Summary
적응 진화와 분리 기술을 설명하고 신속하게 육탄 당과 효소의 오탄당의 혼합 당이 undetoxified 가수 분해물을 당화 및 40g / L의 에탄올을 통해 축적 소비 할 수있는 Scheffersomyces stipitis 변형의 파생 상품 NRRL Y-7124을 얻었다 증명된다.
Introduction
리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 추정 연간 13 억 건조 톤의 에탄올 생산을 지원하고 미국은 30 %의 석유 소비를 줄일 수 있습니다. 1 포도당과 자일 로스 풍부한 식물 바이오 매스 가수 분해 수율 설탕 혼합물, 발효 억제제가 필요한 화학적 전처리에 의해 생성되지만 헤미 셀룰로스를 분해 및 효소 공격 셀룰로오스를 노출합니다. 아세트산, 푸르 푸랄, 및 (HMF) hydroxymethylfurfural는 전처리 중에 형성 많은 억제제 중 주요 구성 요소로 생각된다. 전방 목질 에탄올 산업을 이동하기 위해 연구 절차 생존 효율적 필요한 같은 억제 화합물의 존재하에 육탄 당 및 오탄당 당 모두를 사용하는 기능 할 효모의 진화를 허용한다. 이러한 사카 cerevisiae의 전통 산업 효모 균주의 중요한 추가 약점은, 효율적으로 fermen 할 수 없다는 것입니다식물 바이오 매스의 가수 분해물에서 사용할 수있는 자일 로스에서 t.
피 키아 stipitis 형 균주 NRRL Y-7124 (5773 CBS)는 최근 이름을 바꾼 Scheffersomyces의 stipitis는 잘 에탄올에 자일 로스를 발효하는 것으로 알려져 기본 펜 토스 발효 효모이다. 2,3 여기 추진 된 균주 NRRL Y-7124의 진화가에 문서화되어 있기 때문에 작은 자일리톨 부산물로 40g / L을 초과하는 경제적 복구 에탄올을 축적하는 기본 효모 균주의 가장 큰 잠재력을 가지고있다. 4,5,6을 최적의 미디어, S.에서 stipitis 균주 NRRL Y-7124은 0.41 ± 0.06 g / g 높은 세포 밀도 문화 (6 g / L 세포)이다. 7, 8 저항의 수율 40 시간 (1.75 g / L / 시간) 70 g /의 L의 에탄올을 생산 발효 억제제 에탄올, 푸르 푸랄 및 HMF에도 9 및 S.,보고 된 stipitis은 상업적 규모의 에탄올 블라우스 가능한 가장 유망한 기본 펜 토스 발효 효모 중에서 선정되었습니다N 리그 노 셀룰로즈에서. (10) 우리의 목표는 산업용 애플리케이션에 적합한 균주 NRRL Y-7124의보다 강력한 파생 상품으로 진화를 강제로 다양한 undetoxified 리그 노 셀룰로오스 가수 분해물과 에탄올의 선택 압력을 적용하는 것이 었습니다. 추구 향상된 기능 중 핵심은 농축 된 가수 분해물의 빠른 설탕 흡수 속도,보다 효율적으로 혼합 된 설탕 이용을위한 감소 diauxy, 에탄올 및 억제제의 높은 허용 오차했다. S.의 응용 프로그램 undetoxified 가수 분해물에 stipitis는 overliming 같은 가수 해독 프로세스와 연관된 추가 운영비를 제거하기 위해 연구의 핵심이 있었다.
두 산업 유망 가수 분해물은 진화를 강제로 적용했다 :. (PSGHL)을 당화 암모니아 섬유 확장 전처리 옥수수 여물 가수 분해물 (AFEX CSH)을 효소와 산 - 전처리 지팽이 가수 분해물의 술을 희석 11, 12 AFEX 전처리 기술로 개발되고있다묽은 산 전처리 가장 일반적으로 현재는 낮은 비용 기술을 나타내는 효소 당화위한 바이오 셀룰로오스 노출되도록 실시하면서 발효 억제제의 생산을 최소화한다. PSGHL는 전처리 후 남아있는 셀룰로오스로부터 분리하고 포도당에서 특징적으로 가수 분해 된 헤미셀룰로오스에서 자일 로스 풍부하지만 낮습니다. AFEX의 CSH 및 PSGHL 조성물은 진화 과정을 관리하는 데 이용 된 주요 측면에서 서로 다르다. AFEX CSH PSGHL은 (표 1)에 비해 아미노산 및 암모니아 질소원의 푸란 알데히드 및 아세트산 억제제 낮은하지만 높다. PSGHL는 주된 설탕을 사용할 수있는 자일 로스의 추가 도전을 선물한다. 따라서 PSGHL 특히, 가수 개선 자일 로스 활용 가능 효모의 상업적 사용을 방지 약점을 풍부하게하는 것이 적절하다. 심지어 기본 탄당 발효 효모 사이의 최적 설탕 xylo에 대한 의존도SE는 세포의 성장을 지원하기 위해 수리 더욱 도전 때문에 다양한 이유의 가수가된다 :. 의한 환원 불균형 대사 구조적 무결성 및 중단 셀 대폭 손상 될 영양소 결핍 억제제 9 질소 보충 특히 형태 아미노산은 발효의 중요한 운영 비용을 나타낼 수있다. 분리 선별 및 순위에 질소 보충의 영향은 지팽이 가수로 탐구했다.
향상된 개인은 S.의 자연적인 유전 적 다양성에 의존 다중 선택 압력을 사용하여 진화 인구 풍부한했다 이 다양한 가수 분해물, 에탄올 또는 UV 방사선에 노출에 의해 유도 stipitis 인구와 돌연변이. 선택 압력은 S.의 진화 과정을 탐구하는 병렬 및 직렬 적용되었다 성장하고 가수 분해물에 효율적으로 발효 할 수 원하는 파생 상품으로 stipitis(그림 1). 점점 도전 가수 분해물의 기능성 인구의 반복 배양이 중 12 % 글루칸 AFEX의 CSH의 희석 시리즈를 사용하거나 다른 PGSHL 20 % 고체로드에서 제조 된 마이크로 플레이트에서 수행 하였다. 연속 배양에서 자일 로스에 에탄올 도전 성장의 응용 프로그램은 더 자일 로스 활용의 억압을 에탄올 적은 감수성을 보여주는 표현형에 대한 풍부하여 AFEX의 CSH 적용 인구를 개선. 후자의 기능은 최근에 포도당 발효 다음 균주 NRRL Y-7124에 의해 펜 토스 이용에 문제가 나타났다. PSGHL 8 농축 다음 가수 분해물 기능을 확대 탐구했다.
S.의 추정 개선 파생 상품 stipitis NRRL Y-7124은 가장 일반적인 개체군에서 콜로니를 선택하는 응력 조건으로 희석 도금하에 농축하여 표적 진화 과정의 각 단계에서 분리 하였다. 차원 상대성능 지수 (RPI가)의 반응 속도가 적용된 다른 가수 분해물 형태와 영양 보충제 평가 하였다 전반적인 성능에 기초하여 변형을 평가하기 위해 사용되었다. 다양한 적응 절차의 성공은 S.의 기능을 향상시킬 수 있지만 리그 노 셀룰로오스 가수 분해물의 stipitis 이전 undetoxified 가수 분해물에 경제적 인 에탄올 생산을 보여주는 균주는 이전에보고되지 않은 문서화되어있다. 13-17 진화 절차를 사용하여 여기보다 상세하게 시각화 할, Slininger 등. (18)는 크게 이상 향상 균주 개발 모 균주 NRRL Y-7124 및 AFEX의 CSH에> 40g / L의 에탄올을 생산하고 적절 질소원 보충 당화 지팽이 분해물 (SGH)를 효소 수있다. 이 새로운 균주는 에탄올 산업 개발 리그 노 셀룰로즈 향후 관심을 추가 유전체학 연구 건물의 과목과 같습니다이전 염기 서열을 변형 NRRL Y-11545의 사람들에. 19 균주 개량 연구를 촉진하기위한 전주곡으로 개발하는 동안 발생 유전 적 변화의 역사를 규명 할 그림 1에 도식화 진화의 여러 단계에서 생산 된 최고 균주의 게놈 연구.
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Protocol
1. 분석 실험 장비 및 재료 시작 준비
- 진화, 분리에 사용 및 순위 절차에 대한 전처리 반응에 18 ~ 20 % 초기 바이오 매스 건조 중량을 사용하여 가수를 준비합니다. Slininger 등. 자세한 방법 2015 18 진화, 격리 또는 순위에 사용되는 질소 보충 N1 또는 N2와 AFEX CSH, PSGHL 및 SGH 준비를 참조하십시오. 각 가수 분해물 유형의 구성은 표 1을 참조하십시오.
참고 : 요소, 비타민이없는 아미노산을 포함하여 질소 소스와 : 질소 비율 (N C) 1 몰 탄소 : SGH-N1 = SGH 42에 강화 다음과 같이 SGH의 질소 요새는 정의 SGH-N1 또는 SGH-N2로 지정되었다 정의 출처 카제인, D, L- 트립토판, L- 시스테인, 비타민의 지방산 (예 ~ 몰 질소 N의 15 % 차 아미노기 질소 (PAN) 및인지 ~ N의 85 % 우레아로부터 임); 1 C : SGH-N2 = SGH 37에 강화 N 요소 및 최저 비용 상용 소스 오 등의 대두와 함께F 아미노산 및 비타민 ~ PAN에서 N의 12 % 및 우레아 88 %를 제공한다. - 지시에 따라 모 균주의 동결 건조 문화를 획득, Scheffersomyces stipitis NRRL ARS의 문화 컬렉션에서 Y-7124 (5773 CBS) (농업 활용 연구를위한 국립 센터, 피오리아, 일리노이), 및 글리세롤 재고 문화를 준비합니다. 재고의 부모 효모의 문화와 -80 ° C에서 10 % 글리세롤에 그 유도체를 유지한다.
- 판 한천 효모 맥아 펩톤 덱 스트로스 (YM)에 킬 글리세롤 주식 (3g / L 효모 추출물, 3g / L 맥아 추출물, 5g / L 펩톤, 10g / L의 포도당, 20g / L의 한천) 및 부화 48 25 ° C. 8 개발 판에서 72 시간 4 ° C에서 주일까지 저장할 수있는 등 전 배양액의 접종을 사용하기 전에.
- 준비 최적의 중간 (ODM) 이전에 부모 STR에 의해 에탄올에 자일 로스의 최적의 변환을 위해 개발 된 산업 제제 절차 (20)와 호환 합성 매체를 정의아인 Scheffersomyces (피 키아)는 NRRL Y-7124. 7을 사용하여 발효 성능 생물 검정에 대한 모든 precultures과 문화의 정의 매체 또한 에탄올에 대한 도전, 자일 로스 - 공급 연속 문화 발전을 stipitis. ODM 조성물은 표 2 참조 용으로 나열됩니다.
- 전술 한 바와 같이,도 18 내지 620 (A (620))에서 배양 흡광도를 측정하기 위해, 적절한 같이 cuvette- 또는 마이크로 플레이트 판독 분광계를 사용하여 세포의 바이오 매스를 분석한다. 당류, 에탄올, 푸르 푸랄, hydroxymethylfurfural (HMF) 높은 처리량을 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 또는 포도당 로봇 효소 결정 및 자일 로스를 이용한 배양 샘플 아세트산 정량.
2. AFEX CSH에 직렬 전송시 강력한 파생 상품을 풍성
- 변형 NRRL Y-7124의 예비 배양을 접종한다. 75 ml의 ODM + 150g / L의 자일 로스로 YM 한천에서 전송 세포 O 하에서 성장할 수있는 능력을 유지할smotic 스트레스. 실리콘 스폰지 폐쇄 125 ml의 플라스크에 precultures이 (150 rpm으로, 1 "궤도)을 흔들어 25 ° C에서 24 시간 플러그 품어.
- 사용을위한 차가운 물에 6~12% 글루칸 AFEX의 CSH의 해동 냉동 분취. 필요한 경우 5의 pH를 조정하고 필터에 희석 시리즈 준비 96 웰 마이크로 이전에 소독.
- (620 ㎚) 620 ≥0.1 초기 흡수 할 수 있도록 잘 당 예비 배양의 몇 마이크로 리터로 접종 한 후, 잘 당 50 μL 및 가수 분해물 희석 당 8 웰과 마이크로 입력합니다. 습도 젖은 종이 타월로 플라스틱 상자에 25 ° C에서 정적으로 24 ~ 48 시간 번호판을 품어.
- 초기 620 ≥0.1을 달성하기 위해 눈에 띄게 새로운 가수 분해물 희석 시리즈의 각 웰에 620> 1, 전송 1-5 μL에 성장 곳 가수 분해물 희석 사용.
- 분광 광도계와 함께 성장 문화에게 마이크로 620을 모니터링합니다. uninoculated 희석 시리즈 버리는제어 및 빈으로 보이는 군. 플레이트 뚜껑은 오염을 방지하기 위해 모니터링 중에 왼쪽 및 판독 따라 조정됩니다.
- 정기적으로 개선 된 균주의 후속 분리 또는 지속적인 가수 분해물 희석 시리즈를 reinoculating에 사용하기 위해 적응 문화의 글리세롤 주식을 준비합니다. 수영장, 식민지 최고의 가수 분해물 농도의 네 우물 (200 μl를) 주식을 준비합니다. -80 ° C에서 10 % 글리세롤에서 세포를 동결, 크리오 바이알 (cryovial) 20 % 멸균 글리세롤 1 : 1 혼합.
- 12 % 글루칸 AFEX의 CSH의 성장이 24 시간에서 일관되게 보일 때까지 반복 2.3-2.6 단계를 반복합니다.
AFEX CSH에 농축 한 후 3. 격리 단일 셀은 관대 한 파생 상품
- YM 한천에 적응 문화 및 사용 줄무늬의 행진 선택 글리세롤 주식은 세 개의 마이크로 웰 (A (620) ~ 0.1 초기)의 각각 3 % 또는 6 % AFEX CSH 글루칸 (pH를 5) 50 μl를 접종한다. 단계 2.3에서와 같이 24 시간 마이크로 플레이트 품어. 풀 복제테는 강한 성장 및 희석 판 YM하거나 6 % 글루칸 AFEX의 CSH 한천로 최고의 가수 분해물 강도에 우물을 식민지. 필터의 1 혼합 따뜻한 멸균 30g / L의 한천 용액을 12 % 글루칸 AFEX의 CSH를 멸균 : 1과 같이 후자를 준비합니다.
- 글리세롤 재고 문화로 동결 25 ° C에서 24 ~ 48 시간 배양 후 가장 높은 희석 판 보여주는 성장 5 단일 식민지를 선택합니다. 질주 YM 판에 각 식민지. 24 시간을 품어. 멸균 루프, 10 % 글리세롤의 작은 볼륨으로 세포의 개발을 연속 전송 세포를 일시 중단 혼합하고, -80 ° C에서 동결 2-3 크리오 바이알 (cryovial)에 배포 할 수 있습니다.
4. 부모에 비해 AFEX CSH 관대 한 파생 상품의 성능 평가
- 테스트는 간단한 6 % 글루칸 AFEX CSH 일괄 문화에서 분리합니다.
- 48 시간 판에서 전송 세포를 620 = (10)를 사용하여 1 μl를 세포 현탁액을 준비하는 pH가 7 인산 칼륨 완충액 (0.4 밀리미터)에 글리세롤 주식에서 줄무늬각 현탁액 620 = 0.2 초기 50 ㎕의 3 % 글루칸 가수 네 각 웰에 접종한다. 단계 2.3에서와 같이 24 시간 마이크로 플레이트 품어. 멸균 수로 3 : 12 % 글루칸 AFEX의 CSH 1을 희석하여 pH를 5에서 3 % 글루칸 AFEX의 CSH를 준비합니다.
- 전송이 24 시간 마이크로 웰은 전체 강도의 50 %에서 사용 pH를 5 12 % 글루칸 AFEX의 CSH의 25 ml의 precultures을 접종합니다. . ~ 25 ° C에서 150 rpm으로 (1 "궤도)을 24 시간 동안 실리콘 스폰지 폐쇄와 50 ㎖ 플라스크에 precultures을 품어 가수 분해물 1 희석하여 글루칸 AFEX의 CSH 반 강도에게 12 %를 준비 : 멸균 물 1.
- 620 = 0.1 초기와 유사한 25 ml의 성장 문화를 접종 반 강도 가수 분해물 precultures를 사용합니다. (4.1.2) 위와 같이 성장 문화를 품어 매일 (0.2 ㎖) 샘플. 모니터 바이오 매스의 축적 (A 620)와 설탕과 발효 제품 (HPLC)의 농도.
- 또한, repitch (즉, 수확 및 Reuse) 8 % 글루칸 가수 분해물 배치 문화 테스트를 위해 6 % 글루칸 AFEX의 CSH 성장 효모의 인구, 전술 한 바와 같이. (18)
- 또한, 전술 한 바와 같이, 12 % 글루칸 가수와 공급에 의해 repitched 6 % 글루칸 AFEX의 CSH 문화의 추가 테스트 인구. (18)
- 혼합 설탕과 ODM의 배치 문화 균주의 diauxic 지연을 테스트합니다.
- YM 글리세롤 줄무늬에서 루프 전달에 의해 실리콘 스폰지 폐쇄와 125 ml의 플라스크에 150g / L의의 자일 로스 75 ML의 ODM의 precultures 접종. 단계 2.1에서와 같이 24 시간을 품어.
- ODM은 pH가 6.5에서 75g / L 포도당과 75g / 자일 로스의 L를 포함와 비슷한 75 ml의 시험 문화를 접종 precultures를 사용합니다. 25 ° C, 150 rpm에서 플라스크를 흔들어. 매일 샘플.
- 초기 pH를 pH가 6-7 뒤 유지하는 테스트 배양 물에서 6.0 ± 0.2로 설정된 것을 제외하고 선택적으로, 유사한 프로토콜을 사용하여 글루코스 및 크실 로스의 발효 동안 diauxy에서 0~15g / 리터 아세트산의 영향을 테스트전술 한 바와 같이, 아세트산 소비 반지. 18
5. 에탄올 도전 크 실리 톨 이용을 위해 선택하는 연속 문화를 적용
- pH가 6.3 ± 0.2에서 60~100g / L의의 자일 로스, 20~50g / L의 에탄올로 연속 배양 공급 매체로 ODM를 준비합니다. ~ 0.5 g을 에탄올 / g 자일 로스의 전위 수율을 가정하여 150 g / 리터 크실 로스의 부분 발효 시뮬레이션 자일 로스 및 에탄올의 조합을 선택하고, 50 내지 70 g / L의 발생 에탄올 가능성을 수용 할 수 있습니다. (8)
- 연속 배양 접종을 준비하려면, 에탄올없는 ODM (100g / L의 자일 로스의 75 ml의 48 시간의 YM 판에서 AFEX CSH 허용 식민지 (콜로니 5 유사한 예에서, 그림 1) 루프에 의해 대표를 전송, 125 ml의 플라스크이 경우)이다. 24 시간 동안 25 ° C, 150 rpm으로 (1 "궤도)에 품어. 초기 연속 배양 들고 볼륨의 일치하도록 예비 배양 ODM의 자일 로스 농도를 선택합니다.
- 와 pH에서 ODM의 연속 문화 잡고 볼륨을 접종 6.3 ± 0.2 갖는 100g / L의 자일 로스 + 20g /의 L의 에탄올 ~ 식민지 5, 그림 1에 AFEX CSH 허용 분리의 예비 배양 농축액의 5 ~ 10 ㎖ (유사 ) 초기 620 ~ 0.5 100 ㎖을 얻었다. 쟈켓 100 ㎖ 스피너 플라스크를 200 rpm으로 교반하고, pH를 멸균 전극의 pH 컨트롤러 및 온도 조절 순환 수조 복 25 ° C에서 배양 유지 체적 (V R)을 유지한다.
- 세포 성장으로 인해 에탄올 노출 느려질 수 있기 때문에 초기에, pH가-작동 펌프를 사용하여 투여 량에 공급 매체를 설정합니다. 문화 발효 따라서 추가의 pH 강하를 중지, 5.4 pH를 떨어질 때 100g / L의 자일 로스 및 50g / L의 에탄올로 pH-6.3 ODM를 공급하는 펌프를 설정합니다. 유출 물 펌프가 지속적으로 문화면을 감추고과 100 ㎖의 볼륨을 유지한다. 따라서, 에탄올 농도는 계속 신진 대사와 먹이로 상승한다. 유출 측정하고 전술 한 바와 같이, 가능한 세포 농도, 제품 및 기판의 분석을 위해 지속적인 문화에서 매일 48 ~ 72 시간을 샘플 (1-2 ml)에 그립니다. 18 가능한 세포 농도를 찾으려면에서 샘플의 일련 1시 10분 희석을 버퍼 (4.1.1 참조) 및 확산 판 YM 한천로 희석은 (1.2.1 참조). 폐기물 수집 속도 (Q)에 기초하여, S.의 예에서, 희석 비율 (D) (Q / R V)를 계산하고, stipitis, 그것은 0에서 0.01 시간에 변화 -1.
- 농축에 그 당시 가장 널리 강력한 식민지를 나타내는, 30-100 식민지를 형성 버퍼 샘플 희석의 가능성 판에서 분리 정기적으로 글리세롤 주식을 저장합니다. 10 % 글리세롤 ~ 5 ml의와 홍수 판은 중복 크리오 바이알 (cryovial)의 준비를 할 수 있습니다. 유지 보수 또는 유예의 경우, 연속 배양을 중지하고 대부분의 전류 (저항) 글리세롤 재고 (들)를 사용하여 필요에 따라 다시 시작합니다.
- 대부분의 행진 글리세롤 재고 (들)을 다시 시작하려면YM 한천에 강한 집단과는 상기 배양 에탄올없는 ODM의 사전 문화 루프에 의해 24 ~ 48 시간 세포를 전송합니다. 예비 배양 효모의 농축 물을 사용하는 620 0.5 초기에 ODM의 볼륨을 들고 100 ㎖를 접종하고, 공급 매체의 흐름이 다시 시작되기 전에 문화가 배치 식 고정 단계로 성장 할 수 있습니다.
- 문화> 25g /의 L 에탄올의 존재 자일 로스에 지속적> 0.01 시간 -1에서 성장할 수 있다면, 저에 (30~50g / L에 이르기까지 ODM + 60g / L의 자일 로스 + 에탄올) 연속 배양 공급을 시작 희석 비율 ~ 0.01 시간 -1 볼륨 (처음 ODM + 60g / L의의 자일 로스 + 20g / L의 에탄올)을 들고 100 ㎖에. 시간이 지남에, 50g / L을 향해 피드의 에탄올을 올립니다. 글리세롤 주식에 고급 인구를 캡처합니다.
주 : 저 희석 비율을 유지하는 것이 가능하고, 산소지지 발효를 줄이기 위해 충분히 높은 세포 농도의 형성을 허용한다. - 선택적 irradiat 자외선 (UV)을 적용이온 월 연속 문화를 reinoculate하는 데 사용되는 재고 인구를 글리세롤합니다.
- 60g / L의 자일 로스, 단일 무균 플라스크에 모든 주식을 풀 (precultures에서와 같이) ODM 10ml에 글리세롤 재고 줄무늬에서 재현 탁 식민지. 단지 6 ㎖ / 플레이트 4-5 페트리 접시의 바닥을 다루 ~ 5 × 10 8 실행 가능한 세포 / ml에서 풀링 된 세포 현탁액을 적용합니다. 표준 일회용 페트리 접시의 6 ml의 범위를 얻기 표면 장력을 극복하기 위해 15 ml에 분배 한 다음 9 ml를 제거하십시오.
- 생물 안전 캐비닛의 광원으로부터 UV 각각 열린 문화 판을 노출. 바람직한 킬 율> 90 %를 얻기 위해 UV 노출 시간 또는 간격을 조정한다. 여기서, 광원으로부터 약 56cm에서 45 분 동안 노출.
- 전 조사 후 접시에 세포 현탁액을 희석. 예상 죽일 속도 콜로니 형성 단위를 기준으로. S. 들어 예를 stipitis, 킬 (kill) 속도는 ~ 97 %였다.
- 박편 COV로 UV 노광 배양 (24-30 ml)로 전송50 ㎖ 플라스크를 겹으로하고, 생존 세포의 작은 비율 ~ 1 × 8 가능한 S.에 다시 채울 수 있도록 25 ° C에서 24 시간 동안 150 rpm으로 배양 세포 / ml를 stipitis. 배양은 배양 동안 포토 재 활성화를 방지하여, 호일 커버 돌연변이를 보존한다.
- ~ 1 × 10 7 가능한 세포 / ml의 연속 문화를 접종하기 위해 다시 채워 돌연변이 문화를 사용합니다. 선택 과정을 계속 에탄올 농축 ODM + 60g / L 자일 로스 매체 피드를 다시 시작합니다.
6. 글리세롤 주식 인구를 평가하고 에탄올의 존재에 개선 크 실리 톨 발효와 함께 그 식별
- 킬 에탄올의 존재하에 자일 로스, 최고의 성장 및 발효 화면의 첫 번째 단계로서 YM 한천 글리세롤 스톡 문화를 선택했다.
- 각각의 진화 인구 이동하는 150g / L 포도당과 ODM에 75 ML의 precultures에 한천 줄무늬에서 상영, 125 ml의 플라스크 (96)에 부화한다이전 시간 테스트 문화에 대한 접종으로 사용할 수 있습니다. 큰 포도당 성장 인구는 자일 로스 활용을위한 효소의 유도가 필요합니다.
- 60g / L의 자일 로스 + 30~45g / L의 에탄올 ODM 40의 620 초기, 25 ° C에서 품어, 30 ml의 세포를 일시 중지, 각각의 문화를 수확, 유도을 테스트하려면, 150 RPM (1 "궤도) 실리콘 스폰지 폐쇄와 50 ㎖ 플라스크에. HPLC 분석에 의해 자일 로스 흡수를 모니터링하기 위해 매일 두 번 샘플을 그립니다.
- Slininger에 기재된 바와 같이 선택적으로, 등., 18, 에탄올의 존재하에 자일 로스의 증가를 평가 125 ㎖의 플라스크에 150g / L의 자일 로스와 ODM 75 ml의 루프 전달 각 진화 인구 precultures을 준비하고, 96 부화 25 ° C, 150 rpm으로 (1 "궤도)에서 시간. 125 ml의 플라스크에 ODM + 60g의 /의 L 자일 로스 + 30~45g / L의 에탄올 25 ㎖에 0.1의 낮은 초기 620에 시험 문화를 접종한다. 품어을 25 ° C에서 플라스크, 300 rpm으로, 1 "궤도 및 샘플.
- 6 단계의 결과를 바탕으로,에 성장과 에탄올의 존재 자일 로스를 발효하는 뛰어난 능력을 보여주는 글리세롤 재고 인구를 선택합니다. 줄무늬 판에 다음을 사용합니다. 줄무늬 판은 그 후 세포 현탁액은 620 = 0.5로 96 깊은 웰 플레이트에서 precultures을 접종하는 데 사용되는 620 = (5)의 밀도, 버퍼링 된 세포 현탁액을 준비하는 데 사용됩니다. ODM + 50g / L의 자일 로스 (아무 에탄올)과 1 : PSGHL에 1 ml의 precultures 1 혼합 접종. 빈 우물 96 웰, 배출 낮은 증발 깊은 웰 플레이트는 25 ° C에서 48 시간, 400 rpm으로, 1 "궤도에 대해 설명합니다. 별도의 다른 글리세롤 재고 인구에 precultures을 품어.
- 1 PSGHL : 20 ODM + 50g /의 L의 자일 로스, 30, 또는 허용 식민지를 풍부하게 40g / L의 에탄올 각 예비 배양를 사용 십육 1 ml의 문화가 (620) ~ 0.5 (1)에서 초기에 복제 접종. 농축 cultu을 품어precultures 유사 입술.
- 각각 다른 글리세롤 주식에 대한 가장 높은 에탄올 농도가 성장과 자일 로스 사용을 허용와 문화 우물을 수확. 글리세롤에 보존하기 위해 널리 단일 콜로니를 얻기 위해 YM 한천 각 세포주 플레이트. 글리세롤 재고 준비에 대한 YM 한천 플레이트에 세포 라인과 행진 각 당 열 식민지를 선택합니다.
8. 또한 AFEX CSH에 관해서는, PSGHL에 직렬 전송시 강력한 진화 균주를 풍성
- NRRL Y-7124 (부모)의 사전 문화를 준비 AFEX CSH 허용은 분리 발전, 지속적인 문화는 에탄올의 존재 자일 로스를 사용하는 향상된 능력을 가진 인구 진화. AFEX CSH 가수 분해물 적응 프로세스 (2.1 단계) 전술 한 바와 같이 글리세롤 재고 줄무늬에서 루프에 의해 ODM + 150g / L 자일 로스의 75 ml에 접종한다.
- 증가하는 농도를 제공하는 일련 물로 희석 PSGHL. 각을 사용하여 세 개의 세포주를 각 96 웰 마이크로 플레이트를 준비PSGHL 희석은 50 μL와 8 우물을 채우기 위해. 620 ~ 0.1-0.5 최초 희석 시리즈의 각 50 μL 마이크로 문화를 접종하는 예비 배양을 사용합니다.
- 배양 Δtime 당 ΔA 620 안정적 14-D의 평균 비율로 전체 강도 분해물 성장할 수있을 때까지 상기 (단계 2) 상술 된 AFEX CSH 가수 적응과 동일한 방법을 사용 PSGHL의 강도를 증가시키는 효모의 발전 계속 시리얼 전송이 추가 사개월 계속된다.
또는 에탄올에 도전하지 않고 PSGHL 그라디언트를 사용하여 9 격리 단일 세포 콜로니
- 단일 셀 YM 한천에 희석 도금에 의해 전체 강도 PSGHL 최종 적응 판에서 직접 분리 얻습니다. 이전에 (단계 3.2)에 설명 된대로 글리세롤 주식을 준비하기 위해 YM 판에 세 개의 세포주 및 바 행진의 각 열 많은 식민지를 선택합니다.
- 선택적으로의 이전 시점을 탐색세 개의 세포주의 저장 글리세롤 주식에서 분리하여 진화 과정.
- 글리세롤 재고 줄무늬에서 루프하여 각 세포주에 대한 예비 배양을 접종하고 30 ml의 ODM + 50g / L의 자일 로스에 24 시간 (50 ㎖ 플라스크, 25 ° C, 150 rpm으로)을 품어.
- 초기 620 ~ 0.2 마이크로 웰의 50 % PSGHL의 50 μl를 접종하고 정적으로 48 시간 배양하여 가수 분해물의 성장에 precultures에서 도전 세포.
- (전달 ~ 접시 당 300-400 생세포) 0-50% 강도 분해물 징 PSGHL 그라데이션 아가 플레이트 상에 각각 농후 배양 0.1 ㎖에 분산하고, 경사 가능한 최고 분해물 농도 영역으로부터 세포주 당 10 단일 콜로니를 골라 . 21 킬 단계 3.2에서와 같이 글리세롤 재고의 준비를 위해 YM에 식민지를 들었다.
- 대신 구배 아가 플레이트를 접종, 9.2.3 단계에 대한 대안으로서, 620 ~ 0.2 최초 96 웰 마이크로 플레이트의 웰에 접종 갔지웰을 10 ~ 40g / L, 50 % 농도의 에탄올과 100에서 가수 농도 범위를 포함하도록 재 설계된다. 이 경우, 단계 2.3에서와 달리 마이크로 플레이트를 72-96 시간을 개발하고. 희석 도금을 통해 성장을 보이고 가혹한 가수 분해물 - 에탄올 조합의 우물에서 열 단일 콜로니를 분리하고, 단계 3.2에서와 같이 글리세롤 주식을 준비합니다.
초등 화면 10. 두 영양소 조건에서 PSGHL에 공연을 비교하고 순위에 의해 열등한 분리 된 균주를 제거
- 컨트롤이 여섯 정상 균주를 선택하도록 서른의 화면으로 PSGHL 성능의 높은 처리량 깊은 우물 판 화면을 적용 다섯 세트는 NRRL Y-7124 부모와 (그림 1 진화의 예 식민지 5와 유사) AFEX CSH 허용 분리와 함께 분리 각 세트 (20 %)은 차 심사 레벨 (12 단계)에 전달합니다.
- 물론 당 1 ml의 작성 및 Wi 덮여 깊은 웰 플레이트에서 화면을 수행검은 색 실리콘 낮은 증발 씰 번째 스테인레스 스틸 뚜껑. 인큐베이터 / 통의 보드에 모든 판을 고정하고 25 ° C, 400 rpm으로 (1 "쉐이커 궤도)에서 운영하고 있습니다. 디자인은 모든 깊은 우물 열린 우물에 의해 다른 균주의 분리를 허용하는 패턴을 작성 접시.
- 배양에서 시작하려면 (30)로부터 제조 된 글리세롤 줄무늬에서 세포의 비드를 선택하는 것은 상기와 같이 얻어진 균주 ODM + 50g / L의 자일 로스의 우물을 복제하고 48 시간을 배양하기 (단계 3, 7, 9).
- ODM + 10g / L 포도당 + 50g / L의 자일 로스와 1 : 균주를 preculturing에 대한 도전 매체로서, PSGHL 1을 혼합하여 50 % PSGHL을 준비합니다. (30)에서 분리 된 두 개의 제어 계통, 16 균주의 각 당이 우물 2 판을 스크리닝 다른 균주 사이에 빈 우물을 떠나 채워집니다.
- 도전 문화, 전송의 경우, 분리 된 각이 50 % PSGHL 도전 문화 우물의 각 ODM의 사전 문화의 50 μL 볼륨 (A 620 ~ 10)과는 initi를 얻기 위해 제어알 620 ~ 0.5 72 시간을 배양한다.
- 심사는 분리에 대해 서로 다른 영양 풍요 로움의 두 개의 테스트 미디어를 사용하여 60 % PSGHL + ODM 영양분을; 75 % PSGHL + ODM + YM 영양소합니다. ODM은 50g / L 설탕 (단계 1.3)와 함께 사용하기위한 표준으로 강도의 절반 (설탕 제외) ODM의 영양소를 추가합니다. 지정된 바와 같이, 3g / L의 효모 추출물, 3g / L 맥아 추출물, 5g / L 펩톤의 표준 강도의 절반 (설탕 제외) YM 영양소를 추가합니다.
- 이 테스트 매체의 각각에 대해 오 깊은 우물에서 620 ~ 0.5 초기 1,000 μl를 접종 72 시간 50 % PSGHL 도전 사전 문화의 50 μl를 전송하여 시험 문화를 접종.
- 각 매일 격리 샘플. 에탄올, 글루코스 고 처리량 분석 크실 로스 용 상청액을 수득하는 미세 원심 분리 튜브에서 원심 분리 (5,533 × g으로 15 분)에 웰의 내용물을 피펫. 분광 광도계와 620에서 96 웰 마이크로 플레이트 (200 μL / 웰)와 같은 바이오 매스를 측정한다.
- (30)의 각 세트는 내olates (S. stipitis NRRL Y-7124 5 세트 균주를 발전) 단계 아래 (11)에 설명 된대로 상대 성능 지수 (RPI)를 계산하고 에탄올 수율 (공급 초기 설탕 당 누적 최대 에탄올)에 따라 각 변형 순위를 사용하여 테스트 자일 로스 흡수 속도 모두 테스트 미디어 (초기 96 시간 당 소비 자일 로스 농도).
11. 순위는 상대 성능 지수 (RPI)를 사용하여 기본 PSGHL 화면에서 격리 된 것
- 차 심사 후, 화면에 두 개의 서로 다른 실험 당 영양소 제제, 즉, 60 % PSGHL 75 % PSGHL와 PSGHL에 격리하는 (30)는 다섯 가지 실험을 각각 분리 평가하기 위해 차원의 상대 성능 지수 (RPI)를 계산한다.
- F = (XX의 평균) / S : 주어진 실험에서 시험 균주의 그룹 내에서 분리 성능을 순위에 사용하기 위해 통계 매개 변수 F를 계산합니다. 여기서, X는 성능 파라미터는 수율이다 (Y)X의 평균과의 각각의 평균 및 표준 편차 동안 X 모두가 주어진 실험 내에서 분리 관찰 또는 레이트 (R)는, 각각의 분리에 대해 관찰했다. 정규 분포를 들어, -2 <F <2.
- 각 실험에서 분리를 들어, 4분의 100 × 속도에 따라 상대적으로 성능, RPI R이 = (2 + F R)을 계산하고, 유사 수율에 따라 상대 수익률을 계산, RPI Y는 = (2 + F Y) × 4분의 100 . RPI의 값 (가장 높은 최저) ~ 0에서 100 퍼센트의 범위. 각각의 주어진 가수 분해물 실험에서 분리를 위해 다음과 같이 RPI 평균을 계산 : 수율 및 속도 기여는이 응용 프로그램에 동일한 가중치를 부여 RPI의 평균 = (RPI Y + RPI R) / 2.
중요성이 동일하지 않은 것으로 간주되는 경우에는 일반적으로 그주의, 수율 및 속도 매개 변수를 가중 될 수있다. - 전체 테스트 가수 분해물의 N 유형에서 RPI를 계산 : RPI를 전체 I = 1 N [(RPI RPI Y + R) / 2]의 I / N. 각각 30 균주 2 제어의 실험 장치에서 분리 고려하십시오. ~ 150 단일 식민지의 차 순위 동안 자일 로스 풍부한하는 PSGHL 적응 균주, 전체 화면에 적용이 PSGHL 제제에 걸쳐 요금과 수율에 대해 계산 된 RPI 즉, 60 % PSGHL 75 % PSGHL, 여기서 n = 2.
- 전체 각 실험에서 RPI를 바탕으로, 보조 화면으로 전달하는 균주의 최고 비율을 선택합니다. 이 예에서, 균주의 상부 20 % (즉, 150 (30)가 테스트)를 통과하도록 선택된다.
보조 화면 12. 최고 기능 강력한 균주를 나타 내기 위해 여러 완료 가수 분해물 (> 100g의 /의 L 혼합 설탕)에 최고 기본 화면 공연을 비교
- 6 %에 질소, SGH-N1과 SGH-N2 (구성의 두 가지 수준으로 개정 글루칸 AFEX의 CSH 및 SGH를 최고 PSGHL 공연을 비교최종 순위 표 1)에서와 같이들. PSGHL의 기본 깊은 우물 판 화면에서 최상위했던 30 균주를 화면 식민지 5, 그림 1 예와 유사하고, 두 컨트롤 (모 균주 NRRL Y-7124과 AFEX CSH 허용 분리 ((10, 11 단계) ).
- 이전 1 ML의 ODM + 50g / L의 자일 로스의 깊은 우물을 복제하고 깊은 웰 플레이트 시스템 (단계 10.2)에서 48 시간을 배양 글리세롤 줄무늬에서 세포의 비드를 선택하여 배양에서 시작. 그런 다음) ~ 10에서 620을 얻기 위해 72 시간 동안 깊은 웰 플레이트 시스템에서 50 % SGH 도전 문화에 ODM의 precultures의 50 μl를 전송하고 품어. 무설탕 ODM + 50g / L의 자일 로스 (PH 5.6)으로 1 : SGH 1을 혼합하여 50 % SGH을 준비합니다.
- 균주의 각각에 대해 초기 테스트 문화 ~ 2.0 (620)을 수득 도전 문화의 세 우물에서 세포 펠렛 (15 분, 2711 XG)와 SGH-N1 또는 SGH-N2의 16 ml를 나누어 접종. 25 & #에서 테스트 문화를 품다176;. C 실리콘 스폰지 폐쇄 25 ml의 플라스크에, 180 rpm으로 (1 "궤도) 매일 샘플 플라스크는 PSGHL 화면에 따라 분석 할 수 있습니다.
- 마찬가지로, 스크린 단계 12.2 및 12.3로 분리되지만 도전 배지 테스트 배양액 제조에 사용하기위한 pH를 5.2에서 6 % 글루칸 AFEX의 CSH 이번에 대체 SGH-N1 및 SGH-N2. 충분한 질소 개정하지 않고 있기 때문에 물을 1 : 50 % 강도의 도전 문화를 들면, 1 희석 6 % AFEX의 CSH를 사용합니다.
- 반복 결과를 중복 12.1-12.4 단계를 반복합니다.
13. 순위 전체 다중 완료 가수 분해물의 비율 사용에 RPI를 사용하여 보조 화면의 균주 연주 (Performance)
- 분리의 상위 20 %를 각각 평가하기 위해 상대 성능 지수 (RPI)를 계산한다 (30 ~ 150)의 개 효소의 보조 화면에서 테스트 한 기본 화면에서 영양 풍부한 변화의 가수 분해물 제제를 당화.
- 점수 각세 효소 당화 예비 분해물 제형 수행 크실 로스 흡수율 에탄올 수율에 기초하여, 보조 스크린 시험으로 분리시켜 AFEX CSH (I = 1, 2), SGH-N1 (I = 3, 4) 및 SGH 포함 중복 실행 -N2 (I = 5와 6).
- 각각의 분리에 대한 전반적인 RPI를 계산하고, 또한 우수한 균주의 목록 키질이 순위 매개 변수를 적용 = Σ I = 1, n은 [(RPI Y + RPI R) / 2] I / N, 여기서 n = 6 전체 RPI를 .
참고 : Slininger 등의 절차에 따라 플라스크 문화 SGH-N2의 가수 분해물이 우수한 균주의 반응 속도를 보여준다 18.
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Representative Results
S.의 stipitis은 AFEX의 CSH, PSGHL 및 에탄올 도전 자일 로스 - 공급 연속 문화를 포함 세 가지 선택 문화의 조합을 사용하여 진화 하였다. 그림 1 균주와 함께 수행 진화 실험의 개략도 중 하나를 가장 효과적으로 수행하는 것으로 보여 전체적으로 또는 가장 효과적으로 테스트 가수 분해물 중 하나. 표 3은 이러한 우수한 균주의 NRRL에 수탁 번호를 나타내고, 각각의 균주를 단리하는 농축 된 집단을 실현하는 처리에 적용되는 적응 응력을 요약 한 것이다. 이들의 대부분은 노출되어 진화하는 동안 단 하나의 유형으로 감염시켰다하더라도, 약간 분리 한 두 가수 유형 우수한 상대적인 성능을하는 것으로하였으나,도 7 (11)의 분리 물은 가수 분해물 형태의 모두에 잘 수행 하였다. 다양한 진화의 성공은 그림 2에서 보여 여기에 촬영 접근법 -7 표 4.
도 2는 균주 NRRL Y-7124의 강력한 유도체 AFEX CSH (단계 2)의 농도를 증가시키는 시리얼 전송 중에 농축 된 적응의 첫 단계 후 본 뚜렷한 개선을 나타낸다. 6 % 글루칸 AFEX의 CSH에 성장하는 문화에서 진화 된 인구는 더 빠른 축적과 모 균주에 비해 에탄올의 높은 최종 역가를 보여줍니다. 또한 더 빠른 포도당의 이용은 즉시 포도당의 고갈 다음과 같은 더 빠른 자일 로스 흡수와 함께 볼 수있다. 또한도 3에 변경된 모집단의 안정성은 87g / L의 글루코스 및 66g / L의 크 실리 톨의 혼합물로 합성 매체 ODM에서 설명되는 특징으로한다. 이 경우, 농축 인구 (도 3b) 및 격리 된 콜로니 (콜로니 하나와 콜로니 모두 5,도 3c 및도 3d, 입술에 각기)는 최소 4 일까지 에탄올 피크 시간을 줄여보다 빠르게 에탄올을 더 효율적 크실 로스를 사용하여 모 균주를 능가 할 수있다. 상당히 높은 에탄올 농도는 부모 (40-45g의 /의 L)에 비해 ODM에 진화 계통 (55~60g / L)에 의해 축적되었다. 효모 인구가 AFEX의 CSH 진화로 포도당 자일 로스 전환하고 효율적인 자일 로스 발효 동안 감소 diauxy의 안정적인 표현형을 이끄는 돌연변이는 일어났다.
식민지 5 또한 개선 50g / L까지 에탄올의 수준을 증가의 존재 자일 로스 - 공급 연속 배양에 자연 선택 (natural selection)에 제출하여 추진 하였다. 일정한 희석 불구 발효기를 채우는 데 충분히 높은 속도로 증가 할 수 있도록 이러한 조건 하에서, 연속 배양에 유지 효모 인구 위해 유일한 탄소원으로서 글루코오스 활용 효소를 유도 할 수 있어야율. 부모 균주에서 자일 로스 효소의 유도가 낮은 15 ~ 20로 g / L의 에탄올 농도에서 억제되기 시작. 식민지 5 (8) 파생 상품이 연속 문화의 동작의 초기와 후기 시점에서 글리세롤 주식에 포착되었다, 도 4는 NRRL Y-7124 부모 프로세스 접종 초기 콜로니 5에 비해 콜로니 5 진화 유도체 관찰 40g / L의 에탄올의 존재하에 자일 로스 사용률 성공적인 개선을 나타낸다.
그림 1의 적응 방식의 모든 단계에서 발생하는 균주는 (10.1 단계) 자일 로스를 발효 뛰어난 능력을 가진 사람을 식별하는 데 PSGHL에서 상영되었다. 그림 5의 분리는 아래에 설명 된대로이 기본 화면에 위 ~ 150 중 PSGHL에서 최고의 연주자들과 성능의 모든 보조 화면에 있습니다. 진화 된 균주의 개선을 표시하려면부모에 대하여, 각각의 분리 성능은 부모 균주의 분리 운동 파라미터 값의 비율로 표현 하였다. 분리 성능이 상위에 해당 인 경우의 비율 값이 "하나"가 발생했습니다. 5A 및도 상단 ODM 또는 ODM + YM 영양 보충제와 PSGHL의 60 %와 75 %의 강점에 공연을 분리 요약 5b는. 가수 분해물 농도 거친가 증가함에 성능 비율이 감소 하였다. 60 % 농도의 PSGHL에서 상위 7 중 5 PSGHL 선택 압력 NRRL Y-7124보다 더 많은 시간 (1 분리) 수행 노출 균주. 네 개의 균주는 AFEX의 CSH에 노출되는 동안 진화하지만 PSGHL에는 이전의 선택적 노출이 없었했다 식민지 5 (33 격리),보다 더 나은 수행. 그러나 PSGHL의 75 % 강도 만 3 크게 추가 된 영양소에도 불구하고 부모와 식민지 5 (33 격리)를 모두 능가 분리합니다. 이들 중에서, 우수한은 (15, 16)를 분리 하였다 previouslY는 진화를 안내하는 선택 압력으로 PSGHL 농도 증가에 도전했다. 14, 15 분리, 11, 13, 16 다중 노출했다 동안 3 만, PSGHL에 노출되었다. 11 세 분리하고, 13 PSGHL에 진화시 이전 시점에서 있었고,이 PSGHL의 증가 강점 직렬 전송을 제공하는 것이 그림 5에 분명하지만 그래서 14, 15, 16에 비해 내성을 개발하기 위해 다소 적은 기회가 있었다 그 저해 환경 견고한 균주를 개발하기 위해서는, 단독 AFEX의 CSH의 모 균주 NRRL Y-7124의 노광 가능성 PSGHL 대한 상호 공차 등 (33) 콜로니 5와 같은 균주를 생성 할 수있는 것이 분명하다. 따라서, 복수의 가수 분해물에서 수행 할 수있는 강력한 균주 다른 성능 검사 한 다음 가수 분해에 내성 농축에 의해 발견 될 수 있다는 지적 하였다. 자일 로스 - 공급 연속 배양에서 얻은 분리도 함께 PSGHL 60 %와 75 %의 강점에 상영되었다에탄올 도전을 유지하고 포도당 이용 다음과 자일 로스에 diauxic 지연을 테스트하기 위해 75g / L에서 영양분과 첨가 당. 27, 28, 30가 적응이 단계에서 다른 사람에게 우수 하였다 격리하는 동안, 모두 수율 및 자일 로스 흡수 속도 성능 비율은 아무도 없었다에 반드시 놀라운 일이 아니다 추가 ODM 및 YM 영양소와 75 % PSGHL에 부모, 유사 하였다 이 가수 분해물 이전 노출 (또한 참조 Slininger 등의 알. 18되지 여기에 문화에 대한 표시 추가 데이터는 75g / L의 포도당을 제공).
자일 로스 풍부한 PSGHL에 기본 화면에서 선택하는 가장 좋은 균주는 이후 세 완전한 가수 분해물에 상영되었다. 이러한 가수 분해물 (표 1)은 가장 다양한 ISO를 식별 AFEX의 CSH 및 묽은 산 전처리 SG 상업용 셀룰라아제로 처리하고, 서로 다른 질소 농도 (SGH-N1 및 SGH-N2)에 포함 된 보충억제제 및 영양 환경의 변화에 대하여하는 가를. 상대 성능 지수 (RPI가)는 각 분해물 (도 6a)에서 분리 각의 발효를 계산 하였다.도 6b는 각 계산 합한 전체 성능 지수가 분리 나타낸다. 다섯 분리 (3, 14, 27, 28, 33)가 결합 된 가수 분해물의 변화와 영양의 모든 조건에 가장 강력한로 위를 기록하고있는 60 위의 전체 RPI했다. 표 3의 리뷰를 검토 한 결과, 모두 3를 분리, 27, 28, 33 AFEX의 CSH 또는 AFEX의 CSH와 자일 로스에 에탄올 도전 연속 배양 진화하는 동안 14 PSGHL에 진화되었다. 우수한 여러 가수 분해물 사용을 나타내는 균주 중에 하나 이상의 가수 분해물에 진화되지 않았다.
일부 균주는 "전문가"중 SGH-N1 / 2 또는 AFEX CSH에 더 잘 수행했다. SGH에 전문가로 최고 성능의 이러한 분리가수 분해물은 (11, 16, 9) 마지막 또는 유일한 도전으로 PSGHL에 진화에 의해 수득 하였다. 처음 AFEX의 CSH 도전 증가를 통해 농축 하였다 분리 (11) 및 (16)을 위해 효율적 AFEX CSH 활용하는 능력 적극적 PSGHL의 긴 최종 농축 동안 선택되지 않고, 그 사용을 지원하는 키 유전 인자 명백하게 잃었다. 반대로, 14, 25, 27, 30, 33가 우수한 AFEX의 CSH의 공연, 그리고 모든 14 격리와 함께 또는 에탄올에 도전하지 않고 AFEX CSH에 진화되었다 제외되었다 분리합니다. 예상대로 그래서, AFEX의 CSH에 진화를 지시 또는 PSGHL 잘 선택 가수 분해물에 적응 효모를 위해 선택하는 경향이 있었다. 이 점에서 한 가지 예외는 분리 14 격리 14 만에 도전 PSGHL에서 유래와 최종 PSGHL 농축 문화의 YM 한천 희석 도금로부터 분리 하였다. Slininger 외. (18)의 존재하에 글루코스 성장한 세포 크실 로스 효소 유도 우수한 능력을 갖는 것으로이 분리 하였다5~15g / L 아세트산은 글루코오스 크실 로스 이점 전에 발생> 30g / L의 에탄올에도 불구하고, 75g / L 글루코스 및 크실 로스의 각각에 ODM diauxic 지연을 감소시켰다.
부모 균주 S.를 기준으로 진화 계통의 뛰어난 반응 속도 표 4에 나타낸 바와 같이 stipitis NRRL Y-7124은 25 실리콘 스폰지 캡 125 ml의 플라스크 배양 (PH 6.2) 620 8.4 ± 2.5 75 ml의 SGH-N2 초기에 접종 낮은 수준의 폭기 플라스크 배양의 결과를 나타내는 증명했다 ° C, 150 RPM (1 "궤도)와, (620), 0.5 ㎖의 23 SGH-N2 50 mL의 플라스크 초기 접종 적당한 통기 플라스크 배양을 나타내는도 7이다. (18)이 조건에 의해 제안 된 동작의 두 가지 유형을 나타내는 S.의 stipitis에 의해 에탄올 생산을위한 잠재적으로 상업적으로 유망한 인 것으로 문학. 8,22 전나무에서빠른 발효 즉시 시작하는 낮은 수준의 폭기의 t 인스턴스는, 높은 세포 밀도를 제공한다. 두 번째 인스턴스에있는 반면, 대수 성장의 낮은 세포 밀도와 높은 수준의 폭기 리드 인구를 구축하고 에탄올로 성장 관련 설탕 변환을 가속화한다. 이러한 데이터는 진화 된 균주는 모 균주에 비해 상당한 운동 효과가 있음을 입증 :보다 신속한 글루코스 흡수율 전체 글루코스 크실 로스 모두 (표 4),보다 빠르게 특정 크실 로스 흡수율 (표 4)보다 신속한 에탄올 생산성 (표 4) 짧은 지연 성장을 위의 (그림 7), 짧은 diauxic 포도당 전환 지연 자일 로스합니다. 에탄올 부모 NRRL Y-7124에 대한 본 것보다 40g / L 이상 및 피크 일 이전 (그림 7)에 축적 할 수 이러한 개선. 전체적인 에탄올 생산성 (표 4) 5 시간으로 1.5에서 이루어졌다부모 균주 (표 4)의 진화 변형에 따라하는 것이에요.
도 1 :. Scheffersomyces stipitis 적응 흐름도 나타낸 도면 적응 과정에서인가되는 응력의 순서 우수한 균주 (괄호 안의 숫자)의 복구 지점을 나타낸다. 또한 변형 정체성에 대한 참조로 표 3 격리 키를 참조하십시오. 시간 방향을 제공하기 위해, 적색의 숫자는 적응의 각 단계의 일수를 나타낸다. AFEX의 CSH와 자일 로스 풍부한 PSGHL의 시리얼 전송 단계의 경우, 적응 매일 약 2-4 세대를 나타냅니다. (205일 전체) 연속 문화 단계의 경우, 희석 비율 D는 0-0.1 시간 ~에서 변수 -1 pH의 작동 공급과 운영 125 D시. 다음에팔십일이 작업은 생성 시간 (LN 2) 58 시간, 또는 정상 상태에서 2.4 D 당 1 세대 / (D)를 제공, 0.012 시간 -1에서 D와 지속적인 흐름에 있었다. 다음으로 205 일간 연속 배양 물로부터 구성된 인구의 샘플을 UV 광으로 돌연변이 및 0.012 시간 -1에서 D로 작동 연속 배양에 접종 하였다. (Slininger 등. (18)에서 재현) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 6 % 글루칸 AFEX의 CSH의 개선 배치 발효 Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 AFEX CSH (A)를 비교한다 모 균주 발효의 6 % 글루칸 식민지 5 발효 6 % 글루칸 AFEX - 전처리 옥수수 여물 (H)의 적용ydrolyzate (B). 기호 바이오 매스 (빨간색 사각형), 포도당 (점선과 검은 색 원), 자일 로스 (실선과 파란색 원), 에탄올 (녹색 삼각형), 및 자일리톨 (보라색 다이아몬드)을 지정합니다. (Slininger 등. (18)에서 재현) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 혼합 당으로 정의 된 매체에 diauxic 지연을 감소 발효 공연 ODM에 비교 66g / L의 포도당 87g / L 자일 로스와 모 균주 S. 위해. stipitis NRRL Y-7124 (A)는 AFEX CSH는 Y-7124 (B) 유래의 인구 적응 S. 분리 단일 세포 콜로니 하나를 채택 stipitis 인구 (C), 단세포 콜로뉴욕 5는 적용 인구 (D)에서입니다. 기호 바이오 매스 (빨간색 사각형), 포도당 (점선과 검은 색 원), 자일 로스 (실선과 파란색 원), 에탄올 (녹색 삼각형), 자일리톨 (보라색 다이아몬드), 및 아 도니 (검정색 테두리와 골드 다이아몬드)을 지정합니다. (Slininger 등. (18)에서 재현) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 콜로니 5. 가수 분해물 허용 식민지 (5)의 에탄올 내성 유도체는 더 유일한 탄소원과 에탄올의 높은 수준으로 자일 로스를 포함 ODM에 연속 배양 선택에 의해 개발되었다. 두 파생 글리세롤 재고의 선택 과정 (2A.1.53R, 오렌지 삼각형과 점선) 초기 획득 인구와연속 배양 접종 (2A.1.30R.2, 보라색 원과 점선)의 따고 UV 조사는 NRRL Y-7124 모 균주 (실선 녹색 원)과 AFEX CSH 허용 식민지 5 (검은 색 삼각형과 비교하여 표시됩니다 실선). 40g / L의 에탄올 ODM 포도당 성장 효모의 조밀 한 인구 (A 620 = 50)에 의해 자일 로스의 흡수는 모든 적응 균주는 자일 로스의 신진 대사를 유도 할 수있는 능력에 unadapted 부모를 능가하는 것으로 나타났다. (Slininger 등. (18)에서 재현) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. 부모에 비해 관대 분리의 성능 향상의 비율은 우수한 내성 균주의 공연에 대해 요약PSGHL 각 배합물 (A, B)에 대한 제어 모 균주 NRRL Y-7124. 공연 자일 로스 흡수 속도의 관점에서 평가 하였다 공급 설탕 당과 에탄올 수율 (부모 분리의 비율을 나타내는 녹색 막대) (부모 분리의 비율을 나타내는 파란색 막대). (Slininger 등. (18)에서 재현) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : RPI에 따라 분리 순위. 상대 성능 지수 (RPI) 개념 33 순위 위해 보조 화면의 성과에 도포는 글루코오스 흡수 속도 및 공급 당 당 에탄올 수율에 기초하여 각각의 가수 유형 내에서 분리. (A) 상대 RAN주어진 분리의 왕이 가수 분해물 유형에 의존 (P <0.001) : SGH-N1 (파란색 막대), SGH-N2 (빨간색 막대)와 AFEX CSH (녹색 막대). (B) 모든 가수 분해물 유형에 걸쳐 계산 된 전체 RPI (하늘색 막대) 다른 가수 분해물 조건에서 가장 강력한 성능이 우수한 균주를 지적했다. (Slininger 등. (18)에서 재현) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : S.의 우수한 적응 분리의 비교 SGH 발효 stipitis. 페리는 분리 적응과 부모 균주 NRRL Y-7124은 낮은 초기에 pH가 6.2을 25 ° C에서 희석 된 산 - 전처리 스위치 그래스 (20 % 고형분로드)의 효소 적 가수 분해물을 발효 초기 비교 세포 밀도. 시간의 바이오 매스의 과정 (빨간색 사각형), 포도당 (검은 색 원과 점선), 자일 로스 (파란색 원과 실선), 에탄올 (녹색 삼각형)이 표시됩니다. 오차 막대는 기호로 표시 평균값에 대한 범위를 나타냅니다. (Slininger 등. (18)에서 재현) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 배양에서에 사용 된 가수 분해물의 조성물 (. Slininger 등 18에서 재현) 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (7)에 대한 최적의 정의 매체TPS : //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx ">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3 :. 식물 바이오 매스의 가수 분해물의 발효에 대한 우수한 내성 Scheffersomyces stipitis 균주의 요약 (. Slininger 등 18에서 재현) 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4 : 지팽이 가수 분해물 SGH-N2에 분리의 비교 역학은 초기에 접종 620 = 8.4 ± 2.5 요금은 포도당 또는 자일 로스 소비 동안 단위 흡수 당 정규화 된 요금입니다.. (Slininger 등의 알에서 재현. 18) 이 따를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오상상력.
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Discussion
몇 가지 단계가 발전 처리의 성공에 매우 중요했다. 첫째, 성공적인 응용 프로그램에 필요한 원하는 표현형으로 인구의 진화를 구동하기 위해 적절한 선택 압력을 선택하는 것이 중요합니다. 다음 선택적 응력은 S. 위해 선택되었다 개발 stipitis 원하는 표현형 농축을 안내하도록 적절한 시간에 적용 : 12 % (아세트산 푸란 알데히드 및 다른 억제제 낮은 수준의 존재 하에서 성장하고 다양한 당류 발효 강제) 글루칸 AFEX CSH의 증가 강도; 이 자일 로스 (diauxic 지연을 감소 크실 로스 효소 유도 강제) 에탄올 농도가 증가함에 따라 연속 배양을 공급; 및 (높은 아세트산, 푸란 및 다른 억제제의 존재하에 성장 및 크실 로스의 발효를 강제로) 20 % 고형분 로딩 PSGHL의 강도를 증가시킨다. 둘째, 글리세롤의 동결하여 발전 효모 개체군을 유지하는 것이 중요인구 샘플 tocks 농축 공정이 진행됨. 인구의 이러한 스냅 샷은 진화 과정을 문서화하고 필요에 따라 이후의 절연 부를 수 있도록, 또는 틈새 후 진화 과정을 다시 시작하기 위해 정기적 인 기능 테스트를 저장할 수 있습니다. 진화 과정에서 제 3 키 공정 (예컨대 가수 분해물 및 / 또는 에탄올 농도의 시리즈를 제시하는 응력 구배를 함유하는 한천 또는 마이크로 플레이트와 같은) 편리한 선택 배지에서 선택 배양 집단 또는 글리세롤 방류 집단을 풍부하게함으로써 뛰어난 균주를 회수했다 . 가장 스트레스 조건 하에서 성장 그리고 생존 식민지 나중에 특성에 대한 보존하기 위해 포착 할 수 있습니다. 이 세 가지 기본 단계는 해당되는 경우 하나의 사이클에서, 또는 여러 압력을 각 추가 원하는 표현형 선택 압력을 추구하는 반복, 또는 할 수 있습니다. 천연 부모 효모 인구는 다양한 스트레스에 노출 될 때, 유전 적 다양성을 발생하는 일을 할 것으로 예상된다 거친 자연 또는 유도 된 돌연변이, 그리고 지속적인 노출은 자연 선택이 경쟁력의 생존을 지원하는 가장 유익한 돌연변이를 가진 개인 풍부하게 할 수 있습니다. 선택된 표현형 여러 유전자 돌연변이의 결과로서 발생하는 것으로 예상된다. 위의 프로토콜에서, 돌연변이는 UV 처리시 또는 잠재적으로 가수 분해물에 효모의 노출시 유도 할 수있다. 가수가 손상 미생물에 화합물의 세 가지 클래스를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 카르 복실 산, 알데히드와 페놀 등의 푸르 푸랄 및 5-hydroxymethylfurfural, 세포를 손상 일반적에서 생성 된 활성 산소 종의 고도 (ROS)을 일으킬 수로 (22) 반응성 알데히드, 미토콘드리아. ROS 잘 진핵 세포의 DNA에 돌연변이를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 가수 분해물에 존재하는 23, 24 페놀을, 이전에 유전 독성 것으로 알려져 아니지만, 알데히드 및 돌연변이 ROS의 돌연변이 유발 효과를 촉진하고 시너지 효과 할 수있다. (25)
jove_content "> 점진적으로 어려운 환경의 단계적 전략 표현형 개선의 일련의 진화 계통을 구축 할 것으로 예상된다, 모두 대상도. 특정 비 대상 표현형이 바람직하지 않거나 불안정이 발생할 수있는 가능성이 비 대상입니다. 위해서는 가장 높은 기능과 강력한 균주를 캡처,주의해야 추가 키 단계는 모두 대상 및 비 대상 표현형에 도달, 평가 및 상업적으로 관련 특성으로 선택 균주를 비교하는 것입니다.이를 위해 공연에 비교해야으로 분리시켜 이러한 광범위한 산업 목질 기판 변화에 안정적이고 견고 최상의 전체 균주의 선택 가능 다른 억제제 도전 영양 제제와 가수 분해물 같이 응용 지향 스트레스 조건의 다양한. 또한, 변형 안정성 과제가 혼입 될 수 preculturing 단계의 involv을 포함하여 예제에서 수행 된 같은 화면이 비 선택적 미디어, 추가로 6 ~ 7 세대 50g /의 L의 자일 로스와 합성 ODM 다음에 여러 세대에 대한 YM 한천, 성능의 도전에 앞서 노출 원하는 문화 특성의 불안정에 대한주는 기회를 초기 효모의 성장을 보내고 가수 분해물. 에탄올 수율 크실 로스 흡수율로서 중요한 성능 특징에 기초하여, 분리 후, 예를 들면 분리의 보충 배지에서 상이해도 각 시험 분해물 환경으로서, 각각의 상이한 응력 상태를 기록한다. 무 차원 RPI 비교되는 균주의 전체 평균 상대 성능 등급을 계산하기 위해 사용될 수있다. 무 차원 인자는 상대 가수 분해물의 종류 성능 및 가격 대 수율 상이한 성능 평가에 기초를 반영하는 것이 적절하다. 이는 절차는 성장 조건 및 히드 록 사이드에서 수행 균주 지속적으로 잘 걸쳐 폭 넓은 변화를 식별olyzates하고 강력하고 유 전적으로 안정된 모두가 될 경향이있다.다양한 반복하고 다음 기본 단계의 수정은 리그 노 셀룰로오스 가수 분해물 또는 관심의 다른 기판에 특정 또는 고유 성능 기능 할 수있는 미생물 균주의 진화를 수용 할 필요가있다. S.에서 예를 stipitis, 높은 고체로드에서 준비 가수 저가 상용 소스를 포함하여 영양소의 보충을,주의하는 심사시 개선 된 통계 분리를위한 분리 성능의 동적 범위를 제어하는 핵심 중요하다. 농축 억제 가수 분해물의 성공적인 발효 영양소의 중요성은, 이전에보고 된 아미노산과 같은 스트레스 조건의 결과로서 세포 유지, 환원 분산 및 수리에 필요한 영양소에 대한 높은 요구에 의한 것으로 생각된다 특히 자일 로스 활용 중. 9,26,27영양분이 너무 부족한거나 너무 넘치 경우 또한, 분리 성능의 차이로 인해 모든 균주가 심히 가난하고, 또는 전부가 각각 대단히 잘 통계적으로 검출하기 어려울 수 있습니다. 다양한 조건이 산업 환경 변화에 안정적이나 강력한 것으로 예상되는 잘하에 수행 할 분리.
이 프로토콜의 주요 제한은 적응 진화와 검사가 그 "하나 하나가 풍부하고 화면 것을 얻을 것"에, 결과에 매우 문자 있다는 것입니다. 따라서, 농축 스크린 증폭 조건은 여전히 바람직한 선재의 특성을 유지하면서 표현형에 바람직한 변화를 각각 개인을 식별 할 수 있도록 설계 될 필요가있다. 진화는 산업 성능 (예를 들면, 성장 인자 요구 사항)에 대한 중요한 특성에 대한 비는 선택에 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 이유로, 하나의 특성에 대한 인구 농축 진행 주기적으로 모니터링 할 필요바람직하지 않은 변화 문제 해결의 방법과 같은 다른 특성에 대한 에드. 예를 들어, S.의 독특한 특징 중 하나에 대한 stipitis은 (는) 성장과 자일 로스를 발효하는 그것의 기본 기능입니다. 모든 농축 스크리닝 기판 억제제의 존재 하에서 단독 또는 주요 기여 탄소원으로서 크실 로스를 포함했다. 따라서, 본 예에서는 농축 배양 모두의 공통된 특징은 바로 그 집단들이 더 경쟁했기 때문에 직렬 또는 연속 배양에서 더 농축 된보다 신속한 이용 크실 로스 균주 선정이었다. 의도 된 결과, 개선 된 균주는 모두 더 빠른 자일 로스 흡수 할 수 있었지만, 에탄올 수율 개선은 훨씬 덜 극적인 자일 로스 흡수 속도의 향상보다 있었다. 부모 균주에 의한 에탄올 수율이 상대적으로 높은 이후 후자의 경향은 가능성에 대한 온에서 약 0.3 g / g, 또는 이론적 인의 60 % (0.51 g / g), 세포 성장이 적은 방을 떠날, 가수 분해물에 고정되면서개량. 문화에서, 더 높은 에탄올 수율은 아마도 에탄올이 특성의 진화 인구의 성능 모니터링를 필요로 성장 억제제이기 때문에 선택 될 수있다. 성장 억제의 레벨 이하로 유지 에탄올 농도는 선택 요소로서이를 중화시키는 경향이있다. S. 들어 stipitis NRRL Y-7124, 40g /의 L 에탄올 반쪽 특정 성장 속도 64g는 / L은 성장이 완전히 방지하는 동안. 연속 문화 자일 로스를 공급 도전 에탄올에서 28, 통기가 낮게 유지하고, 희석 비율도에 현재 충분한 자일 로스와 충분히 낮게 유지되었다 위탁 발효보다는 에탄올의 호흡과 원치 않는 에탄올 사용 속성에 농축을 방지 할 수 있습니다. 효모 추출물 등의 고가의 풍부한 영양 공급을 필요로하는 균주에 대한 선택을 피하도록 또한 성능 화면에 사용되는 가수 분해물에 대한 영양 보충제 심하게 설계되었다. 보충 교재는 항상 availabl 낮은 비용 상업 소스를 포함이러한 YM에서와 같이 풍부한 구성 요소는 일반적으로 질소 고갈되어 60 %와 75 % PSGHL의 제제에서와 같이 비교 테스트를 위해 직렬 문화에 적용된하지만 같은 콩 밀가루와 요소와 같은 전자,. 예비 배양 및 성능 배양 화면에 사용되는 합성 배지 ODM, 원래 모 균주 S. 최적의 성능을 위해 설계된 stipitis NRRL Y-7124 상인 단백질 경제적 인 산업 스케일 업하여 호환 영양분을 공급하는 비타민, 미네랄, 퓨린 및 피리 미딘, 아미노산 소스 포함한 정의 재료를 권장 (20)에 의해 기술 된 배지 최적화 루틴에 따른 7 상업 소스. 관련 균주 설계 마지막 포인트는, 예상되는 산업 공정 조건에 가능한 한 관련된 보충 스크린 상태의 디자인을 유지하는 것이다.
비용 경쟁력있는 신 재생 에탄올 오랜 연구를 추구하고있다화석 연료에 대한 의존도를 끌어 내다. S.의 능력을 향상시키기 stipitis NRRL Y-7124, 용납 성장하고 리그 노 셀룰로즈의 억제 가수 분해물을 발효하기는 여러 연구자들은 오버 석회 독을 제거하는 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 묽은 산 - 전처리로 인한 자일 로스 풍부한 술에 반복적 배양. 13,14,16,17을 사용했다 억제제가 여전히 나무와 밀짚 전처리 액에 조기 적응 균주의 성능을 합리적인 수준을 허용하기 위해 필요했다. UV 돌연변이 유발 및 게놈 셔플의 13, 14 다중 반복 라운드 S.의 파생 상품을 개발하기 위해 적용되었습니다 개선 억제제 내성과 나무의 성장과 stipitis NRRL Y-7124은 아황산 술 (HWSSL)를 썼다. (16, 17) 그러나, HWSSL에서이 균주에 의해 생산 된 에탄올 농도가 6 ~ 7 일 후 10g / L 아래에 있었다. 여기에 도시되고 설명 된 기술, S. 새로운 발전 균주를 사용하여 stipitis NRRL Y-7124은 phenoty를 충족하기 위해 개발되었다체육의 목표는 경제적 상업적 사용에 필요한 : 가수 분해물의 발효 등 비용이 많이 드는 폐기물 처리에 리드 - 석회 이상과 같은 이전의 해독 조치없이 pH를 5-6로; 크게 성장과 diauxic 시차를 감소; 상업 증류 (> 40g / L의 에탄올)에 대한 충분 에탄올 축적; 이전 undetoxified 가수 발효 천연 효모 균주에 대해보고 된 것보다 더 빠른 성장과 에탄올의 생산성; 과 및 비추 AFEX의 CSH (그렇지 않으면 질소 불량) 적절하게 대두 질소 보충 SGH을 포함하여 높은 고체로드에서 다양한 가수 분해물에서 성능을 제공합니다. 신규에게 상기 요약 된 주요 단계에서 구체화 진화 적극적인 접근 방식을 사용하여 개발 된 개선 된 균주, 운영 비용, 자본 비용 및 에너지와 물 입력을 낮춤으로써 농업 바이오 매스로부터 에탄올을 생산의 경제성을 유익 할 것으로 예상된다. 이것은 첫번째 변형 발전 계획 S.의 적합한 균주를 수득보고 stipitundetoxified 가수 분해물에 경제적으로 복구 에탄올 생산을 보여주는 것입니다.
S.의 신규 균주 진화 과정 (그림 1)의 각 단계에서 발생하는 stipitis 미래 연구를위한 후보자는 특정 선택 적용 압력과 메커니즘 등 억제제 내성 감소 diauxic 지연 개선 된 가수 분해물 발효의 기본 키 속성과 관련된 유전 적 변화를 결정한다. 이러한 가치있는 새로운 지식은 바이오 연료 및 기타 제품에 리그 노 셀룰로즈의 변환을 위해 차세대 효모 생체 촉매 및 공정의 설계에 도움이됩니다. 새로운 균주 유래, 아마도 다시 가수 분해물의 상업적 이용을 위해 가장 유용한 형질 전환 체를 선택하기 위해 여기에 설명 된 것과 유사한 변형 진화 프로토콜을 통해 유도체 인구를 전달하는 것이 유익 할 것이다. 새로운 균주가 잠재적으로 발견 될 때 유사하게, 만들려면 내재생 가능한 바이오 매스 유용한 신제품 리아드은 진화 과정은 또한 잠재적으로 새로운 생체 촉매 공정 및 제품이 제공 될 수 있도록 가수 분해물의 변형 안정성 및 생산성을 향상시키기 위해 적용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, >99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, >99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay >99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
- Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
- Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
- Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
- Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
- Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
- Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).
- Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
- Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
- Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
- Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
- Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
- Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
- Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
- Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
- Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
- Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
- Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
- Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
- Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
- Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
- Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
- Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).
