Summary
Qui spieghiamo un protocollo per modellare il microambiente biofisico dove reticolazione e una maggiore rigidità della membrana basale (BM) indotta da prodotti finali della glicazione avanzata (AGE) ha rilevanza patologica.
Abstract
Qui si descrive un protocollo che può essere utilizzato per studiare il microambiente biofisico relativi a spessore maggiorato e la rigidità della membrana basale (BM) durante le patologie legate all'età e disturbi metabolici (come cancro, diabete, malattie microvascolare, retinopatia, nefropatia e neuropatia) . La premessa del modello è reticolazione non enzimatica della matrice ricostituito BM (RBM) di trattamento con glicolaldeide (GLA) promuovere avanzata glicazione prodotto finale (AGE) generazione tramite la reazione di Maillard. Esempi di tecniche di laboratorio che possono essere utilizzati per confermare la generazione AGE, reticolazione non enzimatica e una maggiore rigidità in GLA trattati meccanismi sono delineati. Questi includono la preparazione di natale RBM (trattato con soluzione salina tamponata con fosfato, PBS) e rigido RBM (trattato con GLA) per la determinazione di: suo contenuto AGE da analisi fotometrica e microscopia a immunofluorescenza, la sua reticolazione non enzimatica da sodio dodecil solfato poliacrilammideelettroforesi su gel (SDS PAGE) e microscopia confocale, e la sua maggiore rigidità utilizzando reometria. Il procedimento qui descritto può essere utilizzato per aumentare la rigidità (moduli elastici, E) di MLF fino a 3,2 volte, in linea con le misurazioni effettuate in sani contro tessuto prostatico umano malato. Per ricreare il microambiente biofisico associato con l'invecchiamento e la prostata malata ghiandola tre tipi di cellule della prostata sono stati introdotti a RBM nativo e rigido RBM: RWPE-1, le cellule epiteliali della prostata (PEC) derivato da una ghiandola prostatica normale; BPH-1, PEC derivati da una ghiandola prostatica affetti da iperplasia prostatica benigna (BPH); e PC3, cellule metastatiche derivate da un tumore osseo secondario proveniente da cancro alla prostata. parametri multipli possono essere misurati, tra cui le dimensioni, la forma e le caratteristiche invasive della acini ghiandolari 3D formato da RWPE-1 e BPH-1 sul nativo contro rigida RBM, e la durata media delle cellule, la velocità migratoria e la persistenza di movimento delle cellule di spher 3DOID formate da cellule PC3 alle stesse condizioni. Cellulare vie di segnalazione e la localizzazione subcellulare delle proteine può anche essere valutato.
Protocol
1. L'induzione di BM Rigidità indotta da trattamenti GLA (reticolazione non enzimatica)
- Scongelare una fiala congelata di matrice BM (10 ml) mediante incubazione a 4 ° C (in piedi sul ghiaccio in una cella frigorifera o frigorifero) liquido finché il contenuto della fiala sono diventati (8-16 ore).
Attenzione: Se una camera fredda / frigorifero non viene usato, coprire l'intera bottiglia con ghiaccio. Questo consentirà di evitare la soluzione stock di BM solidificazione. - Per gli esperimenti futuri e per evitare cicli di gelo-disgelo ripetuti, preparare 25 x 0,4 ml aliquote da ogni nuovo flaconcino da 10 ml di matrice BM. fiale conservare a -80 ° C fino alla data di scadenza indicata dal produttore. Quando necessario, scongelare fiale a 4 ° C in piedi sul ghiaccio per 2 ore.
- Preparare una superficie uniforme di ghiaccio. Inserire un vetrino camera 8 pozzetti sopra il ghiaccio per mantenere una temperatura di 4 ° C durante la procedura di rivestimento. Scongelare una fiala di matrice di BM a 4 ° C.
Nota: Un 0,4 ml flacone di matrice BM è sufficiente coat una intera diapositiva camera di 1 x 8-bene. Conservare il flaconcino coperto di ghiaccio durante la manipolazione per evitare che la matrice di BM solidificazione. - Tagliare l'estremità di erogazione di un puntale 200 l con le forbici. Raffreddare il blunt-ended 200 microlitri punta della pipetta a 4 ° C e posizionarlo su di un 200 ml di aiuto la capacità di pipettaggio. Raccogliere 40 ml di soluzione fredda di matrice BM nella punta della pipetta e trasferirlo in un pozzo sul refrigerata 8 pozzetti vetrino da camera.
Nota: 40 ml di soluzione di BM è sufficiente a coprire una superficie 0,8 cm 2. Tenere i puntali delle pipette refrigerate durante la procedura di rivestimento per evitare la solidificazione della soluzione BM. Non introdurre bolle d'aria nella soluzione di matrice BM e garantire il pozzo è uniformemente rivestita senza la formazione di un menisco visibile ai bordi. - Ripetere passaggio 1.4 base al numero di pozzetti e camere richiesti.
- Dopo il rivestimento, collocare il vetrino camera 8 pozzetti a 37 ° C per 30 min per promuovere la polimerizzazionedel BM. Chiudere la porta incubatore molta attenzione per evitare eventuali disturbi del liquido RBM. Non superare il tempo di incubazione di 30 minuti per evitare la disidratazione del gel RBM.
Nota: Il gel risultante è il nativo ricostituito BM (RBM). La fase C di incubazione 37 ° non richiede 5% CO 2. Tuttavia, per comodità eseguire questo passaggio in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO 2 (con umidificazione). - Preparare 50 mM glicolaldeide (GLA) diluito in 0,2 M tampone fosfato (pH 7,8). Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron utilizzando una siringa da 50 ml.
- Per una reazione di reticolazione in un volume finale di 250 ml di 50 mM GLA, aggiungere 25 ml di 0,5 M sodio cianoboroidruro o 2,5 M amminoguanidina a 125 ml di 100 mM GLA (2x archivio) e 100 ml di 0,2 M tampone fosfato (pH 7.8 ). Sterilizzare le soluzioni madre facendoli passare attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron utilizzando una siringa da 50 ml.
Attenzione: maneggiare sodiocianoboroidruro indossa un camice da laboratorio, guanti, visiera e respiratore mentre si lavora in una cappa aspirante.
- Per una reazione di reticolazione in un volume finale di 250 ml di 50 mM GLA, aggiungere 25 ml di 0,5 M sodio cianoboroidruro o 2,5 M amminoguanidina a 125 ml di 100 mM GLA (2x archivio) e 100 ml di 0,2 M tampone fosfato (pH 7.8 ). Sterilizzare le soluzioni madre facendoli passare attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron utilizzando una siringa da 50 ml.
- Aggiungere 250 pl di soluzione di GLA per coprire il gel polimerizzato RBM e incubare a 37 ° C per 6 ore per produrre un semi-rigida MLF gel o 14 ore per produrre un gel rigido MLF.
Nota: Il volume di GLA aggiunto deve coprire il gel polimerizzato RBM e deve essere adeguato di conseguenza. Se si utilizzano diversi tempi di incubazione GLA, i gel RBM devono essere analizzati per determinare la piega-aumento di RBM rigidità (vedi punto 2.4).- Preparare un controllo negativo incubando un gel nativo RBM in 250 ml di sterile tampone fosfato salino (PBS) per 14 ore a 37 ° C.
- Preparare due controlli aggiuntivi in cui la formazione della base di Schiff o Amadori addotto riarrangiamento durante la reazione di reticolazione sono inibiti, con l'aggiunta di 50 mM di sodio cianoboroidruro o 250 mM amminoguanidina.
- Preparare 1 M glicina emetil estere (GEE) diluito in PBS. Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron utilizzando una siringa da 50 ml.
- Dopo il periodo di incubazione indicato, rimuovere con attenzione la soluzione di GLA dai gel RBM reticolati, soluzione GLA contenente inibitori delle gel RBM di controllo e PBS dal controllo gel nativi RBM. Aggiungere 250 pl di soluzione GEE a tutti i gel RBM e incubare a 37 ° C per 1 ora.
Nota: Questo passaggio placa la reazione di reticolazione. - Lavare tutti i gel RBM 10 volte in 500 microlitri di PBS per rimuovere tutte le tracce di GLA e GEE. Incubare i gel RBM notte a 37 ° C in 400 ml di PBS per impedire la loro disidratazione.
- Analizzare i gel RBM per l'accumulo di AGE, reticolazione non enzimatica e viscoelastiche proprietà (Steps 2.1-2.4). Per l'analisi reometrica delle loro proprietà viscoelastiche preparare i gel RBM in anelli di clonazione (passo 2,4).
- Per coltura cellulare, sciacquare RBM gel 2 volte con 500 microlitri cultura media prima della semina le cellule (i punti 5 e 6). Eseguire lava delicatamente senza la punta della pipetta di toccare la superficie del gel.
2. Quantificazione di non enzimatica reticolazione e la rigidità dei meccanismi Trattato con GLA
- Analisi fotometrica
- Misurare l'accumulo di AGE in GLA-trattati e controllare i gel RBM utilizzando l'analisi fotometrica per determinare l'entità della reazione di Maillard.
- Dopo il punto 1.11, rimuovere il PBS dal gel RBM negli 8 pozzetti camera di diapositive e aggiungere 250 acqua ghiacciata ml bidistillata. Incubare a 4 ° C per 16-24 ore per assicurare che la matrice è completamente liquefatto.
Nota: peptidi RBM in questa soluzione contengono le età con le proprietà auto-fluorescente. - Trasferire la soluzione BM liquefatto ad una provetta da 1,5 ml e misurare l'emissione fluorescente della soluzione utilizzando uno spettrofotometro (lunghezza d'onda di eccitazione = 370 nm; emissione di lunghezza d'onda = 440 nm).
- Dopo il punto 1.11, rimuovere il PBS dal gel RBM negli 8 pozzetti camera di diapositive e aggiungere 250 acqua ghiacciata ml bidistillata. Incubare a 4 ° C per 16-24 ore per assicurare che la matrice è completamente liquefatto.
- Misurare l'accumulo di AGE in GLA-trattati e controllare i gel RBM utilizzando l'analisi fotometrica per determinare l'entità della reazione di Maillard.
- SDS-PAGE analisi di bromuro di cianogeno Peptidi
- Risolvere i gel GLA-trattati e di controllo RBM su un gel di poliacrilammide per confermare che GLA ha indotto reticolazione e la formazione di macro-fibre.
- Centrifugare la soluzione BM liquefatto raccolti al passo 2.1.1.2 a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione madre contenente 2 g / ml di bromuro di cianogeno diluito in acetonitrile.
Attenzione: Maneggiare sempre bromuro di cianogeno in una cappa aspirante mentre indossa un camice da laboratorio, guanti, visiera e respiratore. - Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet gel BM in 500 ml di 20 mg / ml bromuro di cianogeno + 70% v / v di acido formico e incubare durante la notte a RT.
- Utilizzare un 1 ml siringa monouso per trasferire il gel pellet BM risospese in una cassetta di dialisi con un peso molecolare tagliato 3,5 kDa.
- Immergere la cassetta in un bicchiere di vetro da 500 ml contenente 500 ml di acqua bidistillata e una ancoretta magnetica.Inserire questo su un agitatore magnetico e dializzare notte (16 ore) a 4 ° C (in una camera fredda) per rimuovere tutte le tracce di bromuro di cianogeno e acido formico.
- Utilizzare un 1 ml siringa monouso per trasferire la soluzione BM dializzato dal cassetto in una provetta da 1,5 ml.
- Analizzare 25 microlitri di ciascun campione BM su un 12% v / v di poliacrilammide gel 10,11. Dopo SDS-PAGE, effettuare la colorazione argento del gel poliacrilammide 12 per visualizzare il tracciato elettroforetico di peptidi bromuro di cianogeno-matrice 13.
- Risolvere i gel GLA-trattati e di controllo RBM su un gel di poliacrilammide per confermare che GLA ha indotto reticolazione e la formazione di macro-fibre.
- Analisi immunofluorescenza Microscopia
- Eseguire immunofluorescenza colorazione di GLA trattata e controllare gel meccanismi con Anti-Age / pentosidina, anti-collagene IV e gli anticorpi anti-laminina seguita da microscopia confocale di visualizzare AGE accumulati e riarrangiamenti strutturali in fibra di laminina collagene IV / nel reticolato RBM Gel 13.
Nota: utilizzare sempre un volume sufficiente a coprire la Entire gel RBM durante l'incubazione e lavaggi senza toccare la superficie RBM con la punta della pipetta. Per i dettagli di analizzare le culture acini 3D mediante immunofluorescenza vedi riferimento 6 e per la microscopia confocale di acini 3D vedi riferimento 14.- Lavare GLA trattata e gel di controllo RBM in camera di diapositive 8-pozzetti 2 volte con 300 ml di PBS + (PBS contenente 0.1 mM CaCl 2 e 0,5 mM MgCl 2) per 5 minuti a RT.
- Rimuovere la PBS + quindi aggiungere 300 ml di 4% w / v paraformaldeide (PFA) diluito in PBS + per coprire ogni gel RBM. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare i componenti MLF.
- Rimuovere il 4% w / v soluzione PFA. Aggiungere aggiungere 300 ml di 75 mm NH 4 soluzione Cl + 0,5 mM MgCl 2 e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (ripetere 5 volte) per placare la fissazione.
- Preparare immunofluorescenza tampone (tampone IF), rendendo la seguente soluzione in acqua sterile: 130 mm NaCl, 7 mm Na 2 HPO 4, 3,5 mm NaH2 PO 4, 7.7 mM NaN 3, 0,1% w / v BSA, 0,5% v / v polietilene glicole tert-ottilfenil etere e 0,05% v / v polietilenglicole sorbitan monolaurato.
- Preparare SE tampone di bloccaggio, completandola tampone IF con il 20% di siero di capra v / v.
- Rimuovere la soluzione di tempra e aggiungere 300 ml di IF tampone di bloccaggio ai gel RBM per evitare reazioni aspecifiche. Incubare 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione.
- Rimuovere il tampone bloccante IF e incubare i gel RBM per 16 ore a 4 ° C con 300 ml di anticorpo primario diluito in IF tampone di bloccaggio (1: 500 topo anti-pentosidina mAb; 1/250 di coniglio anti-collagene IV pAb; 1 / 250 coniglio anti-laminina A / C pAB).
Nota: Incubazioni per più di 20 ore a 4 ° C può liquidize la RBM. - Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte (10 min ciascuna) con 300 ml di tampone IF a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione.
- Rimuovere il tampone IF eaggiungere 300 ml di anticorpo secondario (goat anti-rabbit o anti-topo IgG [H + L]), coniugati con un fluorocromo diluito 1: 500 in tampone di bloccaggio IF. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione.
- Rimuovere l'anticorpo secondario e incubare in 300 pl di tampone IF per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone IF e lavare 3 x 10 minuti in 300 ml di PBS + a temperatura ambiente.
- Fissare e dissetare una seconda volta, come descritto sopra (passi 2.3.1.2 e 2.3.1.3).
- Montare colorate gel RBM nei mezzi di montaggio e analizzare la formazione di densi fasci di importanti componenti utilizzando epifluorescente o microscopia confocale.
Nota: per i dettagli di analizzare le culture acini 3D mediante immunofluorescenza vedere riferimento 6 e per epifluorescente e microscopia confocale di acini 3D vedono di riferimento 14.
- Eseguire immunofluorescenza colorazione di GLA trattata e controllare gel meccanismi con Anti-Age / pentosidina, anti-collagene IV e gli anticorpi anti-laminina seguita da microscopia confocale di visualizzare AGE accumulati e riarrangiamenti strutturali in fibra di laminina collagene IV / nel reticolato RBM Gel 13.
- Analisi reologico
- Eseguire l'analisi reometrica di GLA trattata e controllare gel RBM per misurare la loro viscoelasticity (rigidità).
- Impostare gel meccanismi che sono spessi in uno stampo circolare con un diametro di 8 mm 1 mm. Per fare ciò, posizionare un anello clonazione (diametro 8 mm) all'interno di un pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti e aggiungere BM soluzione matrice preparata come descritto nei passaggi 1.3-1.6.
Nota: Per un'accurata ricapitolazione dei gel meccanismi utilizzati per esperimenti, i gel RBM preparate per l'analisi reometrica devono avere la stessa superficie e spessore gel meccanismi istituiti nelle camere 8 pozzetti. I gel RBM analizzati in figura 3 sono stati 1 mm di spessore e 8 mm di diametro. - Trattare i gel RBM allestiti negli anelli di clonazione con PBS, GLA per 6 ore e GLA per 14 ore come descritto sopra (passi da 1,8 a 1,11).
- Misurare il modulo elastico (E) di 8 mm Diametro meccanismi gel su un reometro con un 8 mm piastra parallela seghettata geometria, in un intervallo di 1-3% di deformazione, ad una oscillazione frequenza fissa di 1 Hz e temperatura di 21 ° C. Per ulteriori dettagli sullaanalisi reometrica di gel ECM vedi riferimenti vedere 13,15,16 riferimento.
Nota: E viene determinato dal modulo di accumulo risultante di taglio (G ') mediante l'uso della seguente equazione E = 2 * G' * (1 + v) dove v è il rapporto di Poisson di 0,5, come descritto in riferimento 13,15 , 16.
- Impostare gel meccanismi che sono spessi in uno stampo circolare con un diametro di 8 mm 1 mm. Per fare ciò, posizionare un anello clonazione (diametro 8 mm) all'interno di un pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti e aggiungere BM soluzione matrice preparata come descritto nei passaggi 1.3-1.6.
- Eseguire l'analisi reometrica di GLA trattata e controllare gel RBM per misurare la loro viscoelasticity (rigidità).
3. Cultura e manipolazione della linea normale PEC, RWPE-1
- Grow RWPE-1 le cellule cheratinociti mezzi privi di siero (KSFM) integrata con 5 ng / ml fattore di crescita epidermico (EGF), 50 mg / ml di estratto di ipofisi bovina (BPE) e 50 U / ml di penicillina con 50 mg / ml di streptomicina ( completare KSFM).
Nota: Per evitare l'induzione di epitelio-to-mesenchimale (EMT) -come transizione non esporre le cellule RWPE-1 al siero. Permettere la completa KSFM raggiungere RT per 30 minuti dopo la rimozione dalla conservazione a 4 ° C e non fa caldo in un 37 ° C bagnomaria in quanto ciò inattivare il FEG e BPE. - Aspirare il completoKSFM da un confluenti 10 centimetri 2 piatto di RWPE-1 cellule, lavare con 5 ml di PBS preriscaldata e aggiungere 5 ml di 0,05% v / v tripsina garantire che tutte le cellule sono coperti con la soluzione.
- Collocare le cellule in un incubatore di coltura tissutale fissato a condizioni standard di 37 ° C e 5% CO 2 (con umidificazione) da 5 a 10 min. Controllare l'entità del tripsinizzazione dopo 5 min e toccare delicatamente la piastra di coltura per staccare le cellule.
Nota: le cellule RWPE-1 non tollerano lunghi periodi di tripsinizzazione quindi si consiglia di non gestire più di due piatti contemporaneamente. E 'anche importante dissociare tutte le cellule dalla piastra per evitare selezione clonale.
- Collocare le cellule in un incubatore di coltura tissutale fissato a condizioni standard di 37 ° C e 5% CO 2 (con umidificazione) da 5 a 10 min. Controllare l'entità del tripsinizzazione dopo 5 min e toccare delicatamente la piastra di coltura per staccare le cellule.
- Quando tutte le cellule RWPE-1 si sono dissociate, aggiungere 5 ml di caldo PBS contenente 2% v / v di siero fetale bovino (FCS) per placare la tripsina. Delicatamente pipetta su e giù per rompere le aggregati di cellule prima di trasferire le cellule in una provetta da centrifuga.
- Centrifugare le cellule dissociate a 125-150 xg per 5 min a 25 ° C, scartare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 5 ml di completo KSFM fino ad ottenere una sospensione di cellule singole.
- Trasferire 1 ml di cellule risospese in una nuova provetta e aggiungere 9 ml di completo KSFM per propagare le cellule a una diluizione 1: 5 di passaggio per il successivo uso sperimentale. Contare il resto delle cellule utilizzando un emocitometro per l'impostazione di acini (vedere paragrafo 5.1).
Nota: non cultura RWPE-1 le cellule per più di 10 passaggi da periodi di cultura dopo lunghi non formano acini con l'architettura corretta. - Modificare i terreni di coltura ogni 48 ore per garantire la FEG e BPE rimangono attivi.
Nota: Includere questo cambiamento mezzo per eventuali trattamenti che si estendono oltre 48 ore.
4. Cultura e Manipolazione della BPH linea cellulare, BPH-1
- Culture BPH-1 in cellule RPMI 1640 supporti integrati con 5% v / v FCS, 50 U / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina. scaldare ilterreni di coltura, PBS e 0,25% w / v soluzione di tripsina-EDTA 0,53 M a 37 ° C prima dell'uso.
Nota: Le cellule possono anche essere coltivate in mezzi con 2,5% v / v FCS 8. - Aspirare il terreno di coltura da un confluenti 10 centimetri 2 piatto di BPH-1 le cellule e lavare le cellule 2 x con 3 ml di PBS per rimuovere tutte le tracce di terreni di coltura con siero che può placare la reazione tripsina.
- Aspirare il PBS e aggiungere 3 ml di soluzione di tripsina-EDTA per coprire le cellule. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 (con umidificazione) per 5 min. Rimuovere la soluzione tripsina-EDTA quando le cellule sono rotondi, ma rimangono attaccati al piatto. Lavare le cellule con 5 ml di PBS.
- Dopo la rimozione della PBS, aggiungere 5 ml di terreni di coltura e delicatamente pipetta su e giù per produrre una sospensione di cellule singole. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml.
- Prendere 2 ml di sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga con 8 ml di mezzi completi e targhetta BPH-1 le cellule ontoa 10 centimetri 2 piastra di coltura ad una diluizione 1: 5 di passaggio per il successivo uso sperimentale. Contare il resto delle cellule utilizzando un emocitometro per l'impostazione di acini (vedere paragrafo 5.2).
Nota: Tenere un registro del numero di passaggio, come vecchie cellule BPH-1 non formano acini con un'architettura adeguata. Un numero di passaggio superiore 10 non è desiderata. - Modificare i terreni di coltura ogni 72 ore.
5. Cultura 3D della Prostata Acini su meccanismi nativi e Stiff
- Se RWPE-1 le cellule vengono utilizzate per formare acini, diluire 5.000 celle previste al punto 3.5 in 300 ml di completo KSFM integrato con il 2% v / v della soluzione di BM.
- Se BPH-1 le cellule vengono utilizzate per formare acini, diluire 2.500 celle previste al punto 4.5 in 300 ml di RPMI 1640 terreni di coltura integrato con il 2% v / v della soluzione di BM.
Nota: BPH-1 le cellule sono più grandi di RWPE-1 le cellule in modo che i numeri più bassi di BPH-1 le cellule vengono utilizzati per ottenere una simile distribuzione di acini dopo 6 giorni di cultura. - Sementi delicatamente le cellule sul RBM nativo e AGE-irrigidita e con attenzione inserire le culture in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 (con umidificazione) per garantire una distribuzione uniforme di crescere acini nel pozzo e che ogni cellula si divide per produrre un acina.
- Ogni 2 giorni sostituire il terreno di coltura con terreni di coltura fresco contenente il 2% soluzione v / v BM per assicurare che le cellule sono i fattori di crescita necessari per acina normale omeostasi.
- Monitorare acinare morfologia nelle culture in crescita utilizzando la microscopia in campo chiaro 13.
Nota: Dopo 3 giorni di coltura singole celle formeranno un gruppo di> 3 celle e dopo 1 settimana prostata acini con un diametro di ~ saranno osservati 50 micron. - Seguire protocollo descritto in 2.3 per eseguire immunofluorescenza utilizzando anticorpi specifici per i marcatori di adesioni cellula-matrice, adesioni cellula-cellula, la polarità apico-basale e invasività 13.
6. cultura 3D della prostata Aggregati cellule tumorali su meccanismi nativi e Stiff
- cellule PC3 cultura in terreno RPMI 1640 contenente il 10% v / v FCS e 50 U / ml di penicillina con 50 ug / ml di streptomicina. Riscaldare il terreno di coltura, PBS e 0,25% w / v soluzione di tripsina-EDTA 0,53 M a 37 ° C prima dell'uso.
- Aspirare il terreno di coltura da un confluenti 10 centimetri 2 cultura piatto di cellule PC3 e lavare le cellule 2x con 3 ml di PBS per rimuovere tutte le tracce di FCS che può placare la reazione tripsina.
- Aspirare il PBS e aggiungere 3 ml di soluzione di tripsina-EDTA per coprire le cellule e incubare per 1 min.
- Quando le cellule diventano arrotondati, ma rimangono attaccata al piatto, aspirare accuratamente la soluzione di tripsina-EDTA e lavare con 3 ml di PBS perrimuovere tutte le tracce di tripsina.
- Dopo la rimozione della PBS, aggiungere 5 ml di terreni di coltura e delicatamente pipetta su e giù per produrre una sospensione di cellule singole. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml.
- Prendere 1 ml della sospensione di cellule PC3 in una nuova provetta e aggiungere 9 ml di terreni di coltura. Piastra le cellule su un piatto di 10 centimetri 2 cultura (diluizione 1:10) per il successivo uso sperimentale. Contare le cellule rimanenti utilizzando un emocitometro.
- Diluire 2.500 cellule PC3 previste al punto 6.6 in 300 ml di RPMI 1640 mezzi di coltura addizionato con 2% v / v della soluzione BM per consentire la formazione di un gel gradiente nella coltura.
- Delicatamente seminare le cellule sul RBM nativo e AGE-irrigidita e con attenzione inserire la cultura nella incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 (con umidificazione) per garantire una distribuzione uniforme di crescere sferoidi nel pozzo.
- Modificare i terreni di coltura ogni 72 ore.
- Per studiare l'effetto della rigida RBM (ricco di AGE)sulla migrazione delle cellule tumorali della prostata, le cellule PC3 immagine utilizzando il video campo chiaro microscopia time-lapse con temperatura / CO 2 di controllo e di una camera umidificata 17.
Nota: le cellule PC3 crescono in filoni sui meccanismi nativi e non fanno acini con un lume, ma se lasciato a crescere più di 72 ore su nativo RBM formeranno sferoidi 3D. - Dopo l'acquisizione dei dati, tenere traccia manualmente cellule PC3 e calcolare la loro velocità di migrazione, la forma (rapporto di allungamento) e la persistenza della migrazione 17-19.
Nota: Persistenza = rapporto D / T, D = distanza dall'inizio alla fine della traiettoria delle cellule, T = lunghezza totale della traiettoria delle cellule.
Representative Results
3D prostata Acini coltivate su Stiff RBM
Dopo 6 giorni di coltura, PEC derivate da tessuto prostatico normale (RWPE-1) (Figura 1A) e il tessuto di BPH (BPH-1) (Figura 1B) forma acini su nativa (PBS trattata) RBM che sono organizzati in sferoidi uniformi epiteliale cellule. Questi acini hanno anche le caratteristiche di PEC altamente organizzati con spazio apicale-to-basale polarità e un luminale visibile 13,20.
Il acini formata da PEC derivate da tessuto prostatico normale (RWPE-1) (Figura 1A) e tessuto di BPH (BPH-1) (Figura 1B) su irrigidito RBM (ricco-AGE) (trattato con GLA) hanno un'architettura perturbato (shifting da sferoidale a forma poligonale e le cellule sporgenti / migrazione da acini nel RBM ricco di età) (Figura 1A). Queste acini sono caratterizzati anche da PEC altamente disorganizzati che hanno perso la loro polarità apicale-to-basale con un piccolo o inesistente spazio luminale 13.
Figura 1:. Le cellule epiteliali della prostata coltivata come 3D ghiandolare Acini su Native e Stiff ricostituito membrana basale (RBM) (A) le immagini in campo chiaro di RWPE-1 le cellule coltivate per 12 ore fino a 6 giorni su gel meccanismi trattati con PBS (nativo) o 50 mm glicolaldeide per 14 ore (ricchi di età; rigida); Barra di scala = 50 micron. (B) BPH-1 le cellule, cresciute come descritto nel pannello A; Barre di scala = 50 micron; Dati rappresentativa 3 esperimenti indipendenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Tabella 1:. Caratteristiche epiteliali della prostata RWPE-1 acini Grown su Native, semi-rigida e Stiff ricostituito membrana basale (RBM) RWPE-1 acini sono state coltivate su meccanismi pre-trattati con PBS per 14 ore (nativo), glicolaldeide (GLA ) per 6 ore (semi-rigido) o GLA per 14 ore (rigida). Per la forma acinar, la percentuale (%) ± deviazione standard (SD) di turno, acini semi-poligonale e poligonali sono stati calcolati da 5 esperimenti indipendenti (50 acini quantificati per condizione). dimensione acinare relativa è stata calcolata (nativo RBM = 100%) da 3 esperimenti indipendenti. Per invasività,% ± SD acini con una o più celle sporgenti sono stati calcolati da 3 esperimenti indipendenti. cambiamento Fold è calcolato dividendo il valore medio ottenuto in condizioni di semi-rigidi o rigide per il valore corrispondente per condizioni native. valori di P calcolati utilizzando il test t di Student (α = 0,05).
Cellule PC3 coltivate su nativo RBM migrano, mantenendo costante il contatto cellula-cellula, mentre le cellule PC3 coltivate su ricchi di AGE (rigida) RBM mossa in modo indipendente l'una dall'altra (Figura 2A). Dopo 72 ore nelle cellule PC3 cultura formare foci (sferoidi) su nativo (PBS trattata) RBM, mentre le cellule PC3 sulla rigida (ricco di AGE) RBM Non da sferoidi e migrare in modo indipendente (Figura 2B). Cellule PC3 sulla rigida RBM (ricchi di AGE) sono più allungate rispetto alle cellule PC3 coltivate su nativo RBM (Figura 2C). Cellule PC3 sulla rigida meccanismi migrano più velocemente rispetto alle cellule PC3 coltivate su nativo RBM (Figura 2D). Cellule PC3 sulla rigida meccanismi mostrano una diminuzione della persistenza rispetto alle cellule PC3 coltivate su nativo RBM (Figura 2E).
Figura 2:. La migrazione delle cellule tumorali della prostata su Native e Stiff ricostituito membrana basale (RBM) (A) le immagini in campo chiaro di cellule PC3 coltivate su gel di meccanismi trattati con PBS (nativo) o 50 mm glicolaldeide per 14 ore (ricchi di AGE, rigido) . Le cellule sono state ripreso con un microscopio campo chiaro (obiettivo 10X) e un tasso di acquisizione di 1 immagine per ora per 12 ore seguita da cellule di monitoraggio per generare traiettorie. Immagini mostrati corrispondono ai punti di tempo dopo 0, 3, 6, 9 e 12 ore. Traiettorie delle singole celle sono indicati per il punto di tempo 12 hr. Barra di scala = 100 micron. Cellule (B) PC3 coltivati su meccanismi nativo o rigida per 72 ore, e ripreso come descritto nel pannello (A). Barra di scala = 100 micron. Particolare mostra area selezionata a 2X ingrandimento. (C) Media ± SD lunghezza cellulare (micron); differenza significativa tra i meccanismi nativi e rigido RBM (p = 1.2 x 10 -23). (
Discussion
Un protocollo per la generazione di acini ghiandolari 3D da MECs a puro gel rbm 6 è stato modificato in uno studio precedente con l'aggiunta di 4 mg tipo / ml collagene alla matrice MLF. L'aggiunta di collagene provocato il modulo elastico del gel meccanismi crescenti da 175 ± 37 al 1589 ± 380 Pascal. Questo aumento 9,1 volte della rigidità modulata la crescita, la sopravvivenza, la migrazione e la differenziazione delle MECs 21. Il protocollo è stato modificato nuovamente includendo una fase di trattamento con D - (-) - ribosio promuovere reticolazione non enzimatica del collagene di tipo I che era stato aggiunto al gel MLF. Il risultante aumento di 15 volte della rigidità è stato trovato a collaborare con la trasformazione oncogenica di MECs per promuovere il loro comportamento invasivo 22. L'approccio sperimentale di tipo aggiunta di collagene di gel RBM facilita l'interazione diretta di MECs con fibre di collagene, che si verifica solo nei tessuti umani dopo la barriera fisica tra lo stromaed epitelio fornite dal BM subisce degradazione proteolitica. Generando acini ghiandolari 3D da PEC in gel puro RBM pre-trattati con GLA, l'attuale protocollo apre la strada per studiare come BM rigidità di per sé in grado di attivare il loro comportamento invasivo (Figura 3). I livelli di BM rigidità indotte in questo protocollo hanno rilevanza fisiologica. L'incubazione con 50 mM GLA per 6 ore e 14 ore, rispettivamente aumentato i moduli elastici del gel puro meccanismi a 175 ± 90 e 322 ± 160 rispetto a 122 ± 55 Pascal in gel MLF trattati con PBS (Tabella 1). Questo aumento 1,7-3,2 volte in RBM rigidità ricapitola il 2,5 a 3,4 volte aumento della rigidità osservato in maligno della prostata rispetto al normale o tessuto di BPH 23-26. Come indicato in una recente pubblicazione 13 le variazioni morfologiche indotte da un accumulo di AGE e RBM rigidità PEC acini può essere quantificato per un cambiamento statisticamente significativo da arounded a forma poligonale, diminuzione del lume / superficie totale acinare, e le cellule sporgenti che migrano dal acina nel ricco-AGE RBM (Figura 3). Immunoblotting può anche essere utilizzato per valutare marcatori di EMT (ad esempio perdita di E-caderina 13) e il comportamento contrattili (es fosforilata leggera della miosina catena 2, pMLC2 13) in PEC coltivati in normale rispetto rigida MLF (Figura 3). Ulteriore valutazione usando immunofluorescenza e microscopia confocale può essere applicata per visualizzare il BM (es laminina, collagene IV e accumulo di AGE 13), cellulare polarità apicale-to-basale (es localizzazione apicale EEA1: primi endosomal antigene 1 e GM130: 130 kDa marcatore cis-Golgi 13) e modelli cellulari di molecole di adesione (es localizzazione e-caderina per giunzioni cellula-cellula 13) (Figura 3).
Figura 3:. Panoramica dei diversi protocolli qui presentati Il diagramma illustra come preparare e irrigidire la membrana basale ricostituita (RBM) con glicolaldeide (reazione di Maillard), come seme le cellule al rigida RBM, come analizzare la rigida RBM ( entità della reazione di Maillard) e le procedure che possono essere utilizzate per analizzare i cambiamenti cellulari e molecolari indotte da ricchi-AGE RBM. AGE, prodotti finali della glicazione avanzati; BM, membrana basale; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole; EEA1, presto antigene endosomal 1; GAPDH, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi; GLA, glicolaldeide; GEE, glicina estere etilico; GM130, 130 kDa marcatori cis-Golgi; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), miosina luce catena 2 fosforilata in siti treonina 18 e serina 19; RBM, membrana basale ricostituita; SDS-PAGE, sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide. Per la barra RWPE1 acini Scala = 10 micron; per cellule tumorali PC3bar sferoidi Scala = 100 micron. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 13. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
saranno necessari passaggi di risoluzione dei problemi se D - (-) - ribosio viene scelto come agente reticolante per RBM. Durante lo sviluppo del protocollo è stato trovato che il trattamento con 1 M D - (-) - ribosio per 72 ore, come precedentemente descritto per i gel RBM / collagene 22, portato alla disidratazione e ritiro del gel MLF. La valutazione delle concentrazioni inferiori di D - (-) - ribosio e tempi di trattamento più brevi può contribuire a superare questa limitazione.
Un potenziale limitazione future applicazioni del protocollo potrebbe essere incontrata in cui si desiderano livelli più alti di RBM rigidità. Se i tempi di incubazione più lunghi e concentrazioni più elevate di GLA vengono utilizzati per indurre livelli elevati di MLF gel rigidità sarà necessario valutare se tali condizioni di trattamento hanno un impatto sulla sopravvivenza e la proliferazione cellulare, come descritto in precedenza 13. Va inoltre notato che l'incubazione di RWPE-1 le cellule con siero induce una transizione EMT-like fenotipica e l'esposizione a siero o materiali contenenti siero deve essere evitato. Ad esempio, se gli esperimenti riguardano la transfezione di short interfering RNA oligonucleotidi (siRNA), la procedura deve essere ottimizzato usando le cellule RWPE-1 coltivate in KSFM, senza passare le cellule su un supporto a basso siero trasfezione. Questo inconveniente potrebbe compromettere il livello di silenziamento genico ottenuto utilizzando siRNA transitorio si avvicina nel modello. Per alcuni bersagli proteici che sarebbe stato consigliato di utilizzare vettori shRNA inducibili per sintonizzabile silenziamento genico e la diminuzione desiderata in livelli di proteine. Adattamenti che incorporano reticolazione enzimatica da cellule stromali o cellule tumorali lysyl associato ossidasi (LOX) 17 potrebbe anche essere incorporati in modelli futuri.
jove_content "> Questo protocollo faciliterà il futuro studio dei meccanismi pro-invasive attivati da età-dipendente BM rigidità PEC (RWPE-1, BPH-1) e la valutazione degli obiettivi anti-metastatici in PTC invasive (PC3). Dato che BPH è considerato come un disordine metabolico 27, questo protocollo spiana anche la strada verso la nostra migliore comprensione del legame tra disturbi del metabolismo e aumento del rischio di cancro alla prostata. Dato che BM rigidità indotta dalla sua esposizione alle età può essere un innesco per l'invasività in altro cancro tipi, sarà di interesse per utilizzare il protocollo per impostare modelli simili che incorporano normali cellule epiteliali e le cellule tumorali di altri organi (ad esempio seno, del colon, ovaie, pancreas).Passaggi critici all'interno del protocollo, insieme con i loro tempi, sono riassunte nella Figura 4. Durante la fase iniziale, è fondamentale per mantenere la soluzione stock di RBM a 4 ° C, mentre si scioglie per evitare che la sua polymerization. puntali delle pipette non devono essere inseriti nella soluzione rM magazzino fino a quando non sono state refrigerate a 4 ° C. Per il passo successivo è anche importante per garantire i vetrini camera sono equilibrati a 4 ° C prima di essere rivestiti con la soluzione RBM. Appena la temperatura della soluzione MLF è aumentata oltre 4 ° C che a polimerizzazione irreversibile per formare un gel. È essenziale che i meccanismi non è disturbato durante la fase di polimerizzazione per assicurare che forma una superficie piana adatto per coltura cellulare e analisi microscopica. La durata di incubazione con GLA, con o senza inibitori della reazione di Maillard (sodiocianoboroidruro e amingoguanidine) determinerà come il gel rigido RBM diventa. Si consiglia di utilizzare una incubazione 6 ore con GLA se sono richieste condizioni di semi-rigide, e l'incubazione 14 ore se sono necessarie condizioni rigide (Tabella 1). tempi di incubazione alternative o concentrazioni di GLA possono essere usati se diversi livellidi rigidità sono desiderato. In questo caso l'analisi reologiche del gel RBM devono essere incorporato come un passo essenziale. Dopo la fase di tempra reazione di Maillard mediante incubazione con GEE e le successive fasi di lavaggio con PBS, i gel RBM possono essere utilizzati immediatamente o conservati a 4 ° C per un massimo di 48 ore prima del loro utilizzo per colture cellulari. Una volta colture cellulari sono impostati è importante cambiare il terreno di coltura (compresi eventuali trattamenti) ogni due giorni. Si raccomanda di mantenere le colture cellulari 3D per 3-12 giorni secondo i parametri oggetto di indagine. Per 3D PEC acini si consiglia di analizzare le culture dopo 6 giorni, e per il 3D PTC sferoidi analisi è raccomandata dopo 3 giorni di coltura in prima istanza.
Figura 4:. Semplice Panoramica del protocollo con i punti critici e tempi indicati la floSchema w descrive come preparare e irrigidire la membrana basale ricostituita (RBM) con glicolaldeide (reazione di Maillard) con i punti critici e tempi indicati. Punti in cui il protocollo può essere fermato, e gel RBM conservato, sono indicati anche. RBM, membrana basale ricostituita; GLA, glicolaldeide; GEE, glicina estere etilico; ON, durante la notte; PBS, fosfato tamponata salina; RT, a temperatura ambiente. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I - Material for monolayer culture | |||
| BPH-1 | CaP Cell Line Database | PCaCL-132 | Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu |
| Complete keratinocyte serum-free media | ThermoFisher Scientific | 17005-075 | Do not warm at 37 ºC before use |
| Fetal calf serum | First Link UK Ltd | 02-00-850 | Store at -20 ºC in aliquots |
| PC3 | American Type Culture Collection | CRL-1435 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets | Oxoid | BR0014G | |
| RPMI 1640 medium | Sigma-Aldrich | R5886 | warm in 37 ºC water bath before use |
| RWPE-1 | American Type Culture Collection | CRL-11609 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| II - Material for 3D culture | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Aminoguanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 396494 | Irritating to eyes, respiratory system and skin |
| Chamber slides, 8-well | Thermo Scientific Nunc Lab-Tek | TKT-210-816M | |
| Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract | AMS Biotechnology | 3445-005-01 | Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots |
| Cyanogen bromide | Sigma-Aldrich | C91492 | Toxic by contact skin and inhalation |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) | Sigma-Aldrich | 50060 | Irritating to eyes |
| Glycolaldehyde dimer (GLA) | Sigma-Aldrich | G6805 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation |
| Syringe filter 0.22 microns | Appleton Woods | BC680 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| III - Material to quantify Maillard reaction | |||
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThemoFisher Scientific | D3571 | light sensitive and store at -20 ºC in aliquots |
| Cloning cylinders | Sigma-Aldrich | C1059 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11001 | light sensitive |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11034 | light sensitive |
| Goat serum | Abcam | ab7481 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Vectashield mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb | TransGenic Inc | KH012 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | F8775 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody | Acris Antibodies | R1041 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-laminin A/C pAb | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-7292 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dialysis cassette Slide-A-Lyzer | ThemoFisher Scientific | 66333 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IV - Equipment | |||
| ARG2 controlled strain rotational rheometer | T.A. Instruments | ||
| Axiovert S100 (20X magnification) microscope | Zeiss | ||
| CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope | Solent Scientific | ||
| Confocal Axiovert 200M (40X, 63X magnification) microscope | Zeiss | ||
| Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast | Olympus | ||
| PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer | BMG Labtech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| V - Software | |||
| Image J 1.47v | National Institute of Health, USA | ||
| MetaXpress | Molecular Divices |
References
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