Introduction
Gjennom menneskets svangerskapet, placenta cytotrophoblast celler, som er mononukleærerte stamceller, raskt spre seg og differensiere til enten villous eller extravillous cytotrophoblast celler. Extravillous cytotrophoblasts invadere og oppussing spiralarteriene av livmorveggen. Villous cytotrophoblasts, derimot, fortsetter å spre seg, skille og sikring for å danne multinucleated syncytiotrophoblast (den syncytium) 1. Vedlikehold av villøse trophoblast homeostase er viktig for fosterets trivsel og sunn graviditet. Faktisk villous trophoblasts tillate maternal-føtal utveksling av oksygen og næringsstoffer, og produserer viktige hormoner for graviditet. Dessuten er det syncytiotrophoblast den eneste celletype i direkte kontakt med morens blodsirkulasjonen og gir en vesentlig fysisk og immunologisk barriere. Derfor må syncytiotrophoblast gjennomgå apoptose og erstatning for homeostatic vedlikehold og til avoid morkake patologier 2-5.
Teknikken er utviklet av Kliman et al. 6 i 1986 for å isolere primær villous cytotrophoblasts fra menneskelige placentas forårsaket en revolusjon i placenta forskning ved at studiet av de molekylære mekanismene som er involvert i villøse trophoblast differensiering. Dette klassisk teknikk, basert på sekvensielle enzymatiske digestions med trypsin og DNase, etterfulgt av isolasjon i tetthet sentrifuge media (kolloidalt silikapartiklene belagt med polyvinylpyrrolidon, eller Percoll) er nå anerkjent som gullstandarden for å isolere villous cytotrophoblast celler. Teknikken kan optimaliseres ved magnetisk immunorensing, en prosedyre som skiller villous cytotrophoblasts fra ikke-trofoblastiske celler basert på en annerledes ekspresjon av spesifikke antigener på overflaten av disse cellene. Vi valgte human leukocytt antigen ABC (HLA-ABC) på grunn av fravær av dets ekspresjon på trophoblastic celle membrane 7,8.
Morkaken er et organ som gjennomgår dramatiske variasjoner i oksygennivået i løpet av svangerskapet. I det første trimester, er den oksygenforholdet fysiologisk meget lav (2% O 2), men øker til mild grad av oksygenering (8% O 2) i den andre og tredje trimester. Tuuli et al. 9 beskrevet at in vitro reproduksjon av trophoblast miljøet inne i placenta villi er en utfordring og variasjoner i oksygennivået kan også føre til fenotypiske endringer. Det er derfor foreslått å innføre 8% oksygen som normoxia å etterligne oksygen spenning funnet i placenta villi i løpet av tredje trimester av svangerskapet 8,9. Chen et al., 10 grundig studert av flere variable knyttet til oksygen spenning i trophoblast cellekultur og vist betydningen av å bestemme oksygennivået i en pericellulær miljø. Nivåene av oksygen i de villi har en tendens til å økepå grunn av vaskulogenese. Blodstrøm i placenta villi øker jevnt og nivået av hydrogenperoksid (en rikelig reaktive oksygenforbindelser) er et viktig signal som styrer vaskulogenese 11,12. I svangerskapskomplikasjoner, mangel på vaskulogenese genererer hypoksi, og enda viktigere, intermitterende varianter av oksygenering (kalt hypoksi / Reoksygeneringen). Disse forholdene fører til en unormal økning av oksidativt stress, som kompromisser placenta og fosterets levedyktighet 13,14. De endringer som trophoblast celler gjennomgår in vivo under episoder av hypoksi / Reoksygeneringen kan etterlignet in vitro som følger: villous cytotrophoblasts blir opprettholdt under normoksisk forhold (8% O 2) til de differensiere i syncytiotrophoblast. De blir deretter utsatt for hypoksiske betingelser (0,5% O 2) i 4 timer, etterfulgt av ytterligere 18 timer av normoxia (reoksygenering). Ved hjelp av denne hypoksi / Reoksygeneringen tilnærming, trophoblasts exHibit deregulert redox status og økte nivåer av indre apoptose 8, som har blitt observert i enkelte svangerskapskomplikasjoner. Derfor er dette en nyttig in vitro modell for å vurdere nye forebyggende og terapeutiske tilnærminger for å bekjempe graviditet komplikasjoner forbundet med placenta hypoksi / reoksygenering.
Placentale celler produserer melatonin, som har flere viktige funksjoner, for eksempel en evne til å unngå oksidativt stress og placenta dysfunksjon 15. Her presenterer vi de eksperimentelle tilnærming og cellemodeller som brukes til å demonstrere den beskyttende effekten av melatonin i placenta trophoblast celler på molekylært, cellulært og funksjonsnivå 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Placentas ble innhentet umiddelbart etter spontane vaginale fødsler fra ukompliserte svangerskap på kompis-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Canada, med informert pasienten samtykke og godkjennelse av etiske komiteer (kompis-St-Luc Hospital og INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada).
1. Isolering og rensing av villøse Cytotrophoblast Cells
- Løsninger og media
- Forbered transportmedium ved å supplere Dulbeccos modifiserte Eagle Medium Høy Glukose (DMEM-HG) med 1% vol / vol antibiotika (10.000 enheter / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycin sulfat) og oppbevar ved 4 ° C.
- Fremstille primære dyrkningsmedier ved å supplere DMEM-HG med 10% volum / volum føtalt bovint serum (FBS), 25 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES), 1% vol / vol antibiotika (10.000 enheter / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycin sulfat) og oppbevar ved 4 ° C. Varme media til 37 ° C førbruk.
- Forbered 4 liter av saltoppløsning (0,9% vekt / vol natriumklorid).
- Forbered modifisert Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ved å tilsette 25 mM HEPES til 1 x HBSS (pH 7,4).
- Fremstille friske, fire flasker fordøyelse oppløsning med modifisert HBSS (fremstilt i 1.1.4), magnesiumsulfat (MgSO4), kalsiumklorid (CaCl2), trypsin, deoksyribonuklease IV (DNase IV), og 1% vol / vol antibiotikum ( 10.000 enheter / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycin sulfat) som vist i tabell 1.
- Forbered tetthet sentrifugering media gradient
- Fremstille tetthetssentrifugering media oppløsning ved å supplere tetthetssentrifugering media med 10% volum / volum HBSS 10x.
- Fremstille 14 Analyse-rørene med tetthetssentrifugering media løsning og modifisert HBSS, som beskrevet i tabell 2.
- Bland hver tetthet løsning (trinn 1.1.6.2) kraftig før du legger innholdet til graderingen. Skånsomttilsett tetthet løsninger til et 50 ml glass sentrifugerør sammen med en peristaltisk pumpe (1 ml / min), begynnende med den høyeste konsentrasjon (70%). Unngå dråper ved tømming av væskene mot rørveggen for å opprettholde riktig separasjon av hvert lag av gradienten.
- I fravær av en peristaltisk pumpe, gjelder lagene veldig forsiktig med Pasteur pipetter.
- Fremstille slutt rennende buffer ved å supplere den rennende buffer (se Tabell of Materials) med 2% vol / vol antibiotisk / antimykotisk (10.000 enheter / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycin sulfat). Oppbevar ved 4 ° C.
- Villøse cytotrophoblast isolasjon
Merk: Bruk sterilt kirurgisk utstyr, glass, pipetter, kolber, etc.- På dagen for villøse cytotrophoblast isolasjon, i et 37 ° C vannbad, varme opp digestions løsninger (fra trinn 1.1.5) og 70 ml FBS. Merk: Bruk 50 ml FBS å avbryte digestions ogresterende 20 ml av frysetrinnet (1.2.22) som kan plasseres på is igjen etter tining.
- Etter levering bringe placenta til laboratoriet i iskald transportmedium (fra trinn 1.1.1) så raskt som mulig (mindre enn 1 time).
- Kast transportmedium og morkake blod i flytende søppelbøtten. Vei morkaken og dyppe i kaldt saltvann.
- Mål og analysere følgende funksjoner: navlestreng lengde; navlestreng lokalisering; morkake lengde, bredde, form (oval, discoid); membran farge; cotyledon struktur patologi. Merk: Data er presentert i resultatdelen.
- Kutt navlestrengen sammen med sin morkake innsetting (dvs. ved basen med ytterligere 1 cm radius sirkel rundt ledningen). Dyppe i 300 ml histologisk vev fiksativ oppløsning (formalin 10%) for senere histologisk analyse.
- Skjær hele morkaken i terninger på 5 x 5 x 5 cm. Vask grundig (4 ganger x ~ 1 min) i saltvann solution (0,9%) for å fjerne blodceller før saltløsningen er klar. Kast spylevæske.
- I et urglass, fjerner placenta membranene og kjøttdeig vev for å fjerne blodårer og forkalkninger. Hold blodkar fast med tang og fjerne vev ved hjelp av baksiden av Metzenbaum saks.
- Plasser hakket placenta i en Büchner trakt. Rens med ca. 100 ml saltvannsbuffer. Fortsett hakking inntil 30 - 35 g hakket vev oppnås (bruk plast veiing båt og skala). Hvis nødvendig, hakke resten av placenta for å oppnå opp til tre ytterligere 30 - 35 g preparater. I løpet av denne tiden, setter hakket vev i en veie båt på is.
Merk: Dette trinnet vil ta rundt 45 minutter til 1 time.
- Plasser hakket placenta i en Büchner trakt. Rens med ca. 100 ml saltvannsbuffer. Fortsett hakking inntil 30 - 35 g hakket vev oppnås (bruk plast veiing båt og skala). Hvis nødvendig, hakke resten av placenta for å oppnå opp til tre ytterligere 30 - 35 g preparater. I løpet av denne tiden, setter hakket vev i en veie båt på is.
- Tilsett 30 - 35 g hakket placenta vev til en trypsinizing kolbe. Overføring 150 ml av den fremstilte løsningen fordøyelse 1 (tabell 1) til den trypsinizing kolben og bland godt.
- Plasser trypsinizing kolbe iet ristende vannbad i 30 minutter ved en hastighet på ikke mer enn 50 sykluser / min, og manuelt blande trypsinizing kolben hver 5 min for homogen fordøyelse.
- Ved slutten av den første fordøyelse, fjerner trypsinizing kolben fra vannbadet og vipper den (45 °) i 1 min for å sedimentere placenta vev. Med en 10 ml steril pipette og ta bort ca 80 ml supernatant. Unngå aspirering av vev.
- Overfør 100 ml fordøyelsen løsning 2 (Tabell 1) til trypsinizing kolbe; bland godt og gjenta trinn 1.2.9.
- Ved slutten av den andre fordøyelse, fjerner trypsinizing kolben fra vannbadet og vipper den 45 ° i 1 min. Med en 10 ml steril pipette, fjerne 80 ml supernatant og forsiktig overført til et sentrifugerør med en cellefilter (100 um mesh). Overfør den filtrerte supernatanten til et beger inneholdende 2 ml FBS hver gang sentrifugerøret er full.
- Utføre den tredje fordøyelse som beskrevet forandre fordøyelse (1.2.11 og 1.2.12) med 75 ml fordøyelsen løsning 3. Parallelt utføre trinnene 1.2.15 til 1.2.16.1 for fordøyelsen to.
- Utføre den fjerde fordøyelse nøyaktig som den tredje fordøyelse ved hjelp av fordøyelse oppløsning 4 (75 ml), men samle en maksimal mengde supernatant. Utfør trinn 1.2.15 til 1.2.16.1 parallelt for fordøyelsen tre, og til slutt for fordøyelsen 4.
- Alikvot av supernatanten (fra digestions 2, 3 og 4) i 13,5 ml deler, hver del inn i en 15 ml sentrifugerør. Med en 22,8 cm lang glass Pasteur pipette, meget forsiktig og langsomt sette 1,5 ml FBS ved bunnen av hvert rør for å skape en separat lag. Ikke bland FBS og supernatant. Sentrifuger rørene uten brems i 20 min ved 1250 xg ved romtemperatur.
Merk: Etter sentrifugering 4 lag er synlige i røret, som vist i figur 1. Separasjonen av trypsin og trophoblast celler unngår overdreven celle fordøyelse.. - Med en vakuumpumpe, aspirspiste og kast supernatant (fordøyelse løsning) og FBS lag, inklusive hvitaktig film mellom de to lag. Resuspender pelleten (de trofoblaster og røde blodceller lag) med 1 ml varm cellekulturmedium (trinn 1.1.2, uten FBS og ingen HEPES).
- Samle resuspenderte celler fra alle rør og kombinere dem i en tube. La røret stå ved romtemperatur inntil slutten av alle digestions. Merk: Etter at alle digestions, er den vanlige flyte 3 tuber av resuspendert celler (ett per fordøyelsen).
- Gjør opp volumet til 15 ml med varm cellekulturmedium. Sentrifuger ved 1250 xg i 10 min ved romtemperatur. Fjern supernatanten med en vakuumpumpe. Unngå aspirering av pelleten.
- Forsiktig resuspender pelleten oppnådd fra 3 rør med 1 ml varm cellekulturmedium. Pool innholdet i en tube. For å få 8 ml, komplett volum med varmt cellekulturmedium.
- Meget forsiktig lag cellesuspensjonen på et separasjons gradient med en Pasteur pipette. Sentrifuger uten brems i 30 min ved 507 xg ved romtemperatur.
- Etter sentrifugering identifisere de forskjellige lag av celler i gradienten med back-belysning. Finn de lagene som inneholder trophoblast og kontaminerende celler mellom 40 - 50% av tetthetssentrifugeringsmedium. Med en vakuumpumpe, fjernes øvre lag (> 50%).
- Samle celler lokalisert i lagene av interesse med en Pasteur pipette og overføre dem til et 50 ml sentrifugerør. Gjør opp volumet til 50 ml med cellekulturmedium. Sentrifuger i 10 minutter ved 1250 xg ved romtemperatur.
- Under sterile betingelser, kaste supernatanten, resuspender pelleten med 20 ml FBS og telle antallet celler ved hjelp av et hemocytometer. På is, tilsett 2,22 ml sterilt dimetylsulfoksid (DMSO) og bland forsiktig ved å vende. Alikvot 1,5 ml av cellesuspensjonen i kryogeniske ampuller, fryse over natten ved -80 ° C og overføres til en flytende nitrogen tank.
<li> trophoblast? Trophoblast rensing - Installer skylling og kjører buffere og et nytt filter kolonne på magnet rensing instrument i henhold til produsentens instruksjoner. Utfør "clean program" for å rense negativ en, positiv 1 og positiv 2 porter, og deretter presentere de 50 ml rør under hver port i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tine cellene som ble frosset i trinn 1.2.22 raskt i et 37 ° C vannbad. Overfør cellene til en 50 ml tube og resuspender celler forsiktig med 20 ml kaldt bufferløsning. Sentrifuger røret i 5 min ved 450 xg og 4 ° C.
- Kast supernatanten. Gjenta vasketrinn med kaldt rennende buffer. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer å bestemme levedyktighet. Gjenta sentrifugering (5 min, 450 xg ved 4 ° C). Fjern forsiktig supernatanten. Tilsett 1 ml kaldt rennende buffer inneholdende 1% vol / vol av mus anti-HLA-ABC-antistoffer. Inkuber ved 4 ° C i 30 min, Mixing forsiktig hver 5 min.
- Tilsett 6 ml kaldt rennende buffer. Sentrifuger i 5 minutter ved 450 xg og 4 ° C. Kast supernatanten og gjenta dette trinnet. Resuspender celler i 1 ml kaldt rennende buffer inneholdende 10% vol / vol av anti-muse sekundære antistoff-koplede magnetiske kuler. Inkuber ved 4 ° C i 15 minutter, blandes forsiktig hver 5 min.
- Tilsett 6 ml kaldt rennende buffer. Sentrifuger i 5 minutter ved 450 xg og 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender i 5 ml kaldt rennende buffer.
- Skill trophoblast cellene ved hjelp av magnetiske rensing instrument. Samle celler ved negativ port og legge til 20 ml kaldt rennende buffer.
Merk: trophoblast celler inneholder ikke den komplekse HLA-ABC, og er dermed atskilt fra andre celletyper og rettet mot det negative en port. - Sentrifuger i 5 minutter ved 450 xg og 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender cellene forsiktig i 20 ml varm primærkulturmedium. Telle celler usinga hemocytometer å bestemme levedyktighet.
- Plate cellene ved følgende tettheter: 0,15 x 10 6 celler / brønn i 96-brønners plater, 1.6 x 10 6 celler / brønn i 24-brønners plater og 4,5 x 10 6 celler / brønn på 6-brønners plater. Inkuber platene ved 37 ° C og 5% CO2.
- Bekrefte renheten av trophoblast celler ved flow cytometri 16,17 og / eller ved immunocytokjemi 18.
Merk: Renheten av immunopurified celler ble bestemt ved bruk av FITC-konjugerte monoklonale antistoffer mot cytokeratin-7 og vimentin 17-19. Denne protokollen er godt detaljert i Lanoix et al., 2008 7. - Etter minst 4 timer, skyll cellene to ganger med varmt kulturmedium for å fjerne ufestede celler og deretter overføre platene til den normoxia kammer, som består av 8% O 2 (se figur 2 og seksjon 2).
2. In Vitro -induserten av Normoxia og Hypoksi / Reoksygeneringen
- Inkubator kammer drift (se figur 2A for set-up).
- I en laminær strømningshette ved å plassere en petriskål inneholdende sterilt vann ved bunnen av inkubatoren kammeret for å unngå tørrhet; deretter plassere de tidligere utarbeidet cellekultur plater eller kolber (trinn 1.3.10) på den overlegne hyllene i kammeret.
- Utenfor hetten, fester kammeret (innløpsporten) til gasslangen (Figur 2A: 5a, b og c) for å nå røret av gassen (8% O 2 eller 0,5% O 2) (Figur 2A: 7). Åpne begge innløps- og utløpsportene i kammeret. I dette øyeblikket, gassregulatoren (Figur 2A: 4) skal være lukket.
- Åpne forsiktig gassregulatorventilen (figur 2A: 4). Flush i 4 minutter med en luftstrøm på 25 l / min for å fullstendig erstatte luften inne i kammeret.
- Etter spyling kammeret, stenge gassregulatoren til inntaks og outlet havner i kammeret.
- Koble fra strømningsmåleren utløpsslange (Figur 2A: 5c) fra innløpsåpningen av kammeret og plassere kammeret i en cellekulturinkubator ved 37 ° C.
- Erstatte den luft for tiden er til stede i de plater, flasker og oppløst i kulturmediet ved å fylle kammeret med gass 1 time etter trinn 2.1.3.
- Gjenta trinn 2.1.1 til 2.1.6 for de andre gassammensetninger (for eksempel 2% O 2 for første trimester trophoblast kultur 9).
- Bekreft oksygenprosenten (figur 2B-C)
- For å bekrefte konsentrasjonen av oksygen i cellekulturmedium (uten celler) inne i kammeret, å bruke en oksygenelektrode som er koblet til et oksygen adapter. Koble oksygenelektrode til et voltmeter.
- Lage en kalibreringskurve i den samme oppløsning (dvs. cellekulturmedium) ved å utsette oppløsningen for gasser med kjente oksygeninnhold (for eksempel 0%, og21% oksygen). Etter at målingene er stabilisert for hver konsentrasjon, innføre elektroden inn i mediet i kammeret.
Merk: Ta all måling på samme dybde for å unngå skjevheter i oksygenkonsentrasjonen 10.
- Induksjon av normoxia og hypoksi / Reoksygeneringen i trophoblasts.
- Etter å legge primære trophoblast celler til de riktige cellekulturflasker, plater eller petriskåler, utføre behandlinger som er nødvendige.
- Parallelt inne i kammeret, eksponere cellene til den ønskede gassblandingen for å reprodusere en bestemt tilstand hver 24 timer (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolasjon og immunorensing av villous cytotrophoblast celler fra en normal sikt placenta oppnådd ved vaginal fødsel ga 1 x 10 8 levende celler. Placenta veide 350 g, var 19 cm i diameter og 4 cm høy med skiveformet fasong og gjennomsiktige membraner. Ingen cotyledon misdannelse ble oppdaget. Navlestrengen hadde paracentral lokalisering og en lengde på 56 cm. Renheten ble evaluert ved flow cytometri ved hjelp vimentin og cytokeratin-7 markører. Mer enn 98% av cellene var negative for vimentin og positiv for cytokeratin-7, som bekrefter renheten av villous trofoblaster celler oppnådd fra immunorensing. Villøse cytotrophoblast celler ble tilsatt til 96-brønners kulturplater i henhold til normoksisk betingelser i nærvær eller fravær av 1 mM melatonin. Den biokjemiske differensiering av villous cytotrophoblasts ble overvåket ved å bestemme nivåer av β-humant choriongonadotropin (hCG-β) sekresjon såbeskrevet tidligere 1,7,20,21. Den morfologiske differensiering og apoptose ble vurdert ved immunofluorescens ved anvendelse av anti-desmoplakin og anti-kaspase-spaltet cytokeratin 18 intermediære filamenter 7,22. Celledyrkingsmedier fra dag 1 (hovedsakelig villous cytotrophoblasts) til dag 4 (hovedsakelig syncytiotrophoblasts) ble oppsamlet, sentrifugert og β-hCG-nivåer ble målt i supernatantene. Produksjon av β-hCG, som er eksklusiv for syncytiotrophoblast, øket med tiden kultur (figur 4). Ikke bare hypoksi / Reoksygeneringen, men hyperoksi (> 20% O 2) også aktivert apoptose 23. Således innføring av en 8% O 2-konsentrasjonen var representative for den mengde oksygen som en villøse trophoblast celle ville bli utsatt for under den tredje trimester av svangerskapet 10. Toppen av p-hCG nivåer som ble observert ved 72 timer bekreftet kapasiteten villous cytotrophoblasts å differensiere under disse betingelser.Melatonin endret ikke β-hCG sekresjon under disse studieforhold. Reduksjonen av p-hCG nivåer ved 96 timer ble sannsynligvis forårsaket av apoptose av trophoblast celler, noe som øker etter lengre perioder i primær kultur 5,7,22,24,25 (figur 4). DMSO (0,1% vol / vol) ble valgt fordi det ikke påvirke β-hCG-nivåer 26,27. Den beskyttende rolle melatonin ble sterkt knyttet til sin antioksidantegenskaper. Hypoksi / Reoksygeneringen etter 72h av kultur indusert oksidativt stress i villous trophoblast celler. Den beskyttende effekten av melatonin ble vurdert med reaktive oksygen arter (ROS) Detection Reagent (figur 5A). Etter 96 timer av dyrkningen ble trophoblast cellene inkubert i 45 minutter med 10 uM av 5- (og-6) -karboksy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (karboksy-H2DCFDA) for å detektere den totale mengden av produsert ROS 8. Villous trophoblast celler som gjennomgikk hypoksi / Reoksygeneringen haddebetydelig økt ROS nivåer (54%) sammenlignet med de under normoxia. Denne økningen ble reversert ved behandling med en mM melatonin. Videre under normoxia melatonin ikke modulere ROS-nivåer (Homeostase), som var lik ubehandlede villous trophoblast celler (figur 5A). Figur 4 og 5A viser at under normoxia melatonin endret ikke nivå av oksidativt stress eller β-hCG sekresjon i trophoblast celler, noe som bekrefter tidligere studier som viser ingen modulering av celle homeostase under normale forhold 28,29.
Figur 1:. Fordøyelse Tube Etter sentrifugering blir 4 lag dannes. Det øvre laget er sammensatt av fordøyelsen oppløsning; like nedenfor den føtalt bovint serum (FBS). Begge sjiktene skal kastes med en vakuumpumpe. De nederste lagene are sammensatt som følger: et hvitt lag som inneholder fibroblaster, leukocytter, makrofager, og trofoblaster; og et bunnsjikt består av røde blodlegemer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Komponenter av Hypoksi kammeret og måling / beregning av konsentrasjonen av oppløst oksygen (A) Hypoksi kammeret og gass sylinderenhet: (1) Gass sylinder; (2) Gass regulator; (3) Gassslangeklemme; (4) Cylinder gass slangen; (5) Inlet filter; (6) Inlet slangen; (7) Flow meter; (8) Outlet slangen; (9) Modular inkubator kammer. (B) Beregning av selve oksygenkonsentrasjonen i cellekulturmediet ved å bruke en standardkurve fremstilt med kjente oksygenkonsentrasjoner. (C og D)De relative verdier oppnådd i løsningene "0% O 2" og "21% O 2", er plottet grafisk som en lineær funksjon for å bestemme oksygenkonsentrasjonen i cellekulturmedium "?% O 2". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Generisk Experimental Design of Cell Culture i den modulære Inkubasjon kammeret Normoxia (8% O2; 5% CO2, 87% N2) og hypoksi / reoksygenering (H / R) (0,5% O2; 5% CO 2; 94.5% N2) er betingelser som anvendes til å studere patologiske tilstander i villøse cytotrophoblast (vCTB) og syncytiotrophoblast (STB) celler. Hver 24 timer, medium med eller uten melatonin (1 mM) blir endretog gassblandingen blir fornyet. Under H / R, STB celler gjennomgå hypoksi (0,5% O 2) i 4 timer og deretter gå tilbake til normoxia (8% O 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Effekten av melatonin på beta-humant koriongonadotropin (β-hCG) sekresjon under villøse trophoblast? Trophoblast Differensiering villøse cytotrophoblast celler ble isolert og renset fra menneskelige sunne sikt placentas. Cellene ble behandlet i 96 timer med 1 mM melatonin eller dimetylsulfoksid (DMSO 0,1%: bærerkontroll) under normoksisk betingelser (8% O 2; 5% CO2, 87% N2). β-hCG-nivåer i kulturmediet ble målt ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) etter 24, 48, 72 og 96 timer of primære kultur. Nivåer ble normalisert til proteininnholdet i hel-celle lysat fra hver tilsvarende godt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: Anti-oxidant effekten av melatonin i syncytiotrophoblast Utsatt for Hypoksi / reoksygenering (A) Effekten av melatonin (M; 1 mM) på intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) nivåer i syncytiotrophoblast celler under normoxia (N) eller hypoksi / Reoksygeneringen (HR), indusert etter 72 timer med kultur, ble vurdert av 5- (and-6) karboksy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (karboksy-H2DCFDA) fluorescens. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av 3 forskjellige placentas; *** P <0,001 (Lanoix, et al. 8). (B) De cellulære veier som er involvert i den antatte beskyttelse av melatonin mot hypoksi / reoksygenering-indusert apoptose. Primære villous cytotrophoblast-celler ble dyrket i 72 timer under normoxia (8% O 2) for å tillate differensiering til syncytiotrophoblast. Celler ble utsatt for 1 mM av melatonin eller bærerkontroll, og deretter underkastes hypoksi (0,5% O 2) i 4 timer, etterfulgt av en 18 timers periode reoksygenering (8% O 2). Hypoksi / reoksygenering-induserte oksidativt stress aktiverer redox-sensitive transkripsjonsfaktorer slik som nukleær faktor kappa B (NF-kB) og hypoksi induserbar faktor 1 (HIF-1). NF-kB induserer p53, som utløser Bax / Bcl-2 pathway av mitokondriell apoptose involverer spalting og aktivering av kaspaser 9 og 3. kaspase 3 aktiverer Rho-assosiert, kveilet spiral-inneholdende protein kinase 1 (ROCK-1), det kløyving av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og nedskrivning av DNA-reparasjon. melatonin bygges induksjon av mitokondriell apoptose ved å fungere som en kraftig antioksidant for å redusere oksidativt stress forårsaket av hypoksi / Reoksygeneringen. Dette tallet har blitt forandret fra Lanoix et al., 2013 8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| fordøyelse 1 | fordøyelse 2 | fordøyelse 3 | fordøyelse 4 | |
| Modifisert HBSS (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAse (pl) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0,1 mg /ul) | ||||
| MgSO4 (il) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 mm) | ||||
| CaCl2 (ul) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 mM) | ||||
| Trypsin (U) | 1824000 | 1200000 | 960000 | 960000 |
| P / S (ml) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Tabell 1: Mengder av ingredienser for den Fordøyelse Solution Penicillin og streptomycin (P / S);. magnesiumsulfat (MgSO4); kalsiumklorid (CaCl <sub> 2); deoksyribonuklease IV (DNase IV).
Tabell 2: Volum av tetthetssentrifuge Media Solution og Modified HBSS Nødvendig for forberedelse av Gradient Solution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I pattedyr er fosterutvikling direkte avhengig av tilstrekkelig placenta funksjon. Utviklings opprinnelse lidelser er basert på en hypotese om at årsaken til sykdommer manifestert senere i livet kan spores tilbake til tidlig utvikling og at morkaken har en mekanistisk rolle i foster programmering 30-32. Morkaken er nøkkelen formidler av fosterets vekst og utvikling: det regulerer næringstransport, beskytter mot skadelige eksponeringer, og har store endokrine funksjoner. Utviklingen av Kliman et al. Av en reproduserbar teknikk for å isolere levedyktige primære cytotrophoblasts er en milepæl i studiet av normale og unormale placenta funksjoner 6. Mange forskere har tilpasset denne teknikken til å reprodusere bestemte vilkår in vitro å forstå placenta fysiologi 18,20,33,34. Som beskrevet av Petroff et al., Mange trinn er viktig for å sikre en renset og robust utbytte av isolert cytomegalovirustrophoblast celler 18. For eksempel har fordøyelse fremgangsmåten gjennomgått flere modifikasjoner siden utviklingen av teknikken i 1988, slik som et øket antall og lengde av de digestions, så vel som til sammensetningen og mengden av fordøyelsesenzymer, hvilket resulterer i et større antall levedyktige isolerte cytotrophoblasts 18. Denne strøm protokollen har tre hovedfordeler: nedfrysing, noe som åpner for muligheten til å fortsette protokollen senere immunomagnetisk rensing, noe som øker cytotrophoblast renhet og bruk av pre-belagte mikroplater forbedrer cellefesting 7,34-36. Den eksisterende litteratur inneholder mange eksempler på diverse modifikasjoner av den isolasjon teknikk for cytotrophoblast celler, men egenskapene til tetthetssentrifugeringsmedier har holdt seg praktisk talt uendret 37. Den presenterte teknikken av isolasjon / immunorensing har flere kritiske trinn. Derfor er det viktig å evaluere renhetenav villous cytotrophoblast cellene ved slutten av hver immunorensing. Dette kan gjøres ved strømningscytometri ved anvendelse av passende antistoffer som markører: cytokeratin-7 (trofoblastiske markør), klasedifferensierings 45 (CD45) og vimentin (ikke-trophoblast celler markører) 18,38,39. Andre kritiske aspekter er kvaliteten av de oppnådde placentas, de FBS og tetthetssentrifugering media gradient, samt sentrifugehastighet, som alle kan påvirke utbyttet og kvaliteten av cellene 20,40.
Selv om det er mye brukt, har den foreliggende teknikk uunngåelige begrensninger. For det første er mengden av levedyktige celler cytotrophoblasts oppnådd etter immunorensing er forholdsvis lav og er den viktigste begrensende faktor i antall mulige tilstander / behandlinger som kan testes. Dernest levetiden av primære trophoblast celler er kort og in vitro differensiering i syncytiotrophoblast er tett fulgt av en reduksjon av celle viabili Ty og en økning av apoptose. Den korte lengden på trophoblast cellelevedyktighet som ikke proliferere in vitro, begrenser evalueringen av lengre sikt behandlinger, fordi apoptose irreversibelt utløses etter 4 dagers dyrking 7,41. For det tredje er interplacental variasjon stor, slik at det kreves et forholdsvis stort antall placentas for å oppnå statistisk tolkbare resultater. På den annen side har hoved trophoblast kultur unike fordeler, slik som kapasiteten av cellene til å differensiere til syncytium, som gjør det mulig for studiet av tilstander og behandlinger i forskjellige celle fenotyper i henhold til de forskjellige trinn av differensiering. Oksygene Metoden som presenteres i denne protokollen er svært tilpasningsdyktig og konfigurasjonen kan skreddersys for andre situasjoner, for eksempel kultur primære trophoblast celler fra første trimester av svangerskapet, som skal bli utsatt for en lavere oksygen spenning for normoxia 9,42,43.
ntent "> Det finnes andre måter å studere menneskelige placenta funksjon in vitro. Snap-frysing morkakevev tillater multi-omics analyser, krever men morkakeflersteds prøvetaking, for å unngå for eksempel metabolske variasjoner på grunn av oksygen gradient, noe som reduserer fra sentral villi til periferien 44. men, live trophoblast cellebiologi og adferd kan ikke bli studert ved hjelp av denne tilnærmingen 45. villøse explants har fordelen av å opprettholde hele villøse struktur med de bærende celletyper og deres kommunikasjon, men svar på behandlinger er ikke spesifikke for trophoblast celler 23. Kommersielt tilgjengelige trophoblast lignende choriocarcinoma-cellelinjer, slik som BeWo, JEG-3, og JAR kan brukes til å studere placentale funksjoner, for eksempel fusjon, differensiering og trans transport. Men nyere studier viser at gen-ekspresjon i primære cytotrophoblasts og BeWo kreftceller er dårlig korrelert 46-48. Thus, primære villøse trophoblast cellekultur, til tross for sine begrensninger, har den unike fordelen av å etterligne in vivo miljøet i normal eller unormal placenta.Studier med villøse trophoblast celle i primærkultur og villous explants viser at hypoksi og hypoksi / Reoksygeneringen systematisk redusere trophoblast celle levedyktighet, samtidig med økte nivåer av oksidativt stress, inflammasjon, autofagi og apoptose 43,49-52. Dette hypoksi / reoksygenering cellekulturmodell, spesielt, har gjort det mulig å demonstrere antioksidant og anti-apoptotiske effekter av melatonin i villous trophoblast celler. I primær villous trophoblast celler eksponert for hypoksi / Reoksygeneringen, hindrer melatonin følgende: induksjon av oksidativt stress, redusert antioksidantenzymaktivitet, økt aktivitet av redoks-sensitive signalveier og induksjon av mitokondrie apoptose (figur 5B) 8. den hypoxia / Reoksygeneringen modellen er et unikt verktøy for å fastslå forebyggende rolle melatonin i oksidativt stress-indusert skade og dens mulige beskyttende rolle i svangerskapskomplikasjoner som svangerskapsforgiftning, hvor morkake melatonin syntesen reduseres 53. Melatonin er en kraftig antioksidant med et bredt spekter av mål 54. Også har sikkerheten av melatonin som en behandling i stor grad blitt etablert. De gunstige resultater med melatonin har blitt gjengitt av flere forskere og melatonin er i kliniske studier som en potensiell forebyggende eller terapeutisk behandling i svangerskap komplisert av preeklampsi eller intrauterin veksthem 55,56.
Som konklusjon, isolering, rensing og primær kultur av høy kvalitet cytotrophoblast celler, sammen med teknikken for hypoksi / reoksygenering muliggjøre et bredt spekter av lovende eksperimentelle tilnærminger for å få en bedre forståelse graviditet komplikasjoner relatert til oksidativtstress og forbedre morkake helse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
- Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
