Introduction
Hela graviditet, placenta cytotrofoblastceller, som är mononukleära stamceller, snabbt föröka sig och differentiera till antingen villösa eller extravillous cytotrofoblastceller. Extravillous cytotrofoblaster invadera och omforma spiral artärerna i livmoderväggen. Villösa cytotrofoblaster, å andra sidan, fortsätter att föröka sig, differentiera och säkring för att bilda flerkärniga syncytiotrofoblast (syncytium) 1. Upprätthållandet av villi trofoblasten homeostas är viktigt för fostrets välbefinnande och hälsosam graviditet. I själva verket, villösa trofoblaster tillåter moder till foster utbyte av syre och näringsämnen, och producerar viktiga hormoner för graviditet. Dessutom är syncytiotrofoblast den enda celltyp i direkt kontakt med det maternella blodcirkulationen och ger en väsentlig fysisk och immunologisk barriär. Därför måste syncytiotrofoblast genomgå apoptos och ersättning för homeostatisk underhåll och AVOid placenta patologier 2-5.
Tekniken har utvecklats av Kliman et al. 6 i 1986 för att isolera primära villösa cytotrofoblaster från humana moderkakor orsakade en revolution i placenta forskning genom att studera de molekylära mekanismer som är involverade i villi trofoblasten differentiering. Denna klassiska teknik, baserad på sekventiella enzymatiska spjälkningar med trypsin och DNas, följt av isolering i densitetscentrifugering media (kolloidalt kiseldioxidpartiklar belagda med polyvinylpyrrolidon, eller Percoll) erkänns nu som den gyllene standarden för att isolera villösa cytotrofoblastceller. Tekniken kan optimeras genom magnetisk immunorening, ett förfarande som skiljer villösa cytotrofoblaster från icke-trofoblastiska celler baserat på det differentiella uttrycket av specifika antigener på ytan av dessa celler. Vi valde den HLA-antigen ABC (HLA-ABC) på grund av frånvaron av dess uttryck på trofoblastisk cell membrane 7,8.
Moderkakan är ett organ som genomgår dramatiska variationer i syrenivåer under graviditeten. I den första trimestern, är syreförhållandet fysiologiskt mycket låg (2% O 2) men ökar till milda nivåer av syresättning (8% O 2) i den andra och tredje trimestern. Et al. Tuuli 9 beskrev att reproduktionen av trofoblasten miljön inne i placenta villi in vitro är en utmaning och variationer i syresättningsnivåer kan även leda till fenotypiska förändringar. Det är därför föreslog att anta 8% syre som normoxi att efterlikna syretrycket finns i placenta villi under tredje trimestern av graviditeten 8,9. Chen m.fl.. 10 studerats ingående flera variabler relaterade till syrespänning i trofoblaster cellkultur och visat på vikten av att bestämma syrehalten i en pericellulär miljö. Halterna av syre i villi tenderar att ökapå grund av vaskulogenes. Blodflödet i moderkakan villi ökar ständigt och nivån av väteperoxid (en riklig reaktiva syreradikaler) är en viktig signal som styr vaskulogenes 11,12. I graviditetskomplikationer, en brist på vaskulogenes genererar hypoxi, och ännu viktigare, intermittenta variationer av syresättning (kallas hypoxi / syresättningen). Dessa förhållanden leder till en onormal ökning av oxidativ stress, vilket äventyrar placenta och fetal livskraft 13,14. De förändringar som trofoblastceller genomgår in vivo under episoder av hypoxi / ny syresättning kan efterliknas in vitro enligt följande: villösa cytotrofoblaster hålls under normoxiska förhållanden (8% O 2) tills de differentieras till syncytiotrofoblast. De utsätts sedan för hypoxiska betingelser (0,5% O 2) under 4 timmar, följt av ytterligare 18 h av normoxi (ny syresättning). Med hjälp av denna hypoxi / ny syresättning tillvägagångssätt, trofoblaster exHibit avreglerad redox status och ökade nivåer av inneboende apoptos 8, vilket har observerats i vissa komplikationer. Därför är detta en användbar in vitro-modell för att utvärdera nya förebyggande och terapeutiska metoder för att bekämpa komplikationer i samband med placenta hypoxi / syresättningen.
Placentaceller producerar melatonin, som har flera viktiga funktioner, såsom en förmåga att undvika oxidativ stress och placenta dysfunktion 15. Här presenterar vi de experimentella metoden och cellmodeller som används för att visa de skyddande effekterna av melatonin i moderkakan trofoblastceller på molekylär, cellulär och funktionell nivå 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Moderkakor erhölls omedelbart efter spontana vaginala förlossningar från okomplicerade graviditeter vid CHUM-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Kanada, med informerade patientens medgivande och godkännande av etiska kommittéer (CHUM-St-Luc sjukhus och INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Kanada).
1. Isolering och rening av villi cytotrofoblastceller
- Lösningar och media
- Förbereda transportmedia genom att komplettera Dulbeccos modifierade Eagles medium med hög glukos (DMEM-HG) med 1% vol / vol antibiotikum (10.000 enheter / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycin sulfat) och förvara vid 4 ° C.
- Förbereda primära odlingsmedier genom att komplettera DMEM-HG med 10% vol / vol fetalt bovint serum (FBS), 25 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), 1% vol / vol antibiotikum (10.000 enheter / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycin sulfat) och förvara vid 4 ° C. Varma media till 37 ° C föreanvändning.
- Förbereda 4 L av koksaltlösning (0,9% vikt / vol natriumklorid).
- Förbered modifierad Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) genom tillsats av 25 mM HEPES till 1x HBSS (pH 7,4).
- Förbereda färskt, fyra flaskor digestion lösning med modifierad HBSS (framställd i 1.1.4), magnesiumsulfat (MgSO 4), kalciumklorid (CaCl2), trypsin, deoxiribonukleas IV (DNas IV), och 1% vol / vol antibiotikum ( 10.000 enheter / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycinsulfat) såsom visas i tabell 1.
- Förbered densitetscentrifugering media gradient
- Förbered densitetscentrifugering medielösning genom att komplettera densitetscentrifugering media med 10% vol / vol HBSS 10x.
- Förbered 14 provrör med densitetscentrifugering medielösning och ändras HBSS, som beskrivs i tabell 2.
- Blanda varje densitet lösning (steg 1.1.6.2) kraftigt innan du lägger sitt innehåll till gradienten. Försiktigtlägga densitetslösningar till en 50 ml glas centrifugrör med en peristaltisk pump (1 ml / min), med början med den högsta koncentrationen (70%). Undvik droppar genom att dränera lösningarna mot rörväggen att bibehålla åtskillnad av varje skikt av gradienten.
- I avsaknad av en peristaltisk pump, tillämpa lagren mycket försiktigt med Pasteur pipetter.
- Förbered slutlig rinnande buffert genom att komplettera den löpande buffert (se tabell of Materials) med 2% vol / vol antibiotika / antimykotika (10.000 enheter / ml penicillin G, 100 mg / ml streptomycinsulfat). Lagra vid 4 ° C.
- Villös cytotrofoblast isolering
Obs: Använd steril kirurgisk utrustning, glas, pipetter, flaskor, etc.- På dagen för villösa cytotrofoblast isolering, i ett 37 ° C vattenbad, värma digere lösningar (från steg 1.1.5) och 70 ml av FBS. Obs: Använd 50 ml FBS att avbryta digere ochåterstående 20 ml för fryssteget (1.2.22) som kan placeras på is en gång tinats.
- Efter leverans, ta med moderkakan till laboratoriet i iskallt transportmedium (från steg 1.1.1) så snabbt som möjligt (mindre än 1 timme).
- Släng transportmedium och placenta-blod i flytande soptunnan. Väg moderkakan och doppa i kallt saltlösning.
- Mäta och analysera följande funktioner: navelsträngen längd; navelsträngen lokalisering; placental längd, bredd, form (oval, discoid); membran färg; cotyledon struktur sjukdomar. Obs: Data presenteras i resultatdelen.
- Klippa navelsträngen vid sidan av sin placenta insättning (dvs vid sin bas med en ytterligare en cm radie cirkel runt sladden). Fördjupa sig i 300 ml av histologiska vävnadsfixeringslösning (formalin 10%) för senare histologisk analys.
- Skär hela moderkakan i tärningar av 5 x 5 x 5 cm. Tvätta noggrant (4 gånger x ~ 1 min) i saltlösning solution (0,9%) för att avlägsna blodceller tills koksalt lösningen är klar. Kassera sköljvätska.
- I ett urglas, ta bort moderkakan membran och finhacka vävnad för att ta bort blodkärl och förkalkningar. Håll blodkärl stadigt med pincett och ta bort vävnader med hjälp av baksidan av Metzenbaum sax.
- Placera hackad placenta i en Biichner-tratt. Skölj med ca 100 ml koksaltbuffert. Fortsätt mals tills 30-35 g malet vävnad erhålls (använd plast väger båt och skala). Om det behövs, finhacka återstoden av moderkakan för att erhålla upp till tre ytterligare 30-35 g preparat. Under denna tid satte malet vävnad i en vägningsskål på is.
Obs: Detta steg kommer att ta cirka 45 minuter till en timme.
- Placera hackad placenta i en Biichner-tratt. Skölj med ca 100 ml koksaltbuffert. Fortsätt mals tills 30-35 g malet vävnad erhålls (använd plast väger båt och skala). Om det behövs, finhacka återstoden av moderkakan för att erhålla upp till tre ytterligare 30-35 g preparat. Under denna tid satte malet vävnad i en vägningsskål på is.
- Tillsätt 30-35 g malet placental vävnad till en trypsinizing kolv. Överföring 150 ml den framställda matsmältningen lösning 1 (tabell 1) till trypsinizing kolven och blanda väl.
- Placera trypsinizing kolven iett skakande vattenbad under 30 min vid en hastighet av inte mer än 50 cykler / min och blanda trypsinizing kolven manuellt varje 5 min för homogen matsmältningen.
- Vid slutet av den första matsmältningen, avlägsna trypsinizing kolven ur vattenbadet och luta den (45 °) under 1 min för att sedimentera placentavävnaden. Med en 10 ml steril pipett bort och kassera cirka 80 ml supernatant. Undvika aspire vävnaden.
- Överför 100 ml av uppslutningslösning 2 (tabell 1) och den trypsinizing kolv; Blanda väl och upprepa steg 1.2.9.
- Vid slutet av den andra matsmältningen, avlägsna trypsinizing kolven ur vattenbadet och luta den 45 ° i 1 min. Med en 10 ml steril pipett, avlägsna 80 ml supernatanten och försiktigt över till ett centrifugrör med en cellfilter (100 | j, m mesh). Överföra den filtrerade supernatanten till en bägare innehållande 2 ml av FBS varje gång centrifugröret är full.
- Utför tredje uppslutning som beskrivits förandra matsmältning (1.2.11 och 1.2.12) med hjälp av 75 ml matsmältningen lösning 3. Parallellt utföra steg 1.2.15 till 1.2.16.1 för matsmältningen 2.
- Utför fjärde matsmältningen precis som den tredje matsmältning med hjälp matsmältningen lösning 4 (75 ml), men samla en maximal mängd supernatant. Utför steg 1.2.15 till 1.2.16.1 parallellt för matsmältningen 3, och slutligen för matsmältningen 4.
- Alikvot av supernatanten (från digereringar 2, 3 och 4) i 13,5 ml delar, varje del i en 15 ml centrifugrör. Med en 22,8 cm lång glas pasteurpipett, mycket försiktigt och långsamt placera 1,5 ml FBS vid botten av varje rör för att skapa ett separat lager. Blanda inte FBS och supernatanten. Centrifugera rören utan broms i 20 min vid 1250 xg vid rumstemperatur.
Obs: Efter centrifugering, 4 lager är synliga i röret, såsom visas i figur 1 Separationen av trypsin och trofoblastceller undviker överdriven cellulär matsmältning.. - Med en vakuumpump, aspiråt och kassera supernatanten (digestion lösning) och FBS skikten, inklusive vitaktig filmen mellan de två skikten. Suspendera pelleten (de trofoblaster och röda blodcellskikt) med 1 ml varmt cellodlingsmedium (steg 1.1.2, utan FBS och ingen HEPES).
- Samla återsuspenderade celler från alla rör och kombinera dem i ett rör. Låt röret stå i rumstemperatur fram till slutet av alla klyvningar. Obs: När alla spjälkningar, är den vanliga avkastning 3 rör av resuspenderade celler (en per matsmältningen).
- Gör upp volymen till 15 ml med varmt cellodlingsmedium. Centrifugera vid 1250 xg under 10 min vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten med en vakuumpump. Undvika aspire pelleten.
- Försiktigt resuspendera pelleten som erhållits från 3 rör med 1 ml varm cellodlingsmedium. Pool innehållet i en tub. För erhållande av 8 ml, fyll volymen med varmt cellodlingsmedium.
- Mycket försiktigt lager cellsuspensionen på en separation gradient med en Pasteur-pipett. Centrifugera utan broms i 30 minuter vid 507 xg vid rumstemperatur.
- Efter centrifugering, identifiera de olika lagren av celler i övertoningen med back-belysning. Lokalisera lagren innehåller trofoblaster och kontaminerande celler mellan 40 - 50% av densitetscentrifugering medium. Med en vakuumpump, ta bort de övre skikten (> 50%).
- Samla upp celler belägna i skikten av intresse med en Pasteur-pipett och överföra dem till en 50 ml centrifugrör. Gör upp volymen till 50 ml med cellodlingsmedium. Centrifugera i 10 min vid 1250 xg vid rumstemperatur.
- Under sterila betingelser, kasta supernatanten, suspendera pelleten med 20 ml FBS och räkna antalet celler med användning av en hemocytometer. På is, tillsätt 2,22 ml steril dimetylsulfoxid (DMSO) och blanda försiktigt genom att vända. Alikvotera 1,5 ml cellsuspension i kryogena flaskor, frysa över natten vid -80 ° C och överför till en flytande kväve tank.
<li> trofoblasten rening - Installera sköljning och kör buffertar och en ny filterkolonn på magnetrenings instrumentet enligt tillverkarens anvisningar. Utför "clean programmet" för att rengöra negativa en positiv 1 och positiv 2-portar, och sedan införa 50 ml rör under varje port enligt tillverkarens anvisningar.
- Tina de celler som frystes i steg 1.2.22 snabbt i en 37 ° C vattenbad. Överför celler till en 50 ml rör och återsuspendera cellerna försiktigt med 20 ml kallt rinnande buffertlösning. Centrifugera röret under 5 minuter vid 450 xg och 4 ° C.
- Kassera supernatanten. Upprepa tvättsteg med kallt rinnande buffert. Räkna celler med användning av en hemocytometer för att bestämma viabilitet. Upprepa centrifugering (i 5 min, 450 x g vid 4 ° C). Försiktigt bort supernatanten. Tillsätt 1 ml kallt rinnande buffert innehållande 1% vol / vol av mus anti-HLA-ABC-antikroppar. Inkubera vid 4 ° C under 30 min, mixing försiktigt varje 5 min.
- Tillsätt 6 ml av kallt rinnande buffert. Centrifugera i 5 minuter vid 450 xg och 4 ° C. Kassera supernatanten och upprepa detta steg. Resuspendera cellerna i 1 ml kallt rinnande buffert innehållande 10% vol / vol av anti-mus-sekundär antikropp-kopplade magnetiska pärlor. Inkubera vid 4 ° C under 15 min, blanda försiktigt var 5 min.
- Tillsätt 6 ml av kallt rinnande buffert. Centrifugera i 5 minuter vid 450 xg och 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera i 5 ml kallt rinnande buffert.
- Separera trofoblastcellerna hjälp av magnetiska reningsinstrumentet. Samla upp celler vid den negativa porten och tillsätt 20 ml kallt rinnande buffert.
Obs: trofoblastceller innehåller inte den komplexa HLA-ABC, och därmed separeras från andra celltyper och riktas mot den negativa en port. - Centrifugera i 5 minuter vid 450 xg och 4 ° C. Kasta bort supernatanten och försiktigt återsuspendera cellerna i 20 ml varm primärodlingsmedium. Räkna cellerna usinga hemocytometer för att bestämma lönsamheten.
- Plate cellerna vid följande densiteter: 0,15 x 10 6 celler / brunn i 96-brunnsplattor, 1,6 x 10 6 celler / brunn i 24-brunnsplattor och 4,5 x 10 6 celler / brunn i 6-brunnsplattor. Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2.
- Bekräfta renheten hos trofoblastceller genom flödescytometri 16,17 och / eller genom immuncytokemi 18.
Notera: Renheten hos immunrenat celler bestämdes med användning av FITC-konjugerade monoklonala antikroppar mot cytokeratin-7 och vimentin 17-19. Detta protokoll är väl detaljerat i Lanoix et al., 2008 7. - Efter minst fyra timmar, skölj cellerna två gånger med varmt odlingsmedium för att avlägsna obundna celler och sedan överföra plattorna till normoxi kammaren, som består av 8% O 2 (se figur 2 och avsnitt 2).
2. In vitro Induction normoxi och hypoxi / syresättningen
- Incubator kammar drift (se figur 2A för set-up).
- I en huv med laminärt flöde, placera en petriskål med sterilt vatten vid bottnen av inkubatorn kammaren för att undvika torrhet; sedan placera den tidigare framställda cellodlingsplattor eller kolvar (steg 1.3.10) på den överlägsna hyllorna i kammaren.
- Utanför huven, fästa kammaren (inloppsport) till gasslangen (Figur 2A: 5a, b och c) för att nå röret av gasen (8% O2 eller 0,5% O 2) (Figur 2A: 7). Öppna både insugs- och utloppsportar i kammaren. I detta ögonblick, den gasregulator (Figur 2A: 4) bör förbli stängd.
- Öppna försiktigt gasregulator ventil (Figur 2A: 4). Flush för 4 minuter med ett luftflöde av 25 l / min för att helt ersätta luften inne i kammaren.
- Efter spolning kammaren, stänga gasregulator sedan inloppet och outlet hamnar i kammaren.
- Koppla ur flödesmätaren utloppsslang (Figur 2A: 5c) från inloppsöppningen av kammaren och placera kammaren i en cellkultur inkubator vid 37 ° C.
- Byta luft närvarande närvarande i de plattor, kolvar och löstes i odlingsmediet genom att fylla kammaren med gas 1 tim efter steg 2.1.3.
- Upprepa steg 2.1.1 till 2.1.6 för andra kompositioner gaser (t.ex. 2% O 2 för första trimestern trofoblaster kultur 9).
- Kontrollera syrgashalten (Figur 2B-C)
- För att bekräfta koncentrationen av syre i cellodlingsmediet (utan celler) inuti kammaren, använda en syreelektrod ansluten till en syre adapter. Anslut syreelektroden till en voltmeter.
- Skapa en kalibreringskurva i samma lösning (dvs cellodlingsmedium) genom exponering av lösningen för gaser med kända syrehalter (t.ex. 0% och21% syre). Efter mätvärdena är stabiliserade för varje koncentration, införa elektroden in i mediet i kammaren.
Obs: Ta alla mått på samma djup i syfte att undvika snedvridning i syrekoncentration 10.
- Induktion av normoxi och hypoxi / syresättningen i trofoblaster.
- Efter tillsats av primära trofoblastceller till lämpliga cellodlingsflaskor, plattor eller petriskålar, utför behandlingar som är nödvändiga.
- Parallellt inuti kammaren, exponera celler till den önskade gasblandningen för att reproducera ett specifikt tillstånd varje 24 h (fig 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering och immunrening av villösa cytotrofoblastceller från en normal sikt placenta erhålls genom vaginal förlossning gav 1 x 10 8 livsdugliga celler. Moderkakan vägde 350 g, var 19 cm i diameter, 4 cm hög med skivformen och transparenta membran. Ingen hjärtbladsnod missbildning upptäcktes. Navelsträngen hade para lokaliseringen och en längd av 56 cm. Renheten utvärderades genom flödescytometri med användning av vimentin och cytokeratin-7 markörer. Mer än 98% av cellerna var negativa för vimentin och positiva för cytokeratin-7, vilket bekräftar renheten hos villösa trofoblaster celler erhållna från immunorening. Villösa cytotrofoblastceller sattes till 96-brunnars odlingsplattor i normoxiska betingelser i närvaro eller frånvaro av 1 mM melatonin. Den biokemiska differentieringen av villösa cytotrofoblaster övervakades genom att bestämma nivåer av β-humant koriongonadotropin (β-hCG) sekretion sombeskrivits tidigare 1,7,20,21. Den morfologiska differentiering och apoptos bedömdes genom immunofluorescens med användning av anti-desmoplakin och anti-kaspas-kluvna cytokeratin 18 intermediära filament 7,22. Cellodlingsmedier från dag 1 (främst villösa cytotrofoblaster) till dag 4 (främst syncytiotrophoblasts) samlades, centrifugerades och β-hCG uppmättes i supernatanterna. Produktionen av β-hCG, som är exklusiv för syncytiotrofoblast, ökade med odlingstiden (Figur 4). Inte bara hypoxi / ny syresättning, men hyperoxia (> 20% O 2) aktiveras också apoptos 23. Således var antagandet av en 8% O2 koncentration är representativ för den mängd syre till som en villi trofoblasten cell skulle exponeras under tredje trimestern av graviditeten 10. Toppen av p-hCG nivåer som noterades vid 72 timmar bekräftade kapacitet villösa cytotrofoblaster att differentiera under dessa förhållanden.Melatonin förändrade inte β-hCG sekre under dessa studieförhållanden. Minskningen av p-hCG nivåer 96 timmar var sannolikt orsakad av apoptos av trofoblastceller, vilket ökar efter längre perioder i primärkultur 5,7,22,24,25 (Figur 4). DMSO (0,1% vol / vol) valdes eftersom det inte påverkade β-hCG 26,27. Den skyddande roll av melatonin var starkt relaterade till dess antioxiderande egenskaper. Hypoxi / ny syresättning efter 72h kultur inducerad oxidativ stress i villösa trofoblastceller. Den skyddande effekten av melatonin utvärderades med reaktiva syreradikaler (ROS) Detection Reagent (figur 5A). Efter 96 h av odling, var trofoblastceller inkuberades under 45 min med 10 | iM av 5- (och-6) -karboxi-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (karboxi-H2DCFDA) för att detektera den totala mängden av ROS produceras 8. Villösa trofoblastceller som genomgick hypoxi / ny syresättning hadesignifikant ökad ROS nivåer (54%) jämfört med de under normoxi. Denna ökning vändes genom behandling med 1 mM melatonin. Inom ramen normoxi melatonin inte modulera ROS nivåer (homeostas), vilket var liknande för icke-behandlade villösa trofoblastceller (Figur 5A). Figur 4 och 5A visar att under normoxi melatonin inte ändrade nivåer av oxidativ stress eller β-hCG sekre i trofoblastcellerna, vilket bekräftar tidigare studier som visar ingen modulering av cell homeostas under normala förhållanden 28,29.
Figur 1:. Digestion Tube Efter centrifugering är 4 lager bildas. Det övre skiktet är sammansatt av uppslutningslösning; strax under, det fetalt bovint serum (FBS). Båda skikten skall kasseras med en vakuumpump. De lägre skikten are sammansatt som följer: ett vitt skikt, som innehåller fibroblaster, leukocyter, makrofager och trofoblaster; och ett bottenskikt som består av röda blodkroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2: Komponenter i Hypoxi avdelningen och mätning / Beräkning av koncentrationen av upplöst syre (A) Hypoxi kammare och gas cylinderenhet: (1) Gas cylinder; (2) Gas regulator; (3) Gas slangklämma; (4) Cylinder gasslangen; (5) inloppsfilter; (6) Tilloppsslang; (7) Flödesmätare; (8) Utloppsslang; (9) Modulär inkubator kammaren. (B) Beräkning av den faktiska syrekoncentrationen i cellodlingsmedium med användning av en standardkurva som framställts med kända syrekoncentrationer. (C och D)De relativa värden som erhållits i lösningarna "0% O 2" och "21% O 2", ritas grafiskt som en linjär funktion för att bestämma syrekoncentrationen i cellodlingsmediet "?% O 2". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Generic Experimental Design av cellodling i Modular inkubationskammaren normoxi (8% O2; 5% CO2; 87% N2) och hypoxi / ny syresättning (H / R) (0,5% O2; 5% CO 2; 94,5% N 2) är betingelser som används för att studera patologiska tillstånd i villös cytotrofoblast (vCTB) och syncytiotrofoblast (STB) celler. Varje 24 h, medium med eller utan melatonin (1 mM) ändrasoch gasblandningen förnyas. Under H / R, STB celler genomgår hypoxi (0,5% O 2) under 4 timmar och sedan återgå till normoxi (8% O2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Effekt av melatonin på beta-humant koriongonadotropin (β-hCG) Utsöndring under villös trofoblast Differentiering villösa cytotrofoblastceller isolerades och renades från humana friska sikt placentor. Celler behandlades under 96 timmar med 1 mM melatonin eller dimetylsulfoxid (DMSO 0,1%: vehikelkontroll) under normoxiska förhållanden (8% O 2; 5% CO2; 87% N2). β-hCG-nivåer i odlingsmedium mättes med hjälp av enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) efter 24, 48, 72 och 96 tim of primär kultur. Nivåer normaliserades till proteinhalten i hela-cellysatet från varje motsvarande brunn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Anti-oxidant effekt av melatonin i syncytiotrofoblast Utsatt för Hypoxi / ny syresättning (A) Effekten av melatonin (M; 1 mM) på intracellulära reaktiva syreradikaler (ROS) nivåer i syncytiotrofoblast celler under normoxi (N) eller hypoxi / ny syresättning (HR), induceras efter 72 timmar av kultur, bedömdes av 5- (och-6) -karboxi-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (karboxi-H2DCFDA) fluorescens. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen av 3 olika moderkakor; *** P <0,001 (Lanoix, et al. 8). (B) De cellulära vägarna som är involverade i den förmodade skydd av melatonin mot hypoxi / ny syresättning-inducerad apoptos. Primära villösa cytotrofoblastceller odlades under 72 h under normoxi (8% O2) för att medge differentiering till syncytiotrofoblast. Cellerna exponerades för 1 mM av melatonin eller vehikelkontroll och utsattes därefter för hypoxi (0,5% O2) under 4 timmar följt av en 18 tim ny syresättning period (8% O2). Hypoxi / ny syresättning-inducerad oxidativ stress aktiverar redox känslig transkriptionsfaktorer såsom nukleär faktor kappa B (NF-kB) och hypoxi inducerbara faktor 1 (HIF-1). NF-kB inducerar p53, som triggar Bax / Bcl-2-vägen av mitokondriell apoptos som involverar klyvning och aktivering av caspaser 9 och 3. Caspase 3 aktiverar Rho-associerat, lindad spole-innehållande proteinkinas 1 (ROCK-1), den klyvning av poly (ADP-ribos) polymeras (PARP) och nedskrivning av DNA-reparation. melatonin Förhindraär induktion av mitokondriell apoptos genom att fungera som en kraftfull antioxidant för att minska den oxidativa stress som orsakas av hypoxi / syresättningen. Denna siffra har modifierats Lanoix et al., 2013 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| digestion ett | digestion 2 | digestion 3 | digestion 4 | |
| Modifierad HBSS (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAse (il) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0,1 mg /il) | ||||
| MgSO 4 (il) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 mM) | ||||
| CaCl 2 (il) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 mM) | ||||
| Trypsin (U) | 1824000 | 1200000 | 960000 | 960000 |
| P / S (ml) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Tabell 1: Mängder av ingredienser för matsmältningen lösning Penicillin och streptomycin (P / S);. magnesiumsulfat (MgSO 4); kalciumklorid (CaCl <sub> 2); deoxiribonukleas IV (DNas IV).
Tabell 2: Volymerna av densitetscentrifugering Media Solution och Modified HBSS krävs för att utarbeta den Gradient lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hos däggdjur är fosterutveckling direkt beroende av korrekt placenta funktion. Utvecklings ursprung hälsoproblem är baserade på hypotesen att orsaken till sjukdomar manifest senare i livet kan spåras tillbaka till början av utveckling och att moderkakan har en mekanistisk roll i fetal programmering 30-32. Moderkakan är nyckeln förmedlare av fostrets tillväxt och utveckling: det reglerar närings överföring, skyddar mot skadliga exponeringar, och har stora endokrina funktioner. Utvecklingen av Kliman et al. Av en reproducerbar teknik för att isolera livskraftiga primära cytotrofoblaster är en milstolpe i studiet av normala och onormala placenta funktioner 6. Många forskare har anpassat denna teknik för att återge särskilda villkor in vitro att förstå placental fysiologi 18,20,33,34. Såsom beskrivits av Petroff et al., Många steg är viktiga för att garantera en renad och robust utbyte av isolerade cytotrofoblastceller 18. Till exempel har de matsmältningen steg genomgått flera ändringar sedan utvecklingen av tekniken i 1988, såsom ett ökat antal och längd av digere, samt sammansättningen och mängden av matsmältningsenzymer, vilket resulterar i ett större antal livskraftiga isolerade cytotrofoblaster 18. Denna nuvarande protokollet har tre huvudsakliga fördelar: för frysförvaring, vilket gör det möjligt att fortsätta protokollet senare immunmagnetisk rening, vilket ökar cytotrofoblast renhet och användning av förbelagda mikro förbättra cellvidhäftning 7,34-36. Den befintliga litteraturen innehåller flera exempel på olika modifieringar av isoleringsteknik för cytotrofoblastceller, men egenskaperna hos densitetscentrifugering media har förblivit i stort sett oförändrat skick 37. De presenterade tekniken med isolering / immunorening har flera viktiga steg. Därför är det viktigt att utvärdera renhetenav villösa cytotrofoblastceller vid slutet av varje immunrening. Detta kan göras genom flödescytometri med användning av lämpliga antikroppar som markörer: cytokeratin-7 (trofoblastiska markör), kluster av differentiering 45 (CD45) och vimentin (icke-trofoblastceller markörer) 18,38,39. Andra kritiska aspekter är kvaliteten på de erhållna moderkakor, FBS och densitetscentrifugering media lutning, samt centrifugeringsvarvtal, som alla kan påverka utbytet och kvaliteten på celler 20,40.
Även om i stor utsträckning, har föreliggande teknik oundvikliga begränsningar. För det första, är mängden av livskraftiga cytotrofoblaster celler erhållna efter immunorening relativt låg och är den främsta begränsande faktorn i antalet möjliga tillstånd / behandlingar som kan testas. För det andra är korta livslängd primära trofoblastceller och in vitro differentiering till syncytiotrofoblast är tätt följd av en minskning av cell viabili Ty och en ökning av apoptos. Den korta längd trofoblaster cellviabilitet som inte förökar sig in vitro begränsar utvärderingen av långsiktiga behandlingar, eftersom apoptos irreversibelt utlöses efter ca 4 dagars odling 7,41. För det tredje är interplacental variabilitet stor, så ett relativt stort antal av moderkakor krävs för att erhålla statistiskt tolkningsbara resultat. Å andra sidan, har huvud trofoblasten kultur unika fördelar, såsom förmågan hos cellerna att differentiera till syncytium, vilket möjliggör studier av tillstånd och behandlingar i olika cell fenotyper enligt de olika stadier av differentiering. Metoden syresättning som presenteras i detta protokoll är mycket anpassningsbar och dess konfiguration kan skräddarsys för andra situationer, såsom odling av primära trofoblastceller från första tremånadersperioden av graviditeten, vilket bör utsättas för en lägre syrespänning för normoxi 9,42,43.
ntent "> Det finns andra metoder för att studera human placenta funktion in vitro. Snap-frysning placental vävnad möjliggör flera omik analyser, men kräver placenta flera platser provtagning, för att undvika exempelvis metaboliska variationer på grund av syre lutning, vilket minskar från den centrala Villi till periferin 44. det kan dock inte studeras levande trofoblasten cellbiologi och beteende med hjälp av denna metod 45. villi explants har fördelen av att bibehålla hela villi struktur med de ingående celltyper och deras kommunikation, men svar på behandlingar är inte specifika för trofoblastceller 23. Kommersiellt tillgängliga trofoblasten liknande koriokarcinom cellinjer, såsom BEWO, Jeg-3 och JAR kan användas för att studera placental funktioner, såsom fusion, differentiering och transplacental transport. emellertid, nya studier visar att genexpression i primära cytotrofoblaster och BEWO tumörceller är dåligt korrelerade 46-48. Thus, primär villi trofoblasten cellodling, trots sina begränsningar, har den unika fördelen att härma miljön i normal eller onormal placenta in vivo.Studier som använder villous trofoblasten cell i primär kultur och villösa explantat visar att hypoxi och hypoxi / syresättningen systematiskt minska trofoblaster cellviabiliteten, samtidigt med ökade nivåer av oxidativ stress, inflammation, autophagy och apoptos 43,49-52. Denna hypoxi / ny syresättning cellodlingsmodell specifikt har tillåtit oss att demonstrera antioxidanter och anti-apoptotiska effekter av melatonin i villösa trofoblastceller. I primär villösa trofoblastceller exponerade för hypoxi / ny syresättning förhindrar melatonin följande: induktion av oxidativ stress, minskade antioxidant enzymaktiviteter, ökad aktivitet av redoxkänsliga signalvägar, och framkallande av mitokondrie apoptos (figur 5B) 8. HYpoxia / ny syresättning modellen är ett unikt verktyg för att fastställa förebyggande roll av melatonin i oxidativ stress-inducerad skada och dess eventuella skyddande roll i komplikationer såsom preeklampsi, där placenta melatonin syntes minskar 53. Melatonin är en kraftfull antioxidant med ett brett spektrum av mål 54. Dessutom har säkerheten för melatonin såsom en behandling i hög grad fastställts. De gynnsamma resultat med melatonin har återgivits av flera forskare och melatonin är för närvarande i kliniska prövningar som en potentiell förebyggande eller terapeutisk behandling i graviditeter kompliceras av preeklampsi eller intrauterin tillväxthämning 55,56.
Sammanfattningsvis, isolering, rening och primär kultur av hög kvalitet cytotrofoblastceller, tillsammans med tekniken med hypoxi / ny syresättning möjliggöra ett brett spektrum av lovande experimentella metoder för att bättre förstå pregnancykomplikationer relaterade till oxidativstress och förbättra placental hälsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
- Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
