 timmar, eller en generation per 2,4 d vid steady state. Nästa ett prov av den anpassade populationen från 205-dagars kontinuerlig odling mutageniserades med UV-ljus och inokulerades till en kontinuerlig odling drivs med D vid 0,012 h ^-1. (Återges från Slininger et al. ¹⁸⁾ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2:. Förbättrad batch fermentation av 6% glukan AFEX CSH Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 moderstammen jäsning av 6% glukan AFEX CSH (A) jämförs med anpassad Colony 5 fermentering av 6% glukan AFEX förbehandlat majs Stover hydrolyzate (B). Symboler utse biomassa (röd fyrkant), glukos (svart cirkel med streckad linje), xylos (blå cirkel med heldragen linje), etanol (grön triangel), och xylitol (lila diamant). (Återges från Slininger et al. ¹⁸⁾ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Minskad diauxic eftersläpning i definierat medium med blandade socker Jäsning föreställningar jämförs i ODM med 66 g / L glukos och 87 g / L xylos för moderstammen S.. stipitis NRRL Y-7124 (A), den AFEX CSH anpassad population härledd från Y-7124 (B), enkelcell Colony 1 isolerad från den anpassade S. stipitis befolkningen (C), enda cell ColoNY 5 isolerad från den anpassade populationen (D). Symboler utse biomassa (röd fyrkant), glukos (svart cirkel med streckad linje), xylos (blå cirkel med heldragen linje), etanol (grön triangel), xylitol (lila diamant), och adonitol (guld diamant med svart kant). (Återges från Slininger et al. ¹⁸⁾ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Etanol resistenta derivat av Colony 5. hydrolysat tolerant Colony 5 vidareutvecklades av kontinuerlig odling val på ODM innehållande xylos som enda kolkälla och höga halter av etanol. Två derivat glycerol lager populationer erhållna tidigt i processen val (2A.1.53R, orange triangel och streckad linje) och enfter UV-bestrålning av kontinuerlig odling inokula (2A.1.30R.2, lila cirkel och streckad linje) visas i jämförelse med NRRL Y-7124 moderstammen (grön cirkel med heldragen linje) och AFEX CSH tolerant Colony 5 (svart triangel med solid linje). Xylos upptag av täta populationer av glukos odlade jäst (A ₆₂₀ = 50) i ODM med 40 g / L etanol indikerade att alla anpassade stammar överträffade inte anpassats förälder i förmågan att inducera xylos metabolism. (Återges från Slininger et al. ¹⁸⁾ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5:. Förhållande prestandaförbättring av toleranta isolat jämfört med förälder prestanda överlägsna toleranta isolat sammanfattas i förhållande tillstyrmoderstammen NRRL Y-7124 för varje formulering av PSGHL (A, B). Föreställningar bedömdes i termer av xylos upptagningshastigheten (blå staplar representerar förhållanden mellan isolat till förälder) och etanolutbytet per socker levereras (gröna staplar representerar förhållanden mellan isolat till moder). (Återges från Slininger et al. ¹⁸⁾ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Isolera ranking baserad på RPI. Den relativa prestandaindexet (RPI) koncept tillämpas på prestanda resultat av den sekundära skärmen för att rangordna 33 isolat inom varje hydrolysat typ baserade på xylos upptagningshastighet och etanolutbytet per socker levereras. (A) Den relativa sprangkung av en viss isolat beroende av hydrolysatet typ (P <0,001): SGH-N1 (blå staplar), SGH-N2 (röda staplar) och AFEX CSH (gröna staplar). (B) Den totala RPI beräknas över alla hydrolysat typer (ljusblå staplar) indikerade överlägsen stammar med mest robusta prestanda i olika hydrolysat förhållanden. (Återges från Slininger et al. ¹⁸⁾ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: Jämförande SGH jäsningar av överlägsna anpassade isolat av S. stipitis. Superior anpassade isolat och deras moderstam NRRL Y-7124 jämförs jäsande enzymatiska hydrolysat av utspädd syra förbehandlat switchgrass (20% torrandel) vid 25 ° C och initialt pH 6,2 vid låg initial celltäthet. Tidsförlopp för biomassa (röda kvadrater), glukos (svarta cirklar och streckad linje), xylos (blå cirklar och heldragen linje) och etanol (gröna trianglar) visas. Felstaplar representerar området omkring medelvärdet markeras med symboler. (Återges från Slininger et al. ¹⁸⁾ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1:. Kompositioner av hydrolysat används i odlingar (. Reproduceras från et al Slininger ¹⁸⁾ Klicka här för att ladda ned den här tabellen.

Tabell 2: Optimal definierat medium för Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 ⁷TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> Klicka här för att ladda ned den här tabellen.

Tabell 3:. Sammanfattning av överlägsna toleranta Scheffersomyces stipitis stammar för jäsning av hydrolysat av växtbiomassa (. Reproducerat från et al Slininger ¹⁸⁾ Klicka här för att ladda ned den här tabellen.

Tabell 4: Jämförande kinetik isolat på switch hydrolysat SGH-N2 ympades till inledande A ₆₂₀ = 8,4 ± 2,5 Priserna är normaliserade priser per enhet absorbans under glukos eller xylos konsumtion.. (Återges från Slininger et al. ¹⁸⁾ Klicka här för att ladda ner TAble.

Discussion

Flera steg var kritiska för framgången av utvecklingen processen. Det första är det för att välja lämpliga selektionstryck för att driva befolkningen utveckling mot de önskade fenotyper som behövs för framgångsrik tillämpning. Följande selektiva spänningar valdes för S. stipitis utveckling och tillämpad vid lämpliga tidpunkter för att vägleda anrikning för de önskade fenotyper: ökande styrkor av 12% glukan AFEX CSH (vilket tvingar tillväxt och fermentering av olika sockerarter i närvaro av ättiksyra och låga nivåer av furan aldehyder och andra inhibitorer); xylos matas kontinuerliga kulturer med ökande etanolkoncentration (vilket tvingar xylos enzyminduktion att minska diauxic eftersläpning); och ökande styrka av 20% torrandel PSGHL (vilket tvingar tillväxt och fermentering av xylos i närvaro av höga ättiksyra, furaner, och andra inhibitorer). För det andra är det viktigt att bevara de framväxande jäst populationer genom frysning glycerol stocks populationsprover som anrikningsprocessen fortskrider. Sådana ögonblicksbilder av befolkningen kan lagras för återkommande funktionstestning för att dokumentera utvecklingen framsteg och för att möjliggöra efterföljande isoleringar som önskas, eller att starta evolution processer efter ett uppehåll. Ett tredje viktigt steg i utvecklingen förfarandet var att återvinna exceptionella isolat genom att berika val kultur populationer eller glycerol lager populationer på ett bekvämt selektivt medium (såsom agar eller mikroplattor innehållande en påkänningsgradient presentera en rad hydrolysat och / eller etanolkoncentrationer) . Sedan överlevande kolonier som växer under de mest påfrestande tillstånd kan plockas att bevara för karakterisering senare. Dessa tre grundläggande steg kan upprepas för att fullfölja varje ytterligare önskad fenotyp selektionstryck, eller alternativt flera påtryckningar i en enda cykel om det är lämpligt. När den infödda moderjäst befolkningen utsätts för olika påfrestningar, är den genetiska mångfalden förväntas uppstå th grov naturliga eller inducerade mutationer, och fortsatt exponering gör att det naturliga urvalet att anrika för personer med de mest fördelaktiga mutationerna stöder konkurrenskraftig överlevnad. Det förväntas att den valda fenotypen sker som ett resultat av flera genetiska mutationer. I protokollet ovan, kan mutationer induceras under UV-behandling eller potentiellt under exponering av jäst till hydrolysat. Hydrolysat är kända för att innehålla tre klasser av föreningar skadligt för mikroorganismer:. Karboxylsyror, aldehyder och fenoler ²² Reaktiva aldehyder, såsom furfural och 5-hydroximetylfurfural, kan skada celler och orsaka en förhöjning av reaktiva syreradikaler (ROS), genereras typiskt i mitokondrier. ROS är väl kända för att orsaka DNA-mutationer i eukaryota celler. ^23,24 De fenoler som finns i hydrolysat, men inte tidigare känt att vara genotoxiska, kan främja och samverka de mutagena effekterna av aldehyder och mutagen ROS. ²⁵

jove_content "> Den stegvisa strategi att gradvis krävande miljöer förväntas bygga utvecklats stammar med en rad fenotyp förbättringar både riktade och även icke öron. Det är möjligt att vissa icke-riktade fenotyper kan uppstå som inte är önskvärda eller instabil. För att fånga de mest fungerande och robusta stammar, är ett ytterligare viktigt steg som måste vidtas för att utvärdera och jämföra utvalda isolat för kommersiellt relevanta egenskaper och nådde både målinriktade och icke-målinriktade fenotyper. för att göra detta, isolera föreställningar bör jämföras i en mängd olika applikationsorienterade påfrestningar, till exempel i hydrolysat med olika utmaningar inhibitor och näringsformuleringar, så att val av bästa övergripande stammar som är stabila och robusta för bred industriell lignocellulosa substrat variation. Dessutom kan en stam stabilitets utmaning införlivas i skärm som gjordes i exemplet genom att inkludera preculturing steg involving inledande jäst tillväxt på två icke-selektiva medier, YM agar för flera generationer, följt av den syntetiska ODM med 50 g / L xylos ytterligare 6-7 generationer, vilket ger möjlighet till destabilisering av önskade kulturdrag före exponering för utmaningen av prestanda i hydrolysatet. Baserat på betydande prestandafunktioner, såsom etanol avkastning och xylos upptagningshastighet är isolat sedan rankas i varje olika spänningstillstånd, såsom varje hydrolysat miljö testas, vilket kan skilja sig från isolatet anrikning odlingsmedium. Den dimensionslösa RPI kan användas för att beräkna den genomsnittliga totala relativa prestanda och rang isolat jämförs. En dimensions faktor är lämpligt för att återspegla det relativa resultatet i olika typer av hydrolysat och grundar sig på olika prestationsbedömningar, såsom avkastning kontra priser. Denna rangordning förfarande identifierar stammar som utför konsekvent och över stora variationer i tillväxtbetingelser och hydrolyzates och är benägna att vara både robust och genetiskt stabil.

Olika iterationer och modifieringar av dessa grundläggande steg kan vara nödvändigt för att tillgodose utvecklingen av någon mikrobiell stam med förmåga att specifika eller unika prestandafunktioner på lignocellulosa hydrolysat eller andra substrat av intresse. I S. stipitis exempel är det viktigt att notera att tillskott av näringsämnen, bland annat låg kostnad kommersiella källor, till hydrolysat framställda vid hög torrhalt var nyckeln till att kontrollera det dynamiska omfånget av isolera föreställningar för förbättrad statistisk separation under screening. Vikten av näringsämnen till framgångsrik jäsning av koncentrerade inhiberande hydrolysat har också rapporterats tidigare och tros bero på en förhöjd behov av aminosyror och andra näringsämnen som krävs för cellunderhåll, redox balansering, och reparation som ett resultat av sådana stressförhållanden, speciellt under xylosanvändning. ^9,26,27Dessutom, om näringsämnen är alltför glesa eller för riklig, kan skillnader i isolera föreställningar vara svårt att upptäcka statistiskt på grund av alla isolat gör ytterst dåligt, eller alla gör mycket väl, respektive. Isolerar kan utföra väl under olika förhållanden förväntas vara tillförlitlig, eller robusta för att variationer i industriell miljö.

Den största begränsningen med detta protokoll är att adaptiv evolution och screening är mycket bokstav i resultatet, att "man får vad man berikar och skärmar för". Således, anrikning och skärm villkor måste vara utformade för att förstärka och identifiera individer, respektive, med de önskvärda förändringar i fenotyper och ändå behålla önskvärda befintliga egenskaper. Evolution kan påverka icke-ut för egenskaper som är kritiska för industriell prestanda (t.ex. krav tillväxtfaktor). Av denna anledning befolkning anrikning framsteg för ett drag måste regelbundet övervakaed för andra egenskaper som en metod för felsökning för oönskade förändringar. Till exempel, en av de unika drag av S. stipitis är dess naturliga förmåga att växa på och jäsa xylos. All anriknings- och screening substrat ingår xylos som enda eller nyckel bidragande kolkälla i närvaro av inhibitorer. Följaktligen var ett gemensamt drag hos alla anrikningskulturer i detta exempel att de direkt ut för att snabbare xylos utnyttjar stammar, vars befolkningar blev mer och mer anrikat i seriell eller kontinuerlig odling eftersom de var bättre konkurrenter. Som ett avsett resultat, förbättrade stammar var alla kan snabbare xylos upptag, men förbättringar etanolutbytet var mycket mindre dramatisk än förbättringar i xylos upptagningshastighet. Den senare trenden sannolikt kom sedan etanolutbytet av moderstammen var relativt hög på cirka 0,3 g / g, eller 60% av teoretiskt (0,51 g / g), som celltillväxt blev stillastående i hydrolysat, vilket lämnar mindre utrymme förförbättring. I kulturer, kan högre avkastning etanol möjligen väljas mot eftersom etanol är en tillväxthämmare, som krävde prestandaövervakning av den utvecklade populationen för denna egenskap. Etanolkoncentrationer hålls under nivån för tillväxthämning skulle tendera att neutralisera denna som en selektionsfaktor. För S. stipitis NRRL Y-7124, 40 g / L etanol halvor specifik tillväxthastighet medan 64 g / L förhindrar tillväxten helt. ²⁸ etanol utmanade kontinuerliga kulturer matas xylos, luftning hölls låg och utspädningsgrader var också hållas låg nog med gott xylos närvarande för att foster jäsning snarare än andning etanol och förhindra anrikning för en oönskad etanol bruk egendom. Dessutom, näringstillskott till hydrolysaten som används i prestations skärmar var omsorgsfullt utformad för att undvika att välja för stammar behöver en kostsam rik näringstillförsel, såsom jästextrakt. Kosttillskott ingår alltid lägsta kostnad kommersiella källor tillgänglig före, såsom sojamjöl och urea, fastän rikare komponenter såsom i YM tillämpades i tandemkulturer för jämförande testning, såsom i formuleringarna enligt 60% och 75% PSGHL som normalt bryter av kväve. ODM syntetiskt medium som används i förodling och prestationskultur skärmar, var ursprungligen avsedd för optimal prestanda av parentalstammen S. stipitis NRRL Y-7124 ⁷ i enlighet med odlingsmediet optimeringsrutin beskrivs av Traders Protein ²⁰ som rekommenderar definierade ingredienser, inklusive vitaminer, mineraler, puriner och pyrimidiner, och aminosyrakällor att leverera näringsämnen som är kompatibla med kostnadseffektiv industriell skala upp med hjälp av kommersiella källor. En slutlig rekommendation vid utformningen relevanta stammar, är att hålla utformningen av anriknings- och skärmförhållanden så relevant som möjligt för de förväntade industriella processförhållanden.

Kostnadseffektiv förnybar etanol har länge bedrivits med rDRA UT beroendet av fossila bränslen. För att förbättra förmågan hos S. stipitis NRRL Y-7124 att tolerera, växa och fermen hämmande hydrolysat av lignocellulosa, har flera forskare använt upprepad odling i xylos lut till följd av utspädd syra-förbehandling av lignocellulosa. ^13,14,16,17 Över kalkning att avgifta hämmare fortfarande behövs för att en rimlig nivå av prestanda tidigt anpassade påfrestningar på lövträd och halm vete förbehandlingsvätskor ^13,14 Flera upprepade rundor av UV-mutagenes och genom omflyttning har använts för att utveckla derivat av S.. stipitis NRRL Y-7124 med förbättrad tolerans hämmare och tillväxt i lövträ bringade sulfitlut (HWSSL). ^16,17 emellertid etanolkoncentrationer som produceras av dessa stammar i HWSSL var under 10 g / L efter 6 till 7 dagar. Med hjälp av tekniker som visas och beskrivs här, nya utvecklade stammar av S. stipitis NRRL Y-7124 har utvecklats för att möta phenotype mål som krävs för ekonomisk kommersiell användning: jäsning av hydrolysat vid pH 5-6 utan föregående åtgärder avgiftning, såsom över-kalkning, vilket leder till omhändertagande kostsam avfall; kraftigt minskad tillväxt och diauxic eftersläpning; etanol ansamlingar tillräckligt höga för kommersiell destillation (> 40 g / L etanol); snabbare tillväxt och etanol produktivitet än tidigare rapporterats för infödda jäststammar jäsande undetoxified hydrolysat; och prestanda i olika hydrolysat med hög torrhalt, inklusive lämpligt sojakvävetillskott SGH (som annars kväve dålig) och okompletterat AFEX CSH. De förbättrade stammar som utvecklats med hjälp av den nya aggressiva strategier för utveckling som kommer till uttryck i de viktigaste stegen som sammanfattas ovan, förväntas gynna ekonomin för att producera etanol från biomassa från jordbruket genom att sänka driftskostnader, kapitalkostnader och energi- och vatteningångar. Detta är den första stammen utvecklingen planen rapporteras att ge anpassade stammar av S. stipitär demonstrerar ekonomiskt utvinningsetanolproduktion på undetoxified hydrolysat.

De nya stammar av S. stipitis som härrör från varje fas av utvecklingsprocessen (Figur 1) är kandidater för framtida studier för att bestämma de genetiska förändringar som är förknippade med specifika selektionstryck som använts och mekanismerna bakom viktigaste attributen för förbättrad hydrolysat jäsning, som tolerans hämmare och minskad diauxic eftersläpning. En sådan värdefull ny kunskap kommer att underlätta konstruktion av nästa generations jäst biokatalysatorer och processer för omvandling av lignocellulosa till biobränslen och andra produkter. När nya stammar härrör, kommer det sannolikt vara fördelaktigt att återigen passera derivatet befolkningen genom en stam evolution protokoll liknande det som beskrivs här för att välja de mest användbara transformanter för kommersiellt bruk i hydrolysat. På samma sätt som nya mikrobstammar upptäcks med potential att göra en minRiad användbara nya produkter från förnybar biomassa, kan utvecklingen processen appliceras ytterligare förbättra stam robusthet och produktivitet i hydrolysat, potentiellt tillåta nya bio-katalytisk processer och produkter som ska göras tillgängliga.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com