Techniken für die Entwicklung von robusten Pentose-gärenden Hefe für Biokonversion von Lignocellulose zu Ethanol

Summary

Adaptive Evolution und Isolationstechniken sind beschrieben und gezeigt , Derivate von Scheffersomyces stipitis - Stamm NRRL Y-7124 zu erhalten , die der Lage sind, schnell Hexose und Pentose - Zuckern in gemischten Enzym verbrauchen verzuckert undetoxified Hydrolysate und über 40 g / l Ethanol zu akkumulieren.

Introduction

Schätzungsweise jährlich 1,3 Milliarden trockenen Tonnen Lignocellulose - Biomasse könnte die Ethanolproduktion und damit die USA zu verringern , seine Erdölverbrauch um 30%. ¹ Obwohl pflanzliche Biomasse Hydrolyseausbeuten Zuckermischungen reich an Glucose und Xylose, Fermentationsinhibitoren erzeugt werden durch die chemische Vorbehandlung unterstützen notwendig Hemicellulose zu brechen und zu entlarven Cellulose für einen enzymatischen Angriff. Essigsäure, Furfural und Hydroxymethylfurfural (HMF) sind gedacht, Schlüsselkomponenten unter vielen Inhibitoren zu sein, die während der Vorbehandlung bilden. Um die Lignocellulose äthanolindustrie vorwärts zu bewegen, Forschung und Verfahren, um die Entwicklung von Hefestämmen zu ermöglichen, überlebensfähig und effizient sowohl Hexose und Pentose-Zuckern in Gegenwart solcher inhibitorischen Verbindungen nötig sind, um die Verwendung funktionieren. Eine signifikante zusätzliche Schwäche der traditionellen industriellen Hefestämmen, wie Saccharomyces cerevisiae, ist die Unfähigkeit , effizient ferment die Xylose in Hydrolysaten pflanzlicher Biomasse.

Pichia stipitis Typ - Stamm NRRL Y-7124 (CBS 5773), die vor kurzem umbenannt Scheffersomyces stipitis, ist eine native Pentose gärenden Hefe , die gut bekannt ist , Xylose zu Ethanol zu vergären. ^2,3 Die Entwicklung der Stamm NRRL Y-7124 wurde hier verfolgt , weil es wurde dokumentiert von mehr als 40 g / l mit dem Nebenprodukt wenig Xylit haben das größte Potenzial von nativen Hefestämme wirtschaftlich gewinnbaren Ethanol zu akkumulieren. ^4,5,6 bei optimalen Medien, S. stipitis - Stamm NRRL Y-7124 produziert 70 g / L Ethanol in 40 Stunden (1,75 g / L / h) bei einer Ausbeute von 0,41 ± 0,06 g / g in hochdichten Zellkulturen (6 g / l Zellen). ^7,8 Resistance Fermentationsinhibitoren Ethanol, Furfural und HMF hat auch ⁹ und S. berichtet worden stipitis wurde unter vielversprechendsten nativen Pentose-fermentierenden Hefen für kommerziellen Maßstab Ethanol productio Platzn aus Lignocellulose. ¹⁰ Unser Ziel war es diverse undetoxified Lignocellulose - Hydrolysaten und Ethanol Selektionsdruck anwenden zu zwingen Entwicklung hin zu einem robusteren Derivat von Stamm NRRL Y-7124 geeignet für industrielle Anwendungen. Die wichtigsten unter verbesserten Features waren gesucht schneller Zucker Aufnahmeraten in konzentrierter Hydrolysate, reduziert diauxy für effizientere Mischzuckerverwertung und höhere Toleranzen von Ethanol und Inhibitoren. Die Anwendung von S. stipitis zu undetoxified Hydrolysate war ein Schwerpunkt der Forschung den zusätzlichen Betriebskosten mit Hydrolysat Entgiftungsprozesse, wie overliming assoziiert zu beseitigen.

Zwei industriell vielversprechende Hydrolysate wurden zu zwingen Evolution angewandt. Enzym verzuckerten Ammoniak Faser Expansion vorbehandelten Maisstroh - Hydrolysat (AFEX CSH) und Säure vorbehandelt Switchgrass- Hydrolysat Lauge (PSGHL) verdünnen ^11,12 AFEX Vorbehandlungstechnologie entwickelt wird , umdie Herstellung von Fermentationsinhibitoren zu minimieren, während verdünnte Säurevorbehandlung stellt praktiziert die aktuelle niedrigsten Kosten-Technologie am häufigsten Zellulose-Biomasse zur enzymatischen Verzuckerung zu belichten. PSGHL ist trennbar von der Cellulose nach der Vorbehandlung verbleibenden und ist charakteristisch reich an Xylose aus dem hydrolysierten Hemicellulose, aber wenig Glukose. AFEX CSH und PSGHL Zusammensetzungen unterscheiden sich voneinander in wichtigen Aspekten, die die Evolutionsprozess zu verwalten ausgebeutet wurden. AFEX CSH niedriger in furan Aldehyde und Essigsäure Inhibitoren aber höher in Aminosäuren und Ammoniak Stickstoffquellen im Vergleich mit PSGHL (Tabelle 1). PSGHL stellt die zusätzliche Herausforderung von Xylose die vorherrschende Zucker zur Verfügung stehen. So ist PSGHL angemessen speziell in Hydrolysaten für verbesserte Xyloseverwertung zu bereichern, eine Schwäche kommerzielle Nutzung der verfügbaren Hefe zu verhindern. Auch unter den einheimischen Pentose gärenden Hefen, die das Vertrauen auf die suboptimale Zucker Xylose Zellwachstum zu unterstützen und die Reparatur wird noch schwieriger in Hydrolysaten wegen einer Vielzahl von Gründen. Nährstoffmangel, Inhibitoren große Schäden verursachen strukturelle Integrität zu Zelle und Unterbrechung Metabolismus aufgrund redox Ungleichgewichten ⁹ Stickstoffergänzung, insbesondere in Form von Aminosäuren können eine erhebliche Betriebskosten für Gärungen darstellen. Die Auswirkungen der Stickstoff-Supplementation auf Isolat Screening und Ranking wurde mit Switchgrass Hydrolysate erforscht.

Verbesserte Personen wurden in einer sich entwickelnden Bevölkerung mit mehreren Selektionsdruck angewiesen auf natürliche genetische Vielfalt des S. angereichert stipitis Bevölkerung und von Forderungen an zwei unterschiedlichen Hydrolysate induzierte Mutationen, Ethanol oder UV - Strahlung. Selektionsdruck wurden parallel und in Serie angewandt , um die Evolution Fortschritt von S. zu erkunden stipitis in Richtung gewünschten Derivate der Lage zu wachsen und effizient in Hydrolysaten gären(Abbildung 1). Die wiederholte Kultivierung von funktionellen Populationen in zunehmend herausfordernden Hydrolysate wurde erreicht, in Mikrotiterplatten einer Verdünnungsreihe von entweder 12% Glucan AFEX CSH Einsatz oder auch PGSHL bei 20% Feststoffbeladung hergestellt. Die Anwendung von Ethanol-herausgefordert Wachstum auf Xylose in einer kontinuierlichen Kultur weiter verbessert AFEX CSH angepasst Populationen von für Phänotypen Anreicherung demonstriert weniger Anfälligkeit Unterdrückung der Xyloseverwertung zu Ethanol. Letztere Funktion wurde vor kurzem als problematisch Pentose Nutzung durch den Stamm NRRL Y-7124 gezeigt folgenden Glucosevergärung. ⁸ Anreicherung auf PSGHL wurde neben Hydrolysat Funktionalität zu erweitern sucht.

Vermeintliche verbesserte Derivate von S. stipitis NRRL Y-7124 wurden von jeder Phase des Evolutionsprozesses isoliert Plattierung durch gezielte Anreicherung unter Stressbedingungen und Verdünnung Kolonien von den am weitesten verbreiteten Bevölkerung zu holen. dimensionslos relativPerformance-Indizes (RPI) wurden verwendet, um Stämme basierend auf die Gesamtleistung Rang, wo kinetische Verhalten auf den verschiedenen Hydrolysat-Typen und Nahrungsergänzungsmittel angewendet wurde bewertet. Auch wenn die Erfolge der verschiedenen Anpassungsverfahren die Funktionalität von S. zu verbessern stipitis in Lignocellulose - Hydrolysate wurden bereits dokumentiert, Zerrungen wirtschaftliche Ethanolproduktion auf undetoxified Hydrolysate zeigen bisher nicht berichtet worden. ^13-17 die Evolutionsverfahren Verwendung näher visualisiert werden hier Slininger et al. ¹⁸ Stämme entwickelt , die deutlich verbessert werden über der Elternstamm NRRL Y-7124, und sind in der Lage von> 40 g / L Ethanol in AFEX CSH zu produzieren und verzuckerten Switch Hydrolysat (SGH) entsprechend ergänzt mit Stickstoffquellen Enzyms. Diese neuen Stämme sind von zukünftigen Interesse für die Entwicklung von Lignocellulose-Ethanol-Industrie und als Gegenstand weiterer Genomik Studien Gebäudeauf denen der zuvor Stamm sequenziert NRRL Y-11545. ¹⁹ während der verschiedenen Phasen der Evolution Eine Genomik Studie der Top - Stämme in Abbildung diagramed 1 erzeugt würde die Geschichte von genetischen Veränderungen aufzuklären , die während der Entwicklung als Auftakt fiel Stammverbesserung Forschung fördern.

Protocol

1. Bereiten Sie Materialien und Geräte für Tests starten

1. Bereiten Sie Hydrolysate mit 18 bis 20% anfängliche Biomassetrockengewicht in der Vorbehandlungsreaktion für den Einsatz in der Entwicklung, Isolation und Ranking-Verfahren. Siehe Slininger et al. 2015 ¹⁸ für die detaillierten Methoden AFEX CSH, PSGHL und SGH mit Stickstoff Ergänzungen N1 oder N2 in der Evolution, Isolation oder das Ranking verwendet vorzubereiten. Siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung jedes Hydrolysat - Typ.
   HINWEIS: Nitrogen Befestigungen von SGH wurden als SGH-N1 oder SGH-N2 bezeichnet wie folgt definiert: SGH-N1 = SGH bis 42 befestigte: 1 molar Kohlenstoff zu Stickstoff-Verhältnis (C: N) mit Stickstoffquellen einschließlich Harnstoff, Vitamin-freie Amino- Säuren, die aus Casein, D, L-Tryptophan, L-Cystein und Vitamine aus definierten Quellen (so dass ~ 15% der molar Stickstoff N ist primären Aminostickstoff (PAN) und ~ 85% N von Harnstoff); 1: C: SGH-N2 = SGH bis 37 befestigte N mit Harnstoff und Sojamehl als den niedrigsten Kosten kommerzielle Quelle of Aminosäuren und Vitamine, die Bereitstellung ~ 12% N von PAN und 88% als Harnstoff.
2. Erwerben Sie eine gefriergetrocknete Kultur des Elternstamm Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) von der ARS Culture Collection (Nationales Zentrum für landwirtschaftliche Nutzung Forschung, Peoria, Illinois), und bereiten Kulturen Glycerolstammlösung wie verwiesen. Pflegen Stammkulturen der Mutter Hefe und seine Derivate in 10% Glycerin bei -80 ° C.
   1. Streak Glycerin Aktien Hefe Malz Pepton Dextrose (YM) Agarplatten (3 g / l Hefeextrakt, 3 g / l Malzextrakt, 5 g / l Pepton, 10 g / l Dextrose, 20 g / l Agar) und Inkubation 48- 72 Stunden bei 25 ° C. ⁸ entwickelten Platten können bei 4 ° C bis zu einer Woche gelagert werden vor als flüssige Vorkultur Inokula zu verwenden.
3. Bereiten Optimal Defined Medium (ODM), ein synthetisches Medium kompatibel mit Industrieformulierungsverfahren ²⁰ , die zuvor für die optimale Umwandlung von Xylose zu Ethanol von der Mutter str entwickelteain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Verwenden Sie den definierten Medium in allen Vorkulturen und Kulturen für Gärleistung Biotests und auch für Ethanol in Frage gestellt, Xylose-fed kontinuierliche Kultur Evolution. ODM - Zusammensetzung wird als Referenz in Tabelle 2 aufgeführt.
4. Wie zuvor beschrieben, ¹⁸ Zellbiomasse unter Verwendung eines cuvette- oder Mikroplattenlese - Spektralphotometer, gegebenenfalls analysieren, Kultur Extinktion bei 620 nm (A ₆₂₀₎ zu messen. Quantifizieren Zuckern, Ethanol, Furfural, Hydroxymethylfurfural (HMF) und Essigsäure in Kulturproben Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Roboter enzymatische Bestimmung von Glucose und Xylose für höheren Durchsatz.

2. Bereichern Robust Derivate bei der seriellen Übertragung auf AFEX CSH

1. Impfen eine Vorkultur von Stamm NRRL Y-7124. Übertragungszellen von YM Agar zu 75 ml ODM + 150 g / L Xylose zu erhalten, die Fähigkeit, unter o wachsensmotic Stress. Inkubieren Vorkulturen in 125 ml-Flaschen geschlossen mit Silizium Schwamm 24 Stunden unter Schütteln (150 Umdrehungen pro Minute, 1 "Orbit) bei 25 ° C eingesteckt wird.
2. Tauen gefrorenen Teilmengen von 6-12% Glucan AFEX CSH in kaltem Wasser für den Einsatz. PH-Wert auf 5, wenn nötig und Filter sterilisieren vor einer Verdünnungsreihe in Herstellung 96-well Mikrotiterplatten.
3. Füllen Sie Mikrotiterplatten mit 50 ul pro Vertiefung und 8 Vertiefungen pro Hydrolysat Verdünnung, dann impfen mit wenigen Mikrolitern Vorkultur pro Vertiefung eine anfängliche Absorption (620 nm) A ₆₂₀ ≥0.1 zu ermöglichen. Inkubieren Platten statisch 24-48 Stunden bei 25 ° C in einem Kunststoffkasten mit einem nassen Papiertuch für Feuchtigkeit.
4. Unter Verwendung der am stärksten konzentrierten Hydrolysats Verdünnungs die sichtbar zu A ₆₂₀ wuchs> 1 ist , Transfer 1-5 & mgr; l in jede Vertiefung einer neuen Serie Hydrolysat Verdünnungsanfangs A ₆₂₀ ≥0.1 zu erreichen.
5. Überwachen Wachstumskultur A ₆₂₀ in Mikrotiterplatten mit einem Spektralphotometer. Eine ungeimpften Verdünnungsreihe serves als Steuer- und leer. Teller Deckel sind links auf die während der Kontamination zu verhindern überwachen und die Messwerte entsprechend angepasst.
6. Bereiten Glycerinstammanpassungs Kulturen regelmäßig für die anschließende Isolierung von verbesserten Stämmen oder zur Verwendung in reinoculating die kontinuierliche Hydrolysat Verdünnungsreihe. Zur Vorbereitung Aktien, Pool vier Brunnen (200 ul) der größte Hydrolysat Konzentration besiedelt. Mix 1: 1 mit 20% sterilem Glycerol in Kryoröhrchen, Zellen in 10% Glycerol bei -80 ° C zu gefrieren.
7. Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,6, bis das Wachstum bei 12% Glucan AFEX CSH durchweg sichtbar bei 24 Stunden ist.

3. Isolieren Single Cell Tolerant Derivate nach Anreicherung auf AFEX CSH

1. Streak ausgewählt Glycerinstammanpassungs Kulturen zu YM Agar und Verwendung Streifen zu impfen 50 ul 3% oder 6% Glucan AFEX CSH (pH 5) in jeder der drei Mikrotitervertiefungen (Initiale A ₆₂₀ ~ 0.1). Inkubieren Mikrotiterplatten 24 Stunden, wie in Schritt 2.3. Pool Replikte kolonisiert Brunnen auf dem höchsten Hydrolysat Stärke mit einem starken Wachstum und Verdünnungsplatte oder 6% Glucan AFEX CSH Agar YM. Bereiten Sie die letztere als ein 1: 1-Mischung von Filter 12% Glucan AFEX CSH mit warmem autoklaviert 30 g / l Agar-Lösung sterilisiert.
2. Wählen Sie 5 Einzelkolonien von der höchsten Verdünnungsplatte zeigt das Wachstum nach 24-48 h Inkubation bei 25 ° C als Glycerin-Stammkulturen einzufrieren. Streak jede Kolonie auf einer YM Platte. Inkubiere 24 Stunden. Mit einer sterilen Schleife, übertragen eine entwickelte Streifen von Zellen auf ein kleines Volumen von 10% Glycerin, mischen Zellen zu suspendieren und zu verteilen, um 2-3 Kryovials für bei -80 ° C einfrieren.

4. Bewerten Leistung von AFEX CSH Tolerant Derivate im Vergleich zu Eltern

1. Test-Isolat in Einfache 6% Glucan AFEX CSH Batch-Kulturen.
   1. Transfer - Zellen von 48 h - Platten ausgestrichen aus Glycerinstamm auf pH 7 Kaliumphosphat - Puffer (0,4 mM) Zellsuspensionen mit A ₆₂₀ = 10. Mit 1 ul vorzubereitenJede Suspension zu jeder von vier Vertiefungen von 50 & mgr; l 3% Glucan Hydrolysat inokulieren A ₆₂₀ = 0,2 bis initial. Inkubieren Mikrotiterplatten 24 Stunden, wie in Schritt 2.3. Bereiten Sie die 3% Glucan AFEX CSH bei pH 5 um 12% Glucan AFEX CSH 1 Verdünnung: 3 mit sterilem Wasser.
   2. Übertragen zwei 24-Stunden-Mikrotitervertiefungen 25 ml Vorkulturen bei 50% der vollen Stärke verwendet pH 5 12% Glucan AFEX CSH zu impfen. Inkubieren Vorkulturen in 50 ml Flaschen mit Silikonschwamm Verschlüsse für 24 Stunden bei 25 ° C, ~ 150 Umdrehungen pro Minute (1 "Orbit) Bereiten Sie die Halb Stärke 12% Glucan AFEX CSH durch das Hydrolysat 1 verdünnt. 1 mit sterilem Wasser.
   3. Verwenden halber Stärke - Hydrolysat Vorkulturen ähnlich 25 ml Wachstumskulturen zu impfen A ₆₂₀ = 0,1 bis paraphieren. Inkubieren der Wachstumskulturen wie oben (4.1.2) und Probe täglich (0,2 ml). Monitor Anhäufungen von Biomasse (A ₆₂₀₎ und die Konzentrationen von Zuckern und Fermentationsprodukte (HPLC).
2. Alternativ repitch (dh Ernte und reuse) Populationen von 6% Glucan AFEX CSH wachsene Hefe zum Testen in 8% Glucan Hydrolysat Batch - Kulturen, wie zuvor beschrieben. ¹⁸
3. Alternativ weitere Testpopulationen repitched 6% Glucan CSH Kulturen AFEX indem sie mit 12% Glucan Hydrolysat Einspeisen, wie dies zuvor beschrieben ist . ¹⁸
4. Testen Sie diauxischen Verzögerung der Isolate in Batch-Kulturen von ODM mit gemischten Zucker.
   1. Impfen Vorkulturen von 75 ml ODM mit 150 g / l Xylose in 125 ml-Flaschen mit Silikonschwamm Verschlüsse durch Schleifenübertragung von YM Glycerin Streifen. Inkubiere 24 h, wie in Schritt 2.1.
   2. Verwenden Vorkulturen auf ähnliche 75 ml Testkulturen Beimpfen mit ODM, enthaltend 75 g / l Glucose und 75 g / L Xylose bei pH 6,5. Schüttelkolben bei 25 ° C, 150 Upm. Probieren Sie täglich.
   3. Alternativ testen Sie die Auswirkungen von 0-15 g / l Essigsäure auf diauxy während der Fermentation von Glucose und Xylose durch ein ähnliches Protokoll, mit der Ausnahme anfängliche pH-Wert bei 6,0 ± 0,2 in Testkulturen eingestellt ist pH-Wert aufrechtzuerhalten 6-7 duEssigsäure Verbrauch Ring, wie zuvor beschrieben. ¹⁸

5. Tragen Sie kontinuierlichen Kultur zu wählen für Ethanol-herausgefordert Xyloseverwertung

1. Bereiten ODM als kontinuierliche Kultur Zufütterungsmedium mit 60-100 g / L Xylose, 20-50 g / L Ethanol bei pH 6,3 ± 0,2. Wählen Kombinationen von Xylose und Ethanol die partielle Fermentation von 150 g / L Xylose zu simulieren, eine potentielle Ausbeute von ~ 0,5 g Ethanol / g Xylose vorausgesetzt, und das Potential für 50-70 g / L Ethanol aufzunehmen auftreten. ⁸
2. Um die kontinuierliche Kultur Inokulum vorzubereiten, übertragen eine repräsentative AFEX CSH-tolerante Kolonie (analog zu Colony 5 in Beispiel 1) durch die Schleife von einer 48 Stunden YM Platte bis 75 ml des ethanolfreiem ODM (100 g / l Xylose, in diesem Fall) in 125 ml-Kolben. Inkubieren bei 25 ° C, 150 rpm (1 "Umlaufbahn) für 24 h. Wählen Sie die Vorkultur ODM Xylose-Konzentration, die der anfänglichen kontinuierlichen Kultur Haltevolumen anzupassen.
3. Beimpfen einer kontinuierlichen Kultur Haltevolumen von ODM bei pH 6,3 ± 0,2 mit 100 g / L Xylose + 20 g / l Ethanol mit ~ 5-10 ml einer Vorkultur Konzentrat eines AFEX CSH-tolerant Isolat (analog Colony 5, 1 ) 100 ml bei der ersten A ₆₂₀ ~ 0,5 zu erhalten. Pflegen Sie die Kultur Haltevolumen (V _R), bei 25 ° C in einem ummantelten 100 ml Rührkolben bei 200 Umdrehungen pro Minute und ausgestattet mit sterilisierbar pH - Elektrode, pH - Regler und temperaturgesteuerte zirkulierendes Wasserbad gerührt.
4. Zunächst wird, da das Zellwachstum aufgrund der Ethanolexposition langsam sein, setzen Sie das Fördermedium bis zu dosieren einen pH-betätigten Pumpe. Stellen Sie die Pumpe pH-6,3 ODM mit 100 g / l Xylose und 50 g / L Ethanol, wenn die Kulturfermentation sinkt der pH-Wert auf 5,4, damit das Anhalten weiterer pH-Abfall zuzuführen. Pflegen Sie das Volumen auf 100 ml mit einer Abwasserpumpe die Kulturoberfläche kontinuierlich Skimming. Folglich steigt Ethanolkonzentration mit fort Metabolismus und Fütterung. Messen Sie Abwasser und ziehen Proben (1-2 ml) aus kontinuierlichen Kulturen alle 48-72 Stunden für die Analyse der Lebendzellkonzentration, Produkte und Substrate, wie zuvor beschrieben. ¹⁸ , um Lebendzellkonzentration, machen serienmässigen 1:10 Verdünnungen von Proben finden in Puffer (siehe 4.1.1) und Ausstrichverfahren die Verdünnungen auf YM-Agar (1.2.1 sehen). Basierend auf Abwassersammelraten (Q), die Berechnung der Verdünnungsrate (D) (Q / V _R), und in dem Beispiel von S. stipitis, es variiert von 0 bis 0,01 h ^-1.
5. Sparen Glycerinstamm regelmäßig durch von Lebensfähigkeit Platten gepufferte Probenverdünnungen Isolierung 30-100 Kolonien bilden, was am weitesten verbreitete robuste Kolonisten damals mit der Anreicherung. Flood-Platten mit ca. 5 ml 10% Glycerol Herstellung von doppelten Kryoröhrchen zu ermöglichen. Für die Wartung oder eine Ruhepause, die kontinuierliche Kultur zu stoppen und neu zu starten, da die meisten aktuellen (resistent) Glycerolstammlösung (en) benötigt werden.
6. Zum Neustart Streifen die Glycerolstammlösung (n) von den meistenresistente Populationen auf YM-Agar und übertragen 24-48 hr Zellen durch Schleife zu einer Vorkultur wie oben für die Inkubation ethanolfreiem ODM. Mit einem Konzentrat der vorkultiviertem Hefe beimpft und die 100 - ml - Volumen von ODM Holding A ₆₂₀ 0,5 Erstausbildung und lassen Sie die Kultur chargenweise bis zur stationären Phase zu wachsen , bevor das Fördermedium Fluss neu gestartet wird.
7. Wenn die Kulturen bei stetig wachsen> 0,01 h ^-1 auf Xylose in Gegenwart von> 25 g / l Ethanol, starten Sie die kontinuierliche Kultur - Feed (ODM + 60 g / l Xylose + Ethanol im Bereich von 30 bis 50 g / l) bei einer niedrigen Verdünnungsrate ~ 0,01 h ^-1 bis die 100 ml Haltevolumen (anfänglich ODM + 60 g / l Xylose + 20 g / l Ethanol). Im Laufe der Zeit erhöhen das Ethanol in der Beschickung zu 50 g / L. Nehmen Sie erweiterte Populationen in Glycerin Aktien.
   HINWEIS: die niedrige Verdünnungsrate Aufrechterhaltung Bildung einer ausreichend hohen Zellkonzentration ermöglicht die Sauerstoffverfügbarkeit und Unterstützung Gärung zu reduzieren.
8. Wahlweise gelten ultraviolettem (UV) irradiatIon monatliche Dauerkulturen reinoculate verwendet Lager Populationen zu Glycerin.
   1. Resuspendieren Kolonien von Glycerolstammlösung Streifen in 10 ml ODM (wie in Vorkulturen) mit 60 g / l Xylose und bündeln alle Bestände in einem einzigen sterilen Kolben. Tragen Sie die gepoolten Zellsuspension bei ~ 5 x 10 ⁸ lebensfähige Zellen / ml nur die Böden von 4-5 Petrischalen mit 6 ml / Platte abzudecken. Zur Erzielung 6 ml Abdeckung einer Standard-Einweg-Petrischale, verzichtet werden 15 ml Oberflächenspannung zu überwinden, und entfernen Sie dann 9 ml.
   2. Expose jede offene Kulturplatte von der Lichtquelle in einem biologischen Sicherheitsschrank mit UV. Stellen Sie die UV-Belichtungszeit oder Entfernung die gewünschte Tötungsrate von> 90% zu erhalten. Hier aussetzen für 45 Minuten bei etwa 56 cm von der Quelle.
   3. Verdünnter Plattenzellsuspensionen vor und nach Bestrahlung. Estimate Tötungsrate auf koloniebildenden Einheiten basieren. Für die S. stipitis Beispiel war die Mortalitätsrate ~ 97%.
   4. Übertragung der UV-exponierten Kulturen (24-30 ml) bis zu einer folien covbei 25 ° C und 150 rpm auf ca. 1 x 10 ⁸ lebensfähigen S. Ered 50 ml - Kolben und Inkubieren für 24 h die kleiner Prozentsatz der lebensfähigen Zellen zu ermöglichen , wieder zu bevölkern stipitis / ml Zellen. Durch die Verhinderung Foto Reaktivierungen, die Folienabdeckung bewahrt Mutationen während Kulturen inkubiert werden.
   5. Verwenden Sie die repopulated mutagenisierten Kultur kontinuierliche Kulturen ~ 1 x 10 ⁷ lebensfähige Zellen / ml zu impfen. Starten Sie den Ethanol angereicherte ODM + 60 g / l Xylose Mittelzuführung, den Auswahlprozess fortzusetzen.

6. Werten Glycerolstammlösung Populations und identifizieren Diejenigen mit verbesserter Xylose Fermentation in Gegenwart von Ethanol

1. Streak ausgewählt Glycerinstammkulturen auf YM-Agar als ersten Schritt in dem Bildschirm für die beste Wachstum und die Fermentation von Xylose in Gegenwart von Ethanol.
2. Bringen Sie jede entwickelte Bevölkerung werden von Agar-Streifen zu 75 ml Vorkulturen in ODM mit 150 g / l Glukose gesiebt und brüten 96 in 125 ml-Flaschenh vor der Verwendung als Inokula für Testkulturen. Die großen Glucose gewachsenen Populationen Induktion von Enzymen für Xyloseverwertung erfordern.
   1. Um Induktion zu testen, jede Kultur ernten, zu suspendieren Zellen zu 30 ml, Initiale A ₆₂₀ von 40 in ODM 60 g / l Xylose + 30-45 g / l Ethanol und Inkubation bei 25 ° C, 150 Umdrehungen pro Minute (1 "Orbit) in 50 ml Flaschen mit Silikonschwamm Verschlüsse. zeichnen Proben zweimal täglich zur Überwachung von Xylose-Aufnahme durch HPLC-Analyse.
3. Alternativ kann , wie in Slininger et al., ¹⁸ Wachstum auf Xylose in Gegenwart von Ethanol zu bewerten, die durch das Schleifen Transfer auf 75 ml ODM mit 150 g / L Xylose in 125 ml - Kolben Vorkulturen jeder entwickelten Population herzustellen, und Inkubieren 96 h bei 25 ° C, 150 rpm (1 "Umlaufbahn). Testkulturen auf einen niedrigen Anfangs A ₆₂₀ von 0,1 in 25 ml ODM + 60 g / L Xylose + 30-45 g / L Ethanol in 125 ml - Kolben beimpft. Inkubiere Kolben bei 25 ° C, 300 Upm, 1 "Umlaufbahn und Probe.

1. Basierend auf den Ergebnissen von Schritt 6, wählen Populationen Glycerolstammlösung zeigt überlegene Fähigkeit Xylose in Gegenwart von Ethanol zu wachsen und fermentieren. Verwenden Sie diese Streifen Platten. Die Streifen Platten verwendet werden , um dichte, gepufferte Zellsuspensionen von A ₆₂₀ = 5. Dann Zellsuspensionen verwendet werden , bereiten Vorkulturen in 96-Well - Platten tief zu A ₆₂₀ = 0,5 bis impfen. Impfen 1 ml Vorkulturen auf PSGHL 1: 1 gemischt mit ODM + 50 g / l Xylose (kein Ethanol). Inkubieren Vorkulturen in 96-well, Deep Well Platten mit belüfteter niedrige Verdampfungsabdeckungen für 48 Stunden bei 25 ° C, 400 Umdrehungen pro Minute, 1 "Orbit. Separate verschiedenen Glycerolstammlösung Populationen durch leere Brunnen.
2. Unter Verwendung jedes Vorkultur impfen sechzehn 1 - ml - Kulturen replizieren A bis initial ₆₂₀ ~ 0,5 in 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / l Xylose mit 20, 30 oder 40 g / l Ethanol zu tolerant Kolonisten bereichern. Inkubieren Bereicherung cultures ähnlich Vorkulturen.
3. Für jede unterschiedliche Glycerolstammlösung, ernten die Kulturvertiefungen mit höchsten Ethanolkonzentration, um ein Wachstum und Xylose Verwendung. Platte jede Zelllinie zu YM Agar zu weit verbreitet einzelne Kolonien erhalten in Glycerin zu erhalten. Wählen Sie zehn Kolonien pro Zelllinie und Streifen jeweils auf einer YM-Agar-Platte für Glycerin Stoffaufbereitung.

Bereichern 8. Weitere Robust Evolved Dehnungen während der seriellen Übertragung auf PSGHL, wie für AFEX CSH

1. Bereiten Vorkulturen von NRRL Y-7124 (parent), AFEX CSH-tolerant entwickelt isolieren und kontinuierlicher Kultur entwickelt Population mit verbesserten Fähigkeit Xylose in Gegenwart von Ethanol zu verwenden. Impfen 75 ml ODM + 150 g / L Xylose durch Schleife aus Streifen Glycerolstammlösung wie oben (Schritt 2.1) für die AFEX CSH-Hydrolysat Anpassungsprozess beschrieben.
2. Verdünnte PSGHL mit Wasser eine Reihe von ansteigenden Konzentrationen bereitzustellen. Bereiten Sie eine 96-Well-Mikroplatte für jeden der drei Zelllinien von jedem unter VerwendungPSGHL Verdünnung 8 Vertiefungen mit 50 & mgr; l zu füllen. Verwenden Sie Vorkultur je 50 & mgr; l Mikrokultur der Verdünnungsreihe zu impfen A ₆₂₀ ~ 0,1-0,5 zu paraphieren.
   1. Weiterhin die Entwicklung der Hefe in Stärken PSGHL Erhöhung des gleichen Verfahrens wie das AFEX CSH Hydrolysat Anpassung unter Verwendung der oben detailliert (Schritt 2) bis zu Kulturen der Lage sind , in der vollen Stärke - Hydrolysat zu wachsen auf einem stabilen 14-d durchschnittliche Verhältnis von & Dgr; A ₆₂₀ pro Δtime als serielle Übertragungen werden weitere vier Monate fortgesetzt.

9. Isolieren Einzelzellkolonien Mit PSGHL Gradients mit oder ohne Ethanol Herausforderung

1. Erhalten Einzelzelle direkt aus voller Kraft PSGHL endgültige Anpassung Platten durch Verdünnungsausstrichtechnik auf YM-Agar isoliert. Wählen Sie zehn große Kolonien für jede der drei Zelllinien und Bar Streifen zu YM-Platten Glycerinstamm herzustellen, wie zuvor beschrieben (Schritt 3.2).
2. Optional früheren Zeitpunkten in der erkundenEvolutionsprozess von aus gespeicherten Glycerin Bestände der drei Zelllinien zu isolieren.
   1. Impfen eine Vorkultur für jede Zelllinie durch die Schleife von Glycerolstammlösung Streifen und Inkubation 24 Stunden auf 30 ml ODM + 50 g / l Xylose (50 ml Fläschchen, 25 ° C, 150 Umdrehungen pro Minute).
   2. Challenge - Zellen von Vorkulturen auf Wachstum in Hydrolysat von 50 ul 50% PSGHL in Mikrotitervertiefungen Inokulation auf einen Anfangs A ₆₂₀ ~ 0,2 und statisch 48 Stunden inkubiert.
   3. Verteilt 0,1 ml jeder angereicherten Kultur auf PSGHL Gradienten-Agar-Platten im Bereich von 0 bis 50% ige Hydrolysat (Abgabe ~ 300-400 lebende Zellen pro Platte), und wählen Sie 10 einzelne Kolonien pro Zelllinie aus dem höchstmöglichen Hydrolysat Konzentrationsbereich des Gradienten ^21. Streak nahm Kolonien auf YM für Glycerin Stoffaufbereitung , wie in Schritt 3.2.
   4. Als Alternative 9.2.3 zu Schritt, anstatt die Gradienten - Agar - Platten von Impfen, impfen Wells von 96-Well - Mikroplatten A ₆₂₀ ~ 0,2 bis paraphieren, where die Vertiefungen werden entworfen, um eine Reihe von Hydrolysat Konzentrationen von 50 bis 100% ige und Ethanol 10-40 g / L enthält. In diesem Fall werden Mikroplatten 72-96 hr entwickeln und ansonsten wie in Schritt 2.3. Isolieren zehn einzelne Kolonien aus Brunnen der härtesten Hydrolysat-Ethanol-Kombinationen zeigt das Wachstum über Verdünnungsausstrichtechnik und bereiten Glycerin Bestände wie in Schritt 3.2.

10. In einem primären Screen, beseitigen Inferior Isolaten von Performances auf PSGHL an zwei Nährstoffbedingungen Vergleich und Bewertung

1. Tragen Sie einen hohen Durchsatz Deep - Well - Platte Bildschirm PSGHL Leistung Bildschirm fünf Sätze von dreißig Isolate zusammen mit NRRL Y-7124 Eltern und AFEX CSH-tolerante Isolat (analog zu Colony 5 der Abbildung 1 Evolution Beispiel) als Kontrollen sechs Top - Stämme zu wählen (20%) von jedem Satz an den sekundären Screening-Ebene passieren (Schritt 12).
2. Führen Sie den Bildschirm in Deep Well Platten gefüllt 1 ml pro Vertiefung und bedeckt with Edelstahldeckel mit schwarzem Silikon niedrigen Verdampfungs Dichtungen. Klemmen Sie alle Platten in den Vorstand des Inkubators / Schüttler und den Betrieb bei 25 ° C und 400 Umdrehungen pro Minute (1 "Schüttler Orbit). Entwurf alle tief Well-Platte und Füllmustern Trennung von verschiedenen Isolaten von offenen Brunnen zu ermöglichen.
3. Beginnen Kultivierungen, einen Wulst von Zellen aus Glycerin Streifen aufzunehmen, hergestellt aus 30 Isolaten erhalten wie oben beschrieben (in den Schritten 3, 7 und 9) zu duplizieren Vertiefungen ODM + 50 g / l Xylose und 48 Stunden inkubieren.
4. Als Herausforderung Medium Isolate für Vorkultur, bereiten 50% PSGHL durch PSGHL 1 Mischen: 1 mit ODM + 10 g / l Glukose + 50 g / l Xylose. Bei Screening-30-Isolate und zwei Kontrollstämme, 2 Platten mit 2 Vertiefungen pro jeweils 16 Isolate gefüllt sind, leere Brunnen zwischen den verschiedenen Isolaten zu verlassen.
5. Für Herausforderung Kulturen, zu übertragen, ein 50 & mgr; l Volumen von ODM Vorkulturen (A ₆₂₀ ~ 10) zu jedem der zwei 50% PSGHL Herausforderung Kulturvertiefungen für jedes der Isolate und steuert einen initi zu erhaltenal A ₆₂₀ ~ 0,5 und 72 Stunden inkubiert.
6. Verwenden Sie zwei Testmedien unterschiedlicher Ernährungs Reichtum für das Screening-Isolaten: 60% PSGHL + ODM Nährstoffe; und 75% PSGHL + ODM + YM Nährstoffe. ODM Nährstoffe (ohne Zucker) bei der Hälfte der Stärke als Standard für die ODM mit 50 g verwenden / L Zucker (Schritt 1.3). YM Nährstoffe (ohne Zucker) bei der Hälfte der Standardstärke von 3 g / l Hefeextrakt, 3 g / l Malzextrakt, 5 g / l Pepton Wie bezeichnet, hinzuzufügen.
7. Impfen Testkulturen um 50 & mgr; l von 72 Stunden 50% PSGHL Herausforderung Vorkulturen Übertragung von 1.000 & mgr; l zu impfen A ₆₂₀ ~ 0.5 in fünf Tiefbrunnen für jeden von zwei Testmedien zu paraphieren.
8. Probieren Sie jeder täglich zu isolieren. Pipettieren den Inhalt eines gut auf einem Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiere (5533 xg, 15 min) zu erhalten Überstand für Ethanol, Glucose und Xylose-Hochdurchsatzanalysen. Messung der Biomasse als ₆₂₀ in 96-Well - Mikroplatten (200 ul / Vertiefung) mit einem Spektralphotometer.
9. Innerhalb jeder Satz von 30olates getestet (5 Sätze für S. stipitis NRRL Y-7124 - Stämme entwickelt), die relative Performance - Indizes berechnen (RPI) als 11 unten in Schritt beschrieben und verwenden , um jeden Stamm Rang basierend auf Ethanolausbeute (maximal Ethanol pro anfänglichen Zucker akkumulierten geliefert) und Xylose-Aufnahmerate (Xylosekonzentration pro anfänglichen 96 Stunden verbraucht) an beiden Testmedien.

11. Rang Trennt im primären PSGHL Bildschirm mit Relative Performance Index (RPI)

1. Im Anschluss an das primäre Screening berechnen dimensionslose relative Performance Indizes (RPI), um die 30 - Isolate in jedem der fünf verschiedenen Experimenten auf Rang zu Bildschirm auf PSGHL Isolate mit zwei unterschiedlichen Nährstoffformulierungen pro Experiment, das heißt, 60% und 75% PSGHL PSGHL.
2. Berechnen Sie die statistischen Parameter F für den Einsatz in Ranking - Isolat Leistung innerhalb einer Gruppe von Isolaten in einem bestimmten Experiment getestet: F = (XX _avg) / s. Hier X ist die Leistungsparameter, wie zum Beispiel Ausbeute (Y)oder die Rate (R), für jedes einzelne Isolat beobachtet, während X _avg und s der Mittelwert und die Standardabweichung sind jeweils von X beobachtet für alle in einem gegebenen Experiment isoliert. Für Normalverteilungen, -2 <F <2.
3. Für jede in einem Experiment zu isolieren, auf Preis kann jetzt höher die relative Performance berechnen, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, und in ähnlicher Weise die relative Performance auf Ertrag, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 Basis berechnen . Der Wert des RPI liegt im Bereich von ~ 0 bis 100 Perzentil (steigend). Berechnen Dann RPI Mittelwerte für jede in einem gegebenen Hydrolysat Experiment isolieren wie folgt: RPI _avg = (RPI _Y + RPI _R) / 2, wobei Ausbeute und Rate Beiträge gleicher Gewichtung in dieser Anmeldung angegeben sind.
   Beachten Sie, dass im Allgemeinen, die Ausbeute und Rate-Parameter können gewichtet werden, wenn ungleiche Bedeutung angesehen.
4. Berechnen Sie RPI _insgesamt über die n Arten von Hydrolysaten getestet: RPI _Gesamt i = 1, n [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Betrachten Sie jedes Isolat in einer experimentellen Gruppe von 30 Isolaten und 2 Kontrollen. Während primären Ranking der ~ 150 Einzelkolonie - Isolate angepasst zu Xylose-reiche PSGHL, die RPI _insgesamt für Preise und Renditen in den beiden PSGHL Formulierungen in das Sieb aufgebracht berechnet wird, dh 60% PSGHL und 75% PSGHL, wobei n = 2.
5. Basierend auf RPI _insgesamt in jedem Experiment, wählen Sie den oberen Anteil der Isolate auf dem sekundären Bildschirm zu übergeben. In diesem Beispiel werden die oberen 20% der Stämme ausgewählt , um durch (dh 30 von 150 getestet).

12. In einem zweiten Bildschirm, Vergleichen Sie Top primären Screen Darsteller auf mehrere komplette Hydrolysate (> 100 g / l Misch Sugars) Höchste Funktionierende Robust Stämme zu Reveal

1. Vergleichen Sie Top PSGHL Darstellern auf 6% Glucan AFEX CSH und SGH geändert mit zwei Ebenen von Stickstoff, SGH-N1 und SGH-N2 (Zusammensetzungs , wie in Tabelle 1) für die endgültige Platzierung. Bildschirm , um die 30 - Isolate , die die Top - Performer in der primären Deepwellplatte Bildschirm von PSGHL waren (Schritte 10 und 11) und die beiden Kontrollen (Elternstamm NRRL Y-7124 und AFEX CSH-tolerante Isolat (analog zu Colony 5, Abbildung 1 Beispiel ).
2. Beginnen Kultivierungen durch einen Wulst von Zellen aus Glycerin Streifen picking Tiefbrunnen von 1 ml ODM + 50 g / L Xylose zu duplizieren, wie zuvor und inkubiere 48 Stunden in dem tiefen Well-Platte-System (Schritt 10.2). Dann Transfer 50 ul ODM Vorkulturen auf 50% SGH Herausforderung Kulturen, und Inkubation für 72 Stunden in der tiefen Well - Platte - System A ₆₂₀ bei ~ 10) zu erhalten. Bereiten Sie die 50% SGH durch SGH 1 Mischen: 1 mit sugarless ODM + 50 g / l Xylose (pH 5,6).
3. Für jedes der Isolate, ein 16 ml Aliquot von SGH-N1 oder SGH-N2 mit dem Zellpellet (15 min, 2.711 x g) von drei Vertiefungen Belastungskultur inokulieren anfänglichen Testkultur A ₆₂₀ ~ 2,0 zu ergeben. Inkubieren Testkulturen bei 25 & #176;. C, 180 Umdrehungen pro Minute (1 "Orbit) in 25 ml Flaschen mit Silikonschwamm Verschlüsse Probenflaschen täglich und zu analysieren, pro der PSGHL Bildschirm.
4. Ebenso Bildschirm isoliert wie in den Schritten 12.2 und 12.3, aber diesmal Ersatz SGH-N1 und SGH-N2 mit 6% Glucan AFEX CSH bei pH 5,2 für den Einsatz in der Herausforderung, Kulturmedium und Testkulturmedium vorbereitet. Für die 50% Kulturen Stärke Herausforderung, verwenden Sie 6% AFEX CSH 1: 1 verdünnt mit Wasser, da sie Stickstoff ausreichend ohne Änderung ist.
5. Wiederholen Sie die Schritte 12,1-12,4 Ergebnisse zu duplizieren.

13. Rang die Performances von Isolaten in dem zweiten Bildschirm Mit RPI _insgesamt zu bewerten Verwendung mehrerer komplette Hydrolysate

1. Berechnen Sie die relative Performance Indizes (RPI), um jede der oberen 20% der Isolate auf Rang (~ 30 von 150) aus dem primären Bildschirm, der in dem zweiten Bildschirm auf Enzym getestet wurden verzuckerte Hydrolysat Formulierungen von Nahrungsreichtum variieren.
2. Ergebnis jeIsolat, welches in dem zweiten Bildschirm auf Basis von Xylose-Aufnahmerate und die Ethanolausbeute durchgeführt auf drei Enzym-verzuckert vorbehandelte Hydrolysat Formulierungen laufen in zweifacher Ausfertigung, einschließlich AFEX CSH (i = 1 und 2), SGH-N1 (i = 3 und 4) und SGH getestet -N2 (i = 5 und 6).
3. Berechnen Sie _insgesamt die RPI für jedes Isolat, und wenden Sie diese Ranking - Parameter , um die Liste der überlegenen Isolate winnow: RPI _Gesamt = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n, wobei n = 6 .
   HINWEIS: Demonstrieren Kinetik von höchster Isolate in SGH-N2 Hydrolysate in Kolbenkulturen durch Befolgen der Verfahren in Slininger et al ^18.

Representative Results

S. stipitis wurde mit Kombinationen von drei Auswahlkulturen entwickelt, die AFEX CSH enthalten, PSGHL und Ethanol-herausgefordert Xylose-fed kontinuierlichen Kultur. Figur 1 zeigt die schematische Darstellung der zusammen mit den Isolaten durchgeführt Evolutionsexperimenten gefunden entweder am effektivsten durchzuführen insgesamt oder am effektivsten auf einen der getesteten Hydrolysate. Tabelle 3 zeigt die NRRL - Zugangsnummern dieser superior Isolate und fasst die Anpassung in dem Prozess angewandt Spannungen der angereicherten Population Erzielung von denen jeder Stamm isoliert. Einige Isolate wurden gesehen auf ein oder zwei Hydrolysat Typen überlegen relative Performance zu haben, aber 7 von 11 Isolaten eine gute Leistung auf allen der Hydrolysat-Typen, obwohl die meisten von ihnen ausgesetzt waren und durch nur eine einzige Art im Laufe der Evolution in Frage gestellt. Die Erfolge der verschiedenen Evolutionsansätze hier sind in den 2 gezeigt genommen -7 und Tabelle 4.

Abbildung 2 zeigt die deutliche Verbesserungen nach der ersten Phase der Anpassung zu sehen , in denen robuste Derivate der Stamm NRRL Y-7124 wurden bei der seriellen Übertragung angereichert Konzentrationen von AFEX CSH (Schritt 2) zu erhöhen. In Kulturen, die auf 6% Glucan AFEX CSH wächst, zeigt die weiterentwickelte Bevölkerung schneller Akkumulation und höheren Schluss Titern von Ethanol als der Elternstamm. Schnellere Glukoseverwertung wird auch zusammen mit einer schnelleren Xylose Aufnahme unmittelbar nach der Erschöpfung der Glukose gesehen. Zusätzlich ist in Figur 3 kennzeichnet die Stabilität des veränderten Bevölkerung in dem synthetischen Medium ODM mit einer Mischung aus 87 g / l Glucose und 66 g / L Xylose nachgewiesen. In diesem Fall sind sowohl die angereicherte Population (3B) und isolierte Kolonien (Colony 1 und Colony 5, 3C und 3D, respectively) können die Elternstamm zu übertreffen, indem die Xylose effizienter unter Verwendung von Ethanol schneller zu machen, Zeit reduziert wird Ethanol durch mindestens 4 Tage zu Spitze. Deutlich höhere Ethanolkonzentrationen wurden durch entwickelte Stämme auf ODM (55-60 g / L) akkumuliert im Vergleich zum Mutter (40-45 g / L). Die Mutationen, die bei der Glucose-Xylose Übergang und effizienter Xylose Fermentation auf einen stabilen Phänotyp reduzierten diauxy führte, ergab sich als die Hefepopulation in AFEX CSH entwickelt.

Weitere Verbesserungen Colony 5 wurden durch Vorlage bei der natürlichen Selektion in Xylose-fed kontinuierliche Kultur in Gegenwart von Niveaus von Ethanol verfolgten bis zu 50 g / l erhöht wird. Unter dieser Bedingung muss der Hefepopulation in der kontinuierlichen Kultur gehalten werden können Enzyme Xylose Verwendung als einzige Kohlenstoffquelle zu induzieren, um es der Lage sein, mit einer Rate die Gärtank trotz einer stetigen Verdünnungs aufzufüllen hoch genug zu wachsen,Preis. In dem Elternstamm beginnt die Induktion von Xylose in Ethanol Enzyme Konzentrationen so niedrig wie 15-20 g / L inhibiert wird. ⁸ Derivatives of Colony 5 wurden bei frühen in Glycerinstammkulturen gewonnen und späten Zeitpunkten des Betriebs der kontinuierlichen Kultur, und Figur 4 zeigt die erfolgreiche Verbesserung in Xyloseverwertung in Gegenwart von 40 g / L Ethanol in entwickelt Derivate der Colony beobachtet 5 im Vergleich mit der NRRL Y-7124 Elternteil und der Anfangs Colony 5 mit dem Verfahren geimpft.

Isolaten die sich aus allen Phasen des Anpassungsschema der Figur 1 wurden in PSGHL gescreent diejenigen mit überlegener Fähigkeit zur Identifizierung Xylose zu fermentieren (Schritt 10.1). Die Isolate in 5 gezeigten gehören zu den besten Interpreten auf PSGHL aus ~ 150 in diesem primären Bildschirm gewählt und in allen sekundären Bildschirmen der Leistung , wie unten beschrieben. Zur Verbesserung des entwickelten Isolate zeigenrelativ zu der Eltern wurde die Leistung jedes Isolat als das Verhältnis der kinetischen Parameter-Werte des Isolats zu Elternstamm exprimiert. Ratio - Werte von "Eins" vor , wenn das Isolat Leistung an die Mutter entsprach. 5a und 5b zusammenfassen Spitzenleistungen auf 60% und 75% Stärken von PSGHL mit ODM oder ODM + YM Nahrungsergänzungsmittel zu isolieren. Da das Hydrolysat Konzentration und Härte erhöht wurde, verringerte sich die Leistungsverhältnisse. In der 60% igen PSGHL, fünf von sieben Top-Isolate zu PSGHL Selektionsdruck durchgeführt oft besser als-7124 Y NRRL ausgesetzt (Isolat 1). Vier Isolate besser als Colony 5 (Isolat 33), die während der Belichtung mit AFEX CSH entwickelt hatte, hatte aber keine vorherige selektive Exposition gegen PSGHL. Doch in der 75% igen von PSGHL, nur 3-Isolate sowohl die Eltern und Colony 5 deutlich übertroffen (Isolat 33) trotz der zugesetzten Nährstoffe. Von diesen überlegen Isolate 15 und 16 waren previously herausgefordert mit der Evolution Führungs Konzentrationen von PSGHL als Selektionsdruck erhöht wird. Isolaten 15, 14 und 3 wurden nur PSGHL ausgesetzt, während 11, 13 und 16 Mehrfachbelichtungen haben. Isolaten 3, 11, und 13 wurden von den früheren Zeitpunkten während der Entwicklung auf PSGHL und so hatte etwas weniger Gelegenheit Toleranz zu entwickeln , im Vergleich zu 14, 15 und 16. Während es offensichtlich ist in Abbildung 5 die serielle Übertragung zur Erhöhung der Festigkeiten von PSGHL diente Stämme robust seiner inhibitorischen Umgebung zu entwickeln, ist es auch klar, dass die Exposition des Mutterstammes NRRL Y-7124 zu AFEX CSH allein potentiell Isolate wie Colony 5 (33) mit Kreuztoleranz PSGHL erzeugen könnte. Somit wurde angedeutet, dass robuste Stämme können in mehreren Hydrolysaten ausführen könnte durch Anreicherung von Toleranz in einem Hydrolysat, das durch Leistungs Screening in einer anderen gefolgt finden. Isolaten erhalten aus der Xylose-fed kontinuierlichen Kultur wurden auch auf PSGHL gescreent 60% und 75% Stärke mitNährstoffe und auch hinzugefügt Glucose bei 75 g / L, um das Ethanol Herausforderung und testen diauxischen Verzögerung auf Xylose folgenden Glukoseverwertung zu erhalten. Während Isolaten 27, 28 und 30 zu anderen aus dieser Phasenanpassungs überlegen waren, sowohl Ausbeute als auch Xylose Leistungsaufnahmerate Verhältnisse waren auf 75% PSGHL dem Mutter ähnlich mit zugesetztem ODM und YM Nährstoffe, die, daß keine nicht unbedingt überraschend, hatten vorherige Exposition gegenüber diesem Hydrolysat (siehe auch Slininger et al. ¹⁸ für zusätzliche Daten hier nicht für die Kulturen gezeigt bereitgestellt 75 g / L Glucose).

Die besten Stämme aus dem primären Bildschirm auf Xylose-reiche PSGHL ausgewählt wurden anschließend auf drei kompletten Hydrolysate gescreent. Diese Hydrolysate (Tabelle 1) enthalten AFEX CSH und verdünnter Säure vorbehandelt SG behandelt mit kommerziellen Cellulasen und ergänzt auf zwei verschiedenen Stickstoffwerte (SGH-N1 und SGH-N2) das vielseitigste iso zu identifizierenlates in Bezug auf Variationen in Inhibitor und Ernährungsumwelt. Die relative Performance Indizes (RPI) wurden für die Fermentation von jeweils innerhalb jedes Hydrolysat (6A) zu isolieren berechnet. 6B zeigt die kombinierten Gesamtleistungsindizes für jeden berechnet isolieren. Fünf Isolate (3, 14, 27, 28, 33) hatte insgesamt RPI über 60, die sie als die robusteste, um alle der Variationen von Hydrolysat und Nährstoffbedingungen kombiniert klassifiziert. Überprüfung der Tabelle 3 Isolate sowohl 3 und 14 wurden in PSGHL entwickelt , während 27, 28 und 33 wurden in AFEX CSH oder AFEX CSH und Ethanol-herausgefordert kontinuierlichen Kultur auf Xylose entwickelt. Keiner der überlegen mehrere Hydrolysat Verwendung ausstellenden Stämme wurden auf mehr als einem Hydrolysat entwickelt.

Einige Stämme waren "Spezialisten" eine bessere Leistung auf entweder SGH-N1 / 2 oder AFEX CSH. Diese Isolate am besten als Spezialisten auf SGH DurchführungHydrolysate (11, 16 und 9) wurden durch die Evolution auf PSGHL als letzte oder einzige Herausforderung erhalten. Für Isolate 11 und 16, die AFEX CSH Herausforderung durch zunehmende zunächst angereichert wurden, die Fähigkeit, aktiv, um effizient AFEX CSH nutzen nicht während der langen endgültige Anreicherung in PSGHL ausgewählt, und die wichtigsten genetischen Faktoren, die seine Verwendung Unterstützung waren offenbar verloren. Im Gegensatz dazu Isolaten 14, 25, 27, 30 und 33 Superior-Performer auf AFEX CSH waren, und alle außer Isolat 14 wurden auf AFEX CSH entwickelte sich mit oder ohne Ethanol Herausforderung. So wie erwartet, gerichtete Evolution auf AFEX CSH oder PSGHL eher für Hefe zu wählen und auf die Auswahl-Hydrolysat angepasst. Die einzige Ausnahme in dieser Hinsicht war Isolat 14. 14 Isolate aus dem PSGHL entstand nur herausfordern und wurde von YM Agar Verdünnungsausstrichtechnik der endgültigen PSGHL Anreicherungskultur isoliert. Slininger et al. ¹⁸ zeigte , daß dieses Isolat überlegene Leistungsvermögen Induktion Xylose Enzym in Zellen Glukose-grown zu haben , in Gegenwart von5-15 g / l Essigsäure und reduziert diauxischen Verzögerung auf ODM mit 75 g / L jeder von Glucose und Xylose, trotz> 30 g / L Ethanol vor der Glucose-Xylose Übergangspunkt auftritt.

Die überlegenen Kinetik der entwickelten Stämme gegenüber dem Elternstamm S. stipitis NRRL Y-7124 wurden wie in Tabelle 4 gezeigt , demonstriert, die die Ergebnisse der geringen Kulturen Belüftungskolben inokuliert A ₆₂₀ 8,4 ± 2,5 75 ml SGH-N2 zurück (pH 6,2) inkubiert in 125 ml - Kolben mit Silikonschwamm caps bei 25 ° C, 150 rpm (1 "Umlaufbahn) und in Figur 7 darstellt moderate Kulturen Belüftungskolben A ₆₂₀ 0,5 in 23 ml SGH-N2 pro 50 ml - Kolben zu initial inokuliert. ¹⁸ Diese Bedingungen repräsentieren zwei unterschiedliche Betriebsarten durch die vorgeschlagene Literatur wie von S. stipitis potenziell kommerziell vielversprechend für die Ethanolproduktion zu sein. ^8,22 In den Tannent Instanz von niedrigem Niveau Belüftung, die hohe Zelldichte sorgt für eine schnelle Gärung sofort zu beginnen. Während in der zweiten Instanz, die geringe Zelldichte und eine höhere Ebene Belüftung führen zu logarithmischen Wachstum der Bevölkerung aufzubauen und das Wachstum assoziierten Zucker Umwandlung in Ethanol zu beschleunigen. Diese Daten zeigen , dass die entwickelten Stämme haben erhebliche kinetische Vorteile gegenüber dem Elternstamm: schnellere Glukose - Aufnahmerate (Tabelle 4), eine schnellere spezifische Xylose - Aufnahmerate (Tabelle 4), eine schnellere Ethanolproduktivität sowohl Glucose als auch Xylose und insgesamt (Tabelle 4), kürzere Verzögerung vorhergehenden Wachstum (Figur 7), und kürzere diauxischen Glucose Xylose Übergangsverzögerung. Diese Verbesserungen erlaubt Ethanol über 40 g / L zu akkumulieren und Tage zu Peak früher (Abbildung 7) , als man für die NRRL Y-7124 Mutter gesehen. Höhere Gesamtethanolproduktivität (Tabelle 4) wurde bei 1,5 bis 5 Mal erreichts , dass der Elternstamm (Tabelle 4), auf entwickeltem Belastung abhängig.

Abb . 1: Scheffersomyces stipitis Anpassung Flussdiagramm Das Diagramm zeigt an , die Reihenfolge der Spannungen während des Anpassungsprozesses und die Punkte der Rückgewinnung von überlegenen Isolate (Zahlen in Klammern) angewendet. Siehe auch Tabelle 3 Isolat Schlüssel als Referenz für die Stamm - Identitäten. Um Zeit Orientierung, die Zahlen in rot anzuzeigen, die Anzahl der Tage in jeder Phase der Anpassung bereitzustellen. Für die serielle Übertragung Phasen in AFEX CSH und Xylose-reiche PSGHL, jeden Tag der Anpassung entspricht etwa 2-4 Generationen. Für die kontinuierliche Kulturphase (205 Tage insgesamt), die Verdünnungsrate D war variabel bei ~ 0-0,1 h ^-1 bei 125 d Betrieb mit pH-betätigten Fütterung. Im nächsten80 Tage war Betrieb bei einem kontinuierlichen Fluss mit D bei 0,012 h ^-1, eine Generationszeit (ln 2) / (D) von 58 hr Bereitstellung oder 1 Erzeugung pro 2,4 d im stationären Zustand. Als nächstes wird eine Probe der Population angepasst aus der kontinuierlichen Kultur 205-Tage wurde mit UV - Licht und beimpft mit einer kontinuierlichen Kultur betrieben mit D bei 0,012 h ^-1 mutagenisiert. (Übernommen aus Slininger et al. ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig . 2: Improved batch Fermentation von 6% Glucan AFEX CSH Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 Elternstamm Fermentation von 6% Glucan AFEX CSH (A) verglichen wird mit Colony 5 Fermentation von 6% Glucan AFEX vorbehandelten Maisstroh h angepaßtydrolyzate (B). Symbole bezeichnen Biomasse (rotes Quadrat), Glucose (schwarzer Kreis mit gestrichelte Linie), Xylose (blauer Kreis mit durchgezogene Linie), Ethanol (grünes Dreieck) und Xylit (lila Diamant). (Übernommen aus Slininger et al. ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Reduzierte diauxischen Verzögerung in definiertem Medium mit gemischten Zuckern Fermentation Leistungen verglichen werden in ODM mit 66 g / l Glucose und 87 g / L Xylose für Elternstamm S.. stipitis NRRL Y-7124 (A), angepasst , die AFEX CSH Bevölkerung abgeleitet von Y-7124 (B), einzelne Zelle Colony 1 getrennt von dem adaptierten S. stipitis Bevölkerung (C), einzelne Zelle Colony 5 getrennt von der angepassten Population (D). Symbole bezeichnen Biomasse (rotes Quadrat), Glucose (schwarzer Kreis mit gestrichelte Linie), Xylose (blauer Kreis mit durchgezogene Linie), Ethanol (grünes Dreieck), Xylit (lila Diamanten) und Adonit (Gold Diamant mit schwarzem Rand). (Übernommen aus Slininger et al. ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Ethanol beständige Derivate der Colony 5. Hydrolysat tolerant Colony 5 wurde durch kontinuierliche Kultur Selektion auf ODM entwickelt enthält Xylose als einzige Kohlenstoffquelle und ein hohes Maß an Ethanol. Zwei Derivat Glycerolstammlösung Populationen erhalten zu Beginn des Auswahlprozesses (2A.1.53R, orange Dreieck und gestrichelte Linie) und einfter UV-Bestrahlung von einer kontinuierlichen Kultur Inokula (2A.1.30R.2, lila Kreis und gestrichelte Linie) im Vergleich mit der NRRL Y-7124 Elternstamm (grüner Kreis mit durchgezogene Linie) und AFEX CSH tolerant Colony 5 (schwarzes Dreieck gezeigt mit durchgezogene Linie). Xylose Aufnahme von dichten Populationen von Glucose gewachsenen Hefe (A ₆₂₀ = 50) in ODM mit 40 g / L Ethanol zeigte an, daß alle Stämme , die angepasst unadapted Mutter in der Fähigkeit übertreffen Xylose - Metabolismus zu induzieren. (Übernommen aus Slininger et al. ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5:. Verhältnis von Performance - Verbesserung von toleranten Isolats im Vergleich zu Eltern Die Leistungen von höchster tolerante Isolate werden zusammengefasst in Bezug aufdie Steuerelternstamm NRRL Y-7124 für jede Formulierung PSGHL (A, B). Performances wurden in Bezug auf die Xylose-Aufnahmerate (blaue Balken repräsentieren Verhältnisse von Isolat zu Eltern) und Ethanolausbeute pro Zucker geliefert (grüne Balken repräsentieren Verhältnisse von Isolat zu Eltern) bewertet. (Übernommen aus Slininger et al. ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6: Isolieren basierend auf RPI - Ranking. Die relative Performance Index (RPI) Konzept wurde auf die Leistungsergebnisse des sekundären Bildschirm angelegt, um 33 auf Rang isoliert in jedem Hydrolysat Typ auf Basis von Xylose-Aufnahmerate und Ethanolausbeute pro Zucker geliefert. (A) Die relative RANKönig von einem bestimmten Isolats hing von dem Hydrolysat-Typ (P <0,001): SGH-N1 (blaue Balken), SGH-N2 (rote Balken) und AFEX CSH (grüne Balken). (B) Die Gesamt RPI in allen Hydrolysat Arten berechnet (hellblaue Balken) angegeben überlegen Stämme mit den meisten robuste Performance in verschiedenen Hydrolysat Bedingungen. (Übernommen aus Slininger et al. ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7: Vergleichs SGH Gärungen von höchster angepasst Isolate von S. stipitis. Überlegene angepasst Isolate und ihre Elternstamm NRRL Y-7124 verglichen Fermentieren enzymatische Hydrolysate von verdünnter Säure vorbehandelten Rutenhirse (20% Feststoffbeladung) bei 25 ° C und der Anfangs pH 6,2 bei niedrigen anfänglichen Zelldichte. Zeitverläufe von Biomasse (rote Quadrate), Glukose (schwarze Kreise und gestrichelte Linie), Xylose (blaue Kreise und durchgezogene Linie) und Ethanol (grüne Dreiecke) gezeigt. Fehlerbalken stellen den Bereich um den Mittelwert von Symbolen gekennzeichnet. (Übernommen aus Slininger et al. ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1:. Zusammensetzungen Hydrolysate in Züchtungen verwendet (. Übernommen aus Slininger et al ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um diese Tabelle zu laden.

Tabelle 2: Optimal definierte Medium für Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 ⁷tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> Bitte hier klicken, um diese Tabelle zum Download bereit.

Tabelle 3:. Zusammenfassung der überlegenen tolerant Scheffersomyces stipitis Stämme für die Vergärung von Hydrolysaten pflanzlicher Biomasse (. Übernommen aus Slininger et al ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um diese Tabelle zu laden.

Tabelle 4: Vergleichende Kinetik von Isolaten auf Switchgrass- Hydrolysat SGH-N2 beimpft A ₆₂₀ = 8,4 ± 2,5 bis anfänglichen Raten normalisierte Raten pro Einheit Absorption während Glukose oder Xylose Verbrauch.. (Übernommen aus Slininger et al. ¹⁸⁾ Bitte hier klicken , um diese ta zum Downloadble.

Discussion

Wurden mehrere Schritte für den Erfolg des Evolutionsprozesses entscheidend. Erstens ist es Schlüssel geeigneten Selektionsdruck zu wählen, die Bevölkerung Entwicklung hin zu der gewünschten Phänotypen zu fahren, die für die erfolgreiche Anwendung benötigt werden. Die folgenden punktuelle Belastungen wurden für S. gewählt stipitis Entwicklung und zu geeigneten Zeiten angewendet Bereicherung für die gewünschten Phänotypen zu führen: Erhöhung der Stärken von 12% Glucan AFEX CSH (das Wachstum und die Fermentation verschiedener Zucker in Gegenwart von Essigsäure Kräfte und geringe Mengen an Furan Aldehyde und andere Inhibitoren); Xylose kontinuierliche Kulturen mit steigender Ethanolkonzentration zugeführt (die Xylose Enzyminduktion zwingt diauxischen Verzögerung zu reduzieren); und Erhöhen Stärken von 20% Feststoffbeladung PSGHL (die Wachstumskräfte und die Fermentation von Xylose in Gegenwart von hohen Essigsäure, Furane und andere Inhibitoren). Zweitens ist es wichtig, auf die sich verändernden Hefepopulationen durch Einfrieren Glycerin s zu erhaltentocks der Bevölkerung Proben als die Anreicherungsprozess fortschreitet. Solche Schnappschüsse der Bevölkerung für die regelmäßige Funktionstests gespeichert werden Entwicklung Fortschritte zu dokumentieren und die anschließende Isolationen zu ermöglichen, wie gewünscht, oder Evolution Prozesse nach einer Pause neu zu starten. Ein dritter wichtiger Schritt in der Evolution Verfahren war zu außergewöhnlichen Isolate erholen durch Selektion Kulturpopulationen oder Glycerin sortierten Populationen auf einer bequemen selektiven Medien (wie Agar oder Mikroplatten mit einer Streßgradient präsentiert eine Reihe von Hydrolysat und / oder Ethanolkonzentrationen enthält) Anreicherung . Dann überlebenden Kolonien unter der am stärksten belastenden Zustand wachsen kann abgeholt werden später zur Charakterisierung zu erhalten. Diese drei Grundschritte können wiederholt werden, um jeden zusätzlichen gewünschten Phänotyp Selektionsdruck auszuüben, oder alternativ mehrere Drücke in einem einzigen Zyklus, wenn angemessen. Wenn die native Mutter Hefepopulation an die verschiedenen Belastungen ausgesetzt wird, ist die genetische Vielfalt erwartet th stammend raue natürliche oder induzierte Mutationen und fortgesetzter Belichtung wird die natürliche Selektion erlauben für die Personen mit den meisten vorteilhaften Mutationen Unterstützung wettbewerbsfähiger Überleben zu bereichern. Es wird erwartet, dass der ausgewählte Phänotyp als Folge von mehrfachen genetischen Mutationen auftreten. In dem Protokoll über können Mutationen während der UV-Behandlung oder möglicherweise während der Belichtung von Hefe zu Hydrolysate induziert werden. Hydrolysate sind bekannt drei Klassen von Verbindungen enthalten schädliche Mikroorganismen. Carbonsäuren, Aldehyde und Phenole ²² Reaktive Aldehyde wie Furfural und 5-Hydroxymethylfurfural, können die Zellen beschädigt werden und eine Höhe von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verursachen, erzeugt typischerweise in Mitochondrien. ROS sind gut bekannt , um DNA - Mutationen in eukaryotischen Zellen verursachen. ^23,24 Die vorliegende Phenole in Hydrolysaten, obwohl zuvor genotoxisch sein , nicht bekannt ist , kann die mutagenen Wirkungen von Aldehyden und mutagene ROS fördern und synergistisch. ²⁵

jove_content "> Die schrittweise Strategie schrittweise anspruchsvollen Umgebungen zu erwarten ist entwickelte Stämme mit einer Reihe von Phänotyp Verbesserungen bauen, sowohl gezielte und auch nicht ausgerichtet. Es ist möglich, dass bestimmte nicht gezielt Phänotypen entstehen können, die unerwünschte oder instabil sind. Um die am höchsten funktionierenden und robuste Stämme, ein zusätzlicher wichtiger Schritt, die ergriffen zu erfassen werden muss, ist ausgewählt Isolate für kommerziell relevante Merkmale zu bewerten und zu vergleichen, sowohl für gezielte und nicht gezielte Phänotypen zu erreichen. um dies zu tun, zu isolieren sollte auf Leistungen verglichen werden, eine Vielzahl von anwendungsorientierte Stressbedingungen, wie zum Beispiel in Hydrolysaten mit verschiedenen Inhibitor Herausforderungen und Nährstoffformulierungen, was eine Auswahl der besten Gesamt-Stämme, die stabil und robust breite industrielle Lignocellulosesubstrat Variation sind. Zusätzlich kann eine Belastung Stabilität Herausforderung in die eingearbeitet werden Bildschirm, indem Vorkultur Schritte involv im Beispiel geschehening anfängliche Wachstum der Hefe auf zwei nicht-selektiven Medien, YM-Agar für mehrere durch das synthetische ODM gefolgt Generationen mit 50 g / l Xylose für weitere 6-7 Generationen, geben Gelegenheit zur Destabilisierung der gewünschten Kultur Züge vor der Belichtung auf die Herausforderung der Leistung in Hydrolysat. Basierend auf signifikanten Leistungsmerkmalen, wie Ethanolausbeute und Xylose-Aufnahmerate, Isolate werden dann in jeder unterschiedlichen Spannungszustand, wie jedes Hydrolysat Umgebung getestet, rangiert die aus dem Anreicherungskulturmedium des Isolats unterschiedlich sein kann. Die dimensionslose RPI kann verwendet werden, um die durchschnittliche relative Performance und Rang der Isolate verglichen werden zu berechnen. Ein dimensionsloser Faktor ist geeignet zur relativen Performance in verschiedenen Arten von Hydrolysaten und basieren auf unterschiedlichen Leistungsbeurteilungen, wie die Renditen im Vergleich zu Raten widerspiegeln. Dieses Ranking Verfahren identifiziert Stämme, die durchweg gut über breite Variationen in den Wachstumsbedingungen und hydr ausführenolyzates und sind geeignet sowohl robust als auch genetisch stabil.

Verschiedene Iterationen und Modifikationen dieser grundlegenden Schritte kann notwendig sein, um die Entwicklung jeder Mikrobenstamm der Lage, spezifische oder einzigartige Leistungsmerkmale auf Lignocellulose-Hydrolysaten oder anderen Substraten von Interesse gerecht zu werden. Im S. stipitis ist es beispielsweise wichtig , dass die Ergänzung von Nährstoffen zu beachten, einschließlich preiswerten kommerziellen Quellen, um Hydrolysate bei hoher Feststoffbeladung wurde hergestellt , um den Dynamikbereich des Isolats Leistungen für verbesserte statistische Trennung während Screening zu steuern. Die Bedeutung von Nährstoffen zu erfolgreiche Fermentation konzentrierter inhibitorische Hydrolysate wurde auch bereits berichtet worden und ist vermutlich aufgrund einer erhöhten Bedarf an Aminosäuren und anderen Nährstoffen für die Zell Wartung, redox Ausgleich und Reparatur als Ergebnis einer solchen Stressbedingungen erforderlich sein, vor allem während der Xyloseverwertung. ^9,26,27Außerdem, wenn Nährstoffe zu dünn oder zu reichlich, Unterschiede in Isolat Leistungen kann schwierig sein, statistisch zu erfassen, aufgrund alle Isolate überaus schlecht zu tun, oder alle sehr gut, beziehungsweise. Trennt der Lage, eine gute Leistung unter verschiedenen Bedingungen zu erwarten sein, zuverlässig, robust oder zu Veränderungen der Herstellungsbedingungen.

Die wichtigste Einschränkung dieses Protokolls ist es, dass adaptive Evolution und Screening sehr wörtliche sind in Ergebnis, dass "man bekommt, was man bereichert und Bildschirme für". Somit müssen die Anreicherung und Bildschirmbedingungen ausgelegt werden Individuen zu verstärken und zu identifizieren, die jeweils mit den wünschenswerten Änderungen in Phänotypen, während noch wünschenswerte vorbestehenden Merkmale beibehält. Entwicklung beeinflussen können , für Züge nicht ausgewählt , die für die industrielle Leistungsfähigkeit entscheidend sind (zB Wachstumsfaktor - Anforderungen). Aus diesem Grund Bevölkerung Anreicherung Fortschritt für einen Zug muss regelmäßig sein überwachened für andere Züge als Methode zur Fehlerbehebung für unerwünschte Veränderungen. Beispielsweise eines der einzigartigen Merkmale von S. stipitis ist seine native Fähigkeit , Xylose zu wachsen und fermentieren. Alle Anreicherung und Screening-Substrate enthalten Xylose als alleiniger oder Schlüssel beitragKohlenStoffQuelle in Gegenwart von Inhibitoren. Folglich war ein gemeinsames Merkmal aller der Anreicherungskulturen in diesem Beispiel, dass sie für eine schnellere Xylose unter Verwendung von Stämmen direkt ausgewählt, deren Bevölkerung mehr und mehr angereichert seriell oder kontinuierliche Kultivierung, weil sie bessere Konkurrenten waren. Als beabsichtigte Ergebnis waren verbesserte Stämme alle in der Lage schneller Xylose-Aufnahme, aber Verbesserungen Ethanolausbeute waren viel weniger dramatisch als Verbesserungen der Xylose-Aufnahmerate. Letztere Trend kam wahrscheinlich über da Ethanolausbeute von dem Elternstamm war relativ hoch bei etwa 0,3 g / g oder 60% der Theorie (0,51 g / g), wie das Zellwachstum wurde stationär in Hydrolysaten, weniger Raum fürVerbesserung. In Kulturen, höhere Ethanolausbeuten möglicherweise gegen ausgewählt werden konnte, da Ethanol eine Wachstumsinhibitor, der für dieses Merkmal Leistungsüberwachung der entwickelten Population erforderlich. Ethanolkonzentrationen unter dem Niveau der Wachstumshemmung gehalten würde dazu neigen, dies als Selektionsfaktor zu neutralisieren. Für S. stipitis NRRL Y-7124, 40 g / l Ethanol Hälften spezifische Wachstumsrate , während 64 g / L vollständig Wachstum verhindert. ²⁸ in Ethanol in Frage gestellt kontinuierlichen Kulturen gefüttert Xylose wurde die Belüftung niedrig gehalten und Verdünnungsraten blieben ebenfalls niedrig genug , um mit reichlich Xylose anwesend Pflege Gärung statt Atmung Ethanol und verhindern Anreicherung für eine unerwünschte Ethanol genutzten Immobilie. Zusätzlich Nährstoffergänzungen zu den Hydrolysaten in Performance-Bildschirme verwendet wurden sorgfältig gestaltet, um die Auswahl für die Stämme zu vermeiden eine teure reiche Nährstoffzufuhr, wie Hefeextrakt benötigen. Zuschläge enthalten immer den niedrigsten Kosten kommerziellen Quellen available, wie Sojamehl und Harnstoff, obwohl reicher Komponenten wie in YM in tandem Kulturen für Vergleichstests verwendet wurden, wie in den Formulierungen von 60% und 75% der normalerweise PSGHL Stickstoff verarmen werden. Der ODM synthetisches Medium, in Vorkultur und Leistungskultur Bildschirme verwendet, wurde ursprünglich für eine optimale Leistung des Elternstamm entwickelt S. stipitis NRRL Y-7124 ⁷ in Übereinstimmung mit dem Kulturmedium Optimierungsroutine beschrieben von Traders Protein ²⁰ , die definierte Inhaltsstoffe empfiehlt, einschließlich Vitamine, Mineralien, Purine und Pyrimidine, und Quellen Aminosäure Nährstoffversorgung kompatibel mit kostengünstiger industriellen Scale-up Verwendung kommerziellen Quellen. Eine endgültige Empfehlung relevanten Stämme bei der Gestaltung ist die Gestaltung der Anreicherungs- und Bildschirm Bedingungen so relevant wie möglich zu den erwarteten industriellen Prozessbedingungen zu halten.

Kostengünstige wettbewerbsfähige erneuerbare Ethanol ist seit langem zu r verfolgteduce Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen. Um die Fähigkeit von S. verbessern stipitis NRRL Y-7124 zu tolerieren, zu wachsen und fermentieren hemmende Hydrolysate von Lignocellulose, haben mehrere Forscher wiederholende Kultivierung in der Xylose-reiche Flüssigkeit aus verdünnter Säure-Vorbehandlung von Lignocellulose - Biomasse eingesetzt. ^13,14,16,17 Over-Kalkung zu entgiften Inhibitoren wurde noch ein vernünftiges Maß an Leistung der frühen angepasst Stämme auf Hartholz und Weizenstroh Vorbehandlungsflotten zu ermöglichen , benötigt. ^13,14 Mehrere wiederholte Runden von UV - Mutagenese und Genom schlurfenden wurden Derivate von S. zu entwickeln angewendet stipitis NRRL Y-7124 mit verbesserten Inhibitor Toleranz und Wachstum in Hartholz Sulfitablauge (HWSSL). ^16,17 jedoch Ethanolkonzentrationen von diesen Stämmen in HWSSL hergestellt unter 10 g / l wurden nach 6 bis 7 Tagen. Unter Verwendung der Techniken gezeigt und hier beschriebenen neuen entwickelte Stämme von S. stipitis NRRL Y-7124 entwickelt phenoty gerecht zu werdenpe Ziele für die wirtschaftliche kommerzielle Nutzung benötigt: Vergärung von Hydrolysaten bei pH 5-6 ohne vorherige Entgiftung Maßnahmen wie Über Kalkung, was zu teuren Entsorgung; stark Wachstum reduziert und diauxischen Lags; Ethanol Akkumulationen hoch genug für kommerzielle Destillation (> 40 g / L Ethanol); schnelleres Wachstum und Ethanol Produktivität als bisher für native Hefestämme berichtet undetoxified Hydrolysate gärenden; und Leistung in diversen Hydrolysate bei hohen Feststoffbeladung, einschließlich geeigneter Soja Stickstoff ergänzt SGH (die ansonsten Stickstoff schlecht) und unsupplementierten AFEX CSH. Die verbesserten Stämme unter Verwendung der neuen aggressiven Ansätze zur Evolution entwickelt haben, wie oben zusammengefasst in den Schlüsselschritten ausgeführt ist, wird erwartet, dass die Wirtschaftlichkeit der Herstellung von Ethanol aus landwirtschaftlicher Biomasse zu profitieren durch Senkung der Betriebskosten, Kapitalkosten, sowie Energie- und Wasserzufuhr. Dies ist der erste Stamm Evolution Plan berichtet angepasst Stämme von S. zu erhalten stipitist wirtschaftlich gewinnbaren Ethanolproduktion auf undetoxified Hydrolysate zu demonstrieren.

Die neuen Stämme von S. stipitis aus jeder Phase des Evolutionsprozesses entstehen (Abbildung 1) sind Kandidaten für zukünftige Studien , die genetischen Veränderungen mit Selektionsfaktoren zugeordnet sind, um zu bestimmen angewendet und die zugrunde liegenden Mechanismen Schlüsselattribute von verbesserten Hydrolysat Fermentation, wie Inhibitor Toleranz und reduziert diauxischen Verzögerung. Solche wertvolle neue Wissen wird das Engineering der nächsten Generation von Hefe Biokatalysatoren und Verfahren zur Umwandlung von Lignozellulose zu Biokraftstoffen und anderen Produkten unterstützen. Als neue Stämme abgeleitet sind, wird es wahrscheinlich von Vorteil sein, wieder auf die Ableitung Population durch einen Stamm Evolution Protokoll passieren ähnlich wie hier beschrieben, um die nützlichsten Trans für die kommerzielle Nutzung in Hydrolysaten auszuwählen. In ähnlicher Weise wie neue mikrobielle Stämme mit dem Potential entdeckt werden einem machen meineRiad nützliche neue Produkte aus nachwachsenden Biomasse, die Evolutionsprozess weiter, möglicherweise biokatalytischen Prozesse und Produkte ermöglicht neuartige zugänglich gemacht werden angewendet werden könnte Belastung Robustheit und Produktivität in Hydrolysaten zu verbessern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com