Summary
Nous expliquons ici un protocole pour la modélisation du micro-environnement biophysique où la réticulation et une plus grande rigidité de la membrane basale (BM) induite par les produits de glycation avancée (AGE) ont une pertinence pathologique.
Abstract
Nous décrivons ici un protocole qui peut être utilisé pour étudier le microenvironnement biophysiques liés à l' augmentation de l' épaisseur et la rigidité de la membrane basale (BM) au cours de pathologies liées à l' âge et les troubles métaboliques (par exemple , le cancer, le diabète, la maladie microvasculaire, la rétinopathie, la néphropathie et la neuropathie) . La prémisse du modèle est la réticulation non enzymatique de la matrice BM reconstituée (RBM) par traitement avec glycolaldéhyde (GLA) pour promouvoir avancée glycation produit final (AGE) génération par la réaction de Maillard. Des exemples de techniques de laboratoire qui peuvent être utilisés pour confirmer la production d'AGE, réticulation non enzymatique et une rigidité accrue dans GLA traitées FrP sont décrites. Ceux-ci comprennent la préparation de la GAR native (traitée avec un tampon phosphate salin, PBS) et raide RBM (traité avec GLA) pour la détermination de: sa teneur en AGE par analyse photométrique et de la microscopie par immunofluorescence, sa réticulation non enzymatique par le sulfate de dodécyle sodium polyacrylamideune électrophorèse sur gel (SDS PAGE), ainsi que la microscopie confocale, et sa rigidité augmentée à l'aide rhéométrie. La procédure décrite ici peut être utilisée pour augmenter la rigidité (module élastique, E) de la GAR jusqu'à 3,2 fois, en accord avec les mesures effectuées en bonne santé par rapport à un tissu malade de la prostate humaine. Pour recréer le microenvironnement biophysique associé au vieillissement et de la prostate malade glande trois types de cellules de la prostate ont été introduites sur FrP native et raide RBM: RWPE-1, les cellules épithéliales de la prostate (CBV) provenant d'une glande de la prostate normale; BPH-1, Pecs dérivés d'une glande de la prostate affectée par l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP); et PC3, des cellules métastatiques dérivées d'une tumeur osseuse secondaire provenant d'un cancer de la prostate. Plusieurs paramètres peuvent être mesurés, y compris la taille, la forme et les caractéristiques invasives du acini glandulaires 3D formé par RWPE-1 et BPH-1 sur native par rapport raide FrP, et la longueur moyenne des cellules, la vitesse de migration et de la persistance du mouvement des cellules de Spher 3DOID formés par des cellules PC3 dans les mêmes conditions. voies et la localisation subcellulaire des protéines de signalisation cellulaire peut également être évaluée.
Protocol
1. Induction de la BM Rigidité induite par le traitement GLA (Réticulation non enzymatique)
- Décongeler une fiole congelée de la matrice BM (10 ml) par incubation à 4 ° C (debout sur la glace dans une chambre froide ou un réfrigérateur) liquide jusqu'à ce que le contenu de la fiole sont devenues (8-16 h).
Attention: Si une chambre froide / réfrigérateur est pas utilisé, couvrir l'ensemble de la bouteille avec de la glace. Cela permettra d'éviter la solution mère de BM de se solidifier. - Pour les expériences futures et d'éviter les cycles de congélation-décongélation répétés, préparer 25 x 0,4 ml aliquotes de chaque nouveau flacon de 10 ml de la matrice BM. flacons de conserver à -80 ° C jusqu'à la date de péremption indiquée par le fabricant. En cas de besoin, décongeler flacons à 4 ° C, debout sur la glace pendant 2 heures.
- Préparer une surface plane de glace. Placer un 8 puits lame de verre de la chambre au-dessus de la glace pour maintenir une température de 4 ° C pendant la procédure de revêtement. Décongelez un flacon de matrice BM à 4 ° C.
Note: Un 0,4 ml flacon de matrice BM est suffisante pour coat toute une lame de chambre 1 x 8 puits. Conserver le flacon couvert de glace lors de la manipulation pour empêcher la matrice BM de se solidifier. - Coupez l'extrémité de distribution d'une pointe de pipette 200 pi en utilisant des ciseaux. Refroidir la pointe de la pipette 200 ul émoussée à 4 ° C et le placer sur une aide capacité de pipetage 200 pi. Prenez 40 pi de la solution de matrice BM froid dans la pointe de la pipette et le transférer dans un puits sur le 8 puits lame de verre de la chambre froide.
Remarque: 40 pl de solution BM est suffisante pour couvrir une surface de 0,8 cm2. Gardez les embouts de pipette réfrigérés pendant la procédure de revêtement pour éviter la solidification de la solution BM. Ne pas introduire de bulles d'air dans la solution de matrice BM et veiller à ce que le puits est uniformément recouvert sans la formation d'un ménisque visible sur les bords. - Répétez l'étape 1.4, selon le nombre de puits et les chambres requises.
- Après le revêtement, placer la chambre diapositive 8 puits à 37 ° C pendant 30 min pour favoriser la polymérisationdu BM. Fermez la porte de l'incubateur très soigneusement pour éviter toute perturbation indésirable de l'FrP liquide. Ne pas dépasser les 30 min temps d'incubation pour éviter la déshydratation du gel RBM.
Remarque: Le gel obtenu est le natif BM reconstitué (RBM). C étape d' incubation de 37 ° ne nécessite pas 5% de CO 2. Cependant, pour la commodité d' effectuer cette étape dans un incubateur de culture de tissu fixée à 37 ° C et 5% de CO 2 (avec humidification). - Préparer glycolaldéhyde 50 mM (GLA) dilué dans 0,2 M de tampon phosphate (pH 7,8). Stériliser la solution par passage à travers un filtre à seringue de 0,22 micron en utilisant une seringue de 50 ml.
- Pour une réaction de réticulation dans un volume final de 250 ul de mM GLA 50, ajouter 25 ul de cyanoborohydrure de sodium 0,5 M ou 2,5 M aminoguanidine à 125 ul de mM GLA 100 (2x de stock) et 100 ul de tampon phosphate 0,2 M (pH 7,8 ). Stériliser les solutions mères en les faisant passer à travers un filtre à seringue de 0,22 micron en utilisant une seringue de 50 ml.
Attention: Manipuler cyanoborohydrure de sodium portant une blouse de laboratoire, des gants, un masque facial et un respirateur tout en travaillant dans une hotte.
- Pour une réaction de réticulation dans un volume final de 250 ul de mM GLA 50, ajouter 25 ul de cyanoborohydrure de sodium 0,5 M ou 2,5 M aminoguanidine à 125 ul de mM GLA 100 (2x de stock) et 100 ul de tampon phosphate 0,2 M (pH 7,8 ). Stériliser les solutions mères en les faisant passer à travers un filtre à seringue de 0,22 micron en utilisant une seringue de 50 ml.
- Ajouter 250 pi de solution GLA pour couvrir le gel FrP polymérisé et incuber à 37 ° C pendant 6 heures pour produire un gel semi-rigide FrP ou 14 h pour produire un gel FrP raide.
Remarque: Le volume de GLA ajouté doit couvrir le gel FrP polymérisé et doit être ajustée en conséquence. Si différents temps d'incubation GLA sont utilisés, les gels RBM doivent être analysés pour déterminer le pli-augmentation de la raideur FrP (voir l'étape 2.4).- Préparer un contrôle négatif en incubant un gel FrP natif dans 250 pi de phosphate saline stérile tamponnée (PBS) pendant 14 heures à 37 ° C.
- Préparer deux commandes supplémentaires où la formation de base de Schiff ou le produit d'addition d'Amadori réarrangement durant la réaction de reticulation est inhibée par l'addition de cyanoborohydrure de sodium 50 mM ou 250 mM aminoguanidine.
- Préparer glycine 1 M eester thyl (GEE) dilué dans du PBS. Stériliser la solution par passage à travers un filtre à seringue de 0,22 micron en utilisant une seringue de 50 ml.
- Après le temps d'incubation indiqué, retirez soigneusement la solution GLA des gels RBM réticulés, solution GLA contenant des inhibiteurs des gels de RBM de contrôle et PBS à partir du contrôle des gels natifs RBM. Ajouter 250 pi de solution GEE à tous les gels RBM et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
Remarque: Cette étape désaltère la réaction de réticulation. - Lavez tous les gels RBM 10 fois dans 500 pi de PBS pour éliminer toute trace de GLA et GEE. Incuber les gels GAR pendant une nuit à 37 ° C dans 400 ul de PBS afin d'éviter leur déshydratation.
- Analyser les gels RBM pour l'accumulation d'AGE, réticulation non enzymatique et viscoélastiques propriétés (étapes 2.1-2.4). Pour l'analyse rhéologique de leurs propriétés viscoélastiques préparer les gels GAR dans des anneaux de clonage (étape 2.4).
- Pour la culture cellulaire, rincer gels RBM 2 fois avec 500 culture ul media avant l'ensemencement des cellules (étapes 5 et 6). Effectuer des lavages en douceur sans la pointe de pipette de toucher la surface du gel.
2. Quantification des non-Enzymatic Réticulation et Rigidité de la GAR traitée avec GLA
- Analyse photométrique
- Mesurer l'accumulation d'AGE dans GLA-traités et contrôler les gels RBM en utilisant l'analyse photométrique pour déterminer l'étendue de la réaction de Maillard.
- Après l'étape 1.11, retirez le PBS à partir de gels RBM dans les coulisses de la chambre 8-puits et ajouter 250 pi d'eau glacée doublement distillée. Incuber à 4 ° C pendant 16 à 24 heures pour s'assurer que la matrice est complètement liquéfié.
Note: les peptides GAR dans cette solution contiennent AGEs avec des propriétés d'auto-fluorescent. - Transférer la solution BM liquéfié dans un tube de 1,5 ml et on mesure l'émission de fluorescence de la solution à l'aide d'un spectrophotomètre (longueur d'onde d'excitation = 370 nm; longueur d'onde d'émission = 440 nm).
- Après l'étape 1.11, retirez le PBS à partir de gels RBM dans les coulisses de la chambre 8-puits et ajouter 250 pi d'eau glacée doublement distillée. Incuber à 4 ° C pendant 16 à 24 heures pour s'assurer que la matrice est complètement liquéfié.
- Mesurer l'accumulation d'AGE dans GLA-traités et contrôler les gels RBM en utilisant l'analyse photométrique pour déterminer l'étendue de la réaction de Maillard.
- SDS-PAGE Analyse de bromure de cyanogène Peptides
- Résoudre les gels GLA-traités et le contrôle RBM sur un gel de polyacrylamide pour confirmer que l'AGL a induit la réticulation et la formation de macro-fibres.
- Centrifuger la solution BM liquéfié recueillies à l'étape 2.1.1.2 à 10.000 xg pendant 5 min à température ambiante.
- Préparer une solution mère contenant 2 g / ml de bromure de cyanogène dilué dans l'acétonitrile.
Attention: Toujours manipuler le bromure de cyanogène dans une hotte, tout en portant une blouse de laboratoire, des gants, un masque facial et un respirateur. - Éliminer le surnageant, remettre en suspension le culot de gel BM dans 500 ul de 20 mg / ml de bromure de cyanogène + 70% v / v d'acide formique et on incube pendant une nuit à température ambiante.
- Utiliser une seringue de 1 ml à usage unique pour transférer le BM gel culot remis en suspension dans une cassette de dialyse ayant une masse moléculaire 3,5 kDa coupé.
- Immerger la cassette dans un bécher en verre de 500 ml contenant 500 ml d'eau distillée deux fois et une barre d'agitation magnétique.Placez ce sur un agitateur magnétique et dialyser pendant une nuit (16 heures) à 4 ° C (dans une chambre froide) pour éliminer toute trace de bromure de cyanogène et de l'acide formique.
- Utiliser une seringue de 1 ml à usage unique pour transférer la solution dialysée BM à partir de la cassette dans un tube de 1,5 ml.
- Analyse 25 pi de chaque échantillon sur un BM 12% v / v de gel de polyacrylamide 10,11. À la suite de SDS-PAGE, effectuer coloration à l' argent du gel de polyacrylamide à 12 pour visualiser le motif électrophorétique de peptides au bromure de cyanogène 13 matrice.
- Résoudre les gels GLA-traités et le contrôle RBM sur un gel de polyacrylamide pour confirmer que l'AGL a induit la réticulation et la formation de macro-fibres.
- Analyse d'immunofluorescence Microscopie
- Effectuer immunofluorescence du GLA traité et le contrôle des gels RBM avec anti-AGE / pentosidine, anti-collagène IV et des anticorps anti-laminine suivie par microscopie confocale pour visualiser les AGEs accumulées et le collagène IV / fibre de laminine réarrangements structuraux dans le FrP réticulé gels 13.
Remarque: Utilisez toujours un volume suffisant pour couvrir le entire gel de RBM au cours des incubations et lavages sans toucher la surface FrP avec la pointe de la pipette. Pour plus de détails sur l' analyse des cultures acini 3D par immunofluorescence voir la référence 6 et pour la microscopie confocale de acini 3D voir la référence 14.- Wash GLA traitée et gels de contrôle de la GAR dans les diapositives de la chambre 8-puits 2 fois avec 300 pi de PBS + (PBS contenant 0,1 mM de CaCl2 et 0,5 mM de MgCl2) pendant 5 min à température ambiante.
- Retirez le PBS + puis ajouter 300 pi de 4% p / v de paraformaldehyde (PFA) dilué dans du PBS + pour couvrir chaque gel RBM. Incuber pendant 30 min à température ambiante pour fixer les composants RBM.
- Retirer les 4% p / v solution PFA. Ajouter ajouter 300 pi de mM NH 4 Cl + mM MgCl 0,5 2 solution 75 et incuber pendant 5 min à température ambiante (répéter 5x) pour étancher la fixation.
- Préparer un tampon d' immunofluorescence (IF tampon) en faisant la solution suivante dans l' eau stérile: NaCl 130, 7 mM Na 2 HPO 4, mM NaH 3.52 PO 4, 7,7 mM de NaN 3 à 0,1% en poids / volume d' albumine de sérum bovin, 0,5% v / v de polyéthylèneglycol et l' éther tert - octylphényle 0,05% v / v de polyethylene glycol monolaurate de .
- Préparer IF tampon de blocage en le complétant IF tampon avec 20% de sérum de chèvre v / v.
- Retirer la solution de trempe et ajouter 300 pi de tampon de blocage IF aux gels RBM pour empêcher des réactions non spécifiques. Incuber 2 h à température ambiante sur une plate-forme de trembler.
- Retirez le tampon de blocage IF et incuber les gels RBM pour 16 heures à 4 ° C avec 300 pi d'anticorps primaire dilué dans IF tampon de blocage (1: 500 souris anti-pentosidine mAb; 1/250 de lapin anti-collagène IV pAb; 1 / 250 lapin anti-laminine A / C pAb).
Note: incubations pendant plus de 20 heures à 4 ° C peut mixer le RBM. - Retirer l'anticorps primaire et laver 3 fois (10 min chacun) avec 300 pi de tampon SI à la température ambiante sur une plate-forme de trembler.
- Retirer le tampon IF etajouter 300 ul de l'anticorps secondaire (chèvre anti-lapin ou anti-IgG de souris [H + L]) conjugués à un fluorochrome dilué à 1: 500 dans du tampon de blocage IF. Incuber pendant 2 heures à température ambiante sur une plate-forme de trembler.
- Éliminer l'anticorps secondaire et laisser incuber dans 300 ul de tampon SI pendant 10 min à température ambiante. Retirer le tampon IF et laver 3 x 10 min dans 300 pi de PBS + à la température ambiante.
- Fix et étancher une seconde fois, comme décrit ci-dessus (étapes 2.3.1.2 et 2.3.1.3).
- Monter gels RBM colorés dans les milieux de montage et d'analyser la formation de faisceaux denses de composants majeurs utilisant épifluorescence ou la microscopie confocale.
Remarque: Pour plus de détails sur l' analyse de cultures acini 3D par immunofluorescence voir référence 6 et pour épifluorescence et la microscopie confocale de acini 3D , voir référence 14.
- Effectuer immunofluorescence du GLA traité et le contrôle des gels RBM avec anti-AGE / pentosidine, anti-collagène IV et des anticorps anti-laminine suivie par microscopie confocale pour visualiser les AGEs accumulées et le collagène IV / fibre de laminine réarrangements structuraux dans le FrP réticulé gels 13.
- Analyse rhéologique
- Effectuer une analyse rhéologique de GLA traitée et contrôler les gels RBM pour mesurer leur viscoelasticity (rigidité).
- Mettre en place des gels de RBM qui sont 1 mm d'épaisseur dans un moule circulaire avec un diamètre de 8 mm. Pour ce faire, placez un anneau de clonage (8 mm de diamètre) à l'intérieur d'un puits d'une plaque de culture 24 puits et ajouter BM solution de matrice préparée comme décrit dans les étapes 1,3-1,6.
Remarque: Pour la récapitulation précise des gels RBM utilisés pour les expériences, les gels RBM préparées pour l'analyse rhéologique besoin d'avoir la même surface et épaisseur que les gels RBM mis en place dans les chambres 8 puits. Les gels RBM analysés à la figure 3 étaient de 1 mm d' épaisseur et 8 mm de diamètre. - Traiter les gels RBM mis en place dans les anneaux de clonage avec PBS, GLA pendant 6 heures et GLA pendant 14 heures comme décrit ci-dessus (étapes 1.8 à 1.11).
- Mesurer le module d'élasticité (E) du diamètre de 8 mm gels RBM sur un rhéomètre avec un 8 mm plaque parallèle géométrie en dents de scie, sur une plage de 1-3% de déformation, à une fréquence d'oscillation fixe de 1 Hz et la température de 21 ° C. Pour plus de détails au sujet de laanalyse rhéologique des gels d'ECM voir les références , voir 13,15,16 de référence.
Note: E est déterminé à partir du résultat module de stockage de cisaillement (G ') à l'aide de l'équation suivante : E = 2 * G * (1 + v) où v est le coefficient de Poisson de 0,5, tel que décrit en référence 13,15 , 16.
- Mettre en place des gels de RBM qui sont 1 mm d'épaisseur dans un moule circulaire avec un diamètre de 8 mm. Pour ce faire, placez un anneau de clonage (8 mm de diamètre) à l'intérieur d'un puits d'une plaque de culture 24 puits et ajouter BM solution de matrice préparée comme décrit dans les étapes 1,3-1,6.
- Effectuer une analyse rhéologique de GLA traitée et contrôler les gels RBM pour mesurer leur viscoelasticity (rigidité).
3. Culture et la manipulation de la ligne normale PEC, RWPE-1
- Cultiver RWPE-1 des cellules dans un milieu sans sérum des kératinocytes (KSFM) supplémenté avec 5 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF), le / ml d'extrait pituitaire bovin 50 ug (BPE) et 50 U / ml de pénicilline à 50 ug / ml de streptomycine ( compléter KSFM).
Remarque: Pour éviter l'induction de épithéliale-mésenchymateuse (EMT) -comme transition ne pas exposer les cellules RWPE-1 au sérum. Laisser complète KSFM pour atteindre la température ambiante pendant 30 minutes après avoir retiré du stockage à 4 ° C et ne pas chaud dans un bain-marie à 37 °, comme cela inactiver le FEM et BPE. - Aspirer le completKSFM à partir d' une plaque de 2 cm 10 confluentes de cellules RWPE-1, rincer avec 5 ml de PBS préchauffé et ajouter 5 ml de 0,05% v / v de trypsine faire en sorte que toutes les cellules sont traitées avec la solution.
- Placer les cellules dans un incubateur de culture tissulaire fixé à des conditions standard de 37 ° C et 5% de CO 2 (avec humidification) pendant 5 à 10 minutes. Vérifiez l'étendue de la trypsine après 5 min et tapotez doucement la plaque de culture pour détacher les cellules.
Note: RWPE-1 cellules ne tolèrent pas de longues périodes de trypsinisation il est donc conseillé de ne pas traiter plus de deux plaques en même temps. Il est également important de dissocier l'ensemble des cellules de la plaque pour éviter la sélection clonale.
- Placer les cellules dans un incubateur de culture tissulaire fixé à des conditions standard de 37 ° C et 5% de CO 2 (avec humidification) pendant 5 à 10 minutes. Vérifiez l'étendue de la trypsine après 5 min et tapotez doucement la plaque de culture pour détacher les cellules.
- Lorsque toutes les cellules RWPE-1 ont dissociées, ajouter 5 ml de PBS chaud contenant 2% v / v de sérum de veau fœtal (FCS) pour étancher la trypsine. pipette doucement vers le haut et vers le bas pour briser les agrégats de cellules avant de transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse.
- Centrifuger les cellules dissociées à 125-150 xg pendant 5 min à 25 ° C, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de KSFM complète jusqu'à ce qu'une suspension de cellules uniques est obtenue.
- Transfert 1 ml des cellules remises en suspension dans un nouveau tube et ajouter 9 ml de KSFM complète pour propager les cellules à un 1: passage dilution 5 pour une utilisation expérimentale ultérieure. Comptez le reste des cellules en utilisant un hémocytomètre pour la mise en place acini (voir section 5.1).
Note: Ne pas la culture RWPE-1 cellules pour plus de 10 passages depuis après de longues périodes de culture , ils ne forment pas acini avec l'architecture correcte. - Changer les milieux de culture toutes les 48 heures pour assurer le FEM et BPE restent actives.
Remarque: Intégrer ce changement de milieu pour tous les traitements qui vont au-delà de 48 heures.
4. Culture et la manipulation de l'HBP Cell Line, BPH-1
- Culture BPH-1 des cellules dans du milieu RPMI 1640 complété avec 5% v / v de FCS, 50 U / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine. Réchauffer lades milieux de culture, du PBS et 0,25% p / v de solution de trypsine-EDTA à 0,53 M à 37 ° C avant utilisation.
Note: Les cellules peuvent également être cultivées dans des milieux avec 2,5% v / v de FCS 8. - Aspirer le milieu de culture à partir d' un cm 2 plaques confluentes 10 de BPH-1 cellules et laver les cellules 2 x avec 3 ml de PBS pour éliminer toutes les traces de milieux de culture avec du sérum qui peut étancher la réaction de la trypsine.
- Aspirer le PBS et ajouter 3 ml de solution de trypsine-EDTA pour couvrir les cellules. Placer la plaque dans un incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO 2 (avec humidification) pendant 5 min. Retirer la solution de trypsine-EDTA lorsque les cellules sont rondes, mais restent attachés au plat. Laver les cellules avec 5 ml de PBS.
- Après élimination du PBS, ajouter 5 ml de milieux de culture et doucement la pipette de haut en bas pour produire une suspension de cellules individuelles. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml.
- Prendre 2 ml de la suspension cellulaire dans un nouveau tube de centrifugeuse avec 8 ml de milieu complet et plaque les BPH-1 cellules Ontariooa 10 cm 2 plaque de culture à 1: passage dilution 5 pour une utilisation expérimentale ultérieure. Comptez le reste des cellules en utilisant un hémocytomètre pour la mise en place acini (voir section 5.2).
Remarque: Gardez une trace du nombre de passage, comme des cellules BPH-1 âgées ne forment pas acini avec une architecture appropriée. Un certain nombre de passage de plus de 10 on ne souhaite pas. - Changer les milieux de culture tous les 72 heures.
5. 3D Culture de Prostate Acini sur FrP autochtones et Stiff
- Si RWPE-1 des cellules sont utilisées pour former acini, diluer 5000 cellules préparée à l'étape 3.5 dans 300 pi de toutes KSFM additionné de 2% v / v de la solution BM.
- Si les cellules HPB-1 sont utilisées pour former acini, diluer 2500 cellules préparées à l'étape 4.5 dans 300 pi de RPMI 1640 un milieu de culture additionné de 2% v / v de la solution BM.
Note: HBP-1 cellules sont plus grandes que RWPE-1 cellules de sorte que les numéros inférieurs de l'HBP-1 cellules sont utilisées pour obtenir une distribution similaire des acini après 6 jours de culture. - Ensemencer délicatement les cellules sur la FrP native et AGE-raidi et placer soigneusement les cultures dans un incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO 2 (avec humidification) pour assurer une répartition uniforme des acini de plus en plus dans le puits et que chaque cellule se divise pour produire un acina.
- Tous les 2 jours remplacer le milieu de culture avec un milieu de culture frais contenant de la solution v / v BM 2% pour s'assurer que les cellules sont des facteurs de croissance nécessaires à la normale acina homéostasie.
- Surveiller acineuses morphologie des cultures en croissance à l' aide de la microscopie en fond clair 13.
Remarque: Après 3 jours de culture des cellules individuelles formeront un groupe de> 3 cellules et après 1 semaine de la prostate acini avec un diamètre de ~ 50 um seront observées. - Suivre le protocole décrit dans le paragraphe 2.3 pour effectuer immunofluorescence en utilisant des anticorps spécifiques pour les marqueurs de cellules-matrice adhérences, des adhérences cellulaires, les cellules basales de polarité apico-invasivité et 13.
6. 3D Culture de la prostate Agrégats de cellules tumorales sur FrP autochtones et Stiff
- la culture de cellules PC3 dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% v / v de FCS et 50 U / ml de pénicilline à 50 ug / ml de streptomycine. Chauffer le milieu de culture, du PBS et 0,25% p / v de solution de trypsine-EDTA à 0,53 M à 37 ° C avant utilisation.
- Aspirer le milieu de culture à partir d' un plat de cellules PC3 de culture confluentes 10 cm 2 et laver les cellules 2x avec 3 ml de PBS pour éliminer toute trace de FCS qui peut étancher la réaction de la trypsine.
- Aspirer le PBS et ajouter 3 ml de solution de trypsine-EDTA pour couvrir les cellules et incuber pendant 1 min.
- Lorsque les cellules deviennent arrondies, mais restent attachés au plat, aspirer soigneusement la solution de trypsine-EDTA et laver avec 3 ml de PBS àenlever toutes les traces de la trypsine.
- Après élimination du PBS, ajouter 5 ml de milieux de culture et doucement la pipette de haut en bas pour produire une suspension de cellules individuelles. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml.
- Prélever 1 ml de la suspension de cellules PC3 dans un nouveau tube de centrifugeuse et ajouter 9 ml de milieu de culture. Plaque les cellules sur une boîte de 10 cm 2 de culture (dilution 1:10) pour une utilisation expérimentale ultérieure. Compter les cellules restantes en utilisant un hémocytomètre.
- Diluer 2500 cellules PC3 préparé à l'étape 6.6 dans 300 pi de RPMI 1640 un milieu de culture additionné de 2% v / v de la solution BM pour permettre la formation d'un gel à gradient dans la culture.
- Ensemencer délicatement les cellules sur la FrP native et AGE-raidi et placer soigneusement la culture dans l'incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO 2 (avec humidification) pour assurer une distribution de sphéroïdes de plus en plus dans le puits.
- Changer les milieux de culture tous les 72 heures.
- Pour étudier l'effet de raideur (AGE-riche) FrPsur la migration des cellules tumorales de la prostate, des cellules PC3 d'image en utilisant fond clair vidéo Vidéomicroscopie en utilisant la température / CO 2 de contrôle et une chambre humidifiée 17.
Remarque: les cellules PC3 poussent en brins sur FrP native et ne forment pas acini avec une lumière, mais si on les laisse croître de plus de 72 heures sur native FrP ils formeront sphéroïdes 3D. - Suite à l' acquisition de données, le suivi manuel des cellules PC3 et calculer leur vitesse de migration, la forme (rapport d'allongement) et la persistance de la migration 17-19.
Note: Persistance = rapport D / T, D = distance du début à la fin de la trajectoire de la cellule, T = longueur totale de la trajectoire de la cellule.
Representative Results
3D Prostate Acini Cultured sur Stiff FrP
Après 6 jours de culture, PECs dérivées d' un tissu normal de la prostate (RWPE-1) (figure 1A) et le tissu de BPH (HBP-1) (figure 1B) forme acini sur native (PBS traité) FrP qui sont organisés en sphéroïdes uniformes épithéliales cellules. Ces acini ont aussi les caractéristiques de PECs hautement organisées avec apical à base de polarité et un luminal visible l' espace 13,20.
Le acini formé par PECs dérivées de tissus de la prostate normale (RWPE-1) (figure 1A) et le tissu de BPH (HBP-1) (figure 1B) sur raidi RBM (AGE-riche) (traité avec GLA) ont une architecture perturbée (décalage de sphéroïde à forme polygonale et les cellules en saillie / migration de l'acini dans l'AGE riche RBM) (figure 1A). Ces acini sont également caractérisés par PECs très désorganisés qui ont perdu leur polarité apicale à base d'une petite ou inexistante espace luminal 13.
Figure 1:. Les cellules de la prostate épithéliales Grown comme 3D glandulaire Acini sur autochtone et Stiff Sous - sol Reconstitué Membrane (RBM) (A) images fond clair de RWPE-1 des cellules cultivées pendant 12 heures jusqu'à 6 jours sur des gels RBM traités avec du PBS (native) ou 50 mM glycolaldéhyde pendant 14 heures (AGE-riche, raide); Barre d'échelle = 50 pm. (B) HBP-1 cellules, cultivées comme décrit dans la partie A; Barres d'échelle = 50 pm; données sont représentatives de 3 expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Tableau 1:. Caractéristiques de la prostate épithéliale RWPE-1 acini Cultivé sur Native, semi-rigide et Stiff Sous - sol Reconstitué Membrane (RBM) RWPE-1 acini ont été cultivées sur FrP pré-traitée avec du PBS pendant 14 heures (native), glycolaldéhyde (GLA ) pendant 6 h (semi-rigide) ou GLA pendant 14 heures (raide). Pour la forme acineuses, le pourcentage (%) ± écart-type (SD) du tour, acini semi-polygonale et polygonale ont été calculées à partir de 5 expériences indépendantes (50 acini quantifiées par condition). Taille acineuses relative a été calculée (natif FrP = 100%) à partir de 3 expériences indépendantes. Pour invasivité,% ± écart-type acini avec une ou plusieurs cellules en saillie ont été calculées à partir de 3 expériences indépendantes. Fold changement est calculé en divisant la valeur moyenne obtenue dans des conditions de semi-rigides ou rigides par la valeur correspondante pour les conditions natives. Les valeurs de P calculées en utilisant le test t de Student (α = 0,05).
Cellules PC3 cultivées sur natif FrP migrent en maintenant un contact continu de cellule à cellule, tandis que les cellules PC3 cultivées sur AGE riche (raide) FrP se déplacent indépendamment les uns des autres (figure 2A). Après 72 h en culture des cellules PC3 forment des foyers (sphéroïdes) sur natif (PBS traité) FrP, tandis que les cellules PC3 sur rigide (AGE-riche) FrP ne le font pas de sphéroïdes et migrent indépendamment (figure 2B). Cellules PC3 sur rigide (AGE-riche) FrP sont plus allongées que les cellules PC3 cultivées sur FrP native (figure 2C). Cellules PC3 sur raide FrP migrent plus rapidement que les cellules PC3 cultivées sur FrP native (figure 2D). Cellules PC3 sur raides FrP affichent une diminution de la persistance par rapport aux cellules PC3 cultivées sur FrP native (Figure 2F).
Figure 2:. Prostate Migration des cellules tumorales sur les autochtones et Stiff Sous - sol Reconstitué Membrane (RBM) (A) images fond clair de cellules PC3 cultivées sur des gels RBM traités avec du PBS (native) ou 50 mM glycolaldéhyde pendant 14 heures (AGE-riche, raide) . Les cellules ont été imagées en utilisant un microscope à fond clair (objectif 10X) et un taux d'acquisition de 1 image par heure pendant 12 heures suivie de suivi pour générer des trajectoires cellule. Les images présentées correspondent aux points de temps après 0, 3, 6, 9 et 12 heures. Trajectoires de cellules uniques sont présentées pour le point de temps de 12 heures. Barre d'échelle = 100 um. Cellules (B) PC3 cultivées sur FrP native ou raide pendant 72 heures, et imagés comme décrit dans le panneau (A). Barre d'échelle = 100 um. Détail montre la zone sélectionnée à 2X grossissement. (C) moyenne ± SD longueur de la cellule (um); différence significative entre FrP native et raide FrP (p = 1,2 x 10 -23). (
Discussion
Un protocole pour la génération d'acini glandulaires 3D à partir de MECs dans des gels RBM purs 6 a été modifié dans une étude précédente par l'addition de 4 mg / ml de type collagène à la matrice RBM. L'addition de collagène a entraîné le module d'élasticité du gel RBM passant de 175 ± 37 à 1589 ± 380 pascals. Cette augmentation de 9,1 fois la rigidité modulée de la croissance, la survie, la migration et la différenciation des MECs 21. Le protocole a été modifié à nouveau en incluant une étape de traitement avec la D - (-) - ribose pour favoriser la réticulation non-enzymatique du collagène de type I qui a été ajouté au gel GAR. L'augmentation de 15 fois résultante de la rigidité a été trouvé à coopérer avec la transformation oncogénique de MECs pour promouvoir leur comportement invasif 22. L'approche expérimentale de Type ajoutant collagène à des gels RBM facilite l'interaction directe de MECs avec des fibres de collagène, ce qui ne se produit dans le tissu humain après la barrière physique entre le stromaet de l'épithélium fourni par le BM subit une dégradation protéolytique. En générant acini glandulaires 3D à partir de Pécs en gels RBM purs pré-traités avec GLA, le protocole actuel ouvre la voie à étudier la façon dont BM rigidité en soi peut déclencher leur comportement invasif (Figure 3). Les niveaux de rigidité BM induites dans ce protocole ont une pertinence physiologique. L' incubation avec mM GLA 50 pendant 6 h et 14 h respectivement augmenté les modules élastiques du gel FrP pur à 175 ± 90 et 322 ± 160 par rapport à 122 ± 55 Pascals dans des gels RBM traités avec du PBS (tableau 1). Cette augmentation de 1,7 à 3,2 fois la rigidité FrP récapitule le 2.5- à 3,4 fois-augmentation de la rigidité observée dans maligne par rapport à la prostate normale ou le tissu de BPH 23-26. Comme il est indiqué dans une publication récente 13 , les changements morphologiques induits par l'accumulation d'AGE et FrP raideur dans PEC acini peuvent être quantifiés pour un changement statistiquement significative par rapport arondée de forme polygonale, une diminution de luminal / zone acineuses totale, et les cellules en saillie qui migrent du acina dans le ÂGE riche RBM (Figure 3). Immunotransfert peut également être utilisé pour évaluer les marqueurs de EMT (par exemple perte de E-cadhérine 13) et le comportement contractile (par exemple , la lumière de la myosine phosphorylée chaîne 2, pMLC2 13) à Pécs cultivées dans des conditions normales par rapport à raide FrP (Figure 3). Une évaluation plus poussée en utilisant une coloration immunofluorescente et la microscopie confocale peut être utilisé pour visualiser le BM (par exemple , la laminine, le collagène IV et AGE accumulation 13), la polarité apicale à base cellulaire (par exemple la localisation apicale ROE1: antigène endosomique précoce 1 et GM130: 130 kDa cis-Golgi marqueur 13) et des modèles cellulaires de molécules d'adhésion (par exemple E-cadhérine localisation aux jonctions cellule-cellule 13) (figure 3).
Figure 3:. Vue d' ensemble des différents protocoles présentés ici Le diagramme décrit comment préparer et raidir la membrane basale reconstituée (RBM) avec glycolaldéhyde (réaction de Maillard), comment semer des cellules sur le FrP raide, comment analyser l'FrP rigide ( étendue de la réaction de Maillard) et des procédures qui peuvent être utilisées pour analyser les changements cellulaires et moléculaires induits par AGE riches RBM. AGE, produits de glycation avancée; BM, la membrane basale; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole; EEA1, antigène précoce endosomal 1; GAPDH, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase; GLA, glycolaldéhyde; GEE, l'ester éthylique de la glycine; GM130, 130 kDa marqueurs cis-Golgi; chaîne légère 2 p-MLC2 (Thr18 / SER19), myosine phosphorylée sur des sites thréonine 18 et la sérine 19; RBM, membrane basale reconstituée; SDS-PAGE, électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium. Pour bar RWPE1 acini échelle = 10 pm; pour les cellules tumorales PC3sphéroïdes Barre d'échelle = 100 um. Ce chiffre a été modifié par la référence 13. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les étapes de dépannage seront nécessaires si D - (-) - ribose est choisi comme agent de réticulation pour RBM. Au cours de l' élaboration du protocole , il a été constaté que le traitement avec 1 M de D - (-) - ribose pendant 72 heures, comme décrit précédemment pour les gels RBM / 22 de collagène, conduit à la déshydratation et le retrait des gels GAR. L'évaluation des concentrations plus faibles de D - (-) - ribose de courte durée de traitement peut aider à surmonter cette limitation.
Une limitation potentielle dans des applications futures du protocole pourrait être rencontré où des niveaux plus élevés de la GAR rigidité sont souhaitées. Si de plus longues durées d'incubation et des concentrations plus élevées de GLA sont utilisées pour induire des niveaux plus élevés de rigidité de gel FrP il sera nécessaire de déterminer si les conditions de traitement ont un impact sur la survie et la prolifération cellulaire, comme décrit précédemment 13. Il convient également de noter que l'incubation des cellules RWPE-1 avec du sérum provoque une transition EMT analogue phénotypiques et l'exposition à du sérum ou des matériaux contenant du sérum doit être évitée. Par exemple, si des expériences impliquent la transfection de petits ARN interférents (siARN) oligonucléotides, la procédure doit être optimisée en utilisant des cellules RWPE-1 cultivées en KSFM, sans changer les cellules à faible milieu de transfection de sérum. Cet inconvénient pourrait compromettre le niveau de silençage génique réalisé lors de l'utilisation de siRNA transitoire approches dans le modèle. Pour certaines protéines cibles, il serait conseillé d'employer des vecteurs inductibles shRNA pour le silençage génique accordable et la diminution souhaitée des taux de protéines. Adaptations qui incorporent la réticulation enzymatique par des cellules stromales ou de cellules tumorales associées lysyl oxydase (LOX) 17 peuvent également être incorporés dans les futurs modèles.
jove_content "> Ce protocole facilitera la future étude des mécanismes pro-invasives déclenchées par AGE-dépendante BM raideur dans Pécs (RWPE-1, BPH-1) et l'évaluation des cibles anti-métastatiques dans PTCs envahissantes (PC3). Étant donné que l'HBP est considéré comme un trouble métabolique 27, ce protocole ouvre également la voie à l' amélioration de notre compréhension du lien entre les troubles métaboliques et un risque accru de cancer de la prostate. Étant donné que BM rigidité induite par son exposition aux AGEs peut être un déclencheur pour invasivité dans d' autres cancers types, il sera intéressant d'utiliser le protocole à mettre en place des modèles similaires qui intègrent des cellules épithéliales normales et les cellules tumorales d'autres organes (par exemple , du sein, du côlon, des ovaires, du pancréas).Les étapes critiques au sein du protocole, ainsi que leurs horaires, sont résumés dans la figure 4. Au cours de l'étape initiale , il est essentiel de maintenir la solution mère de la GAR à 4 ° C alors qu'il dégèle pour empêcher sa polymerization. Pointes de pipettes ne doivent pas être placés dans la solution rM des stocks jusqu'à ce qu'ils aient été refroidi à 4 ° C. Pour l'étape suivante, il est également important d'assurer que les diapositives de chambre ont équilibré à 4 ° C avant d'être revêtus de la solution RBM. Dès que la température de la solution GAR est augmentée au-dessus de 4 ° C, il va subir une polymérisation irréversible pour former un gel. Il est essentiel que ces mécanismes ne soit pas perturbé pendant l'étape de polymérisation pour s'assurer qu'il forme une surface plane appropriée pour la culture cellulaire et l'analyse microscopique. La durée d'incubation avec GLA avec ou sans inhibiteurs de la réaction de Maillard (de cyanoborohydrure de sodium et amingoguanidine) déterminera la raideur du gel FrP devient. Il est recommandé d'utiliser une incubation de 6 h avec GLA si les conditions semi-rigides sont nécessaires, et 14 heures d' incubation , si les conditions rigides sont nécessaires (tableau 1). Autres temps d'incubation ou concentrations de GLA peuvent être utilisées si différents niveauxde la rigidité sont souhaitées. Dans ce cas, l'analyse rhéologique des gels RBM doivent être incorporés comme une étape essentielle. Après l'étape de trempe de la réaction de Maillard par incubation avec GEE et les étapes ultérieures de lavage avec du PBS, les gels GAR peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à 4 ° C pendant jusqu'à 48 heures avant leur utilisation pour la culture cellulaire. Une fois que les cultures cellulaires sont mis en place, il est important de changer le milieu de culture (y compris les traitements), tous les deux jours. Il est recommandé de maintenir les cultures de cellules 3D pendant 3-12 jours en fonction des paramètres étudiés. Pour la 3D PEC Acini il est recommandé d'analyser les cultures au bout de 6 jours, et 3D PTC sphéroïdes analyse est recommandée après 3 jours de culture en première instance.
Figure 4:. Simple Aperçu du protocole avec les étapes et les synchronisations critiques Indiqué Le flow diagramme montre comment préparer et raidir la membrane basale reconstituée (RBM) avec glycolaldéhyde (réaction de Maillard) avec des étapes critiques et les horaires indiqués. Points où le protocole peut être arrêté, et les gels RBM stockés, sont également indiqués. RBM, membrane basale reconstituée; GLA, glycolaldéhyde; GEE, l'ester éthylique de la glycine; ON, durant la nuit; PBS, solution saline tamponnée phosphate; RT, la température ambiante. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I - Material for monolayer culture | |||
| BPH-1 | CaP Cell Line Database | PCaCL-132 | Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu |
| Complete keratinocyte serum-free media | ThermoFisher Scientific | 17005-075 | Do not warm at 37 ºC before use |
| Fetal calf serum | First Link UK Ltd | 02-00-850 | Store at -20 ºC in aliquots |
| PC3 | American Type Culture Collection | CRL-1435 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets | Oxoid | BR0014G | |
| RPMI 1640 medium | Sigma-Aldrich | R5886 | warm in 37 ºC water bath before use |
| RWPE-1 | American Type Culture Collection | CRL-11609 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| II - Material for 3D culture | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Aminoguanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 396494 | Irritating to eyes, respiratory system and skin |
| Chamber slides, 8-well | Thermo Scientific Nunc Lab-Tek | TKT-210-816M | |
| Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract | AMS Biotechnology | 3445-005-01 | Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots |
| Cyanogen bromide | Sigma-Aldrich | C91492 | Toxic by contact skin and inhalation |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) | Sigma-Aldrich | 50060 | Irritating to eyes |
| Glycolaldehyde dimer (GLA) | Sigma-Aldrich | G6805 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation |
| Syringe filter 0.22 microns | Appleton Woods | BC680 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| III - Material to quantify Maillard reaction | |||
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThemoFisher Scientific | D3571 | light sensitive and store at -20 ºC in aliquots |
| Cloning cylinders | Sigma-Aldrich | C1059 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11001 | light sensitive |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11034 | light sensitive |
| Goat serum | Abcam | ab7481 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Vectashield mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb | TransGenic Inc | KH012 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | F8775 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody | Acris Antibodies | R1041 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-laminin A/C pAb | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-7292 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dialysis cassette Slide-A-Lyzer | ThemoFisher Scientific | 66333 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IV - Equipment | |||
| ARG2 controlled strain rotational rheometer | T.A. Instruments | ||
| Axiovert S100 (20X magnification) microscope | Zeiss | ||
| CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope | Solent Scientific | ||
| Confocal Axiovert 200M (40X, 63X magnification) microscope | Zeiss | ||
| Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast | Olympus | ||
| PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer | BMG Labtech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| V - Software | |||
| Image J 1.47v | National Institute of Health, USA | ||
| MetaXpress | Molecular Divices |
References
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