Introduction
Nel corso della gravidanza umana, le cellule placentari citotrofoblasto, che sono le cellule staminali mononucleate, rapidamente proliferano e si differenziano in cellule sia citotrofoblasto villi o extravilloso. citotrofoblasti extravilloso invadono e rimodellano le arterie a spirale della parete uterina. Cytotrophoblasts villi, invece, continuano a proliferare, differenziare e fusibile per formare syncytiotrophoblast multinucleate (il sincizio) 1. Il mantenimento della omeostasi dei villi trofoblasto è essenziale per il benessere fetale e gravidanza sana. In realtà, trophoblasts villi consentono lo scambio materno-fetale di ossigeno e nutrienti, e producono ormoni essenziali per la gravidanza. Inoltre, il syncytiotrophoblast è l'unico tipo cellulare in diretto contatto con la circolazione del sangue materno e fornisce una barriera fisica e immunologica essenziale. Pertanto, il sinciziotrofoblasto deve subire apoptosi e la sostituzione per la manutenzione omeostatico e di AVOid placentare patologie 2-5.
La tecnica sviluppata da Kliman et al. 6 nel 1986 per isolare citotrofoblasti villi primari da placenta umana ha causato una rivoluzione nel campo della ricerca placentare, consentendo lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella differenziazione dei villi trofoblasto. Questa tecnica classica, sulla base di digestioni enzimatiche sequenziali con tripsina e DNasi, seguita da isolamento nei media densità centrifugazione (particelle di silice colloidale rivestito da polivinilpirrolidone, o Percoll) è ormai riconosciuto come il gold standard per isolare le cellule citotrofoblasto villi. La tecnica può essere ottimizzata immunopurificazione magnetica, una procedura che separa cytotrophoblasts villi da cellule non trofoblastiche basati sull'espressione differenziale di antigeni specifici sulla superficie di queste cellule. Abbiamo scelto l'antigene leucocitario umano ABC (HLA-ABC) per l'assenza della sua espressione sulla membran cellulare trofoblasticae 7,8.
La placenta è un organo che subisce drammatiche variazioni nei livelli di ossigeno durante la gravidanza. Nel primo trimestre, il rapporto di ossigenazione è fisiologicamente molto bassa (2% O 2), ma aumenta a livelli lievi di ossigenazione (8% O 2) nel secondo e terzo trimestre. Tuuli et al. 9 descritto che la riproduzione in vitro dell'ambiente trofoblasto all'interno del villi della placenta è una sfida e le variazioni dei livelli di ossigenazione può anche portare a cambiamenti fenotipici. È pertanto suggerito di adottare dell'8% ossigeno come normossia per imitare la tensione di ossigeno trovato in villi placentari durante il terzo trimestre di gestazione 8,9. Chen et al. 10 ampiamente studiato diverse variabili legate alla tensione di ossigeno nelle cellule in coltura trofoblasto e dimostrato l'importanza di determinare i livelli di ossigeno in un ambiente pericellulare. I livelli di ossigeno nei villi tendono ad aumentarea causa di vasculogenesi. Il flusso di sangue placentare villi aumenta costantemente e il livello di perossido di idrogeno (un'abbondante specie reattive) è un segnale importante che controlla vasculogenesi 11,12. In complicazioni della gravidanza, la mancanza di vasculogenesi genera ipossia, e ancora più importante, le variazioni intermittenti di ossigenazione (chiamato ipossia / riossigenazione). Queste condizioni portano ad un aumento anomalo stress ossidativo, che compromette placentare e fetale 13,14 vitalità. Le alterazioni che le cellule del trofoblasto subiscono in vivo durante gli episodi di ipossia / riossigenazione possono essere imitate in vitro come segue: citotrofoblasti villi sono mantenute in condizioni di normossia (8% O 2) fino a quando non si differenziano in sinciziotrofoblasto. Essi vengono quindi sottoposti a condizioni di ipossia (0,5% O 2) per 4 ore, seguito da un ulteriore 18 ore di normossia (riossigenazione). Usando questo approccio ipossia / riossigenazione, trofoblasto exvietare liberalizzato stato redox e aumento dei livelli di apoptosi intrinseca 8, come è stato osservato in alcune complicazioni durante la gravidanza. Quindi, questo è un utile modello in vitro per valutare nuovi approcci preventivi e terapeutici per combattere le complicazioni della gravidanza associate a ipossia placentare / riossigenazione.
Cellule placentari producono melatonina, che ha diverse funzioni importanti, come la capacità di ovviare stress ossidativo e disfunzione placentare 15. Qui, presentiamo i modelli di approccio e cellulari sperimentali utilizzate per dimostrare gli effetti protettivi della melatonina in cellule del trofoblasto placentare a livello molecolare, cellulare e funzionale 8.
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Protocol
Placente sono stati ottenuti immediatamente dopo parto vaginale spontaneo da gravidanze complicate al CHUM-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Canada, con consenso informato del paziente e l'approvazione dei comitati etici (CHUM-St-Luc Hospital e INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada).
1. isolamento e la purificazione delle cellule dei villi citotrofoblasto
- Soluzioni e supporti
- Preparare mezzi di trasporto, completandolo Dulbecco Modified Eagle Medio Alto-glucosio (DMEM-HG) con 1% vol / vol antibiotico (10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato) e conservare a 4 ° C.
- Preparare terreni di coltura primaria, completandolo DMEM-HG con il 10% vol / vol siero fetale bovino (FBS), 25 mM 4- (2-idrossietil) Acido -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1% vol / vol antibiotici (10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato) e conservare a 4 ° C. mezzi Riscaldare a 37 ° C primauso.
- Preparare 4 L di soluzione salina (0,9% di cloruro di sodio in peso / vol).
- Preparare modificato soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con l'aggiunta di 25 mM HEPES a 1x HBSS (pH 7,4).
- Preparare freschi, quattro bottiglie di soluzione di digestione con HBSS modificato (preparato in 1.1.4), solfato di magnesio (MgSO 4), cloruro di calcio (CaCl 2), tripsina, deossiribonucleasi IV (DNasi IV), e 1% vol / vol antibiotico ( 10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato) come mostrato in Tabella 1.
- Preparare la densità dei media centrifugazione in gradiente
- Preparare la densità centrifugazione soluzione multimediale completandola mezzi centrifugazione densità con 10% vol / vol HBSS 10x.
- Preparare 14 provette con soluzione supporti densità centrifugazione e modificato HBSS, come descritto nella Tabella 2.
- Mescolare ogni soluzione densità (passo 1.1.6.2) vigorosamente prima di aggiungere il suo contenuto al gradiente. Delicatamenteaggiungere le soluzioni densità a 50 ml tubo di vetro con una pompa peristaltica (1 ml / min), che inizia con la più alta concentrazione (70%). Evitare goccioline drenando le soluzioni contro la parete del tubo per mantenere la corretta separazione di ogni strato del gradiente.
- In assenza di una pompa peristaltica, applicare gli strati molto delicatamente con pipette Pasteur.
- Preparare tampone di corsa finale completando il tampone di corsa (vedi Tabella dei Materiali) con il 2% vol / vol antibiotico / antimicotico (10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato). Conservare a 4 ° C.
- Villi isolamento citotrofoblasto
Nota: utilizzare sterile chirurgica attrezzature, vetreria, pipette, flaconi, ecc- Il giorno di isolamento citotrofoblasto villi, a bagnomaria C 37 °, riscaldare le soluzioni digestioni (dal punto 1.1.5) e 70 ml di FBS. Nota: Usare 50 ml di FBS per interrompere la digestione e larestante 20 ml per la fase di congelamento (1.2.22), che possono essere immessi sul ghiaccio, una volta scongelati.
- Dopo la consegna, portare la placenta al laboratorio in terreno di trasporto ghiacciata (dal punto 1.1.1) il più rapidamente possibile (meno di 1 ora).
- mezzo di trasporto degli scarti e del sangue placentare in pattumiera liquido. Pesare la placenta ed immergerlo in soluzione salina fredda.
- Misurare e analizzare le seguenti caratteristiche: lunghezza del cordone ombelicale; localizzazione cordone ombelicale; lunghezza placentare, la larghezza, la forma (ovale, discoide); colore membrana; patologie struttura cotyledon. Nota: I dati sono presentati nella sezione risultati.
- Tagliare il cordone ombelicale al fianco il suo inserimento placentare (vale a dire, alla sua base, con un ulteriore 1 cm di raggio cerchio intorno al cavo). Immergere in 300 ml di soluzione di tessuto fissativo istologico (formalina al 10%) per l'analisi istologica successiva.
- Tagliare l'intera placenta a cubetti di 5 x 5 x 5 cm. Lavare accuratamente (4 volte x ~ 1 min) in sol salinaution (0,9%) per rimuovere le cellule del sangue fino soluzione salina è chiara. Eliminare il risciacquo liquido.
- In un vetro da orologio, rimuovere membrane placentari e tessuti trito per rimuovere i vasi sanguigni e calcificazioni. Tenere i vasi sanguigni saldamente con una pinza e rimuovere i tessuti utilizzando la parte posteriore di forbici Metzenbaum.
- Mettere placenta tritato in un imbuto Büchner. Risciacquare con circa 100 ml di soluzione salina tampone. Continuare a tritare fino 30 - 35 g di tessuto tritato si ottiene (l'uso di plastica barca e bilancia). Se necessario, tritare il resto della placenta avere fino a tre ulteriori 30 - preparazioni 35 g. Durante questo tempo, mettere dei tessuti macinata in una barca pesata su ghiaccio.
Nota: Questo passo ci vorranno circa 45 minuti a 1 ora.
- Mettere placenta tritato in un imbuto Büchner. Risciacquare con circa 100 ml di soluzione salina tampone. Continuare a tritare fino 30 - 35 g di tessuto tritato si ottiene (l'uso di plastica barca e bilancia). Se necessario, tritare il resto della placenta avere fino a tre ulteriori 30 - preparazioni 35 g. Durante questo tempo, mettere dei tessuti macinata in una barca pesata su ghiaccio.
- Aggiungere il 30 - 35 g di tessuto placentare macinata in un pallone trypsinizing. Transfer 150 ml del preparato di digestione soluzione 1 (tabella 1) al pallone trypsinizing e mescolare bene.
- Porre il pallone in trypsinizingun bagno d'acqua agitando per 30 minuti ad una velocità di non più di 50 cicli / min e miscelare manualmente la beuta trypsinizing ogni 5 minuti per la digestione omogenea.
- Alla fine del primo digestione, rimuovere il matraccio trypsinizing dal bagno e inclinarlo (45 °) per 1 min per sedimentare il tessuto placentare. Con un 10 ml pipetta sterile, rimuovere ed eliminare circa 80 ml di surnatante. Evitare di aspirare il tessuto.
- Trasferire 100 ml di soluzione di digestione 2 (Tabella 1) al pallone trypsinizing; mescolare bene e ripetere il punto 1.2.9.
- Alla fine della seconda digestione, rimuovere il matraccio trypsinizing dal bagno e inclinarlo 45 ° per 1 min. Con un 10 ml pipetta sterile, rimuovere 80 ml surnatante e trasferire delicatamente per un tubo da centrifuga con un colino cella (100 mesh micron). Trasferire il surnatante filtrato in un becher contenente 2 ml di FBS ogni volta la provetta è pieno.
- Eseguire il terzo digestione come descritto per ilsecondo la digestione (1.2.11 e 1.2.12) con 75 ml di soluzione di digestione 3. In parallelo, eseguire i passaggi 1.2.15 a 1.2.16.1 per la digestione 2.
- Eseguire il quarto digestione identico al terzo digestione con la soluzione di digestione 4 (75 ml), ma raccogliere una quantità massima di surnatante. Eseguire le operazioni da 1.2.15 a 1.2.16.1 in parallelo per la digestione 3, e, infine, per la digestione 4.
- Aliquotare il surnatante (da digestioni 2, 3 e 4) in 13,5 ml parti, ciascuna parte in una provetta da centrifuga da 15 ml. Con una lunga 22,8 cm pipetta Pasteur di vetro, molto delicatamente e lentamente posizionare 1,5 ml di FBS al fondo di ogni tubo in modo da creare uno strato separato. Non mescolare FBS e surnatante. Centrifugare i tubi senza freno per 20 min a 1250 xga temperatura ambiente.
Nota: Dopo centrifugazione, 4 strati sono visibili nel tubo, come mostrato nella Figura 1 La separazione delle cellule tripsina e trofoblasto evita eccessivo digestione cellulare.. - Con una pompa a vuoto, aspirmangiato e scartare il surnatante (soluzione digestione) e strati FBS, tra cui la pellicola biancastra tra i due strati. Risospendere il pellet (i trophoblasts e strati di globuli rossi) con 1 ml di mezzo di coltura cellulare calda (fase 1.1.2, senza FBS e senza HEPES).
- Raccogliere cellule risospese da tutte le provette e combinarli in 1 tubo. Lasciare riposare a temperatura ambiente fino alla fine di tutte digestioni. Nota: Dopo tutte le digestioni, il rendimento abituale è di 3 tubi di cellule risospese (uno per la digestione).
- Portare al volume di 15 ml con mezzo di coltura cellulare caldo. Centrifugare a 1250 xg per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto. Evitare di aspirare il pellet.
- Risospendere delicatamente il pellet ottenuto dalle 3 tubi con 1 ml di Abbastanza caldo coltura cellulare. In comune il loro contenuto in 1 tubo. Per ottenere 8 ml, completare il volume con il mezzo di coltura cellulare caldo.
- Molto strato delicatamente la sospensione cellulare su un grad di separazioneiente con una pipetta Pasteur. Centrifugare senza freno per 30 min a 507 xg a temperatura ambiente.
- Dopo centrifugazione, identificare i diversi strati di cellule in gradiente con retroilluminazione. Individuare gli strati che contengono trofoblasto e contaminanti cellule tra il 40 - 50% di media densità centrifugazione. Con una pompa a vuoto, rimuovere gli strati superiori (> 50%).
- Raccogliere le cellule situate negli strati di interesse con una pipetta Pasteur e trasferirli in una provetta da centrifuga da 50 ml. Portare al volume di 50 ml con terreno di coltura cellulare. Centrifugare per 10 minuti a 1250 xg a temperatura ambiente.
- In condizioni sterili, scartare il surnatante, risospendere il pellet con 20 ml di FBS e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Sul ghiaccio, aggiungere 2,22 ml di dimetilsolfossido sterile (DMSO) e mescolare delicatamente spostando. Aliquotare 1,5 ml di sospensione cellulare in fiale criogeniche, congelare una notte a -80 ° C e trasferire ad un serbatoio di azoto liquido.
<li> purificazione Trofoblasto - Installare il risciacquo e buffer in esecuzione e una nuova colonna di filtro sullo strumento di purificazione magnetica in base alle istruzioni del produttore. Eseguire il programma "pulito" per pulire negativi porte 1, positivo 1 e positivo 2, e quindi introdurre i tubi da 50 ml sotto ogni porta secondo le istruzioni del produttore.
- Scongelare le cellule che sono stati congelati in passaggio 1.2.22 rapidamente in un bagno di acqua C 37 °. Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml e risospendere le cellule delicatamente con 20 ml di soluzione tampone fredda corrente. Centrifugare la provetta per 5 minuti a 450 xg e 4 ° C.
- Eliminare il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio con tampone fredda corrente. Contare le cellule utilizzando un emocitometro per determinare la vitalità. Ripetere la centrifugazione (per 5 min, 450 xga 4 ° C). rimuovere con attenzione il surnatante. Aggiungere 1 ml di tampone fredda contenente 1% vol / vol di topo anticorpi anti-HLA-ABC. Incubare a 4 ° C per 30 min, mixing delicatamente ogni 5 minuti.
- Aggiungere 6 ml di tampone fredda corrente. Centrifugare per 5 min a 450 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e ripetere questo passaggio. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone fredda contenente 10% vol / vol di anti-topo sfere magnetiche anticorpi accoppiati secondarie. Incubare a 4 ° C per 15 minuti, mescolando delicatamente ogni 5 min.
- Aggiungere 6 ml di tampone fredda corrente. Centrifugare per 5 min a 450 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere in 5 ml di tampone fredda corrente.
- Separare le cellule del trofoblasto utilizzando lo strumento di purificazione magnetica. Raccogliere cellule al porto negativo e aggiungere 20 ml di tampone fredda.
Nota: cellule del trofoblasto non contengono il complesso HLA-ABC, e sono quindi separati da altri tipi di cellule e diretti verso il porto 1 negativo. - Centrifugare per 5 min a 450 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in 20 ml di caldo terreno di coltura primaria. Contare le cellule usinga emocitometro per determinare la vitalità.
- Piastra le cellule ai seguenti densità: 0.15 x 10 6 cellule / pozzetto in piastre a 96 pozzetti, 1,6 x 10 6 cellule / pozzetto in piastre da 24 pozzetti e 4,5 x 10 6 cellule / pozzetto in 6 pozzetti. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2.
- Confermare la purezza delle cellule del trofoblasto mediante citometria di flusso 16,17 e / o immunocitochimica 18.
Nota: La purezza delle cellule immunopurified è stato determinato utilizzando anticorpi monoclonali coniugati FITC-contro-citocheratina 7 e vimentina 17-19. Questo protocollo è ben dettagliata in Lanoix et al., 2008 7. - Dopo almeno 4 ore, lavare le cellule due volte con mezzo di coltura calda per rimuovere le cellule senza legami e poi trasferire le piastre alla camera normoxia, che è composta da 8% O 2 (vedi figura 2 e la sezione 2).
2. In Vitro installn di normossia e ipossia / riossigenazione
- Il funzionamento della camera Incubator (vedi Figura 2A per il set-up).
- In una cappa a flusso laminare, collocare un piatto Petri contenente acqua sterile sul fondo della camera di incubazione per evitare secchezza; quindi posizionare le piastre o fiaschi (step 1.3.10) di coltura cellulare precedentemente preparati sugli scaffali superiori della camera.
- All'esterno della cappa, collegare la camera (porta di ingresso) al tubo di gas (Figura 2A: 5a, b, c) per raggiungere il tubo di gas (8% O 2 o 0,5% O 2) (Figura 2A: 7). Aprire entrambe le porte di entrata e di uscita della camera. In questo momento, il regolatore del gas (Figura 2A: 4) dovrebbe rimanere chiuso.
- Aprire con cautela la valvola di regolazione del gas (Figura 2A: 4). Flush per 4 minuti con un flusso di aria di 25 L / min per sostituire completamente l'aria all'interno della camera.
- Dopo il lavaggio della camera, chiudere il regolatore del gas poi l'ingresso e l'UOporti tlet della Camera.
- Scollegare il tubo di scarico flussometro (Figura 2A: 5c) dalla porta di ingresso della camera e posizionare la camera in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C.
- Sostituire l'aria attualmente presenti nelle piastre, flaconi e disciolto nel mezzo di coltura riempiendo la camera a gas 1 ora dopo passo 2.1.3.
- Ripetere i punti da 2.1.1 a 2.1.6 per le altre composizioni del gas (ad esempio, 2% O 2 per il primo trimestre cultura trofoblasto 9).
- Confermare la percentuale di ossigeno (Figura 2B-C)
- Per confermare la concentrazione di ossigeno nel terreno di coltura cellulare (senza cellule) all'interno della camera, utilizzare un elettrodo di ossigeno collegato ad un adattatore di ossigeno. Collegare l'elettrodo ossigeno ad un voltmetro.
- Creare una curva di calibrazione nella stessa soluzione (cioè, coltura cellulare medium) esponendo la soluzione ai gas con un contenuto di ossigeno noto (ad esempio, 0% e21% di ossigeno). Dopo le letture sono stabilizzare per ciascuna concentrazione, introdurre l'elettrodo nel mezzo della camera.
Nota: prendere tutti misura alla stessa profondità in modo da evitare qualsiasi distorsione della concentrazione di ossigeno 10.
- Induzione di normossia e ipossia / riossigenazione in trophoblasts.
- Dopo l'aggiunta di cellule del trofoblasto primarie alle appropriate fiasche di coltura cellulare, piatti o piastre Petri, effettuare trattamenti come necessarie.
- Parallelamente, all'interno della camera, esporre le cellule per la miscela di gas desiderata per riprodurre una condizione specifica ogni 24 ore (Figura 3).
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Representative Results
Isolamento e immunopurificazione di cellule citotrofoblasto villi da una normale placenta termine ottenuti da parto vaginale ha prodotto 1 x 10 8 cellule vitali. La placenta pesava 350 g, era di 19 cm di diametro, 4 cm di altezza con forma discoidale e le membrane trasparenti. è stata rilevata alcuna cotyledon malformazione. Il cordone ombelicale aveva localizzazione paracentrale e una lunghezza di 56 cm. La purezza è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando vimentina e citocheratina-7 marcatori. Oltre il 98% delle cellule erano negativi per vimentina e positivo per citocheratina-7, conferma la purezza delle cellule trofoblasto villi ottenuti dalla immunopurificazione. cellule citotrofoblasto villi sono stati aggiunti alle piastre di coltura a 96 pozzetti in condizioni normossia in presenza o assenza di 1 mM melatonina. La differenziazione biochimica di citotrofoblasti villi è stato monitorato attraverso la determinazione dei livelli di β-gonadotropina corionica umana (β-hCG) secrezione comedescritto in precedenza 1,7,20,21. La differenziazione morfologica e l'apoptosi sono state valutate mediante immunofluorescenza utilizzando anti-desmoplakin e anti-caspasi-spaccati citocheratina 18 filamenti intermedi 7,22. terreni di coltura cellulare dal giorno 1 (principalmente citotrofoblasti villi) al 4 ° giorno (principalmente sinciziotrofoblasti) sono stati raccolti, centrifugati e livelli di β-hCG sono stati misurati nei sopranatanti. La produzione di β-hCG, che è esclusivo al sinciziotrofoblasto, aumentata con il tempo la cultura (Figura 4). Non solo ipossia / riossigenazione, ma iperossia (> 20% O 2) anche attivato apoptosi 23. Pertanto, l'adozione di una concentrazione dell'8% O 2 era rappresentativo della quantità di ossigeno a cui una cellula trofoblasto villi sarebbe esposto durante il terzo trimestre di gravidanza 10. Il picco dei livelli beta-hCG osservati a 72 hr confermato la capacità di cytotrophoblasts villi differenziare in queste condizioni.La melatonina non ha alterato la secrezione di β-hCG in queste condizioni di studio. La diminuzione dei livelli di beta-hCG a 96 ore è stato probabilmente causato da apoptosi delle cellule del trofoblasto, che aumenta dopo periodi prolungati in coltura primaria 5,7,22,24,25 (Figura 4). DMSO (0,1% vol / vol) è stato scelto perché non ha influenzato i livelli di β-hCG 26,27. Il ruolo protettivo della melatonina è stato fortemente legato alle sue proprietà antiossidanti. Ipossia / riossigenazione dopo 72h della cultura stress ossidativo indotto in cellule del trofoblasto villi. L'effetto protettivo della melatonina è stata valutata con specie reattive dell'ossigeno (ROS) Detection Reagent (Figura 5A). Dopo 96 ore di coltura, le cellule trofoblasto sono state incubate per 45 min con 10 pM di 5- (e-6) -carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (carbossi-H2DCFDA) per rilevare la quantità totale di ROS prodotta 8. cellule del trofoblasto villi che hanno subito l'ipossia / riossigenazione avevanosignificativamente aumentato i livelli di ROS (54%) rispetto a quelli in normossia. Tale incremento è stato invertito da un trattamento con 1 mM melatonina. Inoltre, ai sensi normossia melatonina non modulare i livelli di ROS (omeostasi), che era simile a cellule del trofoblasto non trattati villi (Figura 5A). Figura 4 e 5A mostrano che in normossia la melatonina non ha modificato i livelli di stress ossidativo e la secrezione di β-hCG nelle cellule del trofoblasto, che conferma studi precedenti che mostrano nessuna modulazione dell'omeostasi cellulare in condizioni normali 28,29.
Figura 1:. Digestion Tubo Dopo centrifugazione, si formano 4 strati. Lo strato superiore è costituito da soluzione di digestione; appena sotto, il siero fetale bovino (FBS). Entrambi gli strati devono essere eliminate con una pompa a vuoto. Gli strati più bassi are composta come segue: uno strato bianco contenente fibroblasti, leucociti, macrofagi e trofoblasto; e uno strato inferiore composto da globuli rossi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 2: Componenti della Camera ipossia e misurazione / calcolo della concentrazione di ossigeno disciolto (A) Camera di ipossia e montaggio bombola del gas: (1) cilindro del gas; (2) Regolatore del gas; (3) fascetta Gas; (4) tubo del gas del cilindro; (5) del filtro di aspirazione; (6) tubo di alimentazione; (7) Misuratore di portata; (8) Tubo di uscita; (9) Camera di incubatore modulare. (B) Calcolo della concentrazione effettiva di ossigeno nel terreno di coltura cellulare utilizzando una curva standard prodotto con concentrazioni di ossigeno note. (C e D)I valori relativi ottenuti nelle soluzioni "0% O 2" e "il 21% O 2", sono riportati graficamente come una funzione lineare per determinare la concentrazione di ossigeno nel terreno di coltura cellulare "?% O 2". Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Generico disegno sperimentale di colture cellulari nel modulare incubazione Camera normossia (8% O 2; 5% di CO 2; 87% N 2) e ipossia / riossigenazione (H / R) (0,5% O 2; 5% di CO 2; 94,5% N 2) sono condizioni utilizzate per studiare le condizioni patologiche in citotrofoblasto villi (vCTB) e le cellule sinciziotrofoblasto (STB). Ogni 24 ore, con o senza supporto melatonina (1 mM) viene modificatoe la miscela di gas viene rinnovato. Sotto H / R, le cellule subiscono STB ipossia (0,5% O 2) per 4 ore e poi tornare alla normossia (8% O 2). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Effetto della melatonina su beta-gonadotropina corionica umana (β-hCG) secrezione durante Villous trofoblasto differenziazione delle cellule dei villi citotrofoblasto sono stati isolati e purificato da placenta termine sani umani. Le cellule sono state trattate per 96 ore con la melatonina di 1 mm o dimetilsolfossido (DMSO 0,1%: il controllo del veicolo) in condizioni di normossia (8% O 2; 5% di CO 2; 87% N 2). i livelli di β-hCG in terreno di coltura sono stati misurati mediante enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dopo 24, 48, 72 e 96 ore ocolture primarie f. I livelli sono stati normalizzati per il contenuto proteico del lisato cellula intera da ciascuno dei quali corrisponde bene. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Anti-ossidante effetto della melatonina in sinciziotrofoblasto esposto ad ipossia / riossigenazione (A) L'effetto della melatonina (M; 1 mm) specie reattive dell'ossigeno intracellulari livelli (ROS) nelle cellule sinciziotrofoblasto sotto normossia (n) o ipossia / riossigenazione (HR), indotta dopo 72 ore di cultura, è stata valutata mediante 5- (e-6) ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (carbossi-H2DCFDA) fluorescenza-2 -carboxy. I risultati sono espressi come media ± SD di 3 diversi placente; *** P <0.001 (Lanoix, et al. 8). (B) Le vie cellulari coinvolti nella protezione putativo di melatonina contro ipossia / riossigenazione apoptosi indotta. Cellule citotrofoblasto villi primarie sono state coltivate per 72 ore sotto normossia (8% O 2) per consentire la differenziazione in sinciziotrofoblasto. Le cellule sono state esposte a 1 mM di melatonina o controllo del veicolo e quindi sottoposti a ipossia (0,5% O 2) per 4 ore, seguito da un periodo di riossigenazione 18 hr (8% O 2). Ipossia / riossigenazione stress ossidativo indotto attiva redox sensibili fattori di trascrizione, come fattore nucleare kappa B (NF-kB) e ipossia fattore inducibile 1 (HIF-1). NF-kB induce p53, che innesca il pathway Bax / Bcl-2 di apoptosi mitocondriale coinvolge la scissione e l'attivazione delle caspasi 9 e 3. caspasi 3 attiva Rho-associata, coiled coil contenente proteina chinasi 1 (ROCK-1), la clivaggio di poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) e la compromissione della riparazione del DNA. Melatonina Prevenires l'induzione di apoptosi mitocondriale agendo come un potente antiossidante per ridurre lo stress ossidativo causato da ipossia / riossigenazione. Questa cifra è stata modificata da Lanoix et al. 2013 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| digestione 1 | digestione 2 | digestione 3 | digestione 4 | |
| Modificato HBSS (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAsi (ml) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0,1 mg /ml) | ||||
| MgSO 4 (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 mm) | ||||
| CaCl 2 (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 mM) | ||||
| Tripsina (U) | 1.824.000 | 1.200.000 | 960.000 | 960.000 |
| P / S (ml) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Tabella 1: quantità di ingredienti per la digestione soluzione penicillina e streptomicina (P / S);. solfato di magnesio (MgSO 4); cloruro di calcio (CaCl <sub> 2); deossiribonucleasi IV (DNasi IV).
Tabella 2: Volumi di densità della soluzione centrifugazione media e modificato HBSS necessario per la preparazione della soluzione gradiente.
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Discussion
Nei mammiferi, lo sviluppo fetale è direttamente dipendente adeguata funzione placentare. Le origini dello sviluppo di disturbi di salute sono basate sull'ipotesi che la causa delle malattie che si manifestano più tardi nella vita può essere fatta risalire al primo sviluppo e che la placenta ha un ruolo meccanicistico nella programmazione fetale 30-32. La placenta è il mediatore chiave della crescita e lo sviluppo fetale: regola il trasferimento dei nutrienti, protegge contro le esposizioni dannose, e ha importanti funzioni endocrine. Lo sviluppo da parte Kliman et al. Di una tecnica riproducibile per isolare citotrofoblasti primarie vitali è una pietra miliare nello studio delle normali e anormali funzioni placentari 6. Molti ricercatori hanno adattato questa tecnica per riprodurre le condizioni specifiche in vitro per capire placentare 18,20,33,34 fisiologia. Come descritto da Petroff et al., Molti passi sono importanti per garantire una resa purificato e robusta cito isolatocellule del trofoblasto 18. Per esempio, le fasi di digestione hanno subito diverse modifiche poiché lo sviluppo della tecnica nel 1988, come ad esempio un aumento del numero e la lunghezza delle digestioni, nonché la composizione e la quantità di enzimi digestivi, con conseguente maggior numero di cytotrophoblasts isolate vitali 18. Questo protocollo corrente ha tre vantaggi principali: crioconservazione, che prevede la possibilità di proseguire il protocollo di purificazione dopo immunomagnetica, che aumenta citotrofoblasto purezza e l'uso di pre-rivestite micropiastre migliorare l'adesione cellulare 7,34-36. La letteratura esistente contiene numerosi esempi di diverse modificazioni della tecnica di isolamento per celle citotrofoblasto, ma le caratteristiche dei media densità centrifugazione è rimasto pressoché invariato 37. La tecnica presentata dell'isolamento / immunopurificazione ha diversi passaggi critici. Quindi, è importante valutare la purezzadelle cellule citotrofoblasto villi alla fine di ogni immunopurificazione. Questo può essere fatto mediante citometria di flusso utilizzando anticorpi adeguati come marcatori: citocheratina-7 (marcatore trofoblastica), cluster di differenziazione 45 (CD45) e vimentina (cellule non-trofoblasto marcatori) 18,38,39. Altri aspetti critici sono la qualità dei placenta ottenuti, i FBS e la densità centrifugazione mezzi di gradiente, così come la velocità di centrifugazione, che possono tutti influenzare la resa e la qualità delle cellule 20,40.
Sebbene ampiamente utilizzate, la presente tecnica ha inevitabili limitazioni. In primo luogo, la quantità di cellule vitali cytotrophoblasts ottenuti dopo immunopurificazione è relativamente basso ed è il principale fattore limitante del numero delle possibili condizioni / trattamenti che possono essere testati. In secondo luogo, la durata della vita delle cellule del trofoblasto primarie è breve e nella differenziazione in vitro in sinciziotrofoblasto è seguito da vicino da una riduzione delle cellule viabili ty e un aumento dell'apoptosi. Il breve tratto di vitalità cellulare trofoblasto che non proliferano in vitro, limita la valutazione dei trattamenti a lungo termine, perché l'apoptosi viene attivato in modo irreversibile dopo circa 4 giorni di coltura 7,41. In terzo luogo, la variabilità interplacental è grande, quindi è necessario un numero relativamente grande di placenta di ottenere risultati statisticamente interpretabili. D'altra parte, la cultura trofoblasto primario ha vantaggi unici, come la capacità delle cellule di differenziarsi in syncytium, che consente lo studio delle condizioni e trattamenti in diversi fenotipi cellulari secondo i vari stadi di differenziazione. Il metodo di ossigenazione presentato in questo protocollo è altamente adattabile e la sua configurazione può essere adattata per altre situazioni, come ad esempio la cultura di cellule del trofoblasto primari da primo trimestre di gravidanza, che dovrebbero essere esposti a una tensione di ossigeno inferiore per normoxia 9,42,43.
S copi "> Ci sono altri approcci per studiare la funzione placentare umano in vitro. Snap-congelamento dei tessuti placentari permette di multi-omiche le analisi, ma richiede il campionamento multisito placentare, per evitare ad esempio le variazioni metaboliche dovute al gradiente di ossigenazione, che diminuisce dalla centrale villi alla periferia 44. Tuttavia, biologia cellulare trofoblasto vivo e comportamento non possono essere studiate usando questo approccio 45. espianti villi hanno il vantaggio di mantenere l'intera struttura dei villi con i tipi di cellule costituenti e la loro comunicazione, ma risposte a trattamenti non sono specifici cellule del trofoblasto 23. linee di cellule coriocarcinoma trofoblasto simili disponibili in commercio, come ad esempio Bewo, Jeg-3 e JAR possono essere utilizzati per studiare le funzioni di placenta, come la fusione, la differenziazione, e il trasporto transplacentare. Tuttavia, recenti studi dimostrano che l'espressione genica in primaria citotrofoblasti e cellule tumorali Bewo sono scarsamente correlati 46-48. Thus, coltura cellulare trofoblasto villi primaria, nonostante i suoi limiti, possiede il vantaggio unico di imitare l'ambiente in vivo della placenta normale o anormale.Gli studi che utilizzano cellule trofoblasto villi in colture primarie e espianti villi mostrano che l'ipossia e ipossia / riossigenazione riducono sistematicamente la vitalità delle cellule trofoblasto, in concomitanza con un aumento dei livelli di stress ossidativo, infiammazione, autofagia e apoptosi 43,49-52. Questo modello di coltura cellulare ipossia / riossigenazione, in particolare, ci ha permesso di dimostrare l'antiossidante e anti-apoptotici effetti della melatonina in cellule del trofoblasto villi. Nelle cellule del trofoblasto villi primarie esposte a ipossia / riossigenazione, melatonina previene la seguente: induzione di stress ossidativo, diminuita attività antiossidante enzimi, una maggiore attività di vie di segnalazione redox-sensibili, e induzione di apoptosi mitocondriale (Figura 5B) 8. il hymodello poxia / riossigenazione è uno strumento unico per accertare il ruolo preventivo della melatonina danni indotta da stress ossidativo e il suo possibile ruolo protettivo in complicazioni di gravidanza come la preeclampsia, dove la sintesi di melatonina placentare è ridotto 53. La melatonina è un potente antiossidante ad un'ampia gamma di obiettivi 54. Inoltre, la sicurezza della melatonina come trattamento è stato ampiamente stabilita. I risultati positivi con la melatonina sono stati riprodotti da diversi ricercatori e melatonina è attualmente in studi clinici come trattamento preventivo o terapeutico potenziale nelle gravidanze complicate da preeclampsia o restrizione della crescita intrauterina 55,56.
In conclusione, l'isolamento, la purificazione e la coltura primaria di alta qualità citotrofoblasto cellule, insieme con la tecnica di ipossia / riossigenazione consentono un'ampia gamma di approcci sperimentali promettenti per comprendere meglio complicazioni della gravidanza sono collegati ossidativolo stress e migliorare la salute della placenta.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
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