Introduction
insan gebelik boyunca, mononükleer kök hücreler plasenta sitotrofoblast hücreleri, hızla çoğalır ve villöz veya extravillous sitotrofoblast hücrelerine ya farklılaşırlar. Extravillous sitotrofoblastlar istila ve rahim duvarına spiral arterleri pişmanlık. Villöz sitotrofoblastlar, diğer yandan, çok çekirdekli sinsityotrofoblastik (Sinsityum) 1 oluşturmak için çoğalmaya ayırt ve sigorta devam etmektedir. villöz trofoblast homeostazındaki bakım fetal iyilik ve sağlıklı hamilelik için esastır. Aslında, villus trofoblastlar oksijen ve besin anne-cenin alışverişi sağlar ve gebelik için gerekli hormonları üretmek. Ayrıca, sinsityotrofoblast anne kan dolaşımı ile doğrudan temas halinde, sadece hücre tipi ve gerekli fiziksel ve immünolojik bir engel oluşturur. Bu nedenle, sinsityotrofoblast homeostatik bakım için apoptoz ve değiştirme geçmelidir ve Avo içinid plasental 2-5 yakınmaları.
Insan plasenta primer villus sitotrofoblastlar izole etmek için 1986 yılında Kliman ve ark. 6 tarafından geliştirilen teknik villöz trofoblast farklılaşmasında rol oynayan moleküler mekanizmaların çalışma izin vererek plasental araştırmalarda bir devrim yarattı. yoğunluk santrifüj medyada izole ardından tripsin ve DNaz ile sıralı enzimatik sindirim dayanan bu klasik teknik, (kolloidal silika partikülleri polivinilpirolidon ile kaplanmış, ya da Percoll) artık villus sitotrofoblast hücrelerini izole etmek için altın standart olarak kabul edilmektedir. teknik manyetik immün-, bu hücrelerin yüzeyleri üzerinde spesifik antijenlerin farklı ekspresyonu göre olmayan trofoblastik hücrelerin villöz sitotrofoblastlar ayıran bir prosedürle optimize edilebilir. Biz nedeniyle trofoblastik hücre zarı üzerindeki ifadesinin yokluğu insan lökosit antijeni ABC (HLA-ABC) seçtie 7,8.
Plasenta gebelik sırasında oksijen seviyelerinde dramatik değişimleri uğrar bir organdır. İlk trimesterde, oksijenasyon oranı fizyolojik çok düşük (% 2 O 2), ancak ikinci ve üçüncü üç aylık dönemde oksijenasyonu hafif düzeyde (% 8 O 2) ile artar. Tuuli ve ark., 9 plasental villus içinde trofoblast ortamında in vitro üreme oksijenlenme seviyelerinde bir meydan okuma ve çeşitleri bile fenotipik değişikliklere yol açabilir olduğunu anlattı. Bu nedenle, gebeliğin 8,9 üçüncü trimesterde plasental villus bulunan oksijen gerilimi taklit etmek normoxia olarak% 8 oksijen benimsemeye önerdi olduğunu. Chen ve ark. 10 yoğun trofoblast hücre kültüründe oksijen basıncına ilgili çeşitli değişkenler okudu ve bir hücreyi ortamda oksijen düzeylerinin belirlenmesi önemini gösterdi. villuslarında oksijen seviyeleri artma eğilimindevaskülojenez nedeniyle. Sürekli plasental villus artar kan akımı ve hidrojen peroksit seviyesi (bol bir reaktif oksijen türleri) vaskülojenez 11,12 kontrol eden önemli bir sinyaldir. gebelik komplikasyonları, vaskülojenez eksikliği hipoksi ve daha da önemlisi, oksijenasyon aralıklı varyasyonlar (denilen hipoksi / reoksijenasyonunu) üretir. Bu koşullar plasental ve fetal canlılığı 13,14 ödün oksidatif stres anormal artışa yol açmaktadır. Villöz sitotrofoblastlar da sinsityotrofoblastlarda farklılaşırlar kadar normoksik koşullar (% 8 O 2) altında tutulan aşağıdaki gibidir: trofoblast hücrelerin hipoksi / reoksijenasyonun dönemleri sırasında, in vivo maruz değişiklikler in vitro taklit edilebilir. Daha sonra normoksiyada (reoksijenasyon) arasında ilave bir 18 saat, ardından 4 saat hipoksik koşullar (% 0.5 O 2) tabi tutulur. Bu hipoksi / reoksijenizasyon yaklaşımı kullanarak, ex trofoblastlarBazı gebelik komplikasyonları gözlenmiştir olarak HiBit, redoks durumu ve iç apoptoz 8 daha yüksek düzeyde deregüle. Bu nedenle, bu plasental hipoksi / reoksijenasyon ile ilişkili gebelik komplikasyonları ile mücadele için yeni önleyici ve tedavi yaklaşımları değerlendirmek için in vitro model bir yararlıdır.
Plasenta hücreler oksidatif stres ve plasental disfonksiyon 15 ortadan kaldırmak için bir yeteneği gibi birçok önemli işlevlere sahiptir melatonin üretir. Burada, moleküler, hücresel ve fonksiyonel 8. seviyede plasental trofoblast hücrelerinde melatoninin koruyucu etkisi göstermek için kullanılan deneysel yaklaşım ve hücre modelleri sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Plasenta, bilgilendirilmiş hasta onam ve etik komitelerin (CHUM-St-Luc Hastanesi ve INRS-Institut Armand-Frappier onayıyla, hemen CHUM-St-Luc Hastanesi, Montreal, QC, Kanada'da gebeden gelen spontan vajinal doğum sonrası elde edildi Laval, QC, Kanada).
Villöz sitotrofoblast 1. Hücre İzolasyonu ve Saflaştırılması
- Çözümler ve medya
- Ilave Nakliye ortamı hazırlamak Dulbecco'nun Eagle Ortamı Yüksek Glikoz% 1 hacim / hacim antibiyotik (DMEM-HG) (10,000 birim / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat) ve mağaza 4 ° C'de modifiye edilmiştir.
- % 10 hac / hac cenin sığır serumu (FBS), 25 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES),% 1 hacim / hacim, antibiyotik (10.000 ünite / DMEM-HG ilave birincil kültür ortamı hazırlamak ml penisilin G, 4 ° C de, 100 mg / ml streptomisin sülfat) ve saklayın. 37 ° C'ye ısınmaya ortam öncekullanın.
- tuz çözeltisi (% 0.9 ağırlık / hacim sodyum klorür) 4 L hazırlayın.
- HBSS (pH 7.4), 1x 25 mM HEPES ekleyerek Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) modifiye hazırlayın.
- (Modifiye (1.1.4 hazırlandı) HBSS, magnezyum sülfat (MgSO ^ 4), kalsiyum klorür (CaCl2), tripsin, deoksiribonükleaz IV (DNaz IV) ve% 1 hacim / hacim antibiyotik ile sindirim çözeltisi taze dört şişe hazırlanması Tablo 1 'de gösterildiği gibi, 10,000 ünite / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat).
- yoğunluk santrifüj medya degrade hazırlayın
- % 10 hacim / hacim HBSS 10x ile yoğunluk santrifüj ortamı tamamlayan tarafından yoğunluk santrifüj medya çözeltisi hazırlayın.
- Tablo 2'de tarif edildiği gibi, yoğunluk santrifüj ortam çözeltisi ve modifiye HBSS ile 14 deney tüpleri hazırlayın.
- şiddetle degrade içeriğini eklemeden önce her yoğunluk çözüm (adım 1.1.6.2) karıştırın. NazikçeEn yüksek konsantrasyonda (% 70) ile başlayan, bir peristaltik pompa (1 mi / dak) ile 50 ml'lik bir cam santrifüj tüpüne yoğunluk çözeltileri ilave edin. gradyan her bir katmanı uygun ayrılığı korumak için boru duvarına karşı çözüm süzülmesiyle damlacıklar kaçının.
- peristaltik bir pompa yokluğunda, Pasteur pipet ile çok yumuşak tabakalar uygulanır.
- Çalışan tampon ilave nihai çalışan tampon hazırlayın (10.000 adet / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat) antimikotik% 2 hacim / hacim antibiyotik / ile (Malzeme Tablo). 4 ° C'de saklayın.
- Villöz sitotrofoblast izolasyon
Not: Steril cerrahi aletler, cam, pipetler, mataralar, vb- villöz sitotrofoblast izolasyon gün, 37 ° C su banyosu içinde ve FBS, 70 mi (aşama 1.1.5 arasında) sindirimler çözüm ısınmaya. Not: FBS 50 ml Kullanım sindirim ve kesmek içinçözüldükten sonra buz üzerine yerleştirilebilir soğutma aşamasında (1.2.22) için 20 ml geri kalan.
- Doğumdan sonra, mümkün (en az 1 saat) kısa sürede (adım 1.1.1) buz gibi soğuk taşıma ortamında laboratuvara plasenta getirmek.
- Iskarta taşıma orta ve sıvı çöplüğüne plasental kan. plasentayı tartılır ve soğuk tuzlu su çözeltisi içinde bırakın.
- Tedbir ve aşağıdaki özellikleri analiz: göbek kordonu uzunluğu; Göbek kordonu lokalizasyonu; plasental uzunluk, genişlik, şekil (oval, diskoid); membran renk; kotiledon yapı patolojileri. Not: Veriler sonuçlar bölümünde sunulmuştur.
- (Kordon etrafında ek 1 cm yarıçapında bir daire ile üssünde, yani) onun plasental ekleme yanında göbek kordonu kesti. Daha sonra histolojik analiz için histolojik doku fiksatif çözeltisi (formalin,% 10) 300 ml bırakın.
- 5 x 5 x 5 cm küpler halinde tüm plasentayı kesin. tuzlu, sol içinde (4 kez x ~ 1 dk) iyice yıkayınsalin çözelti berrak olana kadar Katkı (% 0.9), kan hücreleri çıkarmak için. parlatıcı atın.
- saat camı olarak, kan damarları ve kalsifikasyon kaldırmak için plasental membranlar ve kıyma dokuları çıkarın. forseps ile sıkıca kan damarları tutun ve Metzenbaum makas arka kullanarak dokuları kaldırın.
- Bir Büchner hunisi içinde kıyılmış plasentayı yerleştirin. tuzlu su tampon maddesi, yaklaşık 100 ml ile durulayın. kıyılmış doku 35 gr (tekne ve tartı kullanımı plastik) elde edilir - 30 kadar kıyma devam edin. 35 gr hazırlıkları - Gerekirse, üç ek 30 kadar elde etmek için plasentanın kalanını kıyma. Bu süre boyunca, buz üzerinde bir tartma tekne kıyılmış doku koydu.
Not: Bu adım 1 saat için yaklaşık 45 dakika sürer.
- Bir Büchner hunisi içinde kıyılmış plasentayı yerleştirin. tuzlu su tampon maddesi, yaklaşık 100 ml ile durulayın. kıyılmış doku 35 gr (tekne ve tartı kullanımı plastik) elde edilir - 30 kadar kıyma devam edin. 35 gr hazırlıkları - Gerekirse, üç ek 30 kadar elde etmek için plasentanın kalanını kıyma. Bu süre boyunca, buz üzerinde bir tartma tekne kıyılmış doku koydu.
- Bir trypsinizing şişeye 35 gr kıyılmış plasental doku - 30 ekleyin. Aktarım 150 tripsinize şişeye hazırlanan sindirim çözeltisi 1 (Tablo 1) ile yıkanır ve iyice karıştırın.
- içinde trypsinizing şişeyi koyunBir çok 50 devir / dk'lık bir hızda 30 dakika boyunca su banyosu çalkalanarak elle tripsinize şişeye homojen sindirim için her 5 dakikada karıştırılır.
- İlk sindirim sonunda, su banyosu tripsinize balon çıkarın ve plasenta dokusu çökeltmek için 1 dakika için (45 °) yatırın. 10 ml steril pipet ile çıkarın ve süpernatanın 80 ml atın. doku aspire kaçının.
- Aktarım tripsinize şişeye sindirim çözeltisi 100 ml x 2 (Tablo 1); iyice karıştırın ve adım 1.2.9 tekrarlayın.
- İkinci sindirim sonunda, su banyosu tripsinize şişeyi çıkarın ve 1 dakika boyunca o 45 ° yatırın. 10 ml steril pipet ile, 80 mi süpernatant kaldırmak ve yavaşça, bir hücre süzgecinden (100 um ağ gözü) olan bir santrifüj tüpüne aktarılır. FBS 2 ml santrifüj tüpü dolu her ihtiva eden bir çanağa filtre süpernatant aktarın.
- için tarif edildiği gibi, üçüncü sindirim gerçekleştirmeBuna paralel olarak 75 ml sindirim çözüm 3. kullanarak ikinci sindirim (1.2.11 ve 1.2.12), sindirim 2 1.2.16.1 arasındaki adımları 1.2.15 gerçekleştirin.
- Sindirim solüsyonu 4 (75 mi) ile üçüncü bir sindirim tam olarak dördüncü sindirim gerçekleştirmek ama yüzer maksimum miktarda toplamak. sindirim 3 paralel 1.2.16.1 arasındaki adımları 1.2.15 gerçekleştirmek ve nihayet sindirim 4.
- (Sindirim 2, 3 arasında ve 4) süpernatant 13.5 mi parçaya, bir 15 ml santrifüj tüpüne her bir parçayı kısım. Bir 22.8 cm uzunluğunda cam Pasteur pipeti ile, çok nazik ve yavaş yavaş ayrı bir katman yaratmak amacıyla her tüpün dibinde FBS 1.5 ml yerleştirin. FBS ve süpernatant karışmaz. Oda sıcaklığında 1.250 x g'de 20 dakika süre ile fren olmayan tüpleri santrifüjleyin.
Not: Şekil 1 'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra, 4 kat, tüp içinde görebilir Tripsin ve trofoblast hücrelerin ayrılması, aşırı selüler sindirim önler.. - Bir vakum pompası, aspir ileyedik ve iki tabaka arasında beyazımsı film dahil süpernatant (sindirim çözeltisi) ve FBS katmanları, atın. Sıcak hücre kültürü ortamı, 1 ml ile pelet (trofoblast ve kırmızı kan hücresi kat) yeniden süspanse edin (aşama 1.1.2, hiç FBS ve Resim HEPES).
- Tüm tüplerinden yeniden süspanse hücreleri toplamak ve 1 tüp içinde bunları birleştirmek. Tüp tüm sindirim sonuna kadar oda sıcaklığında bekletin. Not: Tüm sindirim sonra, her zamanki verimi yeniden süspanse hücreleri (sindirim başına bir) 3 tüp olduğunu.
- Sıcak hücre kültür ortamı ile 15 ml hacim oluşturuyor. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1250 x g'de santrifüjleyin. bir vakum pompası ile süpernatantı. pelet çekilmesini önlemek.
- Yavaşça sıcak hücre kültürü ortamı, 1 ml 3 tüplerden elde edilen topak yeniden süspanse edin. 1 tüp içinde kendi içeriklerini Havuz. 8 ml elde etmek için, sıcak bir hücre kültürü ortamı olan hacmi tamamlamak.
- Çok hafifçe ayırma grad hücre süspansiyonu katmanPasteur pipeti ile sağ- lasa. Oda sıcaklığında 507 x g'de 30 dakika süre ile fren olmayan santrifüjleyin.
- Santrifüj işleminden sonra arka aydınlatma ile degradedeki hücrelerin farklı katmanları belirlemek. yoğunluk santrifüj ortamı% 50 - katmanları trofoblast içeren ve 40 ila hücreleri kirletici bulun. Bir vakum pompası ile üst katman (>% 50) çıkarın.
- Pasteur pipeti ile ilgi katlarındaki hücrelerde toplamak ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne transfer edin. hücre kültürü ortamı ile 50 ml hacim oluşturmaktadır. Oda sıcaklığında 1.250 x g'de 10 dakika süre ile santrifüjlenir.
- Steril koşullar altında, süpernatantı atmak FBS 20 ml pelet tekrar süspansiyon ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı. Buz üzerinde, steril dimetil sülfoksit (DMSO) 2.22 ml ilave edilir ve çevirerek hafifçe karıştırın. kriyojenik şişelere hücre süspansiyonu alikotu 1.5 mL, -80 ° C de bir gece boyunca dondurma ve bir sıvı azot tankına aktarılır.
<li> Trofoblast arıtma - durulama ve çalışan tamponlar ve üreticinin talimatlarına göre manyetik arıtma cihaz üzerinde yeni bir filtre sütun takın. negatif 1, pozitif 1 ve pozitif 2 portları temizleyin ve sonra üreticinin talimatlarına göre her port altında 50 ml tüpler tanıtmak "temiz programı" gerçekleştirin.
- 37 ° C su banyosu içinde hızla aşama 1.2.22 dondurulmuştur hücreleri çözülme. 50 ml'lik bir tüp hücreleri aktarın ve yavaşça akan soğuk tampon çözeltisi 20 ml tekrar süspansiyon hücreleri. 450 x g'de 5 dakika 4 ° C'de tüp santrifüjleyin.
- süpernatant atın. akan soğuk tamponu ile yıkama adımı yineleyin. canlılığı belirlemek için bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. santrifüj tekrarlayın (5 dakika, 4 ° C'de 450 xg için). Dikkatle süpernatant kaldırmak. % 1 hacim / fare anti-HLA-ABC antikor vol ihtiva akan soğuk tampon maddesi 1 ml. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir, Mixiyavaşça her 5 dakikada ng.
- akan soğuk tampon 6 ml ekleyin. 450 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj. Süpernatantı atın ve bu adımı tekrarlayın. % 10 hacim / anti-fare ikincil antikoru ile birleştirilmiş manyetik boncuk vol ihtiva akan soğuk 1 ml tampon içinde süspanse hücreleri. yavaşça her 5 dakikada, karıştırma, 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- akan soğuk tampon 6 ml ekleyin. 450 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj. 5 ml soğuk çalışan tampon supernatant ve tekrar süspansiyon atın.
- Manyetik arıtma cihazı kullanılarak trofoblast hücreleri ayırın. Negatif limanda hücreleri toplamak ve akan soğuk tampon 20 ml ekleyin.
Not: Trofoblast hücreler kompleks HLA-ABC içermez ve bu nedenle negatif 1 portuna doğru diğer hücre tiplerinden ayrılan ve yönlendirilmektedir. - 450 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj. Süpernatantı atın ve yavaşça 20 ml ılık birincil kültür ortamında hücreleri tekrar süspansiyon. istimal hücreleri sayınga hemositometre canlılığı belirlemek için.
- Plaka, aşağıdaki yoğunluklarda hücre: 0.15 x 10 6 hücre / kuyuda 96-kuyu plakaları, 1.6 x 10 6 hücre / kuyuda 24-kuyu tabak ve 4.5 x 10 6 hücre / oyuk, 6-çukurlu levha. 37 ° C'de ve% 5 CO2 de inkübe edin.
- 16,17 sitometri ve / veya 18 immünhistokimya ile akışının trofoblast hücrelerinin saflığını onaylayın.
Not: immüno hücrelerinin saflığı sitokeratin-7 ve vimentin 17-19 karşı FITC konjüge monoklonal antikor kullanılarak tespit edildi. Bu protokol Lanoix ve ark iyi ayrıntılı., 2008 7. - En az 4 saat sonra, birleşmeyen hücrelerin çıkarılması ve daha sonra% 8 O 2 (Şekil 2 ve bakınız bölüm 2) oluşmaktadır normoksi odası, plakalar transfer sıcak kültür ortamı ile hücreler iki kez yıkayın.
2. İn Vitro termik indüklemeNormoksi n ve Hipoksi / reoksijenizasyonun
- Inkübatör odası operasyonu (kurulum için Şekil 2A bakınız).
- bir laminar akış başlığı içinde, kuruluğu önlemek için kuluçka odasının altındaki steril su ihtiva eden bir Petri çanağı yer; Daha sonra odanın üstün raflarda önceden hazırlanmış hücre kültürü plakaları veya şişeleri (adım 1.3.10) yerleştirin.
- Kapağın dışında, gaz hortumuna bölme (giriş ağzı parçasını) (Şekil 2A: 5a, b ve c) gaz (% 8 O 2 veya% 0.5 O 2) tüpü ulaşmak için (Şekil 2A: 7). odasının hem giriş ve çıkış portları açın. Bu noktada, gaz regülatörü (Şekil 2A: 4) kapalı kalmalıdır.
- Dikkatle gaz regülatör vanasını açın (Şekil 2A: 4). 25 L 'lik bir hava akışı ile 4 dakika için Yıkama / dakika pistonun içinde hava yerine.
- odasını basması sonra, o giriş ve ou gaz regülatörü kapatınOdanın tlet portları.
- Akış ölçer çıkış hortumunu çıkarın (Şekil 2A: 5c) ve odanın giriş portundan 37 ° C 'de, bir hücre kültürü inkübatöründe odası yerleştirin.
- Aşama 2.1.3 sonra gazı 1 saat ile odasını doldurmak, kültür ortamı içinde, şu anda tablalar, şişeler içinde mevcut ve çözünmüş hava değiştirin.
- Dier gaz bileşimleri için 2.1.6 için 2.1.1 adımları (örneğin,% 2 birinci trimester trofoblast kültürü 9 O 2).
- Oksijen yüzdesi onaylayın (Şekil 2B-C)
- odası içinde (hücre içermeyen) hücre kültür ortamı içinde, oksijen konsantrasyonunun teyit etmek için, bir oksijen adaptörüne bağlı bir oksijen elektrodu kullanın. Bir voltmetre oksijen elektrodu bağlayın.
- Aynı çözelti içinde bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak (yani, hücre kültür ortamı), bilinen oksijen içeriği ile (gazlara çözelti maruz bırakılması ile, örneğin,% 0 ve% 21 oksijen). Kaynaklar her bir konsantrasyon için dengeye oturtulduktan sonra, oda içinde ortam içine elektrot getirmektedir.
Not: oksijen konsantrasyonu 10 herhangi bir önyargı önlemek için aynı derinlikte tüm ölçüm alın.
- trofoblastlar içinde normoxia ve hipoksi / reoksijenasyon indüksiyonu.
- Uygun hücre kültürü şişeleri, tabak ya da Petri birincil trofoblast hücreleri ekledikten sonra, gerekli tedavileri yapar.
- Buna paralel olarak, bölme içinde belirli bir durum, her 24 saat (Şekil 3) üretmek için istenen gaz karışımına hücrelerin maruz kalmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vajinal doğum ile elde edilen normal bir terim plasenta İzolasyon ve villöz sitotrofoblast hücrelerinin immünolojik saflaştırma 1 x 10 8 canlı hücreleri elde edildi. Plasenta, 350 g ağırlığında diskoid şekil ve şeffaf membran ile 4 cm boyunda çapı 19 cm idi. Hiçbir kotiledon malformasyon tespit edildi. Göbek kordonu Parasantral lokalizasyon ve 56 cm'lik bir uzunluğa sahipti. saflık vimentin ve sitokeratin-7 belirteçleri kullanarak flow sitometri ile değerlendirildi. Hücrelerin% 98'den daha fazla immün-elde edilen villöz trofoblastlar hücrelerin saflığını teyit sitokeratin-7 için vimentin için negatif ve pozitif idi. Villöz sitotrofoblast hücreler 1 mM melatonin varlığında veya yokluğunda normoksik koşullar altında, 96-çukurlu kültür plakalarına ilave edildi. villöz sitotrofoblastlar biyokimyasal farklılaşma β-insan koriyonik gonadotropinin seviyelerinin saptanması ile gözlenmiş (β-hCG) salgılanmasıDaha önce tarif edildiği 1,7,20,21. Morfolojik ayrım ve apoptozis anti desmoplakin ve anti-kaspaz-klivaj sitokeratin 18 ara filamentleri 7,22 kullanılarak immünofloresans ile değerlendirildi. 4. günde (özellikle sinsityotrofoblastlarda), 1. günde (özellikle villöz sitotrofoblastlar) hücre kültür ortamı toplanmış, santrifüje tabi tutulur ve β-hCG düzeyleri süpernatant-larında ölçüldü edildi. Sinsityotrofoblastlarda özeldir β-hCG, üretim kültürü zamanında (Şekil 4) artmıştır. Sadece hipoksi / reoksijenasyon, ama hiperoksi (>% 20 O 2) de aktif apoptoz 23. Böylece,% 8'lik bir O 2 konsantrasyonu benimsenmesi villöz trofoblast hücre gebeliğin 10 üncü trimesterde maruz kalacağı hangi oksijen miktarının temsilcisi oldu. 72 saatte gözlenen β-hCG seviyeleri zirve bu koşullar altında ayırt etmek villöz sitotrofoblastlar kapasitesini doğruladı.Melatonin bu çalışma koşulları altında β-hCG salgılanmasını değiştirmedi. 96 saatte β-hCG seviyelerinin azalması muhtemelen birincil kültürdeki uzun süre 5,7,22,24,25 (Şekil 4) sonra artar trofoblast hücrelerinin apoptoz, neden oldu. Bu β-hCG düzeyleri 26,27 etkilemediği için DMSO (% 0.1 hacim / hacim) seçildi. melatoninin koruyucu rolü güçlü antioksidan özellikleri ile ilgilidir. villöz trofoblast hücrelerinde kültür kaynaklı oksidatif stresin 72 saat sonra hipoksi / reoksijenizasyon. Melatoninin koruyucu etkisi Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Algılama Reaktif (Şekil 5A) ile değerlendirildi. Kültür 96 saat sonra, trofoblast hücrelerin 10 5- uM (ve-6) 7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (karboksi-H2DCFDA) ROS toplam miktarı, 8 üretilen tespit etmek için, "-2-karboksi 45 dakika inkübe edildi. hipoksi / reoksijenasyonunu yapılan villus trofoblastların vardıönemli ölçüde normoksiyada altında kıyasla ROS seviyelerini (% 54) artmıştır. Bu artış, 1 mM melatonin işlenerek tersine çevrilmiştir. Dahası, normoxia melatonin altında. Dışı muamele villus trofoblast hücreleri (Şekil 5A) benzer olmuştur ROS seviyelerini (homeostasis), modüle normoxia altında melatoninin oksidatif stres ya da β-hCG salgılanması düzeylerini değiştirmek olmadığını 4 ve 5A gösterisi Şekil vermedi trofoblast hücrelerin, bu normal koşullar altında 28,29 hücre homeostazının Resim modülasyonu gösteren önceki çalışmalarda teyit eder.
Şekil 1:. Sindirme tüpü santrifüjden sonra, 4 tabakalar oluşturulur. Üst tabaka sindirim çözeltisi oluşmaktadır; hemen altında, fetal sığır serumu (FBS). Her iki tabaka, bir vakum pompası ile atılmalıdır. alt katmanları arE aşağıdaki gibi oluşur: fibroblastlar, lökositlerin, makrofajların ve trofoblast ihtiva eden beyaz bir katı; ve kırmızı kan hücrelerinin oluşan bir alt tabaka. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil 2: Hipoksi Odası ve Çözünmüş Oksijen Konsantrasyon Ölçüm / Hesaplama bileşenleri (A) Hipoksi odası ve gaz silindir takımı: (1) Gaz silindiri; (2) gaz regülatörü; (3) Gaz hortum kelepçesi; (4) Silindir gaz hortumu; (5) Giriş filtresi; (6) Giriş hortumu; (7) debimetre; (8) Çıkış hortum; (9) modüler inkübatör. Bilinen oksijen konsantrasyonlarında üretilmiş bir standart eğri kullanılarak, hücre kültürü ortamı içinde gerçek oksijen konsantrasyonunun (B) hesaplanması. (C ve D)Çözümler "% 0 O 2" ve "% 21 O 2" de elde edilen nispi değerler, hücre kültürü ortamında oksijen konsantrasyonunu belirlemek için doğrusal bir fonksiyonu "?% O 2" olarak grafiksel çizilir. Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Şekil 3:. Modüler inkübasyon odası normoksiya'da Hücre Kültürü Genel Deney Tasarımı (% 8 O 2% 5 CO2,% 87 N2) ile hipoksi / reoksijenasyonun (H / R) (% 0.5, O 2,% 5 CO 2;% 94.5 N 2) villöz sitotrofoblast (vCTB) ve sinsityotrofoblast (STB) hücrelerde patolojik durumları incelemek için kullanılan durumlardır. ya da melatonin geçen her 24 saat, orta (1 mM) değiştirilirve gaz karışımı yenilenir. H / R altında, STB hücreleri 4 saat hipoksi (% 0.5 O 2) geçmesi ve daha sonra normoxia (% 8 O 2) geri döner. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Villöz Trofoblast farklılaşması sırasında beta-insan koryonik gonadotropini (β-hCG) salgısını Melatonin Etkisi Villöz sitotrofoblast hücreler izole edilmiş ve insan sağlığı terimi plasenta saflaştırılmıştır. (% 5 CO2,% 87 N2,% 8 O 2) normoksik koşullar altında: (taşıyıcı kontrol DMSO,% 0.1) Hücreler, 1 mM melatonin veya dimetil sülfoksit 96 saat boyunca muamele edilmiştir. kültür ortamında β-hCG seviyesi 24, 48, 72 ve 96 saat o sonra enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) ile ölçüldüf primer kültürü. Seviyeleri iyi gelen her birinden tam hücre lizatı protein içeriğine normalize edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. Hipoksi / reoksijenasyonun (A) melatonin (M, 1 mM) etkisine maruz sinsityotrofoblast Melatoninin anti-oksidan etkileri, hücre içi reaktif oksijen türleri üzerinde (ROS) normoksi altında sinsityotrofoblast hücrelerinde düzeyleri (N) veya hipoksi / kültür 72 saat sonrasında indüklenen reoksijenasyon (HR), 5- (and-6) ile değerlendirildi karboksi-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (karboksi-H2DCFDA) floresans. Sonuçlar, 3 ayrı plasenta ± SD ortalaması olarak ifade edilmiştir; *** P <0,001 (Lanoix, et al. 8). (B), hipoksi / reoksijenasyonu kaynaklı apoptoza karşı melatonin varsayımsal korunması ile ilgili hücresel yollann. Primer villöz sitotrofoblast hücreleri normoksi altında 72 saat (% 8 O 2) sinsityotrofoblastlarda halinde farklılaşmasını sağlamak için kültürlendi. Hücreler, melatonin ve taşıyıcı kontrol içinde 1 mM maruz bırakıldı ve daha sonra 18 saat süre reoksijenizasyon (% 8 O 2) ardından 4 saat hipoksi (% 0.5 O 2) tabi tutuldu. Hipoksi / reoksijenasyon kaynaklı oksidatif stres gibi nükleer faktör kappa B (NF-KB) ve hipoksi indüklenebilir faktör 1 (HIF-1) olarak redoks duyarlı transkripsiyon faktörlerini aktive eder. NF-KB, Rho-ilişkili aktive bölünmesini ve kaspaz 9 ve 3 Kaspaz 3 aktivasyonunu kapsayan mitokondriyal apoptoz Bax / Bcl-2 yolu tetikler p53 indükler, sarmal sargı ihtiva eden bir protein kinaz 1 (ROCK-1), poli ayrılması (ADP-riboz) polimeraz (PARP) ve DNA onarımının değer. melatonin önleyinhipoksi / reoksijenasyon kaynaklanan oksidatif stresi azaltmak için güçlü bir antioksidan olarak hareket ederek mitokondriyal apoptoz indüksiyon s. Bu rakam Lanoix ark dan modifiye edilmiştir. 2013 8. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Sindirim 1 | sindirim 2 | sindirim 3 | sindirim 4 | |
| Modifiye HBSS (mi) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAz (ul) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0.1 mg /il) | ||||
| MgSO 4 (il) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 mM) | ||||
| CaCl2 (ul) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 mM) | ||||
| Tripsin (U) | 1.824.000 | 1.200.000 | 960.000 | 960.000 |
| P / S (mi) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Tablo 1: Sindirim Çözüm Penisilin ve streptomisin (P / S) için Malzemeler miktarları;. Magnezyum sülfat (MgSO 4); kalsiyum klorür (CaC <sub> 2); deoksiribonükleaz IV (DNaz IV).
Tablo 2: Yoğunluk Santrifüj Medya Çözüm hacimleri ve Gradient Çözüm Hazırlama HBSS Gerekli Modifiye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Memelilerde, fetal gelişim yeterli plasental fonksiyonu üzerine doğrudan bağlıdır. Sağlık bozukluklarının gelişimsel kökenleri sonraki hayatında tecelli hastalıkların nedeni erken gelişmesine ve plasenta, fetal programlama 30-32 bir mekanik role sahip olduğu geri izlenebilmektedir hipotezine dayanmaktadır. Bu besin devrini düzenleyen zararlı maruz karşı korur ve önemli endokrin fonksiyonlara sahiptir: plasenta, fetal büyüme ve gelişmenin temel aracıydı. Kliman ve arkadaşları tarafından geliştirilmesi. Yaşayabilir birincil sitotrofoblastlar izole etmek için bir tekrarlanabilir tekniğin normal ve anormal plasental fonksiyonların 6 çalışmalarında bir dönüm noktasıdır. Birçok araştırmacı plasental fizyolojisi 18,20,33,34 anlamak için in vitro özgü şartları yeniden oluşturmak için bu tekniği adapte var. Petroff ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi., Birçok adım izole sito saflaştırılmış ve sağlam verimi garanti altına almak için önemlidirtrofoblastların 18. Örneğin, sindirim adımlar uygulanabilir izole sitotrofoblastlar fazla sayıda sonuçlanan bu tür sindirim, sayısında artış ve uzunluğu gibi yanı sıra sindirim enzimlerinin kompozisyonu ve miktarı 1988, tekniğin gelişmesi beri çeşitli değişiklikler geçirmiş 18. Bu, geçerli protokol üç ana avantajı vardır: olasılık sitotrofoblast saflığı ve kullanımını arttırır protokolü daha sonra immunomanyetik arıtma devam etmek için izin verir dondurulması, hücre eki 7,34-36 iyileştirilmesi mikropleytin önceden kaplanmış. Mevcut literatür sitotrofoblast hücreler için izolasyon tekniğinin farklı değişiklikler çeşitli örnekler içerir, ancak yoğunluk santrifüj medya özellikleri 37 neredeyse değiştirilmemiş kalmıştır. İzolasyon / immün-içinde sunulan teknik birçok kritik adımlar vardır. Bu nedenle, saflığı değerlendirmek için önemlidirHer immün-sonunda villöz sitotrofoblast hücrelerinin. Sitokeratin-7 (trofoblastik işaretleyici), farklılaşma 45 (CD45) ve vimentin küme (non-trofoblastların işaretleri) 18,38,39: belirteçleri olarak uygun antikorlar kullanılarak sitometri Bu akış yapılabilir. Diğer kritik yönleri tüm hücrelerin 20,40 verimini ve kalitesini etkileyebilir elde plasenta kalitesi, FBS ve yoğunluk santrifüjleme ortam gradyan, hem de santrifüj hızı vardır.
yaygın olarak kullanılmasına rağmen, mevcut teknik kaçınılmaz sınırlamalar vardır. Birincisi, immün-sonra elde edilen canlı sitotrofoblastlar hücrelerin miktarı nispeten düşük olduğu ve test edilebilir olası durumlar / tedavi sayısında önemli sınırlayıcı faktördür. İkinci olarak, birincil trofoblast hücrelerin ömrü kısadır ve sinsityotrofoblastlarda in vitro farklılaşmasında yakın hücre viabili bir indirgenmesi takip eder ty ve apoptoz bir artış. Apoptoz tersinmez kültür 7,41 yaklaşık 4 gün sonra tetiklenir, çünkü in vitro çoğalma yoktur trofoblast hücre canlılığı kısa boy, uzun süreli tedavilerde değerlendirilmesini sınırlar. Üçüncü olarak, interplacental değişkenliği büyük, yani plasenta nispeten büyük bir sayıda istatistiki olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için gereklidir. Diğer yandan, birinci trofoblast kültürü gibi farklılaşma çeşitli aşamalarında göre farklı hücre fenotipleri koşulları ve tedavi çalışma sağlar Sinsityum ayırt eden hücrelerin kapasitesi olarak özgü avantajları vardır. Bu protokol sunulan oksijenlenme yöntemi son derece uyarlanabilir ve yapılandırma gibi normoxia 9,42,43 için daha düşük bir oksijen basıncına maruz olmalıdır birinci trimester gebelik birincil trofoblast hücrelerinin, kültür gibi diğer durumlar için uygun olabilir.
ntent "> in vitro insan plasenta fonksiyonunu incelemek için başka yaklaşımlar vardır. Yapış dondurma plasental dokuların çok omik için izin verir, ancak merkezi azalır oksijenlenme degrade nedeniyle örnek metabolik değişimler için önlemek için, plasental çoklu örnekleme gerektiren analizler çevre 44 villi. ancak, canlı trofoblast hücre biyolojisi ve davranışları bu yaklaşımı 45 kullanılarak incelenebilir edilemez. villöz eksplantlar kurucu hücre tipleri ve onların iletişim ile tüm villus yapısını koruyarak avantajı var, ancak tedavilere yanıtları özgü değildir trofoblast hücrelerin 23. Ticari olarak temin edilebilen trofoblast benzeri koryokarsinom hücre çizgileri, örneğin BEWO, jEG-3 ve JAR gibi füzyon, farklılaşma ve transplacental taşıması plasental fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir. Fakat, son çalışmalar, primer gen ekspresyonu olduğunu göstermektedir sitotrofoblastlar ve BEWO tümör hücrelerinin zayıf 46-48 ilişkilidir. Thus, primer villus trofoblast hücre kültürü, onun sınırlamalara rağmen, normal veya anormal plasenta in vivo ortamda taklit benzersiz bir avantaj sahiptirler.Birincil kültür villöz eksplantlarında villöz trofoblast hücre kullanılarak yapılan çalışmalar hipoksi ve hipoksi / reoksijenasyonu sistematik oksidatif stres, iltihap, Otofaji ve apoptoz 43,49-52 artmış düzeyleri ile trofoblast hücre canlılığı, aynı anda azalmaya gösterir. Bu hipoksi / reoksijenizasyon hücre kültürü modeli, özellikle, bize villus trofoblast hücrelerinde melatoninin antioksidan ve anti-apoptotik etkilerini göstermek için izin verdi. Hipoksi / reoksijenasyonun maruz primer villöz trofoblast hücrelerin içinde, melatonin, aşağıdaki engeller: oksidatif stres uyarılmasını, antioksidan enzim aktivitelerini, redoks-duyarlı bir sinyal yollarının artan bir aktivite ve mitokondriyal apoptoz indüksiyonu (Şekil 5B) azalma 8. hypoxia / reoksijenizasyon modeli oksidatif strese bağlı hasar ve plasental melatonin sentezi 53 azalır preeklampsi gibi gebelik komplikasyonları olası koruyucu rolünün melatoninin koruyucu rolünü tespit etmek için eşsiz bir araçtır. Melatonin hedeflerinin 54 geniş bir yelpazede güçlü bir antioksidandır. Ayrıca, bir tedavi olarak melatonin güvenliği büyük ölçüde kurulmuştur. Melatonin ile yararlı sonuçlar birçok araştırmacı tarafından yeniden yapılmış ve melatonin preeklampsi veya intrauterin büyüme geriliği 55,56 ile komplike gebeliklerde potansiyel önleyici veya tedavi edici tedavi olarak klinik çalışmalarda şu anda.
Sonuç olarak, izolasyon, saflaştırma ve hipoksi tekniği ile birlikte hücrelerin sitotrofoblast kaliteli primer kültür, içinde / reoksijenasyon daha iyi oksidatif ilgili gebelik komplikasyonları anlamak için umut verici deneysel yaklaşımlar geniş bir yelpazede etkinleştirmekStres ve plasental sağlığını geliştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
- Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
