Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri

Published: October 24, 2016 doi: 10.3791/54227
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3
1Bioenergy Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 2Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 3Chemical Engineering and Material Science, Great Lakes Bioenergy Center, Michigan State University

Summary

Adaptif gelişimi ve izolasyon teknikleri tarif hızla heksoz ve enzimin pentoz karışık şekerler undetoxified hidrolizatlarını şekerleştirilir ve 40 g / L etanol içinde birikir tüketmek mümkün Scheffersomyces stipitis suşunun türevleri NRRL-Y-7124 elde etmek üzere gösterilmektedir.

Introduction

Lignoselülozik biyokütle tahmini yıllık 1,3 milyar kuru ton etanol üretimini desteklemek ve ABD% 30, petrol tüketimini azaltmak için izin verebilir. 1 glikoz ve ksiloz zengin bitki biyokütle hidroliz verimleri şeker karışımları, fermantasyon inhibitörleri gerekli kimyasal ön tarafından oluşturulan rağmen hemiselüloz yıkmak ve enzimatik saldırı için selülozu ortaya çıkarmak. Asetik asit, furfural ve (HMF) hidroksimetilfurfural ön-muamelesi sırasında oluşturan birçok önleyicileri arasında temel bileşenleri olduğu düşünülmektedir. İleri lignoselülozik etanol endüstriyi için, araştırma ve prosedürler hayatta kalan ve etkili bir şekilde gerekli olan bu tür önleyici bileşikler varlığında heksoz ve pentoz şekerleri her ikisini de kullanmak fonksiyon görme yeteneğine sahip maya suşları evrimini izin vermek. Saccharomyces cerevisiae gibi geleneksel sanayi maya suşları, önemli bir ilave zayıf verimli fermen yetersizlikBitki biyokütle hidrolizatları kullanılabilir ksiloz t.

Pichia stipitis tip suşu NRRL Y-7124 (5773 CBS), son zamanlarda yeniden Scheffersomyces stipitis iyi etanol ksiloz fermente bilinen bir yerli pentoz fermantasyon mayası olduğunu. 2,3 burada izlenmiştir NRRL Y-7124 evrimi bu belgelenmiş oldu çünkü küçük ksilitol yan ürün ile birlikte, 40 g / l'den fazla ekonomik olarak etanol birikmesine ana maya kökü büyük bir potansiyele sahiptir. 4,5,6 uygun ortam, S. olarak stipitis NRRL-Y-7124 0.41 ± 0.06 g / g yüksek hücre yoğunluklu kültürleri (6 g / L hücreleri). 7,8 direnç bir verimle 40 saat (1.75 g / L / saat) 'de 70 g / L etanol üretir fermantasyon inhibitörleri, etanol, furfural ve HMF de 9 ve S. bildirilmiştir stipitis ticari ölçekli etanol Bluz mevcut en umut verici yerli pentoz fermente mayalar arasında yer olmuşturn lignoselüloz gelen. 10 Amacımız endüstriyel uygulamalar için uygun NRRL Y-7124 daha sağlam bir türevi doğru evrimi zorlamak için çeşitli undetoxified lignoselülozik hydrolyzates ve etanol seçilim baskıları uygulamak oldu. aranan geliştirilmiş özellikleri arasında anahtar konsantre hidrolizatları daha hızlı şeker alım hızları, daha etkin bir karışık şeker kullanımı için daha az diauxy ve etanol ve önleyicilerinin yüksek toleransları edildi. S. uygulanması undetoxified hidrolizatları için stipitis gibi overliming olarak hidrolizat detoksifikasyon süreçleri ile ilişkili ilave işletme giderini ortadan kaldırmak için araştırma önemli bir odak noktası oldu.

İki endüstriyel umut verici hidrolizatları evrimi zorlamak için uygulanmıştır. (PSGHL) şekerleştirilmiş amonyak fiber genişletme ön tedavi mısır koçanı hidrolisat (AFEX CSH) enzim ve asit-ön tedavi darı hidrolizat içki sulandırmak 11,12 AFEX ön teknolojisi geliştiriliyorseyreltilmiş asit ön en yaygın güncel en düşük maliyet teknolojiyi temsil eden enzimatik sakarifikasyon için selülozik biyokütle maruz uygulanan ederken, fermantasyon inhibitörlerinin üretimini en aza indirmek. PSGHL ön sonrası kalan selüloz ayrılabilir ve glikoz karakteristik hidrolize hemiselüloz gelen ksiloz zengin, ama düşüktür. AFEX CSH ve PSGHL kompozisyonlar evrim sürecini yönetmek için istismar edildi kilit yönlerini birbirinden farklıdır. AFEX CSH PSGHL (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında, amino asitler ve amonyum azot kaynakları furan aldehit ve asetik asit inhibitörleri düşük ancak daha yüksektir. PSGHL baskın şeker mevcut olan ksiloz ek bir meydan okuma sunuyor. Böylece PSGHL özellikle hidrolizatları geliştirilmiş ksiloz kullanımı için mevcut maya ticari kullanımını engelleyen bir zayıflık zenginleştirmek için uygundur. Hatta yerli pentoz fermantasyon mayaları arasında optimal şeker Xylo dayanmakse hücre büyümesini desteklemek ve onarım daha da zorlu nedenlerden dolayı çeşitli hidrolizatları kazanmaktadır. sebebiyle redoks dengesizlikler metabolizmaya yapısal bütünlüğünü ve bozulma hücre yaygın hasara neden besin eksiklikleri, inhibitörleri 9 Azot takviyesi, özellikle şeklinde amino asitler, fermantasyonlar için önemli bir işletme maliyetini temsil edebilir. izole tarama ve sıralama azot takviyesi etkisi darı hidrolizatları ile araştırılmıştır.

Geliştirilmiş bireyler S. doğal genetik çeşitliliği dayanan çoklu seçim baskıları kullanarak gelişmekte popülasyonda zenginleştirildi İki farklı hidrolizatları, etanol veya UV ışınlarına maruz kalma tarafından uyarılan stipitis nüfus ve mutasyonlar. Seçim basınçları S. evrimi ilerlemesini keşfetmek için paralel ve seri olarak uygulanmıştır büyümek ve hidrolizatları verimli fermente edebilir istenen türevleri doğru stipitis(Şekil 1). giderek daha zor hidrolizatları fonksiyonel popülasyonlarının tekrar kültür ya da% 12 glukan AFEX csh'ın bir seyreltme serisi kullanılarak ya da başka bir PGSHL% 20 katı yüklemede hazırlanan mikro-plakalar içinde gerçekleştirilmiştir. Sürekli kültüründe ksiloz üzerinde etanol-meydan büyüme uygulama daha ksiloz kullanımı baskıyı etanol daha az etkileniyor gösteren fenotipleri için zenginleştirerek AFEX CSH adapte popülasyonları düzeldi. İkinci özellik son zamanlarda glikoz fermantasyonu aşağıdaki NRRL Y-7124 ile pentoz kullanımına sorunlu gösterilmiştir. PSGHL 8 Zenginleştirme sonraki hidrolizat işlevselliği genişletmek için araştırılmıştır.

S. varsayılan gelişmiş türevleri stipitis NRRL Y-7124 en yaygın nüfus gelen koloniler almak için stres koşulları ve seyreltme kaplama kapsamında hedeflenen zenginleştirme kullanarak evrim sürecinin her aşamasında izole edilmiştir. boyutsuz akrabaperformans endeksleri (RPIs) kinetik davranış uygulanan farklı hidrolizat türleri ve besin takviyeleri değerlendirildi genel performansa dayalı suşları sıralamak için kullanıldı. Çeşitli adaptasyon prosedürlerinin başarıları S. işlevselliğini artırmak için olsa lignoselülozik hidrolizatları bölgesindeki stipitis önce undetoxified hidrolizatları, ekonomik etanol üretimi gösteren suşlar, daha önce rapor edilmemiş, belgelenmiştir. 13-17 evrimi prosedürler kullanılarak burada daha ayrıntılı olarak görüntülenmiştir için Slininger ve ark., 18 belirgin olarak üzerinde geliştirilmiş olup soyları geliştirilmiştir üst NRRL-Y-7124 ve AFEX CSH> 40 g / L etanol üretmek ve uygun nitrojen kaynakları ile takviye edilmiş şekerleştirilmiş switchgrass hidrolizatı (SGH) enzim edebiliyoruz. Bu yeni suşlar etanol endüstrisine gelişmekte olan lignoselüloz gelecekteki ilgi ve ek genomik çalışmalar binanın konular gibidirDaha önce sıralı NRRL Y-11545 olanlar üzerinde. 19 suş geliştirme araştırmaları ilerletmek için bir başlangıcı olarak gelişimi sırasında meydana gelen genetik değişikliklerin geçmişini aydınlatmak istiyorum Şekil 1'de diagramed evrimin çeşitli aşamalarında üretilen üst soyların bir genomik çalışması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tahliller için Malzemeler ve Ekipmanları Başlangıç ​​hazırlayın

  1. evrim, izolasyon kullanımı ve sıralama işlemleri için ön reaksiyonunda 18 ila% 20 ilk biyokütle kuru ağırlık kullanılarak hydrolyzates hazırlayın. Slininger ve ark. Detaylı yöntemleri için 2015 18 evrim, izolasyon veya sıralamasında kullanılan azot takviyesi N1 veya N2 ile AFEX CSH, PSGHL ve SGH hazırlamak bakın. Her hidrolizat Çeşidi kompozisyon için Tablo 1'e bakınız.
    NOT: üre, vitamin serbest amino dahil azot kaynakları ile: azot oranı (N C) 1 molar karbon: SGH-N1 = SGH 42 güçlendirilmiş aşağıdaki gibidir: SGH Azot tahkimatı tanımlanan SGH-N1 veya SGH-N2 olarak tayin edildi tanımlanmış kaynaklardan kazein, D, L-triptofan, L-sistein ve vitaminlerden asitler (örneğin ~ mol azot N% 15 primer amino azotu (PAN) olduğu = N% 85 üre olduğu); 1: C: SGH-N2 = SGH 37 zenginleştirilmiş N üre ve düşük maliyetli ticari kaynak o kadar soya unu ileF'nin, amino asitler ve vitaminler, ~ karterinden N% 12 ve üre gibi% 88 sağlar.
  2. Yönetmen olarak ana suşunun liyofilize kültür Edinme, Scheffersomyces stipitis NRRL ARS Kültür Koleksiyonu Y-7124 (5773 CBS) (Tarımsal Kullanımı Araştırmalar Ulusal Merkezi, Peoria) ve gliserol stok kültürleri hazırlamak. Hazır üst maya kültürleri ve -80 ° C'de% 10 gliserol içinde türevlerini koruyun.
    1. agar plakaları maya malt Pepton Dekstroz (YM) için Şerit gliserol stokları (3 g / L maya ekstresi, 3 g / L malt ekstresi, 5 g / L pepton, 10 g / L dekstroz, 20 g / L ağar) ve inkübe 48- 25 ° C. 8 gelişmiş plakaları 72 saat 4 ° C'de bir hafta kadar saklanabilir sıvı ön-kültür inokulum ile ıslatılmıştır.
  3. Hazırlayın Optimal, Orta (ODM) daha önce ana str etanol ile ksiloz optimal dönüşüm için geliştirilen endüstriyel formülasyon prosedürleri 20 ile uyumlu sentetik ortam Tanımlıain Scheffersomyces (Pichia) NRRL Y-7124. 7 kullanın fermantasyon performans biyoanalizlere için tüm takip eden ön kültür ve kültürler tanımlanan orta ve ayrıca etanol için meydan, ksiloz beslenen sürekli kültür evrimi stipitis. ODM kompozisyon Tablo 2'de başvuru için listelenir.
  4. Daha önce tarif edildiği gibi, 18, 620 nm (A 620) kültür içine çekmeyi ölçmek üzere, uygun bir şekilde, cuvette- ya da mikro-plaka okuma spektrometresi kullanılarak hücre biyokütle analiz eder. şekerler, etanol, furfural, hidroksimetilfurfural (HMF) ve daha yüksek verim için, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ya da glikoz robotik enzimatik belirlenmesi ve ksiloz kullanılarak kültür örnekleri asetik asit nicelleştirmektedir.

2. AFEX CSH Seri Transferi sırasında Sağlam Türev zenginleştirin

  1. NRRL Y-7124 bir ön kültüre aşılamak. 75 mi ODM + 150 g / L ksiloz YM agar transfer hücreleri o altında büyüme yeteneğini korumaksmotic stres. Silikon sünger ile kapatılmış 125 mi ön kültür şişelerinde (150 rpm, 1 "yörünge) çalkalanarak 25 ° C'de 24 saat fişler inkübe edin.
  2. kullanım için soğuk suda 6-12% glukan AFEX csh'ın çözülme dondurulmuş alikotları. Gerekirse 5 pH ayarlamak ve filtre bir seyreltme serisi hazırlamak 96-çukurlu mikropleytin önce sterilize edin.
  3. (620 nm) 620 ≥0.1 ilk emicilik sağlamak için oyuk başına önkültürü birkaç mikrolitre inoküle daha sonra, göz başına 50 | il ve hidrolizat seyreltme başına 8 kuyucuklu mikro doldurun. nem ıslak kağıt havlu ile bir plastik kutu içinde 25 ° C'de statik 24-48 saat inkübe edin.
  4. İlk A 620 ≥0.1 ulaşmak için gözle görülür bir yeni hidrolizat seyreltme serisinin her bir kuyunun A 620> 1 transfer 1-5 ul büyüdü en yoğun hidrolizat seyreltme kullanma.
  5. Spektrofotometre ile büyüme kültürü mikropleytin içinde 620 izleyin. Aşılanmamış seyreltme serisi serBir kontrol ve boş olarak ves. Plaka kapakları bulaşmasını önlemek için izleme sırasında sol ve okumalar buna göre ayarlanır.
  6. Düzenli olarak geliştirilmiş suş daha sonra izole edilmesi için veya sürekli hidrolizat seyreltme serisi reinoculating kullanılmak üzere uyarlanması kültürleri gliserol stokları hazırlayın. Havuz, kolonize büyük hidrolizat konsantrasyonunun dört kuyu (200 ul) stokları hazırlamak için. -80 ° C'de% 10 gliserol içinde hücreler dondurma, cryovials içinde% 20 steril gliserol ile 1: 1 karışım.
  7. % 12 glukan AFEX CSH büyüme 24 saat sonra sürekli görünür oluncaya kadar tekrarlayın 2.3-2.6 adımları tekrarlayın.

AFEX CSH üzerinde Zenginleştirme sonra 3. İzole Tek Hücre Toleranslı Türevleri

  1. YM agar uyarlama kültürleri ve kullanımı çizgiler Şerit seçilen gliserol stokları, üç mikro levha boşluklarda (A 620 ± 0.1 başlangıç) her biri% 3 veya% 6 AFEX CSH glukan (pH 5) 50 ul aşılamak için. Adım 2.3 gibi 24 saat mikropleytin kuluçkaya yatmaktadır. havuz çoğaltmate güçlü büyüme ve seyreltme plaka ym veya% 6 glukan AFEX CSH agar ile en yüksek hidrolizat güçte kuyu kolonize. Filtrenin 1 karışımı sıcak bir otoklava, 30 g / L ağar çözeltisi ile% 12 glukan AFEX CSH sterilize: 1 olarak ikinci hazırlayın.
  2. gliserol stok kültürleri olarak dondurmak için 25 ° C'de 24-48 saat inkübasyondan sonra en yüksek seyreltme plaka gösteren büyümeden 5 tek koloniler seçin. Streak bir YM plakasına her koloni. 24 saat inkübe edilir. steril bir çerçevenin bulunduğu,% 10 gliserol, küçük bir hacme kadar hücrelerin gelişmiş bir çizgi transferi hücrelerin süspansiyonu karışımı, -80 ° C'de dondurma 2-3 cryovials dağıtın.

4. Ana karşılaştırıldığında AFEX CSH Toleranslı Türevler Performans değerlendirin

  1. Testi Basit% 6 Glukan AFEX CSH Toplu Kültürleri İzolatlarının.
    1. 48 saat levha transfer edilen hücreler, 620 = 10. Kullanım ile 1 ul hücre süspansiyonları hazırlamak için, pH 7, potasyum fosfat tamponu (0.4 mM), gliserol stoklarından çizgiliHer bir süspansiyon, bir 620 = 0.2 başlangıç 50 ul% 3 glukan hidrolizatı dört gözeneğe her inoküle etmek için. Adım 2.3 gibi 24 saat mikropleytin kuluçkaya yatmaktadır. Steril su ile 3:% 12 glukan AFEX CSH 1 seyreltilerek pH 5% 3 glukan AFEX CSH hazırlayın.
    2. Aktarım, iki 24 saat mikro levha boşluklarda tüm gücünün% 50 kullanılan pH 5 ila 12% glukan AFEX csh'ın 25 mi ön kültür aşılamak için. . *, 25 ° C'de, 150 rpm (1 "yörünge) 24 saat süre ile, silikon sünger kapaklı 50 ml'lik şişelere ön kültür inkübe hidrolizatı 1 seyreltilerek glukan AFEX CSH yarım kuvvette% 12 hazırlayın: steril su ile 1.
    3. A 620 = 0.1 başlangıç benzer 25 ml büyüme kültürleri aşılamak için yarım gücü hidrolizatı takip eden ön kültür kullanın. (4.1.2) yukarıdaki gibi büyüme kültürleri inkübe ve günlük (0.2 ml) örnek. Monitör biyokütle birikimleri (A 620) ve şeker ve fermantasyon ürünleri (HPLC) konsantrasyonları.
  2. Seçenek olarak ise, repitch (yani, hasat ve reuse)% 8 glukan hidrolizat parti kültürü içinde testi için% 6 glukan AFEX CSH yetiştirilen maya popülasyonları, daha önce tarif edildiği gibi. 18
  3. Seçenek olarak ise, daha önce tarif edildiği gibi,% 12 glukan hidrolizatı ile beslenerek repitched% 6 glukan AFEX CSH kültürlerinin diğer test popülasyonu. 18
  4. Karışık şeker ile ODM toplu kültürlerinde izolatların diauxic gecikme test edin.
    1. YM gliserol çizgiler döngü transferi silikon sünger kapaklı 125 ml'lik şişelerde 150 g / L ksiloz ile 75 ml ODM takip eden ön kültür aşılamak. Adım 2.1 gibi 24 saat bekletin.
    2. ODM, pH 6.5 75 g / L glukoz, 75 g / L ksiloz içeren içindeki 75 ml test kültürleri aşılamakta ön kültür kullanın. 25 ° C, 150 rpm'de çalkalama. Günlük Örnek.
    3. başlangıç ​​pH'ı pH 6-7 du korumak için test kültürleri 6.0 ± 0.2 olarak ayarlanmıştır hariç Alternatif olarak, benzer bir protokol kullanılarak glukoz ve ksiloz fermantasyon sırasında diauxy ilgili 0-15 g / L asetik asit etkisini testDaha önce tarif edildiği gibi, asetik asit tüketimi halka. 18

5. Etanol-meydan Xyloz Kullanımı için seçin Sürekli Kültür uygula

  1. pH 6.3 ± 0.2 olarak 60-100 g / L ksiloz, 20-50 g / L etanol ile sürekli kültür besleme ortamı olarak ODM hazırlayın. ~ 0.5 g etanol / g ksiloz potansiyel verim varsayılarak 150 g / L ksiloz kısmi fermantasyon simüle etmek için ksiloz ve etanol kombinasyonu seçin ve 50-70 g / L ortaya etanol potansiyelini barındırmak için. 8
  2. Sürekli kültür inokulum hazırlamak için, etanol içermeyen ODM (100 g / L ksiloz 75 ml 48 saatlik bir YM plaka AFEX CSH dayanıklı koloni (koloni 5'e benzer bir örnekte, Şekil 1) halka ile bir temsilci transfer 125 ml'lik şişelere bu durumda) 'de. 24 saat 25 ° C'de, 150 rpm (1 "yörünge) inkübe. İlk sürekli kültür tutan hacmi uyacak şekilde ön kültür ODM ksiloz konsantrasyonu seçin.
  3. PH ODM sürekli bir kültür tutma hacmi inoküle 6.3 ± 0.2 olan 100 g / L ksiloz + 20 g / L etanol • koloni 5, Şekil 1 'bir AFEX CSH dayanıklı izolatının bir ön kültür konsantrenin 5-10 ml (analog ) ilk A 620 ~ 0.5 100 ml elde etmek. Kılıflı bir 100 mi dönen şişeden 200 rpm'de karıştırıldı ve steril pH elektrodu, pH kontrol aracı, sıcaklık kontrollü bir dolaşan su banyosu ile donatılmış 25 ° C 'de kültür tutma hacmi (V K), muhafaza edin.
  4. hücre büyümesi nedeniyle etanol maruz kalma yavaş olacağından, başlangıçta, pH çalıştırılan pompa kullanılarak doz besleme ortamı kurmak. Kültür fermentasyon böylece daha fazla pH düşüşü durdurma 5.4 pH düştüğünde 100 g / L ksiloz ve 50 g / L etanol ile pH 6.3 ODM beslemek için bir pompa ayarlayın. Bir çıkış pompa sürekli kültür yüzeyi kaymağını 100 ml hacmi korumak. Sonuç olarak, etanol konsantrasyonu sürekli metabolizma ve beslenme ile yükselir. Çıkış maddesi ölçülür ve daha önce tarif edildiği gibi, viyabl hücre konsantrasyonu, ürün ve substratların analizi için sürekli kültürleri her 48-72 saat örnekleri (1-2 mi) çeker. 18 viyabl hücre konsantrasyonu bulmak için, numunelerin seri 1:10 seyreltiler tamponu (4.1.1) ve yayılma plaka YM agar dilüsyonlar (1.2.1 bakınız). Atık toplama oranları (Q) dayanarak, S. örneğinde, sulandırma oranı (D) (Q / V R) hesaplamak ve stipitis 0'dan 0.01 saat kadar değişiyordu -1.
  5. zenginleştirme o zaman en yaygın sağlam kolonicileri temsil 30-100 koloni oluşturan tamponlu numune dilüsyonları canlılığı plakaları izole ederek düzenli olarak gliserol stokları kaydedin. % 10 gliserol ~ 5 ml Sel plakaları çift cryovials hazırlanmasını sağlamak için. bakım veya bir mühlet için, sürekli kültür durdurmak ve en güncel (dirençli) gliserol stoku (ler) kullanılarak gerektiği gibi yeniden başlatın.
  6. , Çoğu çizgi gliserol stoku (ler) yeniden başlatmak içinYM agar dirençli popülasyonları ve yukarıdaki gibi inkübe etanol içermeyen ODM ön kültüre halka ile 24-48 saat hücreleri transferi. Önceden kültürlenmiş maya konsantresi kullanan 620 0.5 başlangıç ODM hacmini tutan 100 ml aşılamak ve yem orta akışı yeniden başlatılmadan önce kültür yığın halinde durağan faza büyümeye olanak sağlar.
  7. Kültürler> 25 g / L etanol varlığında, ksiloz üzerinde sürekli> 0.01 st -1 büyümesi durumunda, düşük de (30-50 g / L arasında değişen ODM + 60 g / L ksiloz + etanol) sürekli bir kültür besleme başlatmak seyrelme oranı ~ 0.01 sa -1 hacmi (ilk ODM + 60 g / l ksiloz + 20 g / L etanol) sahip 100 ml. Zamanla, 50 g / L doğru yemlerde etanol yükseltmek. gliserol stoklarında ileri popülasyonları yakalayın.
    NOT: Düşük seyreltme oranını korumak oksijen kullanılabilirliğini ve destek fermantasyon azaltmak için yeterince yüksek bir hücre konsantrasyonu oluşumunu sağlar.
  8. İsteğe bağlı olarak, irradiat ultra mor (UV) uygulanıriyon aylık sürekli kültürleri reinoculate için kullanılan stok popülasyonları gliserol.
    1. 60 g / L ksiloz ve tek steril bir şişede tüm stokları havuz ile (takip eden ön kültür olduğu gibi) ODM 10 ml gliserol stok damlaciklarini süspanse koloniler. Sadece 6 ml / plaka 4-5 Petri plakaları taban kapağı ~ 5 x 10 8 canlı hücre / ml'de Toplanmış hücre süspansiyonu uygulanır. Standart tek kullanımlık petri tabağında 6 ml kapsama almak yüzey gerilimini aşmak için 15 ml dağıtmak ve sonra 9 ml kaldırmak için.
    2. Bir biyolojik güvenlik kabini ışık kaynağından UV her açık bir kültür pozlandırınız. İstenilen öldürme oranı>% 90 elde etmek için UV ışınlarına maruz kalma süresi ya da mesafeyi ayarlayın. Burada kaynak yaklaşık 56 cm, 45 dakika boyunca maruz kalmaktadır.
    3. radyasyondan önce ve sonra plaka hücre seyreltilmiş süspansiyonlar hazırlanmıştır. Tahmin öldürmek oranı koloni oluşturan birim dayalı. S. örnek stipitis, öldürmek oranı ~% 97 idi.
    4. Bir folyo-cov UV maruz kalan kültürleri (24-30 ml) aktarın50 ml şişe ola- rak ve canlı hücrelerin küçük bir yüzdesi yaklaşık 1 x 10 8 canlı S. yeniden doldurmak için izin vermek için 25 ° C ve 24 saat boyunca 150 rpm'de inkübe hücre / ml stipitis. kültürler kuluçkaya ise fotoğraf reaktivasyonlar önleyerek, folyo kapak mutasyonlar korur.
    5. Yaklaşık 1 x 10 7 canlı hücre / ml olacak şekilde sürekli kültürleri aşılamakta depolanmışsa mutagenize kültür kullanın. seçimi işlemlerini sürdürmek için etanol zenginleştirilmiş ODM + 60 g / L ksiloz ortamı besleme başlatın.

6. Gliserol Stok popülasyonları değerlendirin ve Etanol Varlığında Geliştirilmiş ksiloz Fermantasyon olanlar tanımlayın

  1. Şerit etanol varlığında, ksiloz iyi büyüme ve fermantasyon için ekranın ilk adım olarak YM agar gliserol stok kültürleri seçilir.
  2. Her gelişmiş göç hareketini 150 g / l glikoz ile ODM 75 mi ön kültür agar damlaciklarini filtrelenmiş ve 125 ml'lik şişelere 96 inkübe edilmesiönce saat test kültürleri için inokulum olarak kullanmak için. Büyük bir glikoz yetişen popülasyonları ksiloz kullanımı için enzimlerin indüksiyonu gerektirecektir.
    1. 60 g / L ksiloz + 30-45 g / L etanol ODM 40 A 620 başlangıç ve 25 ° C'de inkübe, 30 ml hücreleri askıya her kültür hasat, indüksiyon test etmek için, 150 rpm (1 "yörünge) silikon sünger kapaklar ile 50 ml'lik şişelerde. HPLC analizi ile ksiloz alımını izlemek için günde iki kez numune çizin.
  3. Slininger de tarif edildiği gibi alternatif olarak, ve diğ., 18, etanol mevcudiyetinde ksiloz üzerinde büyüme değerlendirmek 125 ml'lik şişelere 150 g / L ksiloz ODM, 75 ml döngü transferi her gelişmiş nüfus eden ön kültür hazırlanması ve 96 kuluçkalanması 25 ° C, 150 rpm (1 "yörünge) İK. 125 ml'lik şişelere ODM + 60 g / l ksiloz + 30-45 g / L etanol içinde 25 ml 0.1, düşük bir ilk a 620 test kültürleri inoküle. inkübe 25 ° C'de şişeler, 300 rpm, 1 "yörünge ve örnek.

  1. Aşama 6 sonuçlarına göre, büyümeye ve etanol varlığında, ksilozu fermente üstün kabiliyetini gösteren gliserol hazır popülasyonları seçin. çizgi plakaları için bunları kullanın. Çizgi Plakalar daha sonra hücre süspansiyonları, bir 620 = 0.5, 96-derin yuvalı plakalar içinde takip eden ön kültür aşılamak için kullanılır A 620 = 5. yoğun, tamponlu hücre süspansiyonları hazırlamak için kullanılır. ODM + 50 g / L ksiloz (Resim etanol) 1: PSGHL 1 mi ön kültür: 1 karışık inoküle. Boş kuyulardan 96-de, Bacalı, düşük buharlaşma ile derin kuyu plakaları 25 ° C'de 48 saat, 400 rpm, 1 "yörünge için kapsar. Ayrı ayrı gliserol stok toplumlarda takip eden ön kültür inkübe edin.
  2. 1 PSGHL: 20 ODM + 50 g / L ksiloz, 30, ya da toleranslı kolonicileri ettirecek 40 g / L etanol, her ön kültüre kullanarak, on altı 1 mi kültürler 620 ± 0.5 1 başlangıç çoğaltma inoküle. zenginleştirme Cultu inkübetakip eden ön kültür benzer res.
  3. her biri farklı gliserol stokunun için, en yüksek etanol konsantrasyonu büyüme ve ksiloz kullanılmasına izin kültür kuyuları hasat. gliserol korumak için yaygın tek koloniler elde etmek için YM agar her hücre hattını Plate. gliserol stok hazırlanması için YM agar plaka hücre hattı ve çizgi her başına on koloniler seçin.

8. Ek AFEX CSH için olduğu gibi, PSGHL Seri Transferi sırasında Sağlam Evolved düzensizliğin zenginleştirin

  1. NRRL Y-7124 (üst) ön kültürler hazırlayın AFEX CSH dayanıklı izole gelişti ve sürekli kültür etanol varlığında, ksiloz kullanma özelliği ile olan bu nüfus gelişti. AFEX CSH hidrolizat adaptasyon işlemi için (adım 2.1) yukarıda tarif edildiği gibi gliserol hazır damlaciklarini halka ile ODM + 150 g / L ksiloz 75 mi inoküle.
  2. artan konsantrasyonlarının bir dizi sağlamak üzere, su ile PSGHL seyreltilir. Her kullanarak üç hücre çizgilerinin her biri için, 96-çukurlu mikro levha hazırlanmasıPSGHL seyreltme 50 ul 8 kuyu doldurun. Bir 620 ~ 0.1-0.5 başlangıç seyreltme serisi, her 50 ul mikro-kültür aşılamak için ön kültüre kullanın.
    1. Kültürler Δtime başına ΔA 620 istikrarlı bir 14-d ortalama oran tam mukavemet hidrolizatta büyümek mümkün kadar yukarıdaki (adım 2) detaylı AFEX CSH hidrolizat adaptasyon aynı prosedürü kullanarak PSGHL güçlü artan maya gelişimini devam ediyor gibi seri transferleri ek dört ay devam edilir.

veya Etanol Mücadelesi olmadan PSGHL Degradeleri kullanma 9. İzole Tek hücreli Kolonileri

  1. tek hücreli YM agar seyreltme kaplama tam mukavemet PSGHL son adaptasyon plakaları doğrudan izolatlarının edinin. Daha önce (adım 3.2) açıklandığı gibi gliserol stokları hazırlamak için YM plakalarına üç hücre hatları ve bar çizgi her biri için on büyük koloniler seçin.
  2. İsteğe bağlı olarak, daha önce zaman noktaları keşfetmekÜç hücre çizgilerinin depolanan gliserol stoklarından izole ederek evrim süreci.
    1. gliserol hazır çizgiler döngünün her hücre hattı için bir ön kültüre inoküle ve 30 ml ODM + 50 g / L ksiloz 24 saat (50 mi şişeler, 25 ° C, 150 rpm) inkübe edilir.
    2. Ilk A 620 ~ 0.2 mikroplaka kuyuların% 50 PSGHL 50 ul aşılanması ve statik 48 saat inkübe edilerek hidrolizatta büyümeye takip eden ön kültür gelen meydan hücreleri.
    3. (Teslim ~ plaka başına 300-400 canlı hücreler) 0-50% gücü hidrolizatı değişen PSGHL degrade agar plakaları üzerine her zenginleştirilmiş kültür 0.1 ml yayılmış ve degrade mümkün olan en yüksek hidrolizat konsantrasyon alanından hücre hattı başına 10 tek koloniler almak . 21 Streak adım 3.2 olarak gliserol stok hazırlama YM için koloniler aldı.
    4. Bunun yerine gradyan agar inoküle bölgesinin 9.2.3 adım için bir alternatif olarak, bir 620 ~ 0.2 başlangıç 96-çukurlu mikro levha kuyuları inoküle, whekuyu 10, 40 g / L% 50 kuvvetinde ve etanol ile 100 arasında hidrolizat konsantrasyon aralığı muhafaza etmek üzere tasarlanmış olan yeniden. Bu durumda, adım 2.3 gibi aksi mikro-plakaları 72-96 saat geliştirmek ve. seyreltme kaplama yoluyla büyüme gösteren sert hidrolizat-etanol kombinasyonları kuyulardan on tek koloniler izole ve adım 3.2 olarak gliserol stokları hazırlamak.

Birincil Ekran 10. İki Besin Koşullarında PSGHL üzerinde Performanslar karşılaştırılması ve Sıralama İnferior izolatı eleyin

  1. Kontroller altı top suşları seçmek için otuz ekranına PSGHL performansı yüksek verim derin kuyu plaka ekranı uygulayın beş set NRRL Y-7124 ebeveyn ve (Şekil 1 evrim örneği Colony 5 benzer) AFEX CSH dayanıklı izolatı ile birlikte izole eder her setten (% 20) ikincil Gözlemleme seviyesi (aşama 12) geçmek için.
  2. oyuk başına 1 ml doldurulmuş ve wi kaplı derin kuyu plakaları ekranı yürütmeksiyah silikon düşük buharlaşma mühürler ile inci paslanmaz çelik kapaklar. inkübatör / çalkalayıcı kuruluna tüm plakaları Kelepçe ve 25 ° C ve 400 rpm (1 "sallama yörüngesi) çalışır. Tasarım tüm derin kuyu açık kuyulardan farklı izolatlarının ayrılmasını sağlamak için desen dolgu plaka.
  3. toprağı ekme başlamak için, 30 ile hazırlanan gliserol çizgiler bir hücre boncuk çekme yukarıdaki gibi izole edilen ODM + 50 g / L ksiloz kuyu çoğaltmak ve 48 saat kuluçkalanması (Adım 3, 7 ve 9 olarak).
  4. ODM + 10 g / L glikoz + 50 g / L ksiloz 1: izolatları preculturing için bir meydan okuma ortamı olarak, PSGHL 1 karıştırılarak% 50 PSGHL hazırlar. 30 izolat ve iki kontrol suşları, 16 izolatın her başı 2 kuyuları ile 2 tabak taranması için farklı izolatlar arasındaki boş kuyu bırakarak doldurulur.
  5. Zorluk kültürleri, transfer için, izolatlar her iki% 50 PSGHL meydan kültür kuyularının her ODM ön kültürler 50 ul hacmi (A 620 ~ 10) ve başlatılmaktadır elde etmek için kontrolal A 620 ~ 0.5 ve 72 saat inkübe edin.
  6. tarama izolatları için farklı beslenme zenginlik iki test ortamı kullanın:% 60 PSGHL + ODM besinleri; % 75 PSGHL + ODM + YM besinler ve. ODM 50 g / L şeker (adım 1.3) ile kullanmak için standart olarak gücü yarısında (şekerler hariç) ODM besinleri ekleyin. belirlenmiş, 3 g / L maya ekstresi, 3 g / L malt ekstresi, 5 g / L pepton, standart gücü yarısı (şekerler hariç) YM besin ekleyin.
  7. Iki test ortamı her biri için beş derin kuyu A 620 ~ 0.5 başlangıç 1000 ul aşılamak için 72 saat% 50 PSGHL meydan ön kültürlerin 50 ul aktararak Test kültürleri aşılamak.
  8. Her gün izole Örnek. etanol, glikoz ve yüksek verimlilik analiz ksiloz süpernatının elde etmek için bir mikrofüj tüpü ve santrifüj (5.533 x g, 15 dakika) için de içeriğini Pipet. Bir spektrofotometre ile 620 96-çukurlu mikro plakalara (200 ul / oyuk) biyokütle ölçün.
  9. 30 Her set içindeolates (S. stipitis NRRL-Y-7124 için 5 set suşlar gelişmiştir) aşama aşağıdaki 11'de tarif edildiği gibi göreli performans indeksi (RPI) hesaplar ve etanol verimi (birlikte başlangıç şeker başına biriken fazla etanol) göre, her bir suş sıralamak için kullanımı, test edilmiş ve ksiloz alım oranı her iki test ortamına (ilk 96 saat başına tüketilen ksiloz konsantrasyonu).

11. Sıra Bağıl Performans Endeksi (RPI) kullanarak İlköğretim PSGHL Ekranında İzolatlarının

  1. Primer taramada ardından, ekran, iki farklı deney başına besin formülasyonlan, örneğin,% 60 PSGHL% 75 PSGHL ile PSGHL ile izole 30 beş farklı deneylerde her izole sıralamak amacıyla boyutsuz göreli performans indis (RPI) hesaplar.
  2. F = (XX ort) / s: belirli bir deneyde test izolatlarının bir grup içinde izole performans sıralaması kullanılmak için istatistiksel parametresi F hesaplanır. Burada X performans parametresi gibi verim olarak, (Y)X, ort ve S sırasıyla ortalama ve standart sapma ise X Tüm belirli bir deney içinde izole gözlemlenen veya kuru (R), tek tek her izolat için gözlendi. Normal dağılımlar için, -2 <F <2.
  3. Her bir deneyde izole için 100/4 × oranına dayalı göreli performansını, RPI'nın R = (2 + F R) hesaplamak ve benzer verim dayalı göreli performansını hesaplamak, RPI'nın Y = (2 + Bayan Y) × 100/4 . RPI'nın değeri (en yüksekten en düşüğe) ~ 0'dan 100 persentil arasında değişmektedir. Her belirli bir hidrolizat deney içinde izole için aşağıdaki gibi daha sonra RPI ortalamaları hesaplamak: verim ve hız katkıları bu uygulama eşit ağırlık verilmiştir RPI ort = (RPI Y + RPI R) / 2.
    önemi eşitsiz görüldüğü takdirde genel olarak unutmayın, verim ve hız parametreleri ağırlıklı olabilir.
  4. Genel test hidrolizatlarından n türleri arasında RPI hesaplayın: RPI genel i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n. Her 30 izolatın ve 2 kontrol deneysel sette izole düşünün. ~ 150 tek koloninin birincil sıralamasında sırasında ksiloz-zengin PSGHL adapte izolatları, genel olarak, ekranın uygulanan iki PSGHL formülasyonları arasında oranları ve verim için hesaplanan RPI, yani% 60 PSGHL ve% 75 PSGHL, burada n = 2.
  5. Genel her deneyde RPI'nin dayanarak, ikincil ekrana geçmek için izolatların üst yüzdesini seçin. Bu örnekte, suşların En% 20 (yani, 150, 30 test edilmiştir) geçecek şekilde seçilir.

İkincil Ekran 12., yüksek İşleyişi Sağlam düzensizliğin Ortaya Çoklu Komple hidrolizatları (> 100 g / L Karışık Şekerler) Top İlköğretim Ekran Sanatçıları karşılaştırın

  1. % 6 üzerinde azot, SGH-N1 ve N2 SGH-(kompozisyonun iki düzeyleri ile değiştirilmiştir glukan AFEX csh ve SGH üst PSGHL performans karşılaştırınson sıralama için Tablo 1) 'de olduğu gibi s. PSGHL birincil derin kuyu plaka ekranın üst sanatçılar vardı 30 izolatı Ekran Colony 5, Şekil 1 örnek benzer ve iki kontrol (üst NRRL Y-7124 ve AFEX CSH toleranslı izolat ((10 ve 11 adımlar) ).
  2. daha önce olduğu gibi 1 mi ODM + 50 g / L ksiloz, derin kuyu çoğaltmak ve derin bir plaka sistemi (aşama 10.2) 'de 48 saat inkübe gliserol çizgiler bir hücre boncuk seçerek toprağı ekme başlayın. Daha sonra) ~ 10 ° 620 elde etmek üzere 72 saat için derin oyuklu plaka sisteminde% 50 SGH meydan kültürlere ODM ön kültür, 50 ul transfer ve inkübe edilir. Şekersiz ODM + 50 g / L ksiloz (pH 5.6) ile 1: 1 sgh karıştırılarak% 50 SGH hazırlayın.
  3. Izolatların her biri için, ilk test kültürü ~ 2.0 bir 620 elde etmek için bir meydan okuma kültürün üç kuyu hücre topağı (15 dakika, 2711 x g) ile SGH-N1 ya SGH-N2 16 ml'lik bir şişe inoküle. 25 & # test kültürleri inkübe176;. C silikon sünger kapaklı, 25 ml şişelere, 180 rpm (1 "yörünge) günlük ve Numune şişeleri PSGHL ekran başına analiz edin.
  4. Benzer bir şekilde, ekran adımları 12.2 ve 12.3 olarak izole ancak meydan kültür ortamı ve test kültür ortamı hazırlanmasında kullanılmak üzere, pH 5.2% 6 glukan AFEX CSH bu kez yerine SGH-N1 SGH-N2. yeterli nitrojen değişiklik yapmadan olduğu, su ile 1: 50% 'lik bir meydan okuma kültürler için, 1 seyreltilmiş% 6 AFEX CSH kullanın.
  5. Tekrarlayın sonuçlarını çoğaltmak için 12.1-12.4 adımları.

13. Sıra genel Çoklu Komple hidrolizatlarından Oranı Kullanımına RPI kullanma İkincil Ekran İzolatların Performans

  1. izolatların en üst% 20 her rütbe için göreceli performans endeksleri (RPI) hesaplayın (~ 30 150 üzerinden) enzim ikincil ekranda test edilmiştir birincil ekrandan beslenme zenginliği değişen hidrolizatı formülasyonları şekerleştirilir.
  2. skor herÜç enzim şekerleştirilir önceden muamele edilmiş hidrolizat formülasyonlar üzerinde gerçekleştirilen ksiloz alım hızı ve etanol verimi göre ikincil elekte test izolat AFEX CSH (i = 1 ve 2), SGH-N1 (i = 3 ve 4) ve SGH dahil olmak üzere, iki kopya halinde çalıştırmak -N2 (i = 5 ve 6).
  3. Her izolat için, genel RPI hesaplayın ve ayrıca birçok izolatların listesini ayıklamak için bu sıralama parametre geçerlidir: = Σ i = 1, N [(RPI Y + RPI R) / 2] / n, burada n = 6 genel RPI .
    NOT: Slininger ark prosedürleri takip ederek balonu kültürlerinde SGH-N2 hidrolizatları üstün izolatların kinetik gösterin 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

S. stipitis AFEX CSH, PSGHL ve etanol-meydan ksiloz beslenen sürekli kültürü dahil üç seçim kültürlerin kombinasyonları kullanılarak gelişti. Şekil 1 izolatların birlikte gerçekleştirilen evrim deneyleri şeması ya en etkin gerçekleştirmek için bulundu gösterir Genel olarak ya da en etkili test hidrolizatlarının seçebilir. Tablo 3, bu birçok izolatların NRRL erişim numaraları gösterir ve her suş izole edildiği zenginleştirilmiş popülasyonu elde işleminde uygulanan adaptasyon gerilmeleri özetlemektedir. Bunların çoğu maruz kalan ve evrimi sırasında sadece tek bir tip meydan olsa bile, bazı izolatlar bir ya da iki hidrolizat türleri üstün nispi performansa sahip görüldü, ancak 7 11 izolatı hidrolizat türleri iyi performans. Çeşitli evrim başarıları Şekil 2 gösterilmiştir burada alınan yaklaşımları -7 ve Tablo 4.

Şekil 2, NRRL Y-7124 sağlam türevleri AFEX CSH (Aşama 2) artan konsantrasyonlarda seri aktarımı esnasında zenginleştirilmiş edildiği uyum birinci aşamasından sonra görülen belirgin bir iyileşme göstermektedir. % 6 glukan AFEX CSH büyüyen kültürlerde, evrimleşmiş nüfus daha hızlı birikimi ve ebeveyn gerginlik daha etanol yüksek nihai titreleri göstermektedir. Ayrıca daha hızlı glikoz kullanımı derhal glikoz tükenmesi sonrasında daha hızlı ksiloz alımı ile birlikte görülür. Ek olarak Şekil 3'te, değiştirilen nüfusunun kararlılık 87 g / L glukoz, 66 g / L ksiloz içeren bir karışım ile sentetik ortam ODM gösterilmiştir bulunmaktadır. Bu durumda, zenginleştirilmiş popülasyon (Şekil 3B) ve izole edilmiş koloni (Koloni 1 ve Koloni 5 hem Şekil 3C ve 3D, Respectively), en az 4 gün etanol zirve zamanı azaltarak, daha hızlı bir şekilde etanol yapmak için daha verimli ksiloz kullanılarak üst gerginlik daha iyi performans edebiliyoruz. Anlamlı derecede yüksek etanol konsantrasyonları üst (40-45 g / L) göre ODM üzerinde gelişti suşları (55-60 g / L) tarafından toplanan bulundu. maya nüfus AFEX CSH gelişti olarak glikoz-ksiloz geçiş ve daha verimli ksiloz fermantasyonu sırasında azaltılmış diauxy istikrarlı bir fenotip açan mutasyonlar, ortaya çıktı.

Colony 5'e daha fazla iyileştirmeler 50 g / L kadar etanol seviyelerinin arttırılması mevcudiyetinde ksiloz beslenen sürekli kültür doğal seleksiyon için göndererek takip edilmiştir. sürekli bir seyreltme rağmen fermentörünü doldurmak için yeterince yüksek bir oranda büyümesine edebilmek için, bu koşul altında, sürekli kültür içinde muhafaza maya popülasyonu için tek karbon kaynağı olarak ksiloz kullanımı için enzimleri etkileyen gerekiroranı. Ana suş olarak, ksiloz enzim indüksiyonu düşük 15-20 g / l etanol konsantrasyonlarında inhibe başlar. Koloni 5 8 türevleri sürekli kültür çalışması erken ve geç zaman noktalarında, gliserol stokları yakalandı, ve Şekil 4, NRRL-Y-7124, üst ve işleme aşılanmış, ilk koloni 5 ile karşılaştırıldığında Colony 5 gelişti türevleri gözlenen 40 g / L etanol varlığında, ksiloz kullanımı başarılı gelişme gösterir.

Şekil 1 adaptasyon düzeninin tüm aşamalarında ortaya çıkan izolatlar (10.1 Adım) ksiloz fermente üstün yeteneği olan tanımlamak için PSGHL içinde tarandı. Şekil 5'te gösterilen izolatları, aşağıda tarif edildiği gibi, bu primer ekranda sıralanmış ~ 150 üzerinden PSGHL ilgili iyi performans arasında ve performansının tüm ikincil taramalar içindedir. evrimleşmiş izolatların iyileşmeye işaret etmek, üst göre her bir izolatın performansı ana suş izole etmek kinetik parametre değerlerinin oranı olarak ifade edilmiştir. Izolatın performans ebeveyne eşdeğer olup olmadığını oranı değerleri "bir" oluştu. 5a Şekiller ve üst ODM ve ODM + YM besin takviyeleri ile PSGHL% 60 ve% 75 güçlü yönlerini performansları izole özetlemek 5b. hidrolizat konsantrasyon ve sertlik artışına paralel olarak, performans oranları azalmıştır. % 60 kuvvetinde PSGHL olarak, yedi üst beş PSGHL seçim baskısı NRRL Y-7124 daha birçok kez (1 izole) gerçekleştirilir maruz izolatların. Dört izolat AFEX CSH maruz kalma sırasında gelişti ancak PSGHL için daha önce hiç seçici pozlama vardı Colony 5 (33 izole), daha iyi performans gösterdi. Ancak, PSGHL% 75 gücü, sadece 3 önemli ölçüde katma besin rağmen ebeveyn ve Koloni 5 (33 izole) hem de aştı izolatların. Bunlardan, üst 15 ve 16 idi previousl izoleY evrimi yönlendiren bir seçme basıncı PSGHL artan konsantrasyonları ile tehdit. 14, 15 izole eder ve 11, 13 ve 16 çoklu pozlama vardı 3, sadece PSGHL maruz bırakılmıştır. 11, 3 izolat 13 PSGHL evrim sırasında erken zaman noktalarında vardı ve bu PSGHL artan güçlü seri transferi hizmet ettiği, Şekil 5'te görülmektedir da bu nedenle, 14, 15 ve 16 ile karşılaştırıldığında tolerans geliştirmek için bir miktar daha az fırsat oldu inhibe çevreye sağlam suşları geliştirmek için, tek başına AFEX CSH, ana NRRL-Y-7124 maruz potansiyel PSGHL çapraz toleransla örneğin (33) Koloni 5 gibi izolatı oluşturabilir olduğu da açıktır. Böylece, birden fazla hidrolizatları gerçekleştirmek mümkün sağlam suşları başka performans tarama izledi tek hidrolizat hoşgörü zenginleştirilmesi ile bulunamadı belirtilmiştir. ksiloz beslenen sürekli kültüründen izole edilen ayrıca PSGHL% 60 ve% 75 güçlü tarandıetanol meydan sürdürmek ve glikoz kullanımını takip ksiloz üzerinde diauxic lag test etmek için 75 g / L'de besin maddeleri ve de ilave glükoz. 27, 28 ve 30 adaptasyon bu aşamasından diğerlerinden üstün olduğunu izolatları iken, hem verim ve ksiloz emiş hızı performans oranları hiçbiri vardı mutlaka şaşırtıcı değildir eklendi ODM ve YM besin% 75 PSGHL üzerinde ebeveyn, benzerdi Bu hidrolizata mi maruz (bakınız ayrıca Slininger ve ark., 18 burada kültürleri için gösterilen ek veriler 75 g / L glikoz verilen).

ksiloz zengin PSGHL birincil ekranından seçilen en iyi suşları daha sonra üç kez tam hidrolizatları tarandı. Bu hidrolizatları (Tablo 1) çok yönlü iso tespit etmek AFEX CSH ve seyreltik asit ön-muamele SG ticari selülazlar ile muamele edilmiş ve iki nitrojen seviyeleri (SGH-N1 SGH-N2) de takviye dahilönleyicisi ve besin ortamında varyasyonlar ile ilgili lat'lar. Göreli performans indeksi (RPIs), her bir hidrolizat (Şekil 6A) içinde izole her fermantasyonu için hesaplanmıştır. Şekil 6B, her biri için hesaplanan Birleştirilen genel performans endeksleri izole gösterir. Beş izolat (3, 14, 27, 28, 33) bir araya getirilmiş hidrolizatı varyasyonlar ve besin koşulları tüm en sağlam olarak sıralanmış olan 60 ° C'nin üzerinde, genel RPI vardı. Tablo 3 gözden geçirildiğinde, her iki 3 ayırır ve 27, 28 ve 33 AFEX CSH ya AFEX CSH ve ksiloz üzerinde etanol-meydan sürekli kültür gelişti ise 14 PSGHL içinde geliştirildi. Üstün çoklu hidrolizat kullanımını gösteren suşların hiçbiri birden fazla hidrolizat üzerinde gelişti bulundu.

Bazı suşlar "uzmanlar" ya SGH-N1 / 2 veya AFEX CSH daha iyi performans idi. SGH üzerinde uzman olarak en iyi performansı bu izolatlarhidrolizatları (11 16 ve 9) nihai ya da sadece meydan okuma olarak PSGHL evrim ile elde edilmiştir. Başlangıçta AFEX CSH meydan artırılarak zenginleştirildi izolatları 11 ve 16 için verimli AFEX CSH kullanabilme becerisi aktif PSGHL içinde uzun nihai zenginleşme sırasında seçilen değildi ve kullanımını destekleyen önemli genetik faktörler açıkça kayboldu. Bunun aksine, 14, 25, 27, 30 ve 33 her türlü AFEX CSH ilgili performans ve 14 izolatı ile ya da etanol meydan vermeden AFEX CSH gelişti edildi hariç olduğu izole eder. beklendiği gibi Yani, AFEX CSH üzerinde evrimi yönettiği veya PSGHL iyi seçim hidrolizatma adapte maya için seçmek eğiliminde. Bu bakımdan, bir özel durum izole 14. İzole 14 tek sorun PSGHL kaynaklanan ve son PSGHL zenginleştirme kültür YM agar seyreltme kaplama izole oldu. Slininger ve ark., 18 mevcudiyetinde glikoz yetişen hücreler ksiloz enzim indüksiyonu birçok özelliğine sahip olması, bu izolat gösterdi5-15 g / L asetik asit ve glükoz-ksiloz geçiş noktasının öncesinde meydana> 30 g / L etanol rağmen 75 g / L glukoz ve ksiloz her biri ile ODM diauxic gecikme azaltılabilir.

Ana suş S. göre gelişmiş suşların her türlü kinetiği Tablo 4'te gösterildiği gibi, stipitis NRRL-Y-7124 25 ° C'de silikon sünger kapakları 125 ml'lik şişelere inkübe (pH 6.2) bir 620 8.4 ± 2.5 75 mi SGH-N2 başlangıç aşılanmış düşük düzeyde havalandırma şişe kültürleri sonuçlarını temsil gösterildi ° C, 150 rpm (1 "yörünge) ve A 620, 0.5 ml 23 SGH-N2 50 ml başına şişesi başlangıç aşılanmış orta havalandırma şişesi kültürleri temsil eden Şekil 7'de. 18 Bu koşullar tarafından önerilen iki farklı çalışma türlerini temsil S. stipitis tarafından etanol üretimi için potansiyel ticari umut verici olarak edebiyat. 8,22 köknar isehızlı fermantasyon hemen başlaması için düşük seviye havalandırma t örneği, yüksek hücre yoğunluğu sağlar. ikinci etapta ise, logaritmik büyüme düşük hücre yoğunluğu ve üst düzey havalandırma Kurşun nüfusu oluşturmak ve etanol büyüme ile ilişkili şeker dönüşümü hızlandırmak için. Bu veriler, gelişmiş suşlar ana suş üzerinde önemli kinetik avantajlara sahip olduğunu göstermektedir: daha hızlı bir glukoz alımını oranı genel olarak glikoz ve ksiloz ve hem de (Tablo 4), daha çok hızlı, spesifik ksiloz alım oranı (Tablo 4), daha hızlı bir etanol verimliliği (Tablo 4), daha kısa bir gecikme büyüme Yukarıdaki (Şekil 7), ve daha kısa diauxic glukoz geçiş lag ksilozun için. Etanol üst NRRL-Y-7124 görüldü 40 g / L den fazla ve en yüksek gün önce (Şekil 7) birikmesine izin Bu geliştirmeler. Yüksek genel etanol verimlilik (Tablo 4) 5 kez 1.5 elde edildiebeveyn suşu (Tablo 4), bir evrimleşmiş gerginlik bağlı olarak bu s.

Şekil 1
Şekil 1:. Scheffersomyces stipitis adaptasyon akış şeması gösterilmiştir diyagram adaptasyon sürecinde uygulanan gerilmelerin sırasını ve üstün izolatların (Parantez içindeki rakamlar) kurtarma noktalarını gösterir. Ayrıca gerilme kimlikler için referans olarak Tablo 3 izole anahtarı. Zaman oryantasyon sağlamak için, kırmızı sayılar adaptasyon her aşamasında gün sayısını gösterir. AFEX CSH ve ksiloz zengin PSGHL seri aktarım fazlar için, adaptasyon her gün yaklaşık 2-4 nesiller temsil eder. (205 gün toplam) Sürekli kültür aşaması için, seyreltme oranı D 0-0,1 saat ~ değişken oldu -1 pH çalıştırılan beslenme ile çalışma 125 d sırasında. Gelecek80 gün, operasyon bir kuşak süresi (ln 2) 58 saat, veya kararlı durumda 2.4 d başına 1 nesil / (D) sağlayan, 0.012 saat -1 D ile sürekli bir akış oldu. Sonraki 205 günlük sürekli kültür uyarlanan nüfus numune, UV ışığı ile mutagenize ve 0.012 saat -1, D ile çalıştırılan kesintisiz bir kültüre inoküle edilmiştir. (Slininger ve ark., 18 den çoğaltılmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:.% 6 glukan AFEX csh'ın Geliştirilmiş kesikli fermantasyon Scheffersomyces stipitis NRRL-Y-7124 AFEX CSH (A) ile karşılaştırıldığında ana suş fermentasyon% 6 glukan koloni 5 fermentasyon% 6 glukan AFEX-muamele edilmiş mısır koçanı, H uyarlanmışydrolyzate (B). Semboller biyokütle (kırmızı kare), glukoz (kesikli çizgi ile siyah daire), ksiloz (düz çizgi ile mavi daire), etanol (yeşil üçgen) ve ksilitol (mor elmas) belirler. (Slininger ve ark., 18 den çoğaltılmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Karışık şekerler tanımlanmış ortam içinde diauxic gecikme Azaltılmış Fermantasyon Performans ODM karşılaştırılmıştır 66 g / L glukoz ve 87 g / L ksiloz ile ana soy S.. stipitis NRRL-Y-7124 (A) AFEX CSH-Y-7124, (B) elde edilen popülasyon, adapte S'den izole edilmiş tek hücre kolonisi 1 adapte stipitis popülasyonu (C) tek bir hücre ColoNY 5 adapte popülasyon (D) izole edilmiştir. Semboller biyokütle (kırmızı kare), glukoz (kesikli çizgi ile siyah daire), ksiloz (düz çizgi ile mavi daire), etanol (yeşil üçgen), ksilitol (mor elmas) ve adonitol (siyah kenarlı altın elmas) belirler. (Slininger ve ark., 18 den çoğaltılmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: Koloni 5. hidrolizat dayanıklı koloni 5 Etanol dayanıklı türevleri daha tek karbon kaynağı ve etanol yüksek seviyede olarak ksiloz içeren ODM sürekli kültür seçimi ile geliştirilmiştir. İki türev gliserol stok seçim süreci (2A.1.53R, turuncu üçgen ve kesikli çizgi) erken elde popülasyonları veSürekli kültür aşı (2A.1.30R.2, mor daire ve kesik çizgi) fter UV ışınlaması NRRL Y-7124 ana suşu (katı çizgi ile yeşil daire) ve AFEX CSH hoşgörülü Colony 5 (siyah üçgen ile karşılaştırıldığında gösterilmektedir düz çizgi). 40 g / L etanol ile ODM glikoz yetiştirilen maya yoğun popülasyonları (A 620 = 50) ile ksiloz alımı, tüm uyarlanmış türlerine ksiloz metabolizmasını indükleme yeteneği uyumsuz üst aştı olduğunu göstermiştir. (Slininger ve ark., 18 den çoğaltılmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5:. Ebeveyne göre hoşgörülü izolatın performans iyileştirme oranı üstün toleranslı izolatlarının performansları göre özetlenmiştirPSGHL her formülasyon (A, B) için, kontrol, ana NRRL-Y-7124. Performans ksiloz alımı oranı açısından değerlendirildi verilen şeker başına ve etanol verimi (ebeveyne izolatın oranlarını temsil yeşil çubuklar) (ebeveyne izolatın oranlarını temsil mavi bar). (Slininger ve ark., 18 den çoğaltılmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: RPI'nin dayalı izole sıralaması. göreceli performans indeksi (RPI) kavramı 33 sıralamak için ikincil ekran performans sonuçlarına uygulanan ksiloz alım oranı ve verilen şeker başına etanol verimi esas alarak her hidrolizat türü içinde izole eder. (A) göreceli koştuherhangi bir izolatın kral hidrolizat tipine bağlı (P <0.001): SGH-N1 (mavi bar), SGH-N2 (kırmızı bar) ve AFEX CSH (yeşil çubuklar). (B) tüm hidrolizat türleri arasında hesaplanan genel RPI (açık mavi bar) farklı hidrolizat koşulları genelinde en güçlü performansı ile üstün suşları gösterdi. (Slininger ve ark., 18 den çoğaltılmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil 7: S. üstün uyarlanmış izolatların Karşılaştırmalı SGH fermantasyonları stipitis. Üstün izolatı adapte ve üst NRRL-Y-7124, düşük başlangıç pH 6.2, 25 ° C 'de seyreltilmiş asit ile işleme tabi tutulan switchgrass (% 20 katı yükleme) enzimatik hidrolizatları fermantasyon ve ilk karşılaştırıldığında Hücre yoğunluğu. Zaman biyokütle kursları (kırmızı kareler), glukoz (siyah daireler ve kesikli çizgi), ksiloz (mavi daireler ve düz çizgi) ve etanol (yeşil üçgenler) gösterilmektedir. Hata çubukları sembollerle işaretlenmiş ortalama değeri hakkında aralığı temsil etmektedir. (Slininger ve ark., 18 den çoğaltılmıştır) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1:. Cultivations kullanılan hidrolizatlarından kompozisyonlar (. Slininger ark 18 den çoğaltılmıştır) Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.

Tablo 2: Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 7 için en uygun belirlenmiş bir ortamtps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> bu tabloyu indirmek için tıklayınız.

Tablo 3:. Bitki biyokütle hidrolizatlarından fermantasyon için üstün toleranslı Scheffersomyces stipitis suşların Özeti (. Slininger ark 18 den çoğaltılmıştır) Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.

Tablo 4: darı hidrolizat SGH-N2 izolatların Karşılaştırmalı kinetik başlangıç aşılanan A 620 = 8.4 ± 2.5 Oranları glukoz veya ksiloz tüketimi sırasında birim absorbans başına normalize oranları.. (Slininger ark dan yeniden basılmıştır. 18) , bu ta indirmek için tıklayınızble.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Birkaç adım evrim sürecinin başarısı için kritik idi. Birincisi, başarılı bir uygulama için gerekli olan istenilen fenotip doğru nüfus evrimi götürmek uygun seçim baskıları seçmek için anahtardır. Aşağıdaki seçici gerilmeleri S. seçildi gelişimi stipitis ve istenen fenotipleri için zenginleştirme yol uygun zamanlarda uygulanır:% 12 (asetik asit ve furan aldehitler ve diğer inhibitörleri düşük seviyelerde mevcudiyetinde büyüme ve çeşitli şekerlerin fermentasyonu kuvvetleri) glukan AFEX CSH artan güçlü; ksiloz (diauxic lag azaltmak için ksiloz enzim indüksiyon zorlar) etanol konsantrasyonu artan sürekli kültürleri beslenen; (yüksek asetik asit, furanlar ve diğer inhibitörlerin varlığında büyüme ve ksiloz fermentasyonu kuvvetleri)% 20 katı yükleme PSGHL güçlü artar. İkincisi, gliserol s dondurarak gelişen maya popülasyonları korumak için önemlidirNüfus örneklerinin Tocks zenginleştirme süreci ilerledikçe. Nüfusun bu tür anlık evrim ilerlemesini belgelemek ve istediğiniz gibi daha sonraki izolasyonların izin vermek veya aradan sonra evrim süreçlerini yeniden periyodik fonksiyonel test için saklanabilir. evrim prosedüründe bir üçüncü anahtar aşama (örneğin hidrolizat ve / veya etanol konsantrasyonları bir dizi sunan bir gerilme derecesi içeren agar ya da mikro-levhalar gibi) uygun bir seçici ortam üzerinde Seçim kültür popülasyonları veya gliserol dolu popülasyonları zenginleştirerek olağanüstü izolatları bulmaktı . En stresli koşullarında yetiştirilen Sonra hayatta kalan koloniler daha sonra karakterizasyonu için korumak için alınabilir. Bu üç temel adımlar uygun olduğunda tek bir döngü içinde, alternatif olarak, çok sayıda basınçlar her ek istenen fenotipin seçimi basıncı sürdürmeye tekrar ya da edilebilir. yerli ana maya nüfus çeşitli baskılara maruz kaldığında, genetik çeşitlilik th ortaya çıkması bekleniyor kaba doğal veya uyarılmış mutasyonlar ve devam eden maruz kalma, doğal seleksiyon rekabetçi hayatta kalma destekleyen en yararlı mutasyon olan bireyler için zenginleştirmek için izin verecektir. Seçilen fenotipi çok genetik mutasyonlar sonucunda meydana gelmesi beklenir. Yukarıdaki protokol, mutasyonlar, UV tedavisi sırasında ya da potansiyel hidrolizatlarının için maya maruz kalma sırasında indüklenebilir. Hidrolizatları zarar mikroorganizmalara bileşiklerin üç sınıf içerdiği bilinmektedir. Karboksilik asitler, aldehitler ve fenolikler gibi furfural ve 5-hidroksimetilfurfural, hücrelere zarar ve tipik olarak üretilen reaktif oksijen türünün bir yükseklik (ROS) neden olabilir ve 22 reaktif aldehidler, mitokondri. ROS iyi ökaryotik hücrelerde DNA mutasyonlarının neden olduğu bilinmektedir. Hidrolizatları bulunan 23,24 fenolikler, daha önce genotoksik olduğu bilinen olmasa da, aldehit ve mutajenik ROS mutajenik etkileri teşvik etmek ve synergize olabilir. 25

jove_content "> giderek zorlu ortamlarda adım adım strateji fenotip iyileştirmeler bir dizi ile gelişti suşlar inşa bekleniyor, hem hedef hem de. Bazı hedefli olmayan fenotipleri istenmeyen veya kararsız olduklarını ortaya olasıdır hedefli olmayan olduğunu. amacıyla en çok işleyen ve güçlü suşları yakalamak için, alınması gereken ek bir önemli bir adım, hem hedef ve hedefli olmayan fenotip ulaşan, değerlendirilmesi ve ticari ilgili özellikler için seçilen izolatları karşılaştırmaktır. bunu yapmak için, performansları karşılaştırıldığında gerektiğini izolat bu tür geniş bir endüstriyel lignoselülozik alt-tabaka varyasyonuna sabit ve sağlam en iyi genel soyların seçimi sağlayan farklı inhibitör zorluklar ve besin formülasyonlar ile hidrolizatları gibi uygulamaya yönelik stres koşulları, çeşitli. Buna ek olarak, bir gerilme dayanıklılık baskılarına katılabilecektir preculturing adımlar involv dahil ederek örnekte yapıldığı gibi ekranİki seçici olmayan medya, ek 6-7 nesiller için 50 g / L ksiloz sentetik ODM ardından birkaç nesildir YM agar, performans zorluk içinde maruz bırakılmadan önce istenen kültür özelliklerinin istikrarın bozulması için verilmesi fırsatı başlangıç ​​maya büyüme ing hidrolisat. etanol verimi ve ksiloz emiş hızı, önemli performans özelliklerine bağlı olarak, daha sonra izole izolat zenginleştirme kültür ortamından farklı olabilir, test edilen her hidrolizat ortamı olarak, her biri farklı bir stres durumu sıralanır. boyutsuz RPI karşılaştırılan izolatların ortalama genel göreli performansını ve rütbe hesaplamak için kullanılabilir. Bir boyutsuz faktör göreli hidrolizatlarından farklı tipte performans ve bu tür oranları karşı verimleri gibi farklı performans değerlendirme dayalı yansıtmak için uygundur. Bu sıralama prosedür büyüme koşulları ve hydr gerçekleştirmek suşları sürekli iyi genelinde geniş varyasyonlar tanımlarolyzates ve sağlam ve genetik kararlı hem de olmaya yatkındır.

Çeşitli tekrarlamalar ve bu temel adımların değişiklikler lignoselülozik hidrolizatları veya diğer ilgi yüzeyler üzerinde belirli veya benzersiz performans özellikleri yeteneğine sahip herhangi bir mikrobiyal zorlanma evrimini karşılamak için gerekli olabilir. S. olarak örnek stipitis, yüksek katı yüklemede hazırlanan hidrolizatları için düşük maliyetli ticari kaynaklardan da dahil olmak üzere besin takviyesinin, dikkat edilmesi gereken tarama sırasında gelişmiş istatistiksel ayrılması için izole performansları dinamik aralığını kontrol anahtarı önemli idi. Konsantre önleyici hidrolizatlarının başarılı bir şekilde fermantasyon besin önemi, daha önce rapor edilmiştir ve amino asitler ve stres koşullarının bir sonucu olarak, hücre bakım, redoks dengesi ve tamiri için gerekli olan diğer besinler için yüksek bir ihtiyacı nedeniyle olduğu düşünülmektedir özellikle ksiloz kullanımı sırasında. 9,26,27besinler çok seyrek ya da çok bol olduğu, ayrıca, izole performansları farklılıklar nedeniyle tüm izolatlar derece kötü yapıyor, ya da tüm sırasıyla derece iyi yapıyor istatistiksel tespit etmek zor olabilir. farklı koşullar endüstriyel koşullarda varyasyonlara, güvenilir ve sağlam olması bekleniyor de altında yapabilen izole eder.

Bu protokolün ana sınırlama adaptif evrim ve tarama bu "tek tek için zenginleştirir ve ekranları ne alırsınız" olarak, sonuç çok değişmez olmasıdır. Böylece, zenginleştirme ve ekran koşulları yükseltmek ve hala arzu önceden var olan özelliklerini koruyarak fenotipleri arzu edilen değişiklikler ile, sırasıyla, bireyleri tanımlamak için tasarlanmış olması gerekir. Evrim endüstriyel performans (örneğin, büyüme faktörü gereksinimleri) için kritik özellikler için seçili olmayan etkileyebilir. Bu nedenle, tek bir özellik için popülasyon zenginleştirme ilerleme düzenli olarak izlemek gerekiristenmeyen değişiklikler için sorun giderme yöntemi olarak diğer özellikler için ed. Örneğin, S. eşsiz özelliklerinden biri için stipitis büyümeye ve ksiloz fermente yerli yeteneğidir. Tüm zenginleştirme ve tarama alt-tabakalar, inhibitörlerin varlığında tek ya da anahtar katkıda karbon kaynağı olarak ksiloz dahil. Sonuç olarak, bu örnekte, zenginleştirme kültürlerin her bir ortak özelliği, doğrudan olan nüfus daha iyi rakip çünkü seri ya da sürekli kültür içinde daha zenginleştiğini daha hızlı ksiloz kullanılarak suşlar, seçilen oldu. amaçlanan bir sonucu olarak, geliştirilmiş suş daha hızlı bir ksiloz alımı yapamadı, etanol verimi artışı çok daha az dramatik ksiloz yükseliş hızı geliştirmeler miktardan daha fazladır. ana suş ile etanol verimi nispeten yüksek olduğu için ikinci bir eğilim olasılıkla ortaya çıktı olarak 0.3 g / g kadar ya da teorik% 60 (0.51 g / g), hücre büyümesi için daha az yer kalmakta, hidrolizatları durağan oldu gibigelişme iyilesme duzelme ilerleme. kültürler, daha yüksek verimler, etanol muhtemelen etanol Bu özellik için evrimleşmiş nüfusun performansının izlenmesi zorunlu büyüme önleyicisi, çünkü karşı seçilebilir. büyüme inhibisyonuna seviyesinin altında muhafaza Etanol konsantrasyonları seçim unsuru olarak nötralize eğiliminde olacaktır. S. stipitis NRRL-Y-7124, 40 g / L etanol yarım özgül büyüme oranı, 64 g / l, tamamen önler. Sürekli Kültürleri ksiloz beslenen meydan etanol 28, havalandırma düşük tutulması ve seyreltme oranları da mevcut geniş ksiloz yeterince düşük tutuldu foster fermantasyon yerine etanol solunum ve istenmeyen etanol kullanımı özelliği zenginleşmesini önlemek. maya özütü gibi pahalı bir zengin bir besin kaynağına ihtiyaç suşlar için seçilerek önlemek için, ayrıca performansı ekranlarında kullanılan hidrolizatları besin takviyeleri özenle tasarlanmıştır. Takviyeler her zaman availabl düşük maliyetli ticari kaynaklar dahilBu YM olarak zengin parçalar, normal olarak bir azot tüketen% 60 ve% 75 PSGHL formülasyonlarında karşılaştırmalı testler için, ikili kültür uygulanmıştır, ancak soya unu ve üre e,. Ön kültür ve performans kültürü ekranlarında kullanılan ODM sentetik ortam, aslında ana suş S. optimal performans için tasarlanmıştır stipitis NRRL Y-7124 Tüccarlar Protein maliyetli endüstriyel ölçek büyütme kullanarak uyumlu besinleri tedarik vitaminler, mineraller, Pürinlerin ve amino asit kaynakları dahil olmak üzere tanımlanan maddeler, önerir 20 tarafından açıklanan kültür ortamı optimizasyon rutin uyarınca 7 ticari kaynaklar. İlgili suşları tasarımında son bir öneri, beklenen endüstriyel proses koşullarına mümkün olduğunca ilgili zenginleştirme ve ekran koşulları tasarımını tutmaktır.

Maliyet rekabet yenilenebilir etanol uzun r takip edilmiştirfosil yakıtlara bağımlılığı educe. S. yeteneğini geliştirmek için stipitis NRRL Y-7124, tahammül büyümek ve lignoselüloz inhibitör hydrolyzates mayalanmaya, bazı araştırmacılar Over-liming detoks lignoselülozik biyokütle seyreltilmiş asit-ön kaynaklanan ksiloz zengin içki tekrarlayan kültürlenmesini. 13,14,16,17 kullanmış inhibitörleri hala parke ve buğday samanı ön likör erken adapte suşları performansı makul bir düzeyde sağlamak için gerekli. UV mutagenez ve genom karıştırma ve 13,14 Çoklu tekrarlanan mermi S. türevlerini geliştirmek için uygulanmıştır geliştirilmiş önleyicisi tolerans ve ahşap büyüme ile stipitis NRRL-Y-7124 sülfit likörü (HWSSL) geçirdi. 16,17 Ancak HWSSL bu cinsler tarafından üretilen etanol konsantrasyonu 6 ila 7 gün sonra, 10 g / L altında idi. Burada gösterilen ve tarif edilen teknikler, S. yeni gelişmiş türleri kullanılarak stipitis NRRL Y-7124 phenoty karşılamak için geliştirilmiştirpe hedefleri ekonomik ticari kullanım için gerekli: hidrolizatlarından fermantasyon gibi pahalı atık imhası yol açar-Kireçlik olarak üzerinde önceden detoksifikasyon önlemler olmadan pH 5-6; büyük ölçüde büyüme ve diauxic gecikme azalır; Ticari damıtma (> 40 g / L etanol) için yeterince yüksek etanol birikimleri; Daha önce undetoxified hydrolyzates fermente yerli maya suşları için bildirilen daha hızlı büyüme ve etanol verimlilik; ve ve katkısız AFEX CSH (aksi azot yoksul) uygun soya azot takviye SGH dahil olmak üzere yüksek katı yüklemede farklı hidrolizatları, performans. romanına Yukarıda özetlenen önemli adımlar somutlaşan olarak evrim agresif yaklaşımlar kullanılarak geliştirilen gelişmiş suşlar, işletme maliyetleri, sermaye maliyetleri ve enerji ve su girişlerini azaltarak tarımsal biyokütle etanol üretimi ekonomisini yararlanması bekleniyor. Bu ilk gerilme evrim planı S. uyarlanmış suşları elde bildirilmiştir stipitundetoxified hidrolizatları ekonomik açıdan geri kazanılabilir etanol üretimini gösteren olduğunu.

S. yeni suşlar evrim sürecinde (Şekil 1) her aşaması kaynaklanan stipitis gelecek çalışmalar için aday spesifik seçim uygulanan baskılar ve mekanizmalar gibi inhibitör hoşgörü ve azaltılmış diauxic gecikme olarak geliştirilmiş hidrolizat fermantasyon yatan temel nitelikleri ile ilişkili genetik değişimlerin belirlenmesi için vardır. Böyle değerli yeni bilgi biyoyakıt ve diğer ürünlere lignoselüloz dönüştürülmesi için yeni nesil maya Biyokatalizörler ve süreçlerin mühendislik yardımcı olacaktır. Yeni suşlar, türetilmiş olduğu için, büyük olasılıkla daha hidrolizatları ticari kullanım için en yararlı transformantların seçilmesi için burada tarif edilene benzer bir gerilme gelişimi protokolü üzerinden türevi nüfus geçmesi için yararlı olacaktır. Yeni mikrobiyal suşlar potansiyeline sahip keşfedilen Benzer şekilde, bir yapmak benimYenilenebilir biyokütleden kullanışlı yeni ürünlerin Riad, evrim süreci daha da potansiyel olarak yeni biyo-katalitik prosesler ve ürünler kullanılabilir hale sağlayan, hidrolizatları strain sağlamlık ve verimliliği artırmak için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour Archer Daniels Midland Co. (ADM) 63160 ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant) Sigma-Aldrich P1300 Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids Becton Dickinson and Company 228830 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan  Sigma-Aldrich T3300 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine  Sigma-Aldrich C7352 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar Becton Dickinson and Company 214010 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract Becton Dickinson and Company 218630 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract Becton Dickinson and Company 212750 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean Fluka P0521-500g multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder Sigma-Aldrich A8626 CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99% Sigma-Aldrich C3506 CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra Sigma-Aldrich G6779 CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99% Sigma-Aldrich T0376 CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99% Sigma-Aldrich U0750 CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS Fisher Chemical D16-500 CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99% Sigma-Aldrich X1500 CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates Becton Dickinson Falcon 351172 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper Kimberly-Clark towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) Corning Life Science Glass 4980-125 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) M1335-0016 multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates Applikon Biotechnology Z365001700 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates Applikon Biotechnology Z365001296 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover Applikon Biotechnology V0W1040027 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover Applikon Biotechnology V0W1040001 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene Applikon Biotechnology ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks Bellco 1924-00032 Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. Bellco 1968-00100 (original Cat. No.) Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven MathisAg Typ-Nbr BFA12 215307 Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer YSI Life Sciences 2900D-UP www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer Bio-Tek Instruments, Inc MQX200R www.biotek.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
  3. Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
  4. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
  5. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
  6. Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
  7. Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
  8. Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
  9. Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
  10. Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
  11. Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).
  12. Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
  13. Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
  14. Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
  15. Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
  16. Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
  17. Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
  18. Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
  19. Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
  20. Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
  21. Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
  22. Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
  23. Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
  24. Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
  25. Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
  26. Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
  27. Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
  28. Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).

Tags

Biyomühendislik Sayı 116, fermentasyon inhibitörleri göreli performans indeksi anahtar otu mısır koçanı hidrolizat furfural asetik asit hidroksimetilfurfural
Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M.… More

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter