Introduction
Tout au long de la grossesse humaine, les cellules placentaires cytotrophoblaste, qui sont des cellules souches mononucléées, prolifèrent rapidement et se différencient en cellules soit de cytotrophoblaste villeux ou extravilleux. cytotrophoblastes extravillositaire envahissent et remodeler les artères spiralées de la paroi utérine. Cytotrophoblastes villeux, d'autre part, continuent à proliférer, se différencient et fusionnent pour former syncytiotrophoblaste multinucléés (le syncytium) 1. Le maintien de l'homéostasie villous trophoblaste est essentiel pour le bien-être du fœtus et la grossesse en bonne santé. En fait, trophoblaste villeux permettent l'échange d'oxygène et de nutriments materno-fœtale, et produisent des hormones essentielles pour la grossesse. Par ailleurs, le syncytiotrophoblaste est le seul type de cellule en contact direct avec la circulation sanguine maternelle et fournit une barrière physique et immunologiques essentielles. Par conséquent, le syncytiotrophoblaste doit subir l'apoptose et de remplacement pour l'entretien homéostatique et Avoid placentaire pathologies 2-5.
La technique développée par Kliman et al. , 6 en 1986 pour isoler cytotrophoblastes villosités primaires de placentas humains a provoqué une révolution dans la recherche placentaire en permettant l'étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation du trophoblaste villeux. Cette technique classique, sur la base des digestions enzymatiques séquentielles avec de la trypsine et de l'ADNase, suivie d'un isolement en milieu de centrifugation de densité (particules de silice colloïdale revêtue par de la polyvinylpyrrolidone ou de Percoll) est maintenant reconnu comme l'étalon-or pour isoler des cellules du cytotrophoblaste villeux. La technique peut être optimisée par immunopurification magnétique, une procédure qui sépare cytotrophoblastes villeux des cellules non trophoblastiques basées sur l'expression différentielle des antigènes spécifiques sur les surfaces de ces cellules. Nous avons choisi le leucocyte humain antigène ABC (HLA-ABC) en raison de l'absence de son expression sur le Membran cellulaire trophoblastiquee 7,8.
Le placenta est un organe qui subit des variations considérables dans les niveaux d'oxygène au cours de la grossesse. Au cours du premier trimestre de la grossesse, le taux d'oxygénation est physiologiquement très faible (2% d' O 2) , mais augmente à des niveaux d'oxygénation légers (8% O 2) dans le deuxième et le troisième trimestre de la grossesse. Tuuli et al. 9 décrit que la reproduction in vitro de l'environnement à l' intérieur du trophoblaste villosités placentaires est un défi et des variations dans les niveaux d'oxygénation peuvent même conduire à des changements phénotypiques. Il est donc suggéré d'adopter 8% d' oxygène en normoxie pour imiter la tension d'oxygène trouvé dans villosités placentaires au cours du troisième trimestre de la gestation 8,9. Chen et al. 10 longuement étudié plusieurs variables liées à la tension d'oxygène dans la culture de cellules de trophoblaste et ont démontré l'importance de la détermination des niveaux d'oxygène dans un environnement péricellulaire. Les niveaux d'oxygène dans les villosités tendent à accroîtreen raison de la vasculogenèse. Le flux sanguin dans les villosités placentaires augmente constamment et le niveau de peroxyde d'hydrogène (une espèce d'oxygène réactif abondant) est un signal important qui contrôle la vasculogenèse 11,12. Dans complications de la grossesse, un manque de vasculogenèse génère l'hypoxie, et plus important encore, les variations intermittentes de l'oxygénation (appelé hypoxie / réoxygénation). Ces conditions conduisent à une augmentation anormale du stress oxydatif, ce qui compromet la viabilité fœtale placentaire et 13,14. Les modifications que les cellules trophoblastiques subissent in vivo au cours des épisodes d'hypoxie / réoxygénation peuvent être imitées in vitro comme suit: cytotrophoblastes villosités sont maintenues dans des conditions normoxiques (8% de O 2) jusqu'à ce qu'ils se différencient en syncytiotrophoblaste. Elles sont ensuite soumises à des conditions hypoxiques (0,5% O 2) pendant 4 heures, suivie d'une 18 heure supplémentaire normoxie (réoxygénation). En utilisant cette approche hypoxie / réoxygénation, trophoblastes exHiBit déréglementé état redox et des niveaux accrus d'apoptose intrinsèque 8, comme cela a été observé dans certaines complications de la grossesse. Par conséquent, cela est un utile dans le modèle in vitro pour évaluer de nouvelles approches préventives et thérapeutiques pour lutter contre les complications de la grossesse associés à placentaire hypoxie / réoxygénation.
Les cellules placentaires produisent la mélatonine, qui a plusieurs fonctions importantes telles que la capacité à prévenir le stress oxydatif et à un dysfonctionnement placentaire 15. Ici, nous présentons les modèles d'approche et de cellules expérimentales utilisées pour démontrer les effets protecteurs de la mélatonine dans les cellules trophoblastiques placentaires au niveau moléculaire, cellulaire et fonctionnelle 8.
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Protocol
Placentas ont été obtenus immédiatement après les accouchements vaginaux spontanés des grossesses sans complication au CHUM-Hôpital St-Luc, Montréal, QC, Canada, avec le consentement du patient éclairé et l'approbation des comités d'éthique (CHUM-Hôpital St-Luc et l'INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada).
1. Isolement et purification de cellules Villous Cytotrophoblaste
- Solutions et médias
- Préparer les milieux de transport en le complétant de Dulbecco Modifié Moyen Haut-glucose (DMEM-HG) avec 1% vol / vol antibiotique (10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine) et magasin d'Eagle à 4 ° C.
- Préparer un milieu de culture primaire en complétant DMEM-HG avec 10% en volume / volume de sérum de fœtus bovin (FBS), 25 mM d' acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1% en volume / volume d' antibiotiques (10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine) et conserver à 4 ° C. médias chauds à 37 ° C avantutilisation.
- Préparer 4 L de solution saline (0,9% de chlorure de sodium en poids / vol).
- Prepare modifié une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) en y ajoutant 25 mM de HEPES à 1x HBSS (pH 7,4).
- Préparer une solution fraîche, quatre bouteilles de solution de digestion avec du HBSS modifiée (préparée 1.1.4), le sulfate de magnésium (MgSO 4), du chlorure de calcium (CaCl 2), la trypsine, la désoxyribonucléase IV (désoxyribonucléase IV) et 1% vol / vol antibiotique ( 10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine) , comme indiqué dans le tableau 1.
- Préparer gradient de densité de milieux de centrifugation
- Préparer la solution de support de centrifugation de densité en complétant les médias de centrifugation de densité avec 10% vol / vol HBSS 10x.
- Préparer 14 des tubes à essai avec une solution de milieu de centrifugation de densité et HBSS modifiée, telle que décrite dans le tableau 2.
- Mélanger chaque solution de densité (étape 1.1.6.2) vigoureusement avant d'ajouter son contenu au gradient. Doucementajouter les solutions de densité dans un tube à centrifuger en verre de 50 ml avec une pompe péristaltique (1 ml / min), en commençant par la plus forte concentration (70%). Éviter des gouttelettes en drainant les solutions contre la paroi du tube pour maintenir la bonne séparation de chaque couche de gradient.
- En l'absence d'une pompe péristaltique, appliquer les couches très doucement avec des pipettes Pasteur.
- Préparer finale tampon en cours d'exécution en complétant le tampon en cours d' exécution (voir le tableau des matériaux) avec 2% vol / vol antibiotique / antimycosique (10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine). Conserver à 4 ° C.
- isolement cytotrophoblaste villeux
Remarque: L' utilisation stérile chirurgical équipement, verrerie, pipettes, flacons, etc.- Le jour de l'isolement du cytotrophoblaste villeux, dans un bain-marie à 37 °, de chauffer les solutions de digestions (étape 1.1.5) et 70 ml de FBS. Remarque: Utilisez 50 ml de FBS pour interrompre les digestions et larestante 20 ml pour l'étape de congélation (1.2.22) qui peut être placé sur la glace une fois décongelé.
- Après l'accouchement, amener le placenta au laboratoire dans un milieu de transport glacé (de l'étape 1.1.1) aussi rapidement que possible (moins de 1 h).
- moyen de transport Jeter et le sang placentaire poubelle liquide. Peser le placenta et plonger dans une solution saline froide.
- Mesurer et analyser les caractéristiques suivantes: longueur du cordon ombilical; localisation du cordon ombilical; longueur placentaire, la largeur, la forme (ovale, discoïde); la couleur de la membrane; des pathologies de la structure de cotylédons. Note: Les données sont présentées dans la section des résultats.
- Couper le cordon ombilical aux côtés de son insertion placentaire (ie, à sa base avec un 1 cm cercle de rayon supplémentaire autour du cordon). Immerger dans 300 ml de solution de fixation de tissu histologique (formaline 10%) pour une analyse histologique ultérieure.
- Couper le placenta entier en cubes de 5 x 5 x 5 cm. Laver à fond (4 fois x ~ 1 min) dans une solution saline solution (0,9%) pour éliminer les cellules de sang jusqu'à ce que la solution saline est claire. Jeter le liquide de rinçage.
- Dans un verre de montre, retirer les membranes placentaires et les tissus hachis pour enlever les vaisseaux sanguins et calcifications. Tenir les vaisseaux sanguins fermement avec une pince et retirer les tissus en utilisant le dos de ciseaux Metzenbaum.
- Placez le placenta émincé dans un entonnoir Büchner. Rinçage avec environ 100 ml de tampon salin. Continuer émincer jusqu'au 30 - on obtient 35 g de tissu haché (plastique à usage bateau et balance). Si nécessaire, émincer le reste du placenta pour obtenir jusqu'à trois 30 supplémentaires - 35 g préparations. Pendant ce temps, mettre le tissu émincé dans un bateau pesant sur la glace.
Remarque: Cette étape dure environ 45 min à 1 h.
- Placez le placenta émincé dans un entonnoir Büchner. Rinçage avec environ 100 ml de tampon salin. Continuer émincer jusqu'au 30 - on obtient 35 g de tissu haché (plastique à usage bateau et balance). Si nécessaire, émincer le reste du placenta pour obtenir jusqu'à trois 30 supplémentaires - 35 g préparations. Pendant ce temps, mettre le tissu émincé dans un bateau pesant sur la glace.
- Ajouter le 30 - 35 g de tissu placentaire haché dans un flacon de trypsinisation. Transfert 150 ml de la digestion préparée solution 1 (Tableau 1) dans le flacon de trypsinisation et bien mélanger.
- Placer le ballon dans trypsinisationun bain-marie agitateur pendant 30 mn à une vitesse de pas plus de 50 cycles / min et mélanger manuellement le flacon trypsinisation toutes les 5 minutes pour la digestion homogène.
- A la fin de la première digestion, enlever le ballon trypsinisation du bain d'eau et de l'incliner (45 ° C) pendant 1 min pour sédimenter le tissu placentaire. Avec un 10 ml pipette stérile, enlever et jeter environ 80 ml de surnageant. Éviter l'aspiration du tissu.
- Verser 100 ml d' une solution de digestion 2 (tableau 1) dans le ballon de trypsinisation; bien mélanger et répéter l'étape 1.2.9.
- A la fin de la deuxième digestion, enlever le ballon trypsinisation du bain d'eau et de l'incliner à 45 ° C pendant 1 min. Avec une pipette de 10 ml stérile, enlever 80 ml de surnageant et le transfert en douceur vers un tube centrifuge avec un tamis cellulaire (100 um de maille). Transférer le surnageant filtré dans un bêcher contenant 2 ml de FBS à chaque fois que le tube de centrifugeuse est pleine.
- Effectuer la troisième digestion comme décrit pour ladeuxième digestion (1.2.11 et 1.2.12) en utilisant 75 ml de solution de digestion 3. En parallèle, effectuez les étapes 1.2.15 à 1.2.16.1 pour la digestion 2.
- Effectuer la quatrième digestion exactement comme la troisième digestion en utilisant la solution de digestion 4 (75 ml), mais collecter un maximum de surnageant. Effectuer les étapes 1.2.15 à 1.2.16.1 en parallèle pour la digestion 3, et enfin pour la digestion 4.
- Aliquoter le surnageant (de digestions 2, 3 et 4) dans 13,5 ml parties, chaque partie en un seul 15 ml tube de centrifugeuse. Avec un 22,8 cm de long pipette Pasteur en verre, très doucement et placez lentement 1,5 ml de FBS au bas de chaque tube afin de créer une couche séparée. Ne pas mélanger FBS et surnageant. Centrifuger les tubes sans frein pendant 20 min à 1.250 xg à la température ambiante.
Nota: Après la centrifugation, 4 couches sont visibles dans le tube, comme représenté sur la figure 1 La séparation des cellules à la trypsine et trophoblastiques évite la digestion cellulaire excessive.. - Avec une pompe à vide, aspirmangé et jeter le surnageant (solution de digestion) et des couches de FBS, y compris le film blanchâtre entre les deux couches. Remettre en suspension le culot (les trophoblastes et les couches de cellules sanguines rouges) avec 1 ml de milieu de culture cellulaire chaude (étape 1.1.2, sans FBS et non HEPES).
- Collecter les cellules remises en suspension de tous les tubes et les combiner dans 1 tube. Laissez le tube reposer à température ambiante jusqu'à ce que la fin de toutes les digestions. Note: Après tous les digestions, le rendement habituel est de 3 tubes de cellules remises en suspension (un par digestion).
- Compléter le volume à 15 ml avec chaud milieu de culture cellulaire. Centrifuger à 1250 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant avec une pompe à vide. Évitez aspirer le culot.
- Resuspendre doucement le culot obtenu à partir des 3 tubes avec 1 ml de chaleur du milieu de culture cellulaire. En commun leur contenu dans 1 tube. Pour obtenir 8 ml, compléter le volume avec chaud milieu de culture cellulaire.
- Très couche doucement la suspension cellulaire sur un grad de séparationient avec une pipette Pasteur. Centrifugeuse sans frein pendant 30 min à 507 xg à la température ambiante.
- Après centrifugation, identifier les différentes couches de cellules dans le gradient avec rétro-éclairage. Repérez les couches contenant trophoblaste et contaminantes cellules entre 40 - 50% du milieu de centrifugation de densité. Avec une pompe à vide, enlever les couches supérieures (> 50%).
- Recueillir les cellules situées dans les couches d'intérêt à l'aide d'une pipette Pasteur et les transférer dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Compléter le volume à 50 ml avec du milieu de culture cellulaire. Centrifuger pendant 10 min à 1.250 xg à la température ambiante.
- Dans des conditions stériles, jeter le surnageant, resuspendre le culot avec 20 ml de FBS et de compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Sur la glace, ajouter 2,22 ml de diméthylsulfoxyde stérile (DMSO) et mélanger doucement en retournant. Aliquote de 1,5 ml de suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques, le gel pendant une nuit à -80 ° C et on transfère vers un réservoir d'azote liquide.
<li> Purification de Trophoblast - Installez le rinçage et des tampons en cours d'exécution et une nouvelle colonne de filtre sur l'instrument de purification magnétique selon les instructions du fabricant. Effectuer le «programme de nettoyage" pour nettoyer les ports négatifs 1, positif 1 et positive 2, puis introduire les tubes de 50 ml dans chaque port selon les instructions du fabricant.
- Décongeler les cellules qui ont été gelés à l'étape 1.2.22 rapidement dans un bain d'eau C 37 °. Transfert des cellules à un tube de 50 ml et les cellules doucement avec 20 ml de solution tampon froide de resuspendre. Centrifuger le tube pendant 5 minutes à 450 xg et 4 ° C.
- Jeter le surnageant. Répétez l'étape de lavage avec un tampon froide. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre pour déterminer la viabilité. Répéter la centrifugation (5 min, 450 x g à 4 ° C). Retirez délicatement le surnageant. Ajouter 1 ml de tampon froid contenant 1 roulement% en volume / volume de souris d' anticorps anti-HLA-ABC. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, mixing doucement toutes les 5 min.
- Ajouter 6 ml de tampon courante froide. Centrifugeuse pendant 5 min à 450 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et répéter cette étape. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon courante froide contenant 10% en volume / volume de billes magnétiques secondaires couplées à des anticorps anti-souris. Incuber à 4 ° C pendant 15 minutes, en mélangeant doucement toutes les 5 min.
- Ajouter 6 ml de tampon courante froide. Centrifugeuse pendant 5 min à 450 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de tampon courante froide.
- Séparer les cellules trophoblastiques en utilisant l'instrument de purification magnétique. Recueillir les cellules au port négatif et ajouter 20 ml de tampon courante froide.
Nota: Les cellules du trophoblaste ne contiennent pas le complexe HLA-ABC, et sont ainsi séparées des autres types de cellules et dirigés vers le négatif 1 port. - Centrifugeuse pendant 5 min à 450 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre doucement les cellules dans 20 ml chaud milieu de culture primaire. Compter les cellules USINga hémocytomètre pour déterminer la viabilité.
- Plaque les cellules à des densités suivantes: 0,15 x 10 6 cellules / puits dans des plaques à 96 puits, 1,6 x 10 6 cellules / puits dans des plaques à 24 puits et 4,5 x 10 6 cellules / puits dans des plaques à 6 puits. Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Confirmer la pureté des cellules trophoblastiques par cytométrie de flux 16,17 et / ou par immunocytochimie 18.
Remarque: La pureté des cellules immunopurifiés a été déterminée en utilisant des anticorps monoclonaux conjugués à FITC contre-cytokératine 7 et 17 à 19 vimentine. Ce protocole est bien détaillé dans Lanoix et al., 2008 7. - Après au moins 4 heures, rincer les cellules deux fois avec un milieu de culture chaude pour éliminer les cellules seules et ensuite transférer les plaques à la chambre de normoxie, qui est composé de 8% O 2 (voir la figure 2 et à la section 2).
2. in vitro induction de normoxie et hypoxie / réoxygénation
- Fonctionnement de la chambre de l' incubateur (voir Figure 2A pour set-up).
- Dans une hotte à flux laminaire, placer une boîte de Pétri contenant de l'eau stérile, au fond de la chambre de l'incubateur pour éviter la sécheresse; puis placer les plaques ou flacons (étape 1.3.10) culture de cellules préalablement préparées sur les étagères supérieures de la chambre.
- À l' extérieur du capot, fixer la chambre (orifice d' entrée) au tuyau de gaz (Figure 2A: 5a, b et c) pour atteindre le tube de gaz (8% d' O 2 , soit 0,5% de O 2) (figure 2A: 7). Ouvrez les deux ports de la chambre d'entrée et de sortie. A ce moment, le régulateur de gaz (Figure 2A: 4) doit rester fermé.
- Ouvrir la vanne de régulation de gaz (Figure 2A: 4). Flush pendant 4 min avec un débit d'air de 25 L / min pour remplacer complètement l'air dans la chambre.
- Après le rinçage de la chambre, fermer le régulateur de gaz, puis l'entrée et ousports tlet de la chambre.
- Débrancher le tuyau de sortie du débitmètre (figure 2A: 5c) de l'orifice d'entrée de la chambre et à mettre la chambre dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C.
- Remplacer l'air actuellement présent dans les assiettes, flacons et dissous dans le milieu de culture en remplissant la chambre avec le gaz 1 h après l'étape 2.1.3.
- Répéter les étapes 2.1.1 à 2.1.6 pour les autres compositions de gaz (par exemple, 2% d' O 2 pour le premier trimestre de la grossesse trophoblaste culture 9).
- Confirmer le pourcentage d'oxygène (figure 2B-C)
- Pour confirmer que la concentration d'oxygène dans le milieu de culture cellulaire (sans cellules) à l'intérieur de la chambre, en utilisant une électrode d'oxygène relié à un adaptateur d'oxygène. Connecter l'électrode d'oxygène à un voltmètre.
- Créer une courbe d'étalonnage dans la même solution ( par exemple, la culture cellulaire moyenne) en exposant la solution à gaz avec des teneurs en oxygène connues (par exemple, 0% et21% d'oxygène). Une fois que les valeurs se stabilisent pour chaque concentration, d'introduire l'électrode dans le milieu dans la chambre.
Remarque: Prenez toutes mesures à la même profondeur afin d'éviter tout biais de la concentration en oxygène 10.
- Induction de normoxie et hypoxie / réoxygénation dans trophoblastes.
- Après avoir ajouté les cellules trophoblastiques primaires dans les flacons de culture cellulaire appropriés, des plaques ou des boîtes de Petri, effectuer des traitements selon les besoins.
- En parallèle, à l' intérieur de la chambre, exposer les cellules au mélange de gaz désiré pour reproduire une condition spécifique à chaque 24 heures (figure 3).
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Representative Results
Isolement et immunopurification des cellules cytotrophoblaste villeux à partir d' un placenta à terme normaux obtenus par voie vaginale ont donné 1 x 10 8 cellules viables. Le placenta pesait 350 g, était de 19 cm de diamètre, 4 cm de haut avec forme discoïde et membranes transparentes. Aucune cotylédons malformation n'a été détectée. Le cordon ombilical avait localisation paracentral et une longueur de 56 cm. La pureté a été évaluée par cytométrie en flux en utilisant vimentine et cytokératine-7 marqueurs. Plus de 98% des cellules étaient négatives pour la vimentine et positives pour la cytokératine-7, ce qui confirme la pureté des cellules trophoblastes villeux obtenues à partir de l'immunopurification. les cellules villeuses du cytotrophoblaste ont été ajoutées à des plaques de culture à 96 puits dans des conditions normoxiques, en présence ou en absence de 1 mM de mélatonine. La différenciation biochimique de cytotrophoblastes villeux a été surveillée en déterminant les niveaux de gonadotrophine chorionique β humaine (β-hCG), comme la sécrétion de1,7,20,21 décrit précédemment. La différenciation morphologique et l' apoptose ont été évalués par immunofluorescence à l' aide anti-desmoplakine et anti-caspase-clivée cytokératine 18 filaments intermédiaires 7,22. milieux de culture cellulaire du jour 1 (principalement des cytotrophoblastes villeux) à 4 jours (principalement des syncytiotrophoblastes) ont été recueillies, centrifugé et niveaux β-hCG ont été mesurés dans les surnageants. La production de β-hCG, qui est exclusive pour le syncytiotrophoblaste, augmente avec le temps de culture (figure 4). Non seulement l' hypoxie / réoxygénation, mais hyperoxie (> 20% O 2) a également activé l' apoptose 23. Ainsi, l' adoption d'une concentration de 8% d' O 2 est représentatif de la quantité d'oxygène à laquelle une cellule de trophoblaste villeux serait exposé au cours du troisième trimestre de la grossesse 10. Le pic du taux de ß-hCG observées à 72 heures a confirmé la capacité de cytotrophoblastes villeuses de se différencier dans ces conditions.La mélatonine n'a pas modifié de β-hCG la sécrétion dans ces conditions d'études. La diminution des niveaux de ß-hCG à 96 h a été probablement causée par l' apoptose des cellules trophoblastiques, qui augmente après des périodes prolongées en culture primaire 5,7,22,24,25 (figure 4). DMSO (0,1% vol / vol) a été choisi parce qu'il n'a pas d' incidence sur les niveaux-hCG β 26,27. Le rôle protecteur de la mélatonine a été fortement liée à ses propriétés antioxydantes. Hypoxie / réoxygénation après 72h de la culture induite par le stress oxydatif dans les cellules du trophoblaste villeux. L'effet protecteur de la mélatonine a été évaluée avec les espèces réactives de l' oxygène (ROS) Réactif de détection (figure 5A). Après 96 h de culture, les cellules trophoblastiques ont été incubées pendant 45 minutes avec 10 uM de 5- (et-6) -carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluoresceine diacétate (carboxy H2DCFDA) pour détecter la quantité totale de produit 8 ERO. cellules trophoblastiques villeuses qui ont subi une hypoxie / réoxygénation avaientaugmenté de façon significative les niveaux de ROS (54%) par rapport à ceux sous normoxie. Cette augmentation a été renversée par un traitement avec 1 mM mélatonine. En outre, en vertu de la normoxie mélatonine n'a pas moduler les niveaux de ROS (homéostasie), qui était similaire à des cellules trophoblastiques villeuses non traitées (figure 5A). Figure 4 et 5A montrent que sous normoxie mélatonine n'a pas modifié les niveaux de stress oxydatif ou β-hCG sécrétion dans les trophoblastes, ce qui corrobore des études antérieures montrant une absence de modulation de l' homéostasie des cellules dans des conditions normales 28,29.
Figure 1:. Digestion Tube Après centrifugation, 4 couches sont formées. La couche supérieure est composée d'une solution de digestion; juste au-dessous, le sérum de veau fœtal (FBS). Les deux couches doivent être mis au rebut avec une pompe à vide. Les couches inférieures are composé comme suit: une couche blanche contenant des fibroblastes, des leucocytes, des macrophages et des trophoblastes; et une couche inférieure composée de globules rouges. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 2: Composants de la Chambre hypoxie et Mesure / Calcul de la concentration d'oxygène dissous (A) chambre hypoxie et de cylindre de gaz: (1) bouteille de gaz; (2) Le régulateur de gaz; (3) collier de serrage de gaz; (4) tuyau de gaz de cylindre; (5) Filtre Inlet; (6) Le tuyau d'admission; (7) Le débitmètre; (8) le tuyau de sortie; (9) chambre de l' incubateur modulaire (B) . Le calcul de la concentration réelle en oxygène dans le milieu de culture cellulaire en utilisant une courbe d' étalonnage produite avec des concentrations connues de l' oxygène. (C et D)Les valeurs relatives obtenues dans les solutions "0% O 2" et "21% O 2", sont représentés graphiquement comme une fonction linéaire pour déterminer la concentration d'oxygène dans le milieu de culture cellulaire "?% O 2". S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Générique Conception expérimentale de culture cellulaire dans la Incubation Modular Chambre normoxie (8% O 2, 5% de CO 2; 87% N 2) et de l' hypoxie / réoxygénation (H / R) (0,5% O 2; 5% de CO 2; 94,5% N 2) sont des conditions utilisées pour étudier les conditions pathologiques dans cytotrophoblaste villeux (vCTB) et syncytiotrophoblaste STB (cellules). Toutes les 24 heures, avec ou sans moyen de mélatonine (1 mM) est changéeet le mélange gazeux est renouvelé. Sous H / R, les cellules STB subissent une hypoxie (0,5% O 2) pendant 4 heures, puis revenir à normoxie (8% O 2). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Effet de la mélatonine sur la bêta-gonadotrophine chorionique humaine (β-hCG) Sécrétion pendant Villous Trophoblast Différenciation cellules cytotrophoblaste villeux ont été isolés et purifiés à partir de placentas terme humains en bonne santé. Les cellules ont été traitées pendant 96 h avec de la mélatonine 1 mM ou du diméthylsulfoxyde (DMSO 0,1%: le contrôle du véhicule) dans des conditions normoxiques (8% O 2, 5% de CO 2, 87% N 2). les niveaux β-hCG dans un milieu de culture ont été mesurées par une enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) après 24, 48, 72 et 96 h oculture primaire f. Les niveaux ont été normalisées à la teneur en protéines du lysat de cellules entières de chaque puits correspondant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Anti-oxydant effet de la mélatonine dans Syncytiotrophoblaste exposés à une hypoxie / réoxygénation (A) L'effet de la mélatonine (M; 1 mM) sur les espèces réactives de l' oxygène intracellulaire (ROS) niveaux dans les cellules syncytiotrophoblaste sous normoxie (N) ou hypoxie / réoxygénation (HR), induite après 72 h de culture, a été évalué par 5- (et-6) ', 7'-dichlorodihydrofluoresceine diacétate (carboxy-H2DCFDA) fluorescence-2 -carboxy. Les résultats sont exprimés par la moyenne ± écart-type de 3 placentas différents; *** P <0,001 (Lanoix et al. 8). (B) Les voies cellulaires impliquées dans la protection putative de la mélatonine contre l' hypoxie / apoptose induite par la réoxygénation. Les cellules villeuses du cytotrophoblaste primaires ont été cultivées pendant 72 heures sous normoxie (8% d' O 2) afin de permettre une différenciation en syncytiotrophoblaste. Les cellules ont été exposées à 1 mM , de la mélatonine ou de contrôle du véhicule et ensuite soumis à une hypoxie (0,5% de O 2) pendant 4 heures suivie d'une période de 18 h réoxygénation (8% d'O 2). Hypoxie / réoxygénation induite par le stress oxydatif active redox sensible à des facteurs de transcription tels que le facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et facteur induit par l'hypoxie 1 (HIF-1). NF-kB induit p53, ce qui déclenche l'Bax / Bcl-2 voie de l'apoptose mitochondriale impliquant le clivage et l'activation des caspases 9 et 3. caspase 3 active Rho-associé, la bobine enroulée contenant de la protéine kinase 1 (ROCK-1), le clivage de la poly (ADP-ribose) polymérase (PARP) et la déficience de réparation de l'ADN. mélatonine prevents l'induction de l'apoptose mitochondriale en agissant comme un puissant antioxydant pour réduire le stress oxydatif causé par l'hypoxie / réoxygénation. Ce chiffre a été modifié depuis Lanoix et al., 2013 8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Digestion 1 | Digestion 2 | Digestion 3 | Digestion 4 | |
| Modifié HBSS (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAse (ul) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0,1 mg /ul) | ||||
| MgSO4 (ul) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 mM) | ||||
| CaCl 2 (pi) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 mM) | ||||
| Trypsine (U) , | 1824000 | 1.200.000 | 960.000 | 960.000 |
| P / S (ml) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Tableau 1: Quantités de Ingrédients pour la Digestion Solution Pénicilline et streptomycine (P / S);. sulfate de magnésium (MgSO 4); du chlorure de calcium (CaCl <sub> 2); désoxyribonucléase IV (DNase IV).
Tableau 2: Volumes de densité Solution Centrifugation médias et modification HBSS requis pour la préparation de la solution de dégradé.
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Discussion
Chez les mammifères, le développement du foetus est directement dépendante de la fonction placentaire adéquate. Les origines développementales des troubles de santé sont fondées sur l'hypothèse que la cause des maladies qui se manifestent plus tard dans la vie peut être retracée au développement précoce et que le placenta a un rôle mécanique dans la programmation fœtale 30-32. Le placenta est le médiateur clé de la croissance et le développement du fœtus: il régule le transfert des nutriments, protège contre les expositions nocives, et a d'importantes fonctions endocrines. Le développement par Kliman et al. D'une technique reproductible pour isoler cytotrophoblastes primaires viables est une étape importante dans l'étude des fonctions placentaires normales et anormales 6. De nombreux chercheurs ont adapté cette technique pour reproduire les conditions spécifiques in vitro pour comprendre la physiologie placentaire 18,20,33,34. Comme cela est décrit par Petroff et al., Plusieurs étapes sont importantes pour garantir un rendement purifié et isolé robuste de cytocellules trophoblastiques 18. Par exemple, les étapes de digestion ont subi de nombreuses modifications depuis le développement de la technique, en 1988, par exemple une augmentation du nombre et de la longueur des digestions, ainsi que la composition et la quantité des enzymes de la digestion, ce qui entraîne un plus grand nombre d'viables cytotrophoblastes isolées 18. Ce protocole courant présente trois avantages principaux: la cryoconservation, qui permet la possibilité de continuer le protocole de purification immunomagnétique plus tard, ce qui augmente la pureté du cytotrophoblaste et l'utilisation de pré-enduit des microplaques améliorant la fixation des cellules 7,34-36. La littérature contient de nombreux exemples de diverses modifications de la technique d'isolement des cellules cytotrophoblastiques, mais les caractéristiques du milieu de centrifugation de densité est restée pratiquement non modifiée 37. La technique présentée d'isolement / immunopurification comporte plusieurs étapes critiques. Par conséquent, il est important d'évaluer la puretédes cellules villeuses du cytotrophoblaste à la fin de chaque immunopurification. Cela peut être fait par cytométrie en flux en utilisant des anticorps appropriés comme marqueurs: cytokératine-7 (marqueur trophoblaste), un cluster de différenciation 45 (CD45) , et la vimentine (cellules non trophoblastiques marqueurs) 18,38,39. D' autres aspects critiques sont la qualité des placentas obtenus, les FBS et centrifugation de gradient de densité de médias, ainsi que la vitesse de centrifugation, qui peuvent tous influer sur le rendement et la qualité des cellules 20,40.
Bien que largement utilisé, la technique actuelle a des limites inévitables. Tout d'abord, la quantité de cellules cytotrophoblastes viables obtenues après immunopurification est relativement faible et est le principal facteur limitant le nombre de conditions / traitements possibles qui peuvent être testés. En second lieu , la durée de vie des cellules trophoblastiques primaires est court et dans la différenciation in vitro en syncytiotrophoblaste est suivi de près par une réduction de viabili cellulaire té et une augmentation de l'apoptose. La faible longueur de la viabilité des cellules du trophoblaste qui ne prolifèrent pas in vitro, limite l'évaluation des longs traitements à long terme, parce que l' apoptose est déclenchée de façon irréversible au bout de 4 jours de culture 7,41. Troisièmement, la variabilité interplacental est grande, donc un nombre relativement important de placentas est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. D'autre part, la culture du trophoblaste primaire a des avantages uniques, tels que la capacité des cellules à se différencier en syncytium, qui permet l'étude des conditions et des traitements dans les différents phénotypes cellulaires en fonction des différents stades de différenciation. La méthode d'oxygénation présentées dans ce protocole est très adaptable et sa configuration peut être adaptée à d' autres situations, telles que la culture de cellules trophoblastiques primaires de la première trimestre de grossesse, qui devraient être exposés à une tension d'oxygène inférieure pour normoxie 9,42,43.
ntent "> Il existe d' autres approches pour étudier le fonctionnement du placenta humain in vitro. Snap-congélation des tissus placentaires permet multi-omique analyses, mais nécessite un échantillonnage multisite placentaire, pour éviter par exemple des variations métaboliques dues au gradient d'oxygénation, ce qui diminue de la centrale Villi à la périphérie 44. Cependant, en direct la biologie et le comportement des cellules de trophoblaste ne peuvent pas être étudiés en utilisant cette approche 45. explants villosités ont l'avantage de maintenir toute la structure villositaire avec les types cellulaires constitutifs et leur communication, mais les réponses aux traitements ne sont pas spécifiques à cellules trophoblastiques 23. disponibles dans le commerce des lignées cellulaires de choriocarcinome trophoblaste-like, comme BeWo, Jeg-3 et JAR peuvent être utilisés pour étudier les fonctions placentaires, telles que la fusion, la différenciation et le transport transplacentaire. Cependant, des études récentes montrent que l' expression des gènes dans le primaire cytotrophoblastes et les cellules tumorales sont faiblement corrélés BeWo 46-48. Thus, culture cellulaire de trophoblaste villeux primaire, malgré ses limites, possèdent l'avantage unique de mimer l'environnement in vivo du placenta normal ou anormal.Des études utilisant des cellules de trophoblaste villeux en culture primaire et explants villeux montrent que l' hypoxie et de l' hypoxie / réoxygénation diminuent systématiquement la viabilité des cellules de trophoblaste, concomitante à une augmentation des niveaux de stress oxydatif, l' inflammation, l' autophagie et l' apoptose 43,49-52. Ce modèle de culture cellulaire d'hypoxie / ré-oxygénation, plus précisément, a permis de démontrer les propriétés antioxydantes et anti-apoptotiques effets de la mélatonine dans les cellules trophoblastiques villeuses. Dans les cellules trophoblastiques villeuses primaires exposés à une hypoxie / ré - oxygénation, la mélatonine empêche les suivantes: l' induction du stress oxydatif, une diminution de l' activité antioxydante d'enzymes, une activité accrue des voies de signalisation redox sensible, et l' induction de l' apoptose mitochondriale (figure 5B) , 8. Le hymodèle poxia / réoxygénation est un outil unique pour déterminer le rôle préventif de la mélatonine dans les dommages oxydatifs induits par le stress et son rôle protecteur possible des complications de grossesse telles que la prééclampsie, où la synthèse de la mélatonine placentaire est réduite 53. La mélatonine est un puissant antioxydant avec un large éventail de cibles 54. En outre, la sécurité de la mélatonine en tant que traitement a été largement mis en place. Les résultats bénéfiques avec la mélatonine ont été reproduites par plusieurs chercheurs et de la mélatonine est actuellement en essais cliniques comme traitement potentiel préventif ou thérapeutique dans les grossesses compliquées par prééclampsie ou de la croissance intra - utérine restriction 55,56.
En conclusion, l'isolement, la purification et la culture primaire de haute qualité cytotrophoblaste cellules, ainsi que la technique de l'hypoxie / réoxygénation permettent à un large éventail d'approches expérimentales prometteuses pour mieux comprendre les complications de la grossesse liés à l'oxydationle stress et améliorer la santé du placenta.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
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