Introduction
На протяжении всей человеческой беременности, плацентарные цитотрофобласта клетки, которые Мононуклеированные стволовые клетки, быстро пролиферируют и дифференцируются в или ворсинками или extravillous цитотрофобласта клеток. Extravillous cytotrophoblasts вторгнуться и реконструируют спиральные артерии стенки матки. Ворсинчатая cytotrophoblasts, с другой стороны, продолжают пролиферировать, дифференцироваться и сливаются в форме многоядерные syncytiotrophoblast (синцитии) 1. Содержание ворсинок трофобласта гомеостаза имеет важное значение для плода благополучия и здоровой беременности. На самом деле, ворсинчатые трофобласты позволяют обмен матери плоду кислорода и питательных веществ, а также произвести необходимые гормоны для беременности. Кроме того, syncytiotrophoblast является единственной типа клеток в прямом контакте с циркуляцией крови матери и обеспечивает существенную физическую и иммунологического барьера. Таким образом, syncytiotrophoblast должны подвергаться апоптозу и замену для поддержания гомеостаза и AVOID плацентарной патологии 2-5.
Методика , разработанная Kliman и др. , 6 в 1986 году выделить первичные ворсинчатых cytotrophoblasts из человеческих плацентами вызвало революцию в плацентарной исследований, позволяя изучение молекулярных механизмов , участвующих в ворсинок трофобласта дифференциации. Эта классическая методика, основанная на последовательных ферментативных варок с трипсина и ДНКазы, с последующим выделением в плотности центрифугирование среды (частицы коллоидного кремнезема покрыты поливинилпирролидона или Перколла) в настоящее время признается в качестве золотого стандарта для выделения ворсинчатых цитотрофобласта клеток. Этот метод может быть оптимизировано с помощью магнитной иммуноочистки, процедура, которая отделяет ворсинчатых cytotrophoblasts от не трофобласта клеток на основе дифференциальной экспрессии специфических антигенов на поверхности этих клеток. Мы выбрали человеческий лейкоцитарный антиген ABC (HLA-ABC) из-за отсутствия его экспрессии на клеточной трофобластическая мембранныхе 7,8.
Плацента является органом, который претерпевает значительные изменения в уровнях кислорода во время беременности. В первом триместре, отношение оксигенации является физиологически очень низкой (2% O 2) , но возрастает до умеренных уровней оксигенации (8% O 2) во втором и третьем триместре. Tuuli и др. 9 описано , что размножение в пробирке трофобласта среды внутри плацентарной ворсинок является проблемой и изменения в уровнях насыщения воды кислородом может даже привести к фенотипическим изменениям. Поэтому, предлагается принять 8% кислорода , как нормоксии , чтобы имитировать напряжение кислорода найденный в плацентарной ворсинок в третьем триместре беременности 8,9. Чен и др. 10 широко изучены несколько переменных , связанных с напряжением кислорода в культуре клеток трофобласта и продемонстрировали важность определения уровня кислорода в околоклеточном среде. Уровни кислорода в ворсинках имеют тенденцию к увеличениюиз-за васкулогенезе. Кровоток в плацентарных увеличивается ворсинок постоянно и уровень перекиси водорода (распространен по активные формы кислорода) является важным сигналом , который управляет васкулогенез 11,12. В осложнений во время беременности, отсутствие васкулогенезе порождает гипоксию, и что более важно, прерывистые вариации оксигенации (называемую гипоксию / реоксигенация). Эти условия приводят к ненормальному увеличению окислительного стресса, который ставит под угрозу плацентарного и жизнеспособности плода 13,14. Изменения , которые клетки трофобласта подвергаются в естественных условиях во время эпизодов гипоксии / реоксигенация может быть передразнил в пробирке следующим образом : ворсинчатые cytotrophoblasts поддерживаются при нормоксических условиях (8% O 2) , пока они не дифференцируются в syncytiotrophoblast. Они затем подвергаются гипоксических условиях (0,5% O 2) в течение 4 ч, а затем еще в течение 18 ч от нормоксии (реоксигенации). Используя эту гипоксия / реоксигенация подход, трофобласта ехHiBit дерегулированы окислительно - восстановительный статус и повышенные уровни внутреннего апоптоза 8, как было отмечено в некоторых осложнений во время беременности. Следовательно, это полезно в модели пробирке для оценки новых профилактических и терапевтических подходов для борьбы с осложнениями беременности , связанных с плацентарной гипоксия / реоксигенация.
Плацентарные клетки производят мелатонин, который имеет несколько важных функций, таких как способность устранени окислительного стресса и плацентарной дисфункции 15. Здесь мы приводим экспериментальные модели подход и клеточные , используемые для демонстрации защитных эффектов мелатонина в плацентарных клеток трофобласта на молекулярном, клеточном и функциональном уровне 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Плаценте были получены сразу после спонтанных вагинальных родов с неосложненной беременности на CHUM-St Luc-Hospital, Монреаль, Квебек, Канада, с информированного согласия и одобрения этических комитетов (CHUM-St-Luc больницы и INRS-Institut Armand-Frappier пациента, Лаваль, QC, Canada).
1. Выделение и очистка ворсинок цитотрофобласта клеток
- Решения и средства массовой информации
- Подготовка транспортной среды путем дополнения модифицированную Dilbecco орла Средний высокого уровня глюкозы (DMEM-HG) с 1% об / об антибиотиком (10000 единиц / мл пенициллина G, 100 мг / мл стрептомицина сульфата) и хранят при температуре 4 ° С.
- Подготовка первичной медиакультуру дополнив DMEM-HG с 10% об / об эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 25 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), 1% об / об антибиотик (10000 единиц / мл пенициллина G, 100 мг / мл стрептомицина сульфата) и хранят при температуре 4 ° С. Теплые средства массовой информации до 37 ° C доиспользование.
- Приготовьте 4 л солевого раствора (0,9% вес / объем хлорида натрия).
- Готовят модифицированный Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS) добавлением 25 мМ HEPES до 1х HBSS (рН 7,4).
- Подготовить свежие, четыре бутылки переваривания раствора с модифицированной HBSS (полученного в 1.1.4), сульфат магния (MgSO 4), хлорид кальция (CaCl 2), трипсин, дизоксирибонуклеаза IV (ДНКазы IV), и 1% объем / объем антибиотика ( 10000 единиц / мл пенициллина G, 100 мг / мл стрептомицина сульфата) , как показано в таблице 1.
- Приготовьте плотности Центрифугирование медиа градиент
- Приготовьте плотность центрифугирование раствора носителя путем дополнения плотности центрифугирование среды с 10% об / об HBSS 10x.
- Приготовьте 14 Пробирки с плотностью раствора центрифугирования медиа и модифицированного HBSS, как описано в таблице 2.
- Смешайте каждого решения плотности (этап 1.1.6.2) энергично, прежде чем добавлять его содержимое градиента. нежнодобавить растворов плотностью до 50 мл стекл центрифужные пробирки с помощью перистальтического насоса (1 мл / мин), начиная с самой высокой концентрации (70%). Избегайте капель путем слива растворов к стенке трубки, чтобы поддерживать надлежащее разделение каждого слоя градиента.
- При отсутствии перистальтического насоса, применять слои очень осторожно с пипетки Пастера.
- Подготовка окончательного рабочего буфера путем добавления к рабочим буфером (см таблицу материалов) с 2% об / об антибиотик / противогрибковым (10000 ед / мл пенициллина G, 100 мг / мл стрептомицина сульфата). Хранить при температуре 4 ° С.
- Ворсинок цитотрофобласта изоляция
Примечание: Используйте стерильный хирургическое оборудование, изделия из стекла, пипеток, фляги и т.д.- В день ворсинок изоляции цитотрофобласта, в C водяной бане при 37 °, согревать пищеварений решения (со стадии 1.1.5) и 70 мл ФБС. Примечание: Используйте 50 мл FBS, чтобы прервать варок и томуОставшиеся 20 мл на стадии замерзания (1.2.22), которые могут быть помещены на лед один раз размораживали.
- После родов, принесите плаценту в лабораторию в ледяном транспортной среде (со стадии 1.1.1) как можно быстрее (менее чем за 1 час).
- Отбросить транспортная среда и плацентарной крови в жидком помойку. Взвесьте плаценту и погружают в холодную солевом растворе.
- Измерять и анализировать следующие особенности: пупочной длина шнура; локализация пуповины; плацентарного длина, ширина, форма (овальная, дискоидная); Мембрана цвет; структура семядолей патологиях. Примечание: Данные приведены в разделе результатов.
- Перерезать пуповину , наряду со своей плацентарной вставки (т.е., на его базе с дополнительным 1 см радиус окружности вокруг шнура). Погружают в 300 мл раствора гистологического ткани закрепителя (формалина 10%) для последующего гистологического анализа.
- Вырезать всю плаценту на кубики 5 х 5 х 5 см. Тщательно промыть водой (4 раза х ~ 1 мин) в солевом золесоциологическое загрязнение (0,9%) для удаления клеток крови, пока физиологический раствор не станет прозрачным. Откажитесь промывочной жидкостью.
- В часовом стекле, удалите плацентарных мембран и тканей фарша для удаления кровеносных сосудов и обызвествления. Держите кровеносные сосуды крепко пинцетом и удалить тканей с использованием задней части Metzenbaum ножниц.
- Поместите рубленый плаценту в воронку Бюхнера. Полоскание с приблизительно 100 мл солевого буфера. Продолжить мясорубки до 30 - 35 г измельченной ткани не получают (используйте пластиковые взвешенную лодочку и масштаб). В случае необходимости, пропустить через мясорубку оставшуюся часть плаценты, чтобы получить до трех дополнительных 30 - 35 г препаратов. В это время, накройте измельченной ткани в взвешенную лодочку на льду.
Примечание: Этот шаг займет около 45 мин до 1 ч.
- Поместите рубленый плаценту в воронку Бюхнера. Полоскание с приблизительно 100 мл солевого буфера. Продолжить мясорубки до 30 - 35 г измельченной ткани не получают (используйте пластиковые взвешенную лодочку и масштаб). В случае необходимости, пропустить через мясорубку оставшуюся часть плаценты, чтобы получить до трех дополнительных 30 - 35 г препаратов. В это время, накройте измельченной ткани в взвешенную лодочку на льду.
- Добавьте 30 - 35 г рубленого плацентарной ткани в trypsinizing колбу. Передача 150 мл приготовленного раствора пищеварения 1 (таблица 1) в trypsinizing колбу и хорошо перемешать.
- Поместите trypsinizing колбу втрясущейся водяной бане в течение 30 мин со скоростью не более 50 циклов / мин и вручную смешать trypsinizing колбу каждые 5 мин для однородного пищеварения.
- В конце первого переваривания, удалите trypsinizing колбу из водяной бани и наклонить его (45 °) в течение 1 мин для осаждения плацентарной ткани. С помощью 10 мл стерильной пипетки, удалить и выбросить примерно 80 мл надосадочной жидкости. Избегайте аспирационных ткани.
- Передача 100 мл раствора 2 пищеварения (Таблица 1) в trypsinizing колбу; хорошо перемешать и повторить шаг 1.2.9.
- В конце второго переваривания, удалите trypsinizing колбу из водяной бани и наклонить его на 45 ° в течение 1 мин. С помощью 10 мл стерильной пипетки, удалить 80 мл надосадочной жидкости и осторожно переносят в центрифужную пробирку с сотовым сетчатого фильтра (меш 100 мкм). Перенести отфильтрованный супернатант в химический стакан, содержащий 2 мл ФБС каждый раз, когда центрифуга трубка заполнена.
- Выполнение третьего перевариванию, как описано длявторое пищеварение (1.2.11 и 1.2.12) с использованием 75 мл раствора переваривание 3. Параллельно, выполните шаги 1.2.15 к 1.2.16.1 для пищеварения 2.
- Выполнение четвертого переваривание точно в качестве третьего переваривания с использованием раствора переваривание 4 (75 мл), но собирают максимальное количество супернатанта. Выполните шаги 1.2.15 для 1.2.16.1 параллельно для переваривания 3, и, наконец, для пищеварения 4.
- Алиготе супернатант (от переваривания 2, 3 и 4) в 13,5 мл частей, каждая часть в одну центрифужную пробирку 15 мл. С длинной 22,8 см стекло пипетки Пастера, очень осторожно и медленно поместите 1,5 мл ФБС в нижней части каждой трубки, чтобы создать отдельный слой. Не следует смешивать FBS и супернатант. Центрифуга трубки без тормоза в течение 20 мин при 1250 х г при комнатной температуре.
Примечание: После центрифугирования 4 -х слоев видимы в трубе, как показано на рисунке 1 Разделение трипсина и клеток трофобласта позволяет избежать чрезмерного клеточного пищеварения.. - С помощью вакуумного насоса, Aspirели и отбросить супернатант (переваривание раствор) и FBS слоев, в том числе беловатой пленки между двумя слоями. Ресуспендируют осадок (в трофобласта и красных слоев клеток крови) с 1 мл теплой среды для культивирования клеток (этап 1.1.2 программного обеспечения, без FBS и не HEPES).
- Собирают ресуспендировали клетки из всех трубок и объединить их в 1 трубе. Пусть труба не выдерживают при комнатной температуре до конца всех варок. Примечание: После всех варок, обычный выход 3 трубы ресуспендировали клеток (по одному на пищеварение).
- Составляют объем до 15 мл теплой среде для культивирования клеток. Центрифуга при 1250 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант с помощью вакуумного насоса. Избегайте аспирационных гранул.
- Аккуратно ресуспендируют осадок, полученный из 3-х пробирки с 1 мл теплой среды для культивирования клеток. Бассейн их содержание в 1 тубы. Для получения 8 мл, полный объем теплой среде для культивирования клеток.
- Очень нежно слой клеточной суспензии на граде разделениянике, с помощью пипетки Пастера. Центрифуга без тормоза в течение 30 мин при 507 мкг при комнатной температуре.
- После центрифугирования идентифицировать различные слои клеток в градиенте с фоновой подсветки. Найдите слои, содержащие трофобласт и загрязняющие клетки от 40 - 50% от плотности среды центрифугирования. С помощью вакуумного насоса, удалить верхние слои (> 50%).
- Сбор клеток, расположенных в слоях, представляющих интерес с пипеткой Пастера и передавать их в центрифужную пробирку на 50 мл. Составляют объем до 50 мл клеточной культуральной среды. Центрифуга в течение 10 мин при 1250 х г при комнатной температуре.
- В стерильных условиях, отбросить супернатант, ресуспендируют осадок с помощью 20 мл ФБС и подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра. На льду, добавляют 2,22 мл стерильного диметилсульфоксиде (ДМСО) и осторожно перемешать, переворачивая. Аликвоты 1,5 мл суспензии клеток в криогенных флаконах, замораживание в течение ночи при -80 ° С и переносят в баке жидкого азота.
<литий> очистка трофобласта - Установите промывку и эксплуатационные буферы и новый столбец фильтра на магнитном инструменте очистки в соответствии с инструкциями изготовителя. Выполните "чистую" программу, чтобы очистить отрицательные порты 1, положительный 1 и положительный 2, а затем ввести 50 мл пробирки по каждому порту в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Оттепель клетки, которые были заморожены на стадии 1.2.22 быстро в C водяной бане при 37 °. Передача клеток в 50 мл пробирку и ресуспендируют клетки осторожно 20 мл холодного раствора. Проточном буфере Отцентрифугировать пробирку в течение 5 мин при 450 х г и 4 ° С.
- Удалите супернатант. Повторите шаг стирки с холодной проточной буфера. Граф клеток с помощью гемоцитометра для определения жизнеспособности. Повторите центрифугирования (в течение 5 мин, 450 мкг при 4 ° С). Осторожно удалите супернатант. Добавить 1 мл холодной проточной буфера , содержащего 1% об / об мышиных анти-HLA-ABC антител. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 30 мин, Миксинг нежно каждые 5 мин.
- Добавить 6 мл холодной проточной буфера. Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г и 4 ° С. Удалите супернатант и повторите этот шаг. Ресуспендируют клеток в 1 мл холодной проточной буфера , содержащего 10% об / об анти-мышиных вторичными антителами связью магнитных шариков. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 15 мин, перемешивание осторожно каждые 5 мин.
- Добавить 6 мл холодной проточной буфера. Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г и 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендируют в 5 мл холодной проточной буфера.
- Отдельные клетки трофобласта с помощью магнитного инструмента очистки. Собирают клетки в отрицательном порту и добавьте 20 мл холодной проточной буфера.
Примечание: клетки трофобласта не содержат комплекс HLA-ABC, и, таким образом, отделены от других типов клеток, и направлен в сторону отрицательного 1 порта. - Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г и 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и осторожно ресуспендирования клеток в 20 мл теплой первичной культуральной среды. Граф клеток USINга гемоцитометр для определения жизнеспособности.
- Пластина клетки на следующих плотностей: 0,15 х 10 6 клеток / лунку в 96-луночные планшеты, 1,6 х 10 6 клеток / лунку в 24-луночные планшеты и 4,5 х 10 6 клеток / лунку в 6-луночные планшеты. Инкубируйте пластин при 37 ° С и 5% CO 2.
- Подтверждение чистоты трофобласта клеток методом проточной цитометрии 16,17 и / или иммуноцитохимически 18.
Примечание: Чистота иммунологически клеток определяли с использованием FITC-конъюгированных моноклональных антител против цитокератина-7 и виментина 17-19. Этот протокол также подробно описаны в Lanoix и др., 2008 7. - После того, как по меньшей мере 4 ч, промыть клетки дважды теплой культуральной среды , чтобы удалить клетки неприкрепленные , а затем передать пластины в нормоксии камеру, которая состоит из 8% O 2 (см рисунок 2 и раздел 2).
2. In Vitro Inductioп нормоксии и гипоксия / реоксигенация
- Инкубатор операции камеры (рис 2A для настройки).
- В ламинарном потоке, поместите чашку Петри, содержащую стерильную воду на дно инкубатора камеры, чтобы избежать сухости; затем поместите предварительно подготовленные культуры клеток пластин или колб (этап 1.3.10) на улучшенных полок камеры.
- Вне капот, прикрепить камеру (входное отверстие) в газовый шланг (Рисунок 2А: 5а, б, в) , чтобы достичь трубки газа (8% O 2 , или 0,5% O 2) (рис 2А: 7). Откройте оба впускных и выпускных портов камеры. В этот момент, газовый регулятор (рис 2А: 4) должен оставаться закрытым.
- Осторожно откройте газовый регулятор клапана (рис 2A: 4). Промывка в течение 4 мин со скоростью потока воздуха 25 л / мин, чтобы полностью заменить воздух внутри камеры.
- После продувки камеры, закройте газовый регулятор, то входное отверстие и НУtlet порты камеры.
- Отсоедините выпускной шланг расходомер (фиг.2А: 5с) от впускного отверстия камеры и помещают в камеру в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Заменить воздух в настоящее время, присутствующий в виде пластин, колб и растворенное в культуральной среде путем заполнения камеры газом 1 часа после того, как шаг 2.1.3.
- Повторите шаги 2.1.1 2.1.6 для других газовых составов (например, 2% O 2 для первого триместра трофобласта культуры 9).
- Confirm процентное содержание кислорода (Фигура 2В-С)
- Подтверждения концентрации кислорода в среде для культивирования клеток (без клеток) внутри камеры, используют кислородный электрод, подключенный к адаптеру кислорода. Подключите электрод кислорода к вольтметру.
- Создание калибровочной кривой в том же растворе (то есть среда культуры клеток) путем воздействия на решение газов с известным содержанием кислорода (например, 0% и21% кислорода). После того, как показания стабилизируются для каждой концентрации, вводится электрод в среду в камере.
Примечание: Принять все измерения на той же глубине , с тем , чтобы избежать какой - либо уклон в концентрации кислорода 10.
- Индукция нормоксии и гипоксией / реоксигенация в трофобласта.
- После добавления первичных клеток трофобласта в соответствующие колбы для культивирования клеток, тарелки или чашки Петри, выполнить процедуры по мере необходимости.
- Параллельно с этим , внутри камеры, подвергать клетки к желаемой газовой смеси , чтобы воспроизвести определенное условие каждые 24 ч (рисунок 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выделение и иммуноочистки из ворсинок цитотрофобласта клеток из нормального срока плаценты , полученных при вагинальных родах дали 1 х 10 8 жизнеспособных клеток. Плацента весил 350 г, был 19 см в диаметре, 4 см высотой с дискообразной формой и прозрачной мембраны. Не обнаружено семядолей уродства. Пуповина была парацентральная локализацию и длину 56 см. Чистоту оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием виментин и Цитокератин-7 маркеров. Более 98% клеток были отрицательными для виментину и положительный результат на цитокератином-7, что подтверждает чистоту трофобласта клеток ворсинок, полученных из иммуноочистки. Ворсинчатая цитотрофобласта клеток добавляли в 96-луночные культуральные планшеты при нормоксических условиях в присутствии или в отсутствие 1 мМ мелатонина. Биохимический дифференциация ворсинчатыми cytotrophoblasts контролировали путем определения уровня бета-хорионического гонадотропина человека (β-ХГЧ) секреторный1,7,20,21 описано ранее. Морфологической дифференциации и апоптоза оценивали с помощью иммунофлуоресценции с использованием анти-desmoplakin и анти-каспазы-расщепляется цитокератин 18 промежуточных филаментов 7,22. Среда культуры клеток из 1-й день (в основном ворсинчатые cytotrophoblasts) в 4-й день (в основном syncytiotrophoblasts) собирали, центрифугировали и уровни β-ХГЧ измерялись в супернатантах. Получение бета-ХГЧ, который является эксклюзивным для syncytiotrophoblast, возрастает со временем культивирования (рисунок 4). Не только гипоксия / реоксигенация, но гипероксия (> 20% O 2) также активируется апоптозу 23. Таким образом, принятие 8% -ной концентрации O 2 был представителем количества кислорода , к которому ворсинок трофобласта ячейка будет подвергаться во время третьего триместра беременности 10. Пик уровней бета-ХГЧ, наблюдаемых при 72 ч подтвердили способность ворсинчатыми cytotrophoblasts дифференцироваться в этих условиях.Мелатонин не изменяет бета-ХГЧ секрецию в этих условиях исследования. Снижение бета-ХГЧ уровней на 96 часов был , вероятно , вызвано апоптоз клеток трофобласта, что увеличивает после длительных периодов времени в первичной культуре 5,7,22,24,25 (рисунок 4). ДМСО (0,1% об / об) был выбран потому , что он не влияет на уровень β-ХГЧ 26,27. Защитная роль мелатонина тесно связана с его антиоксидантными свойствами. Гипоксия / реоксигенация после 72h культуры индуцированного окислительного стресса в клетках трофобласта ворсинок. Защитное действие мелатонина оценивали с помощью форм кислорода (ROS) Обнаружение Реагент (рисунок 5А). После 96 часов культивирования трофобласта клетки инкубировали в течение 45 мин с 10 мкМ 5- (а-6) карбокси-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein диацетат (карбокси-H2DCFDA) , чтобы обнаружить общее количество ROS получено 8. Ворсинок трофобласта клетки, перенесшие гипоксию / реоксигенация былозначительно повышенные уровни ROS (54%) по сравнению с теми, под нормоксии. Это увеличение было отменено путем обработки 1 мМ мелатонина. Кроме того, при нормоксии мелатонина не модулировать уровни ROS (гомеостаз), который был похож на необработанными ворсинок клеток трофобласта (рис 5А). Рисунок 4 и 5А показано , что при нормоксии мелатонин не изменяет уровень окислительного стресса или бета-ХГЧ секреции в клетках трофобласта, который подтверждает результаты предыдущих исследований, свидетельствующих об отсутствии модуляции клеточного гомеостаза в нормальных условиях 28,29.
Рисунок 1:. Переваривание Tube После центрифугирования образуются 4 -х слоев. Верхний слой состоит из переваривания раствора; как раз ниже, фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Оба слоя должны быть отброшены с помощью вакуумного насоса. Нижние слои аре состоит в следующем: белый слой, содержащий фибробласты, лейкоциты, макрофаги и трофобласта; и нижний слой , состоящий из красных кровяных клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 2: Компоненты гипоксия палаты и измерения / расчета концентрации растворенного кислорода (A) Гипоксия камера и монтаж газового баллона: (1) Газовый баллон; (2) Регулятор давления газа; (3) газовый шланг зажим; (4) Цилиндр газовый шланг; (5) Входной фильтр; (6) Подающий шланг; (7) Расходомер; (8) Сливной шланг; (9) инкубатором камера. (Б) Расчет фактической концентрации кислорода в среде для культивирования клеток с использованием стандартной кривой , полученные с известной концентрацией кислорода. (С и D)Относительные значения , полученные в растворах "0% O 2" и "21% O 2", изображены графически в виде линейной функции для определения концентрации кислорода в клеточной культуральной среде "?% O 2". Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть увеличенная версия этой фигуры.
Рисунок 3:. Общий План эксперимента клеточной культуры в модульном инкубационной камере нормоксии (8% O 2, 5% СО 2, 87% N 2) и гипоксией / реоксигенация (H / R) (0,5% O 2, 5% СО 2; 94,5% N 2) являются условия , используемые для изучения патологических состояний в ворсинок цитотрофобласта (vCTB) и syncytiotrophoblast STB) клеток (. Каждые 24 часа, среда с добавлением или без мелатонина (1 мМ) изменяетсяи газовая смесь обновляется. Под H / R, STB клетки подвергаются гипоксию (0,5% O 2) в течение 4 часов , а затем вернуться к нормоксии (8% O 2). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Влияние мелатонина на бета-хорионический гонадотропин человека (бета-ХГЧ) Секреция во ворсинок трофобласта дифференциацию ворсинок цитотрофобласта клетки были выделены и очищены от здоровых термина плаценте человека. Клетки обрабатывали в течение 96 ч с 1 мМ мелатонина или диметилсульфоксид (ДМСО 0,1%: управления транспортным средством) при нормоксических условиях (8% O 2, 5% СО 2, 87% N 2). β-ХГЧ уровней в культуральной среде измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), после того, как 24, 48, 72 и 96 часов Oе первичная культура. Уровни были нормализованы к содержанию белка в целом-клеточного лизата от каждого соответствующие лунки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5:. Антиоксидант эффект мелатонина в Syncytiotrophoblast выдержан гипоксией / реоксигенация (А) эффект мелатонина (М, 1 мМ) на внутриклеточных активных форм кислорода уровни (ROS) в syncytiotrophoblast клетках под нормоксии (N) или гипоксия / реоксигенация (ЧСС), индуцированные через 72 ч культуры, оценивали с помощью 5- (а-6) карбокси-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein диацетат (карбокси-H2DCFDA) флуоресценции. Результаты выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение от 3-х различных плаценте; *** Р <0,001 (Lanoix и др. 8). (В) Клеточные путей , участвующих в предположительной защиты мелатонина против гипоксией / реоксигенации-индуцированного апоптоза. Первичные ворсинчатые цитотрофобласта клетки культивировали в течение 72 ч при нормоксии (8% O 2) , чтобы позволить дифференцировки в syncytiotrophoblast. Клетки подвергали воздействию 1 мМ мелатонина или управления транспортным средством , а затем подвергают гипоксии (0,5% O 2) в течение 4 ч , за которым следует период реоксигенации 18 ч (8% O 2). Гипоксия / реоксигенация-индуцированного окислительного стресса активирует окислительно-восстановительные чувствительные факторы транскрипции, такие как ядерный фактор каппа В (NF-kB) и индуцируемого гипоксией фактор 1 (HIF-1). NF-kB индуцирует р53, который инициирует путь Вах / Bcl-2 митохондриального апоптоза с участием расщепление и активацию каспаз 9 и 3. каспазы 3 активирует Rho-ассоциированной, обмотанный катушечного содержащий протеинкиназа 1 (РОК-1), расщепление поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP) и нарушение репарации ДНК. Мелатонин Предотвратитьs индукции апоптоза митохондриальной действуя как мощный антиоксидант для снижения окислительного стресса, вызванного гипоксией / реоксигенация. Эта цифра была изменена с Lanoix и др., 2013 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Переваривание 1 | Переваривание 2 | Переваривание 3 | Переваривание 4 | |
| Модифицированный HBSS (мл) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| ДНКазы (мкл) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0,1 мг /мкл) | ||||
| MgSO 4 (мкл) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 мМ) | ||||
| CaCl 2 (мкл) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 мМ) | ||||
| Трипсин (U) | 1824000 | 1200000 | 960000 | 960000 |
| P / S (мл) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Таблица 1: количества ингредиентов для переваривания раствора пенициллина и стрептомицина (P / S);. сульфат магния (MgSO 4); хлорид кальция (CaCl <к югу от > 2); дизоксирибонуклеаза IV (ДНКазы IV).
Таблица 2: Объемы плотности Центрифугирование Медиа Solution и Модифицированные HBSS , требуемое для подготовки градиента решения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
У млекопитающих, развитие плода напрямую зависит от адекватной плацентарной функции. Истоки развития нарушений здоровья основаны на гипотезе о том , что причиной заболеваний проявляются позже в жизни может быть прослежено к раннему развитию и что плацента имеет механистической роль в программировании плода 30-32. Плацента является ключевым медиатором роста и развития плода: он регулирует передачу питательных веществ, защищает от вредных воздействий, а также имеет серьезные эндокринные функции. Разработка Kliman и др. Из воспроизводимой методики выделения жизнеспособных первичных cytotrophoblasts является важным этапом в изучении нормальных и аномальных плацентарных функций 6. Многие исследователи адаптировали эту технику , чтобы воспроизвести специфические условия в пробирке , чтобы понять плацентарный физиологии 18,20,33,34. Как описано Петрофф и др., Много шагов , имеют важное значение , чтобы гарантировать очищенный и надежный выход изолированной цитоклетки трофобласта 18. Например, этапы переваривания претерпели ряд модификаций с учетом развития техники в 1988 году, таких, как увеличение числа и продолжительности варок, а также к составу и количеству переваривания ферментов, в результате чего большее число жизнеспособных изолированных cytotrophoblasts 18. Этот обычный протокол имеет три основных преимущества: криоконсервации, которое допускает возможность продолжить протокол позже иммуномагнитный очистки, что повышает чистоту цитотрофобласта и использование предварительно покрытых микропланшетов улучшения прикрепления клеток 7,34-36. Существующая литература содержит несколько примеров различных модификаций метода изоляции для цитотрофобласта клеток, но характеристики плотности центрифугирование сред остается практически неизмененной 37. Представленная методика изоляции / иммуноочистки имеет несколько важных шагов. Следовательно, важно, чтобы оценить чистотуиз ворсинок цитотрофобласта клеток в конце каждого иммуноочистки. Это может быть сделано с помощью проточной цитометрии с использованием соответствующих антител в качестве маркеров: цитокератина-7 (трофобласта маркер), кластером дифференцировки 45 (CD45) и виментину (не клетки трофобласта маркеры) 18,38,39. Другие критические аспекты являются качество полученных плаценте, ФПС и плотности центрифугирование медиа градиент, а также скорость центрифугирование, что все они могут влиять на урожайность и качество клеток 20,40.
Хотя широко используется, настоящая методика имеет неизбежные ограничения. Во-первых, количество жизнеспособных клеток cytotrophoblasts, полученных после того, как иммуноочистки является относительно низким и является основным фактором, ограничивающим число возможных условий / процедур, которые могут быть проверены. Во- вторых, продолжительность жизни первичных клеток трофобласта является коротким и в пробирке дифференциации в syncytiotrophoblast тесно с последующим снижением клеточного viabili ти и увеличение апоптоза. Короткая длина жизнеспособности клеток трофобласта , которые не размножаются в лабораторных условиях , ограничивает оценку долгосрочных лечения, потому что апоптоз необратимо срабатывает примерно через 4 дня культивирования 7,41. В-третьих, interplacental изменчивость велика, так что относительно большое количество последов требуется для получения статистически интерпретируемые результаты. С другой стороны, первичная культура трофобласт имеет уникальные преимущества, такие как способность клеток дифференцироваться в синцитий, что позволяет для исследования условий и методов лечения в различных фенотипов клеток в зависимости от различных стадиях дифференцировки. Метод оксигенации представлен в этом протоколе хорошо адаптируется и его конфигурация может быть адаптирована для других ситуаций, таких как культуры первичных клеток трофобласта с первого триместра беременности, которые должны подвергаться воздействию более низкого напряжения кислорода для нормоксии 9,42,43.
ntent "> Есть и другие подходы к изучению функции плацентарных. Snap-замораживании плацентарных тканей позволяет мульти-omics анализа, но требует плацентарный многоузловое выборки, чтобы избежать, например , метаболических изменений за счет градиента оксигенации, которая уменьшается от центральной ворсинок к периферии 44. Тем не менее, живут трофобласта клеточной биологии и поведение не могут быть изучены с помощью этого подхода 45. ворсинчатая эксплантов имеют преимущество сохранения всей ворсинок структуры с типами составных клеток и их связи, но ответы на лечение не являются специфическими для клетки трофобласта 23. Коммерчески доступные трофобласта типа линии хориокарциному клеток, такие как BeWo, Jeg-3 и JAR могут быть использованы для изучения плацентарной функции, такие как слияния, дифференциации и трансплацентарной транспорта. Однако недавние исследования показывают , что экспрессии генов в первичной cytotrophoblasts и опухолевые клетки BEWO слабо коррелируют 46-48. ТHUS, первичная культура ворсинок трофобласта клеток, несмотря на ограничения, обладают уникальным преимуществом имитируя среды в естественных условиях нормальной или ненормальной плаценты.Исследования с использованием ворсинок трофобласта клетки в первичной культуре и ворсинок эксплантов показывают , что гипоксия и гипоксия / реоксигенация систематически уменьшают жизнеспособность клеток трофобласта, сопутствующая с повышенным уровнем окислительного стресса, воспаления, аутофагии и апоптоза 43,49-52. Эта гипоксия / реоксигенация модель культуры клеток, в частности, позволило нам продемонстрировать антиоксидантными и анти-апоптотических эффекты мелатонина в ворсинчатыми клетках трофобласта. В первичных клетках ворсинок трофобласта , подвергшихся воздействию гипоксии / реоксигенация, мелатонин предотвращает следующее: индукция окислительного стресса, снижение активности антиоксидантных ферментов, повышение активности окислительно - восстановительных чувствительных сигнальных путей и индукции апоптоза митохондрий (рис 5б) 8. гипpoxia / реоксигенация модель является уникальным инструментом для установления профилактической роли мелатонина в оксидативного повреждения вызванного стрессом и его возможной защитной роли в осложнений беременности , таких как преэклампсия, где плацентарной синтез мелатонина снижается 53. Мелатонин является мощным антиоксидантом с широким диапазоном целей 54. Кроме того, безопасность мелатонина в качестве лечения была в значительной степени создана. Благоприятные результаты с мелатонином были воспроизведены несколькими исследователями и мелатонина в настоящее время в клинических испытаниях в качестве потенциального профилактического или терапевтического лечения при сроке беременности , осложненной преэклампсией или внутриматочной роста ограничения 55,56.
В заключение, выделения, очистки и первичной культуры высокого качества цитотрофобласта клеток вместе с техникой гипоксии / реоксигенация позволяют широкий спектр перспективных экспериментальных подходов, чтобы лучше понять, осложнений беременности, связанных с окислительнымстресс и улучшить плацентарный здоровье.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
- Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
