Introduction
Igennem human graviditet, placenta cytotrophoblastceller, som er mononukleære stamceller, hurtigt proliferere og differentiere til enten villøse eller extravillous cytotrophoblastceller. Extravillous cytotrophoblaster invadere og remodel spiral arterier i livmodervæggen. Villøse cytotrophoblaster, på den anden side, fortsætter med at proliferere, differentiere og sikringen til dannelse flercellede syncytiotrophoblast (syncytium) 1. Opretholdelsen af villus trofoblast homeostase er afgørende for føtal trivsel og sund graviditet. Faktisk villøse trofoblaster tillader maternel-føtal udveksling af ilt og næringsstoffer, og producere væsentlige hormoner for graviditet. Desuden syncytiotrophoblast er den eneste celletype i direkte kontakt med den maternelle blodomløb og giver en væsentlig fysisk og immunologiske barriere. Derfor skal syncytiotrophoblast undergå apoptose og erstatning for homeostatiske vedligeholdelse og avoid placenta patologier 2-5.
Teknikken er udviklet af Kliman et al. 6 i 1986 at isolere primære villøse cytotrofoblaster fra menneskelige moderkager forårsagede en revolution i placenta forskning ved at tillade undersøgelse af de molekylære mekanismer, der er involveret i villøs trofoblasten differentiering. Denne klassiske teknik, baseret på sekventielle enzymatiske fordøjelse med trypsin og DNase, efterfulgt af isolering i densitetscentrifugering medier (kolloide silicapartikler overtrukket med polyvinylpyrrolidon, eller Percoll) er nu anerkendt som den gyldne standard for isolering villøse cytotrophoblastceller. Teknikken kan optimeres ved magnetisk immunorensning, en procedure, der adskiller villøse cytotrophoblaster fra ikke-trofoblastiske celler baseret på den differentielle ekspression af specifikke antigener på overfladen af disse celler. Vi valgte den humane leukocyt antigen ABC (HLA-ABC) på grund af fraværet af dets ekspression på trophoblastisk celle membrane 7,8.
Moderkagen er et organ, der undergår dramatiske variationer i ilt niveauer under graviditet. I det første trimester, iltning forholdet er fysiologisk meget lav (2% O 2), men stiger til milde niveauer af iltning (8% O 2) i andet og tredje trimester. Tuuli et al. 9 beskrevet, at in vitro-gengivelse af trofoblast miljø inde i placenta villi er en udfordring og variationer i iltning niveauer kan endda føre til fænotypiske ændringer. Det er derfor, foreslog at vedtage 8% ilt som normoxi at efterligne ilt spænding findes i placenta villi i tredje trimester af drægtigheden 8,9. Chen et al. 10. studeret indgående flere variabler i relation til ilt spændinger i trofoblast cellekultur og vist vigtigheden af at bestemme iltindholdet i en pericellulært miljø. Niveauerne af oxygen i villi tendens til at øgegrundet vaskulogenese. Blodgennemstrømningen i placenta villi stiger stabilt og niveauet af hydrogenperoxid (en rigelig reaktive oxygenarter) er et vigtigt signal, der styrer vaskulogenese 11,12. I graviditet komplikationer, manglende vaskulogenese genererer hypoxi, og endnu vigtigere, intermitterende variationer af iltning (kaldet hypoxi / reoxygenering). Disse forhold kan føre til en unormal stigning i oxidativ stress, som kompromitterer placenta og føtal levedygtighed 13,14. De ændringer, der trophoblastceller undergår in vivo under episoder med hypoxi / reoxygenering kan efterlignes in vitro som følger: villøse cytotrophoblaster opretholdes under normoxiske betingelser (8% O 2), indtil de differentierer til syncytiotrophoblast. De er derefter udsat for hypoxiske betingelser (0,5% O 2) i 4 timer, efterfulgt af yderligere 18 timer for normoxi (reoxygenering). Brug af denne hypoxi / reoxygenering tilgang, trophoblaster exforbyde dereguleret redox status og forhøjede niveauer af iboende apoptose 8, som er blevet observeret i visse graviditet komplikationer. Derfor er dette en nyttig in vitro model til at vurdere nye forebyggende og terapeutiske metoder til at bekæmpe graviditet komplikationer forbundet med placenta hypoxi / reoxygenering.
Placentale celler producerer melatonin, som har flere vigtige funktioner, såsom en evne til at forebygge oxidativ stress og placenta dysfunktion 15. Her præsenterer vi de eksperimentelle tilgang og celle modeller, der anvendes til at påvise de beskyttende virkninger af melatonin i placenta trophoblastceller på molekylært, cellulært og funktionelle niveau 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Moderkager blev opnået umiddelbart efter spontane vaginale leverancer fra ukomplicerede graviditeter på kammerat-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Canada, med informeret patient samtykke og godkendelse af etiske udvalg (KAMMERAT-St-Luc Hospital og INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada).
1. Isolering og oprensning af villus cytotrophoblastceller
- Løsninger og medier
- Forbered transportmedier ved supplering Dulbeccos modificerede Eagles Medium High-Glucose (DMEM-HG) med 1% vol / vol antibiotikum (10.000 enheder / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycin sulfat) og opbevares ved 4 ° C.
- Forbered primær dyrkningsmedier ved supplering DMEM-HG med 10% vol / vol føtalt bovint serum (FBS), 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES), 1% vol / vol antibiotikum (10.000 enheder / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycin sulfat) og opbevares ved 4 ° C. Varm medier til 37 ° C førbrug.
- Forbered 4 l saltopløsning (0,9% vægt / vol natriumchlorid).
- Fremstille modificerede Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ved tilsætning af 25 mM HEPES til 1x HBSS (pH 7,4).
- Friske, fire flasker fordøjelse opløsning med et modificeret HBSS (fremstillet i 1.1.4), magnesiumsulfat (MgSO4), calciumchlorid (CaCl2), trypsin, deoxyribonuclease IV (DNase IV), og 1% vol / vol antibiotikum ( 10.000 enheder / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycinsulfat) som vist i tabel 1.
- Forbered densitetscentrifugering medier gradient
- Forbered densitetscentrifugering medier opløsning ved at supplere densitetscentrifugering medier med 10% vol / vol HBSS 10x.
- Forbered 14 assayrør med densitetscentrifugering medier opløsning og modificeret HBSS, som beskrevet i tabel 2.
- Bland hver densitet løsning (trin 1.1.6.2) kraftigt før du tilføjer dens indhold til gradienten. forsigtigttilføje densitet løsninger på en 50 ml glas centrifugerør med en peristaltisk pumpe (1 ml / min), der begynder med den højeste koncentration (70%). Undgå dråber ved dræning opløsningerne mod rørvæggen at opretholde den passende adskillelse af hvert lag af gradienten.
- I mangel af en peristaltisk pumpe, anvender lagene meget forsigtigt med Pasteur-pipetter.
- Forbered endelig kører buffer ved at supplere den løbende buffer (se tabel of Materials) med 2% vol / vol antibiotikum / antimykotikum (10.000 enheder / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycin-sulfat). Opbevares ved 4 ° C.
- Villøs cytotrophoblast isolation
Bemærk: Brug sterilt kirurgisk udstyr, glas, pipetter, kolber mv- På dagen for villøs cytotrophoblast isolation, i et 37 ° C vandbad, opvarme spaltninger løsninger (fra trin 1.1.5) og 70 ml FBS. Bemærk: Brug 50 ml FBS at afbryde de spaltninger ogresterende 20 ml til indefrysning trin (1.2.22), som kan placeres på is, når optøet.
- Efter fødslen bringe placenta til laboratoriet i iskoldt transportmedium (fra trin 1.1.1) så hurtigt som muligt (under 1 time).
- Kassér transportmedium og placenta blod i flydende skraldespand. Vejes placenta og fordybe i koldt saltvand.
- Mål og analysere følgende funktioner: navlestrengen længde; navlestrengen lokalisering; placental længde, bredde, form (oval, discoid); farve membran; cotyledon struktur patologier. Bemærk: Data er præsenteret i resultatafsnittet.
- Skær navlestrengen sideløbende med sin placenta indsættelse (dvs. på sin base med yderligere 1 cm radius cirkel omkring ledningen). Fordybe i 300 ml histologisk væv fikseringsopløsning (formalin 10%) for senere histologisk analyse.
- Skær hele placenta i kuber af 5 x 5 x 5 cm. Vask grundigt (4 gange x ~ 1 min) i saltvand solution (0,9%) for at fjerne blodceller, indtil saltvandsopløsning er klar. Kassér skyllevæske.
- I et urglas, fjerne placentale membraner og hakkekød væv til at fjerne blodkar og forkalkninger. Hold blodkar fast med pincet og fjern væv under anvendelse bagsiden af Metzenbaum saks.
- Placer hakket placenta i en Buchner tragt. Skyl med ca. 100 ml saltvand buffer. Fortsæt hakning indtil 30-35 g hakket væv opnås (brug plast vejer båd og skala). Hvis det er nødvendigt, hakkekød resten af moderkagen at opnå op til tre yderligere 30 - 35 g præparater. I løbet af denne tid, sætte hakket væv i en vejebåd på is.
Bemærk: Dette trin vil tage omkring 45 min til 1 time.
- Placer hakket placenta i en Buchner tragt. Skyl med ca. 100 ml saltvand buffer. Fortsæt hakning indtil 30-35 g hakket væv opnås (brug plast vejer båd og skala). Hvis det er nødvendigt, hakkekød resten af moderkagen at opnå op til tre yderligere 30 - 35 g præparater. I løbet af denne tid, sætte hakket væv i en vejebåd på is.
- Tilføj de 30 - 35 g hakket placentavæv til en trypsinbehandling kolbe. Transfer 150 ml af det forberedte fordøjelse opløsning 1 (tabel 1) til trypsinbehandling kolben og bland godt.
- Placer trypsinbehandling kolben iet rystevandbad i 30 minutter ved en hastighed på ikke mere end 50 cykler / min og manuelt blande trypsinbehandling kolben hver 5 min til homogen fordøjelse.
- Ved afslutningen af den første fordøjelse, den trypsinbehandling kolben fra vandbadet og vippe det (45 °) i 1 minut for at sedimentere det placentavæv. Med en 10 ml steril pipette, fjerne og kassere ca. 80 ml supernatant. Undgå opsugning vævet.
- Transfer 100 ml fordøjelse opløsning 2 (tabel 1) til trypsinbehandling kolbe; bland godt og gentag trin 1.2.9.
- Ved slutningen af den anden fordøjelse, den trypsinbehandling kolben fra vandbadet og vippe det 45 ° i 1 min. Med en 10 ml steril pipette 80 ml supernatant og overføre forsigtigt til et centrifugerør med en cellesigte (100 um mesh). Overfør den filtrerede supernatant til et bægerglas indeholdende 2 ml FBS hver gang centrifugeglasset er fuld.
- Udfør den tredje fordøjelse som beskrevet foranden fordøjelse (1.2.11 og 1.2.12) ved hjælp af 75 ml fordøjelsen løsning 3. Sideløbende udføre trin 1.2.15 til 1.2.16.1 for fordøjelsen 2.
- Udfør den fjerde fordøjelse præcis som den tredje fordøjelse ved hjælp af fordøjelse løsning 4 (75 ml), men indsamle en maksimal mængde af supernatant. Udfør trin 1.2.15 til 1.2.16.1 parallelt for fordøjelsen 3, og endelig for fordøjelsen 4.
- Alikvot supernatanten (fra fordøjelser 2, 3 og 4) i 13,5 ml dele, hver del i en 15 ml centrifugerør. Med en 22,8 cm lang glas Pasteur-pipette, meget forsigtigt og langsomt placere 1,5 ml FBS i bunden af hvert rør for at skabe et separat lag. Bland ikke FBS og supernatant. Centrifuger rørene uden bremse i 20 minutter ved 1.250 xg ved stuetemperatur.
Bemærk: Efter centrifugering 4 lag er synlige i røret, som vist i figur 1 Adskillelsen af trypsin og trophoblastceller undgår overdreven cellulær spaltning.. - Med en vakuumpumpe, aspirspiste og kassér supernatanten (fordøjelse opløsning) og FBS lag, herunder hvidlig film mellem de to lag. Pellet resuspenderes (de trofoblaster og røde blodlegemer lag) med 1 ml varmt celledyrkningsmedium (trin 1.1.2, uden FBS og ingen HEPES).
- Saml resuspenderede celler fra alle rør og kombinere dem i en slange. Lad røret stå ved stuetemperatur indtil slutningen af alle fordøjelser. Bemærk: Når alle spaltninger, den sædvanlige udbytte er 3 rør af resuspenderede celler (en pr fordøjelsen).
- Der fyldes op til 15 ml med varm cellekulturmedium. Centrifuger ved 1.250 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten med en vakuumpumpe. Undgå opsugning pelleten.
- Forsigtigt resuspender pellet opnået fra de 3 rør med 1 ml varmt celledyrkningsmedium. Pool deres indhold i en slange. Til opnåelse 8 ml, fuldføre volumen med varm celledyrkningsmedium.
- Meget forsigtigt lag cellesuspensionen på en adskillelse gradient med en Pasteur-pipette. Centrifugér uden bremse i 30 minutter ved 507 xg ved stuetemperatur.
- Efter centrifugering, identificere de forskellige lag af celler i gradienten med back-belysning. Lokalisere lag indeholdende trophoblast og kontaminerende celler mellem 40 - 50% af densitetscentrifugering medium. Med en vakuumpumpe, fjernelse af de øverste lag (> 50%).
- Indsamle celler placeret i de lag af interesse med en Pasteur-pipette og overføre dem til et 50 ml centrifugerør. Der fyldes op til 50 ml med cellekulturmedium. Centrifuger i 10 minutter ved 1.250 xg ved stuetemperatur.
- Under sterile forhold, supernatanten fjernes, resuspender pelleten med 20 ml FBS og tælle antallet af celler under anvendelse af et hæmocytometer. På is, tilsæt 2,22 ml sterilt dimethylsulfoxid (DMSO) og bland forsigtigt ved at vende. Alikvot 1,5 ml cellesuspension til kryogene hætteglas, fryses natten over ved -80 ° C og overføres til en flydende nitrogen tank.
<li> trofoblasten rensning - Installer skylning og kører buffere og et nyt filter kolonne på den magnetiske rensning instrument ifølge producentens anvisninger. Udfør "clean program" til at rense negative 1, positiv 1 og positiv 2 porte, og derefter introducere de 50 ml rør under hver port i henhold til producentens anvisninger.
- Optø celler, som blev frosset i trin 1.2.22 hurtigt i et 37 ° C vandbad. Overfør celler til en 50 ml rør og resuspender cellerne forsigtigt med 20 ml koldt pufferopløsning. Centrifugeres i 5 minutter ved 450 xg og 4 ° C.
- Supernatanten kasseres. Gentag vasketrinet med koldt rindende puffer. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer at bestemme levedygtighed. Der centrifugeres (5 min, 450 xg ved 4 ° C). Fjern forsigtigt supernatanten. Der tilsættes 1 ml koldt buffer indeholdende 1% vol / vol muse-anti-HLA-ABC-antistoffer. Der inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter, mixing forsigtigt hver 5 min.
- Tilsæt 6 ml koldt buffer. Centrifuger i 5 minutter ved 450 xg og 4 ° C. Supernatanten fjernes, og gentage dette trin. Resuspender celler i 1 ml af koldt puffer indeholdende 10% vol / vol af anti-muse-sekundært antistof-koblede magnetiske perler. Der inkuberes ved 4 ° C i 15 minutter blandes forsigtigt hver 5 min.
- Tilsæt 6 ml koldt buffer. Centrifuger i 5 minutter ved 450 xg og 4 ° C. Supernatanten fjernes, og resuspender i 5 ml koldt puffer.
- Adskil trophoblastceller benyttes magnetisk oprensning instrument. Indsamle celler ved den negative havn og der tilsættes 20 ml koldt rindende puffer.
Bemærk: trophoblastceller ikke indeholder komplekset HLA-ABC, og er således adskilt fra andre celletyper og rettet mod den negative 1 port. - Centrifuger i 5 minutter ved 450 xg og 4 ° C. Supernatanten kasseres, og forsigtigt cellerne resuspenderes i 20 ml varm primær dyrkningsmedium. Tæl cellerne Bruga hæmocytometer at bestemme levedygtighed.
- Plade cellerne ved følgende densiteter: 0,15 x 10 6 celler / brønd i plader med 96 brønde, 1,6 x 10 6 celler / brønd i plader med 24 brønde og 4,5 x 10 6 celler / brønd i plader med 6 brønde. Pladerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Bekræft renheden af trophoblastceller ved flowcytometri 16,17 og / eller ved immunocytokemi 18.
Bemærk: Renheden af immunorenset celler blev bestemt ved anvendelse FITC-konjugerede monoklonale antistoffer mod cytokeratin-7 og vimentin 17-19. Denne protokol er godt detaljeret i Lanoix et al., 2008 7. - Efter mindst 4 timer, skylles cellerne to gange med varmt dyrkningsmedium at fjerne ubundne celler og derefter overføre pladerne til normoxi kammer, som er sammensat af 8% O 2 (se figur 2 og § 2).
2. In vitro Induction af normoxi og hypoxi / reoxygenering
- Incubator kammer drift (se figur 2A til opsætning).
- I en laminær strømning, placere en petriskål indeholdende sterilt vand ved bunden af inkubatoren kammer for at undgå tørhed; derefter placere den tidligere fremstillede cellekultur plader eller kolber (trin 1.3.10) på den overlegne hylderne i kammeret.
- Uden for hætte, vedhæfte kammeret (indløbsporten) til gas slange (Figur 2A: 5a, b og c) for at nå røret af gassen (8% O 2 eller 0,5% O2) (figur 2A: 7). Åbn begge tilgangs- og afgangsåbninger i kammeret. På dette tidspunkt, gas regulator (figur 2A: 4) bør forblive lukket.
- Åbn forsigtigt gas regulator ventilen (figur 2A: 4). Flush i 4 min med en luftstrøm på 25 l / min fuldstændigt at erstatte luften inde i kammeret.
- Efter skylning kammeret, lukke gas regulator så indløbet og outlet havne i kammeret.
- Tag stikket slange flowmeteret udløb (figur 2A: 5c) fra indløbsporten af kammeret og placere kammeret i en cellekultur inkubator ved 37 ° C.
- Udskifte luften i øjeblikket til stede i de plader, kolber og opløst i dyrkningsmediet ved at fylde kammeret med gas 1 time efter trin 2.1.3.
- Gentag trin 2.1.1 til 2.1.6 for de andre gassammensætninger (f.eks 2% O 2 for første trimester trofoblasten kultur 9).
- Bekræft procentdel oxygen (figur 2B-C)
- For at bekræfte koncentrationen af oxygen i celledyrkningsmediet (uden celler) inden i kammeret, anvende en oxygenelektrode forbundet til et oxygen-adapter. Tilslut ilt elektrode til et voltmeter.
- Opret en kalibreringskurve i den samme opløsning (dvs. celledyrkningsmedium) ved at udsætte opløsningen for gasser med kendte iltindhold (f.eks 0% og21% oxygen). Efter målingerne stabiliseres for hver koncentration, indfører elektroden ind i mediet i kammeret.
Bemærk: Tag alle målinger i samme dybde for at undgå enhver skævhed i iltkoncentration 10.
- Induktion af normoxi og hypoxi / reoxygenering i trophoblaster.
- Efter tilsætning primære trophoblastceller til de relevante celle kultur flasker, plader eller petriskåle, udføre behandlinger efter behov.
- Parallelt hermed inden i kammeret, eksponere cellerne til den ønskede gasblanding til at reproducere en specifik betingelse hver 24 timer (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering og immunrensning af villøse cytotrophoblastceller fra en normal sigt placenta opnået ved vaginal fødsel gav 1 x 10 8 levedygtige celler. Placenta vejede 350 g, var 19 cm i diameter, 4 cm høj med skiveform og gennemsigtige membraner. Ingen cotyledon misdannelser blev opdaget. Navlestrengen havde paracentrale lokalisering og en længde på 56 cm. Renheden blev vurderet ved flowcytometri under anvendelse vimentin og cytokeratin-7 markører. Mere end 98% af cellerne var negative for vimentin og positive for cytokeratin-7, bekræfter renheden af villøse trofoblaster celler opnået fra immunorensning. Villøse cytotrophoblastceller blev tilsat til 96-brønds dyrkningsplader under normoxiske betingelser i nærvær eller fravær af 1 mM melatonin. Den biokemiske differentiering af villøse cytotrophoblaster blev overvåget ved at bestemme niveauer af β-humant choriongonadotropin (β-hCG) sekretion somtidligere 1,7,20,21 beskrevet. Den morfologiske differentiering og apoptose blev vurderet ved immunofluorescens ved anvendelse af anti-desmoplakin og anti-caspase-spaltet cytokeratin 18 intermediære filamenter 7,22. Celledyrkning medier fra dag 1 (hovedsagelig villøse cytotrophoblaster) til dag 4 (hovedsagelig syncytiotrofoblaster) blev indsamlet, centrifugeres og β-hCG niveauer er målt i supernatanterne. Produktion af β-hCG, som er eksklusivt til syncytiotrophoblast, steg med kultur tid (figur 4). Ikke kun hypoxi / reoxygenering, men hyperoxi (> 20% O2) aktiveres også apoptose 23. Således vedtagelse af en 8% O 2 koncentrationen var repræsentativ for den mængde ilt, som en villøs trofoblasten celle ville blive udsat for under tredje trimester af graviditeten 10. Toppen af p-hCG nås efter 72 timer bekræftede kapacitet villøse cytotrophoblaster at differentiere under disse betingelser.Melatonin ændrede ikke β-hCG sekretion under disse undersøgelse betingelser. Faldet af p-hCG niveau på 96 timer var sandsynligvis forårsaget af apoptose af trophoblastceller, hvilket øger efter lange perioder i primær kultur 5,7,22,24,25 (figur 4). DMSO (0,1% vol / vol) blev valgt, fordi det ikke påvirkede β-hCG 26,27. Den beskyttende rolle af melatonin var stærkt relateret til sin antioxidant egenskaber. Hypoxi / reoxygenering efter 72h kultur induceret oxidativt stress i villøse trophoblastceller. Den beskyttende virkning af melatonin blev vurderet med reaktive oxygenarter (ROS) påvisningsreagens (figur 5A). Efter 96 timer af kultur blev trophoblastceller inkuberet i 45 minutter med 10 uM af 5- (and-6) -carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (carboxy-H2DCFDA) for at detektere den totale mængde af ROS produceres 8. Villøse trophoblastceller der undergik hypoxi / reoxygenering havdevæsentligt forøget ROS niveauer (54%) sammenlignet med dem under normoxi. Denne stigning blev vendt ved behandling med 1 mM melatonin. I henhold normoksi melatonin ikke modulere ROS niveauer (homeostase), som var magen til ikke-behandlede villøse trophoblastceller (figur 5A). Figur 4 og 5A viser, at under normoxi melatonin ændrede ikke niveauet af oxidativt stress eller β-hCG sekretion i trophoblastceller, hvilket bekræfter tidligere undersøgelser, der viser ingen modulation af cellehomeostase under normale forhold 28,29.
Figur 1:. Digestion Tube Efter centrifugering er 4 lag dannes. Det øvre lag består af fordøjelsen opløsning; lige under, den føtale bovine serum (FBS). Begge lag skal kasseres med en vakuumpumpe. De lavere lag are sammensat som følger: et hvidt lag indeholdende fibroblaster, leukocyter, makrofager og trofoblaster; og et bundlag bestående af røde blodlegemer. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2: Komponenter i Hypoxi Afdeling og måling / Beregning af opløst ilt koncentration (A) Hypoxi kammer og gasflaske samling: (1) Gas cylinder; (2) Gas regulator; (3) Gas slange klemme; (4) Cylinder gasslange; (5) Inlet filter; (6) Inlet slange; (7) Flowmåler; (8) Outlet slange; (9) Modular inkubator kammer. (B) Beregning af den effektive koncentration oxygen i cellekulturmedium under anvendelse af en standardkurve fremstillet med kendte oxygenkoncentrationer. (C og D)De relative værdier opnået i de løsninger "0% O 2" og "21% O 2", er plottet grafisk som en lineær funktion til at bestemme koncentrationen af ilt i cellekultur medium "?% O 2". Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3:. Generisk Experimental Design af cellekultur i Modular Inkubation Afdeling normoxi (8% O2; 5% CO2; 87% N2) og hypoxi / reoxygenering (H / R) (0,5% O2; 5% CO 2; 94,5% N2) er betingelserne anvendt til at studere patologiske tilfælde villøs cytotrophoblast (VctB) og syncytiotrophoblast (STB) celler. Hver 24 timer, medium med eller uden melatonin (1 mM) ændresog gasblandingen fornyes. Under H / R, STB celler undergår hypoxi (0,5% O 2) i 4 timer og derefter vende tilbage til normoxi (8% O 2). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Virkning af Melatonin på beta-humant choriongonadotropin (β-hCG) Sekretion under villøse trofoblasten Differentiering villøs cytotrophoblastceller blev isoleret og oprenset fra humane sunde sigt placentaer. Cellerne blev behandlet i 96 timer med 1 mM melatonin eller dimethylsulfoxid (DMSO 0,1%: vehikelkontrol) under normoxiske betingelser (8% O 2; 5% CO2; 87% N2). β-hCG i dyrkningsmediet blev målt ved enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) efter 24, 48, 72 og 96 timer of primær kultur. Niveauer blev normaliseret til indholdet af den hel-cellelysat protein fra hver tilsvarende brønd. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Antioxidantvirkning af melatonin i Syncytiotrophoblast Exposed på hypoxi / reoxygenering (A) Virkningen af melatonin (M; 1 mM) på intracellulære reaktive oxygenarter (ROS) niveauer i syncytiotrophoblast celler under normoxi (N) eller hypoxi / reoxygenering (HR), induceret efter 72 timer af kultur, blev vurderet ved 5- (og 6) -carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (carboxy-H2DCFDA) fluorescens. Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD af 3 forskellige placenta; *** P <0,001 (Lanoix, et al. 8). (B) De cellulære veje, der er involveret i den formodede beskyttelse af melatonin mod hypoxi / reoxygenering-induceret apoptose. Primære villøse cytotrophoblastceller blev dyrket i 72 timer under normoxi (8% O2) for at tillade differentiering til syncytiotrophoblast. Celler blev udsat for 1 mM af melatonin eller kontrol køretøj, og derefter udsat for hypoxi (0,5% O2) i 4 timer efterfulgt af en 18 timers periode reoxygenering (8% O2). Hypoksi / reoxygenering-induceret oxidativt stress aktiverer redox følsomme transkriptionsfaktorer, såsom nuklear faktor kappa B (NF-KB) og hypoxi inducerbar faktor 1 (HIF-1). NF-KB inducerer p53, hvilket udløser Bax / Bcl-2 pathway af mitokondriel apoptose involverer spaltning og aktivering af caspaser 9 og 3. Caspase 3 aktiverer Rho-associeret, coiled coil-holdigt protein kinase 1 (ROCK-1), den spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og nedskrivning af DNA-reparation. Melatonin Prevents induktionen af mitokondrisk apoptose ved at virke som en kraftfuld antioxidant til at reducere oxidativt stress forårsaget af hypoxi / reoxygenering. Dette tal er blevet ændret fra Lanoix et al., 2013 8. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Fordøjelse 1 | Fordøjelse 2 | Fordøjelse 3 | Fordøjelse 4 | |
| Modificeret HBSS (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAse (pi) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0,1 mg /pi) | ||||
| MgSO4 (pi) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 mM) | ||||
| CaCl2 (pi) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 mM) | ||||
| Trypsin (U) | 1.824.000 | 1.200.000 | 960.000 | 960.000 |
| P / S (ml) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Tabel 1: Mængder af Ingredienser til fordøjelse Solution Penicillin og streptomycin (P / S);. magnesiumsulfat (MgSO4); calciumchlorid (CaClz <sub> 2); deoxyribonuclease IV (DNase IV).
Tabel 2: Mængder af densitetscentrifugering Media Solution og Modified HBSS nødvendig for at udarbejde den Gradient Solution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I pattedyr fosterudvikling er direkte afhængig af tilstrækkelig placental funktion. De udviklingsmæssige oprindelse sundhedsproblemer er baseret på den hypotese, at årsagen til sygdomme manifesteret senere i livet kan spores tilbage til tidlig udvikling, og at moderkagen har en mekanistisk rolle i føtal programmering 30-32. Moderkagen er nøglen mediator af fosterets vækst og udvikling: det regulerer næringsstoffer overførsel, beskytter mod skadelige påvirkninger, og har store endokrine funktioner. Udviklingen af Kliman et al. Af en reproducerbar teknik til at isolere levedygtige primære cytotrophoblaster er en milepæl i studiet af normale og unormale placenta funktioner 6. Mange forskere har tilpasset denne teknik til at reproducere særlige betingelser in vitro til at forstå placenta fysiologi 18,20,33,34. Som beskrevet af Petroff et al., Mange trin er vigtigt at sikre en oprenset og robust udbytte af isoleret cytotrophoblastceller 18. For eksempel har fordøjelsen trin undergået flere ændringer siden udviklingen af teknikken i 1988, såsom en forøget antallet og længden af de spaltninger, samt til sammensætningen og mængden af fordøjelsesenzymer, hvilket resulterer i et større antal levedygtige isolerede cytotrophoblaster 18. Denne nuværende protokol har tre fordele: kryopræservering som giver mulighed for at fortsætte protokollen senere immunomagnetisk rensning, hvilket øger cytotrophoblast renhed og brugen af præ-belagt mikroplader forbedre cellebinding 7,34-36. Den eksisterende litteratur indeholder flere eksempler på forskellige modifikationer af isolation teknik til cytotrophoblastceller, men de særlige kendetegn ved densitetscentrifugering medier har stort set umodificeret 37. Den præsenterede teknik isolation / immunoprensning har flere kritiske trin. Derfor er det vigtigt at evaluere renhedenDe villøse cytotrophoblastceller i slutningen af hver immunorensning. Dette kan gøres ved flowcytometri under anvendelse af egnede antistoffer som markører: cytokeratin-7 (trofoblastiske markør), differentieringsklynge- 45 (CD45) og vimentin (ikke-trophoblastceller markører) 18,38,39. Andre kritiske aspekter er kvaliteten af de opnåede placenta, de FBS og densitetscentrifugering medier gradient, samt centrifugering hastighed, som alle kan påvirke udbyttet og kvaliteten af cellerne 20,40.
Selvom meget udbredt, den foreliggende teknik har uundgåelige begrænsninger. For det første er mængden af levedygtige cytotrophoblaster celler opnået efter immunorensning er relativt lav og er den vigtigste begrænsende faktor i antallet af mulige tilstande / behandlinger, som kan afprøves. For det andet, levetid af primære trophoblastceller er kort og in vitro differentiering i syncytiotrophoblast er tæt fulgt af en reduktion af celle viabili ty og en stigning af apoptose. Den korte længde af trofoblast cellelevedygtighed, som ikke prolifererer in vitro, begrænser evaluering af mere langsigtede behandlinger, fordi apoptose irreversibelt udløses efter ca. 4 dages dyrkning 7,41. For det tredje, interplacental variabilitet er stort, så et relativt stort antal af placentaer er nødvendig for at opnå statistisk fortolkelige resultater. På den anden side, primær trofoblast kultur har unikke fordele, såsom evnen af cellerne til at differentiere til syncytium, som giver mulighed for studiet af betingelser og behandlinger i forskellige cellefænotyper efter de forskellige stadier af differentiering. Den iltning metode præsenteres i denne protokol er meget fleksibel, og dens konfiguration kan skræddersys til andre situationer, såsom kultur af primære trophoblastceller fra første trimester graviditet, som bør udsættes for en lavere ilt spænding for normoxi 9,42,43.
ntent "> Der er andre tilgange til at studere menneskelige placenta funktion in vitro. Snap-frysning placentale væv giver mulighed for multi-omics analyser, kræver men placenta multisite prøvetagning, for at undgå for eksempel metaboliske variationer på grund af iltning gradient, der aftager fra den centrale villi til periferien 44. imidlertid levende trofoblast cellebiologi og adfærd kan ikke undersøges ved hjælp af denne fremgangsmåde 45. villøse eksplantater har fordelen ved at opretholde hele villus struktur med de indgående celletyper og deres kommunikation, men reaktioner på behandlinger er ikke specifikke for trophoblastceller 23. Kommercielt tilgængelige trofoblast-lignende choriocarcinom cellelinjer, såsom BeWo, JEG-3 og JAR kan bruges til at studere placentale funktioner, såsom fusion, differentiering og transplacental transport. De seneste undersøgelser viser, at genekspression i primære cytotrophoblaster og BeWo tumorceller er dårligt korreleret 46-48. Thus, primær villus trofoblasten cellekultur, trods sine begrænsninger, besidder den unikke fordel efterligne in vivo miljøet til en normal eller unormal placenta.Studier med villøs trofoblasten celle i primær kultur og villøse eksplantater viser, at hypoxi og hypoxi / reoxygenering systematisk nedsætte trofoblasten cellelevedygtighed, samtidig med øgede niveauer af oxidativt stress, inflammation, autophagy og apoptose 43,49-52. Denne hypoxi / reoxygenering cellekultur model, specifikt har tilladt os at demonstrere antioxidant og anti-apoptotiske virkninger af melatonin i villøse trophoblastceller. I primære villøse trophoblastceller udsat for hypoxi / reoxygenering, melatonin forhindrer således: induktion af oxidativt stress, nedsat antioxidant enzymaktiviteter, øget aktivitet af redox-sensitive signalveje, og induktion af mitokondriel apoptose (figur 5B) 8. den hypoxia / reoxygenering model er et unikt værktøj til at fastslå den forebyggende rolle melatonin i oxidativ stress-induceret skade og dens mulige beskyttende rolle i graviditet komplikationer såsom præeklampsi, hvor placenta melatonin syntese reduceres 53. Melatonin er en kraftig antioxidant med en lang række af mål 54. Også sikkerheden af melatonin som en behandling er stort set blevet etableret. De gavnlige resultater med melatonin er blevet gengivet af flere forskere og melatonin er i øjeblikket i kliniske undersøgelser som en potentiel forebyggende eller terapeutisk behandling i graviditeter kompliceret af præeklampsi eller intrauterin vækst begrænsning 55,56.
Det konkluderes, at isolering, oprensning og primær kultur af høj kvalitet cytotrophoblastceller, sammen med teknikken med hypoxi / reoxygenering muliggøre en lang række lovende eksperimentelle metoder til bedre at forstå graviditet komplikationer relateret til oxidativtstress og forbedre placental sundhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
- Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
