Summary
Aqui nós explicar um protocolo para modelar o microambiente biofísico onde reticulação e o aumento da rigidez da membrana basal (BM) induzida por produtos finais de glicação avançada (AGEs) tem relevância patológica.
Abstract
Descrevemos aqui um protocolo que pode ser utilizado para estudar o microambiente biofísico relacionadas ao aumento da espessura e rigidez da membrana basal (BM) durante patologias relacionadas com a idade e distúrbios metabólicos (por exemplo, cancro, diabetes, doença microvascular, retinopatia, nefropatia e neuropatia) . A premissa de que o modelo é de ligação cruzada não enzimática de BM matriz reconstituído (RBM), por tratamento com glicolaldeído (GLA) para promover a glicação avançada produto final geração (FGA), através da reacção de Maillard. Exemplos de técnicas laboratoriais que podem ser utilizados para confirmar a geração de AGE, a reticulação não enzimática e aumento da rigidez em GLA tratada RBM são descritas. Estes incluem a preparação de MAE nativa (tratados com solução salina tamponada com fosfato, PBS) e rígida RBM (tratadas com GLA) para a determinação de: o seu conteúdo de AGE por análise fotométrica e de microscopia de imunofluorescência, a sua ligação cruzada não enzimática de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódioelectroforese em gel (SDS-PAGE), bem como microscopia confocal, e a sua rigidez aumentada utilizando reometria. O processo descrito aqui pode ser utilizado para aumentar a rigidez (módulos elásticos, E) de MAE-se para 3,2 vezes, consistente com as medições efectuadas em saudável contra o tecido da próstata humano doente. Para recriar o microambiente biofísico associado ao envelhecimento e próstata doente glândula três tipos de células da próstata foram introduzidas para RBM nativa e dura RBM: RWPE-1, células epiteliais da próstata (PECs) derivada de uma próstata normal; HBP-1, PEC derivadas de uma próstata afectados por hiperplasia prostática benigna (BPH); e PC3, células metastáticas derivado de um tumor ósseo secundário proveniente de cancro da próstata. Vários parâmetros podem ser medidos, incluindo o tamanho, forma e características invasoras do acini glandular 3D formado por RWPE-1 e BPH-1 no nativa contra RBM duro, e duração média de células, a velocidade de migração e persistência de circulação de células de spher 3Doids formados por células PC3 sob as mesmas condições. Vias celular e a localização subcelular de proteínas de sinalização pode igualmente ser avaliada.
Protocol
1. Indução da BM Rigidez induzida pela GLA Tratamento (reticulação não enzimática)
- Descongelar uma ampola congelada de matriz BM (10 ml) por incubação a 4 ° C (de pé sobre gelo numa câmara fria ou refrigerador) líquido até que o conteúdo do frasco se tornaram (8-16 h).
Cuidado: Se um quarto frio / frigorífico não for utilizado, cobrir toda a garrafa com gelo. Isso vai evitar que a solução estoque da BM solidifique. - Para experiências futuras e evitar os ciclos de descongelamento congelamento repetidas, preparar 25 x 0,4 mL de alíquotas de cada novo frasco de 10 ml da matriz BM. frascos armazenar a -80 ° C até o prazo de validade indicado pelo fabricante. Quando necessário, descongelar frascos a 4 ° C que estão em gelo durante 2 hr.
- Prepare uma superfície uniforme de gelo. Coloque uma lâmina de vidro câmara de 8 poços em cima de gelo para manter uma temperatura de 4 ° C durante o processo de revestimento. Descongelar um frasco de matriz BM a 4 ° C.
Nota: Uma 0,4 ml frasco de matriz BM é suficiente para coat um slide de câmara de 1 x 8 poços inteiro. Manter o frasco coberto de gelo durante o manuseio para evitar a matriz BM solidifique. - Cortar a extremidade de distribuição de uma ponteira 200 mL com uma tesoura. Resfriar o blunt-ended 200 mL ponta da pipeta para 4 ° C e coloque-a a um auxílio capacidade de pipetagem 200 mL. Tome-se 40 ul da solução fria matriz BM para a ponta da pipeta e transferi-lo para um poço no-8 bem lâmina de vidro câmara refrigerada.
Nota: 40 ul de solução BM é suficiente para cobrir uma área de superfície de 0,8 cm2. Manter as pontas das pipetas refrigerados durante o procedimento de revestimento, para evitar a solidificação da solução BM. Não introduzir bolhas de ar na solução da matriz BM e assegurar que o poço é revestido uniformemente, sem a formação de um menisco visível nas bordas. - Repetir o passo 1.4 de acordo com o número de poços necessários e câmaras.
- Após o revestimento, colocar a corrediça câmara de 8 poços a 37 ° C durante 30 min para promover a polimerizaçãoda BM. Feche a porta da incubadora com muito cuidado para evitar qualquer perturbação indesejada do RBM líquido. Não exceda o tempo de incubação de 30 min para evitar a desidratação do gel RBM.
Nota: O gel resultante é o nativo reconstituído BM (RBM). O passo de incubação a 37 ° C não necessita de 5% de CO 2. No entanto, por conveniência realizar este passo num incubador de cultura de tecido fixada em 37 ° C e 5% de CO 2 (com humidificação). - Prepare glicolaldeído 50 mM (ABL) diluído em tampão fosfato 0,2 M (pH 7,8). Esterilizar a solução por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 micron utilizando uma seringa de 50 ml.
- Para uma reacção de reticulação, num volume final de 250 ul de GLA 50 mM, adicionar 25 ul de cianoboro-hidreto de sódio 0,5 M ou 2,5 M de aminoguanidina, a 125 ul de ABL 100 mM (2x estoque) e 100 ul de tampão fosfato 0,2 M (pH 7,8 ). Esterilizar a soluções de reserva, passando-os através de um filtro de seringa de 0,22 micron utilizando uma seringa de 50 ml.
Cuidado: Pega cianoborohidreto de sódio vestindo um jaleco, luvas, máscaras de proteção e máscara, enquanto trabalhava em um exaustor.
- Para uma reacção de reticulação, num volume final de 250 ul de GLA 50 mM, adicionar 25 ul de cianoboro-hidreto de sódio 0,5 M ou 2,5 M de aminoguanidina, a 125 ul de ABL 100 mM (2x estoque) e 100 ul de tampão fosfato 0,2 M (pH 7,8 ). Esterilizar a soluções de reserva, passando-os através de um filtro de seringa de 0,22 micron utilizando uma seringa de 50 ml.
- Adicionar 250 uL de solução de GLA a cobrir o gel RBM polimerizado e incubar a 37 ° C durante 6 horas para produzir um gel semi-rígida RBM ou 14 h para produzir um gel duro RBM.
Nota: O volume de ABL adicionado deve cobrir o gel RBM polimerizada e deve ser ajustado em conformidade. Se forem utilizados diferentes tempos de incubação ABL, os géis RBM devem ser analisados para determinar a vezes de aumento na RBM rigidez (ver Passo 2.4).- Preparar um controlo negativo através da incubação de um gel nativo RBM em 250 ul de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) durante 14 h a 37 ° C.
- Preparar dois controlos adicionais onde a formação da base de Schiff ou de Amadori aducto rearranjo durante a reacção de reticulação são inibidas, pela adição de cianoboro-hidreto de sódio a 50 mM ou 250 mM de aminoguanidina.
- Prepare 1 M de glicina eéster Thyl (GEE) diluído em PBS. Esterilizar a solução por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 micron utilizando uma seringa de 50 ml.
- Após o tempo de incubação indicado, retire cuidadosamente a solução GLA dos géis RBM reticuladas, solução GLA contendo inibidores de géis RBM controle e PBS dos géis RBM nativos de controle. Adicionar 250 uL de solução de GEE para todos os géis RBM e incubar a 37 ° C durante 1 h.
Nota: Esta etapa sacia a reacção de reticulação. - Lave todos os géis RBM 10 vezes em 500 mL PBS para remover todos os vestígios de ABL e GEE. Incubar os géis RBM durante a noite a 37 ° C em 400 ul de PBS para impedir a sua desidratação.
- Analisar os géis RBM para a acumulação de AGE, de reticulação não enzimática e viscoelásticas propriedades (Passos 2,1-2,4). Para a análise Rheometric de suas propriedades viscoelásticas preparar os géis RBM em anéis de clonagem (passo 2.4).
- Para cultura de células, lavar géis RBM 2 vezes com 500 mL de cultura media antes da semeadura das células (etapas 5 e 6). Realizar lavagens suavemente, sem a ponta da pipeta tocar a superfície do gel.
2. Quantificação de não enzimática reticulação e rigidez da RBM Tratada com GLA
- análise fotométrica
- Medir a acumulação de AGE em GLA-tratada e controlar géis RBM usando análise fotométrica para determinar a extensão da reacção de Maillard.
- Após o passo 1.11, remover o PBS a partir de géis RBM nas lâminas de câmara de 8-poços e adicionar 250 mL de água bi-destilada gelada. Incubar a 4 ° C durante 16-24 h, para assegurar que a matriz é completamente liquefeitos.
Nota: peptídeos RBM nesta solução conter as idades com propriedades auto-fluorescente. - Transferir a solução BM liquefeito para um tubo de 1,5 ml e medir a emissão de fluorescência da solução utilizando um espectrofotómetro (excitação comprimento de onda = 370 nm; comprimento de onda de emissão = 440 nm).
- Após o passo 1.11, remover o PBS a partir de géis RBM nas lâminas de câmara de 8-poços e adicionar 250 mL de água bi-destilada gelada. Incubar a 4 ° C durante 16-24 h, para assegurar que a matriz é completamente liquefeitos.
- Medir a acumulação de AGE em GLA-tratada e controlar géis RBM usando análise fotométrica para determinar a extensão da reacção de Maillard.
- SDS-PAGE Análise de brometo de cianogénio Peptides
- Resolver os géis GLA-tratados e RBM controlo sobre um gel de poliacrilamida para confirmar que ABL tem induzido a reticulação e a formação de macro-fibras.
- Centrifugar a solução BM liquefeito recolhidas no passo 2.1.1.2 a 10.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Prepara-se uma solução de estoque contendo 2 g / ml de brometo de cianogénio em acetonitrilo diluída.
Cuidado: Sempre lidar com brometo de cianogênio em um exaustor enquanto usava um jaleco, luvas, máscaras de proteção e máscara. - Remover o sobrenadante, re-suspender o sedimento em gel BM em 500 ul de 20 mg / ml de brometo de cianogénio + 70% v / v ácido fórmico e incubar durante a noite à TA.
- Usar uma seringa de 1 ml descartável para transferir o sedimento ressuspenso em gel BM numa cassete de diálise com um peso molecular de corte 3,5 kDa.
- Submerge a cassete numa proveta de vidro de 500 ml contendo 500 ml de água duplamente destilada e uma barra de agitação magnética.Coloque esta sobre um agitador magnético e diálise durante a noite (16 horas) a 4 ° C (numa sala fria) para remover todos os vestígios de brometo de cianogénio e ácido fórmico.
- Usar uma seringa de 1 ml descartável para transferir a solução dialisada BM a partir da cassete para um tubo de 1,5 ml.
- Analisar 25 uL de cada amostra sobre uma BM 12% de gel de poliacrilamida v / v 10,11. Após SDS-PAGE, coloração com prata realização do gel de poliacrilamida a 12 para visualizar o padrão electroforético de peptídeos de brometo de cianogénio-matriz 13.
- Resolver os géis GLA-tratados e RBM controlo sobre um gel de poliacrilamida para confirmar que ABL tem induzido a reticulação e a formação de macro-fibras.
- Análise de imunofluorescência Microscopia
- Execute coloração de imunofluorescência de ABL tratada e controlar géis RBM com anti-AGE / pentosidina, anti-colágeno IV e anticorpos anti-laminina seguido por microscopia confocal para visualizar AGEs acumulados e colágeno IV / rearranjos estruturais de fibra de laminina na RBM reticulado géis 13.
Nota: Utilize sempre um volume suficiente para cobrir a entire gel RBM durante incubações e lavagens sem tocar a superfície do RBM com a ponta da pipeta. Para mais detalhes sobre a análise culturas acini 3D por imunofluorescência ver referência 6 e para a microscopia confocal de ácinos 3D ver a referência 14.- Lavar ABL tratada e géis controlo RBM em lâminas de 8 poços câmara 2 vezes com 300 ul de PBS + (PBS contendo 0,1 mM de CaCl 2 e 0,5 mM de MgCl2) durante 5 min à TA.
- Remover o PBS +, em seguida, adicionar 300 uL de 4% w / v de paraformaldeído (PFA) diluída em PBS + para cobrir cada gel RBM. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente para fixar os componentes RBM.
- Remover a 4% w / v solução de PFA. Adicionar 300 ul de adicionar mM NH 4 Cl + solução de 75 mM de MgCl 2, 0,5 e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (repetir 5x) para extinguir a fixação.
- Preparar tampão de imunofluorescência (IF tampão), fazendo a seguinte solução em água estéril: 130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de NaH2 PO 4, 7,7 mM NaN 3, 0,1% w / v de albumina de soro bovino, 0,5% v / v de polietileno-glicol-terc-octilfenil éter e 0,05% v / v de polietilenoglicol sorbitano.
- Prepare IF tampão de bloqueio, completando tampão IF com 20% de soro de cabra v / v.
- Remover a solução de têmpera e adicione 300 ml de IF tampão de bloqueio aos géis RBM para evitar reações inespecíficas. Incubar 2 horas a RT em uma plataforma de agitação.
- Remover o tampão de bloqueio e incubar SE RBM os géis durante 16 horas a 4 ° C com 300 uL de anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio SE (1: 500 de murganho anti-mAb pentosidina; 1/250 de coelho anti-colagénio IV pAb; 1 / 250 de coelho anti-laminina / C pAB).
Nota: As incubações por mais de 20 horas, a 4 ° C pode liquidificar o RBM. - Remover o anticorpo primário e lava-se 3 vezes (10 minutos cada) com 300 ul de tampão IF à temperatura ambiente numa plataforma de agitação.
- Remover o tampão de IF eadicionar 300 uL de anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho ou anti-rato IgG [H + L]) conjugado com um fluorocromo diluído 1: 500 em tampão de bloqueio SE. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente numa plataforma de agitação.
- Remover o anticorpo secundário e incubar em 300 ul de tampão IF durante 10 min à temperatura ambiente. Remover o tampão de IF e lavar 3 x 10 min em 300 ul de PBS + à temperatura ambiente.
- Fix e extingue-se uma segunda vez, como descrito acima (Passos 2.3.1.2 e 2.3.1.3).
- Montar géis RBM manchadas nos meios de montagem e analisar a formação de feixes densos de componentes principais, utilizando epifluorescência ou microscopia confocal.
Nota: Para mais informações sobre análise de culturas acini 3D por imunofluorescência ver referência 6 e de epifluorescência e microscopia confocal de ácinos 3D ver a referência 14.
- Execute coloração de imunofluorescência de ABL tratada e controlar géis RBM com anti-AGE / pentosidina, anti-colágeno IV e anticorpos anti-laminina seguido por microscopia confocal para visualizar AGEs acumulados e colágeno IV / rearranjos estruturais de fibra de laminina na RBM reticulado géis 13.
- Análise reológica
- Realizar análise Rheometric de ABL tratada e controlar géis RBM para medir a sua viscoelasticity (rigidez).
- Configurar géis RBM que são 1 mm de espessura em um molde circular com um diâmetro de 8 mm. Para fazer isso, coloque um anel de clonagem (8 mm de diâmetro) dentro de um poço de uma placa de cultura de 24 cavidades e adicionar a BM solução de matriz preparados conforme descrito nos Passos 1,3-1,6.
Nota: Para recapitulação precisa dos géis RBM utilizados para fins experimentais, os géis preparados para análise RBM Rheometric precisa de ter a mesma área de superfície e espessura que os géis RBM criadas em câmaras de 8 poços. Os géis RBM analisados na Figura 3 foram de 1 mm de espessura e 8 mm de diâmetro. - Trate os géis RBM criados nos anéis de clonagem com PBS, GLA durante 6 horas e GLA, durante 14 horas, como descrito acima (Passos 1.8 a 1.11).
- Medir o módulo de elasticidade (E) dos géis RBM 8 mm de diâmetro sobre um reómetro com 8 mm de placas paralelas serrilhadas geometria, ao longo de um intervalo de 1-3% de deformação, a uma frequência de oscilação fixa de 1 Hz e a temperatura de 21 ° C. Para detalhes adicionais sobre aanálise Rheometric de géis ECM ver referências ver 13,15,16 referência.
Nota: E é determinada a partir da resultante módulo de armazenamento de cisalhamento (G '), através da utilização da seguinte equação E = 2 * L' * (1 + V) em que v é a razão de 0,5 de Poisson, conforme descrito em referência 13,15 , 16.
- Configurar géis RBM que são 1 mm de espessura em um molde circular com um diâmetro de 8 mm. Para fazer isso, coloque um anel de clonagem (8 mm de diâmetro) dentro de um poço de uma placa de cultura de 24 cavidades e adicionar a BM solução de matriz preparados conforme descrito nos Passos 1,3-1,6.
- Realizar análise Rheometric de ABL tratada e controlar géis RBM para medir a sua viscoelasticity (rigidez).
3. Cultura e manipulação da linha normal PEC, RWPE-1
- Cresça RWPE-1 de células em meios isentos de soro de queratinócitos (KSFM) suplementado com 5 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF), 50 ug / ml de extracto de pituitária de bovino (BPE) e 50 U / ml de penicilina, com 50 ug / ml de estreptomicina ( completar KSFM).
Nota: Para evitar a indução de epitelial-a-mesenquimal (EMT) -como transição não expõem células RWPE-1 ao soro. Permitir completa KSFM atingir a TA durante 30 min após a remoção de armazenamento a 4 ° C e não aquecido num banho de água a 37 ° C, pois isso irá inactivar o EGF e BPE. - Aspirar o completoKSFM de um confluente 10 cm2 placa de células RWPE-1, lavar com 5 ml de PBS pré-aquecido e adicionar 5 ml de 0,05% v / v de tripsina de assegurar que todas as células são cobertas com a solução.
- Colocar as células numa incubadora de cultura de tecido fixado em condições padrão de 37 ° C e 5% de CO 2 (com humidificação) durante 5 a 10 min. Verificar a extensão da tripsinização após 5 minutos e bata suavemente na placa de cultura para separar as células.
Nota: células RWPE-1 não toleram longos períodos de tripsinização por isso é aconselhado a não lidar com mais de duas placas ao mesmo tempo. É também importante a dissociar-se todas as células a partir da placa para evitar a selecção clonal.
- Colocar as células numa incubadora de cultura de tecido fixado em condições padrão de 37 ° C e 5% de CO 2 (com humidificação) durante 5 a 10 min. Verificar a extensão da tripsinização após 5 minutos e bata suavemente na placa de cultura para separar as células.
- Quando todas as células RWPE-1 têm dissociado, adicionar 5 ml de PBS quente contendo 2% / v de soro fetal bovino v (FCS) para extinguir a tripsina. Pipeta suavemente cima e para baixo para romper os agregados de células antes da transferência das células para um tubo de centrífuga.
- Centrifugar as células dissociadas em 125-150 xg durante 5 min a 25 ° C, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de completa KSFM até se obter uma suspensão de células individuais.
- Transferir 1 ml das células ressuspensas para um novo tubo e adicionar 9 ml de completa KSFM para propagar as células numa diluição 1: passagem 5 para uso experimental subsequente. Contar o resto das células usando um hemocitômetro para a criação de ácinos (ver Secção 5.1).
Nota: Não cultura células RWPE-1 para mais de 10 passagens desde após períodos prolongados de cultura que eles não formam ácinos com a arquitetura correta. - Alterar os meios de cultura a cada 48 horas para garantir a EGF e BPE permanecem ativos.
Nota: Incluir esta mudança de meio para quaisquer tratamentos que se estendem para além de 48 horas.
4. Cultura e manipulação da linha de células BPH, BPH-1
- BPH-1 de células de cultura em meio RPMI 1640 complementado com 5% v / v de FCS, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina. aqueça omeios de cultura, PBS e 0,25% w / v de solução de tripsina-EDTA a 0,53 M a 37 ° C antes da utilização.
Nota: As células também podem ser cultivadas em meios com 2,5% v / v de FCS 8. - Aspirar o meio de cultura a partir de um confluente 10 cm2 placa de células BPH-1 e lava-se as células 2 x com 3 ml de PBS para remover todos os vestígios de meio de cultura com soro, que pode temperar a reacção tripsina.
- Aspirar o PBS e adicionar 3 ml de solução de tripsina-EDTA para cobrir as células. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 (com humidificação) durante 5 min. Remover a solução de tripsina-EDTA, quando as células são redondas, mas manter-se ligada ao prato. Lavar as células com 5 ml de PBS.
- Após a remoção do PBS, adicionam-se 5 ml de meio de cultura e gentilmente pipeta-se para baixo e para produzir uma suspensão de células individuais. Transferir as células para um tubo de 15 ml.
- 2 ml da suspensão de células para um novo tubo de centrífuga com 8 mL de meio completo e a chapa células BPH-1 ontOA 10 cm2 placa de cultura a uma diluição de 1: 5 passagem para uso experimental subsequente. Contar o resto das células usando um hemocitômetro para a criação de ácinos (ver Secção 5.2).
Nota: Mantenha um registro do número passagem, como as células mais velhas BPH-1 não formam ácinos com uma arquitectura adequada. Um número de passagens mais do que 10 não é desejado. - Alterar os meios de cultura a cada 72 horas.
5. Cultura 3D da próstata Gland Acini na RBM Native e Stiff
- Se as células RWPE-1 estão a ser utilizados para formar ácinos, dilui-se 5000 células, preparado no passo 3.5, em 300 ul de KSFM completo suplementado com 2% v / v de solução BM.
- Se as células BPH-1 estão a ser utilizados para formar ácinos, diluir 2.500 células, preparado no passo 4.5, em 300 ul de meio RPMI 1640 meio de cultura suplementado com 2% v / v de solução BM.
Nota: as células BPH-1 são maiores do que as células RWPE-1, de modo mais baixos números de células BPH-1 são utilizadas para se obter uma distribuição semelhante de ácinos após 6 dias de cultura. - Suavemente semear as células para o RBM nativa e endureceu-AGE e cuidadosamente colocar as culturas numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 (com humidificação) para assegurar uma distribuição uniforme de crescimento ácinos no bem e que cada célula se divide para produzir um acina.
- A cada 2 dias substituir o meio de cultura com meio de cultura fresco contendo 2% v / v de BM para assegurar que as células têm os factores de crescimento necessários para o normal acina homeostase.
- Monitorar morfologia acinar em culturas em crescimento por meio de microscopia de campo claro 13.
Nota: Após 3 dias em cultura as células individuais vai formar um conjunto de células de> 3 e após 1 semana ácinos glândula da próstata com um diâmetro de ~ será observado 50 uM. - Seguir o protocolo descrito no ponto 2.3 para executar imunofluorescência utilizando anticorpos específicos para os marcadores de adesões célula-matriz, adesões célula-célula, a polaridade APICO-basal e invasividade 13.
6. Cultura 3D de próstata Agregados tumor de células no RBM Native e Stiff
- Cultura de células PC3 em meio RPMI 1640 contendo 10% v / v de FCS e 50 U / ml de penicilina, com 50 ug / ml de estreptomicina. Aquece-se a meios de cultura, PBS e 0,25% w / v de solução de tripsina-EDTA a 0,53 M a 37 ° C antes da utilização.
- Aspirar o meio de cultura a partir de uma placa de cultura de 10 cm2 confluente de células PC3 e lavar as células 2x com 3 ml de PBS para remover todos os vestígios de FCS que podem extinguir a reacção de tripsina.
- Aspirar o PBS e adicionar 3 ml de solução de tripsina-EDTA para cobrir as células e incuba-se durante 1 min.
- Quando as células se tornam arredondadas, mas permanecer ligada ao prato, aspirar cuidadosamente a solução de tripsina-EDTA e lava-se com 3 ml de PBS pararemover todos os vestígios de tripsina.
- Após a remoção do PBS, adicionam-se 5 ml de meio de cultura e gentilmente pipeta-se para baixo e para produzir uma suspensão de células individuais. Transferir as células para um tubo de 15 ml.
- Tomar 1 ml da suspensão de células PC3 para um novo tubo de centrifugação e adicionar 9 ml de meio de cultura. Placa as células em um prato de 10 cm 2 de cultura (1:10) para uso experimental subsequente. Contar as células restantes usando um hemocitômetro.
- Diluir 2.500 células PC3 preparadas na etapa 6.6, em 300 ul de meio RPMI 1640 meio de cultura suplementado com 2% v / v de solução de BM para permitir a formação de um gel de gradiente na cultura.
- Gentilmente semear as células para a RBM nativa e endureceu-AGE e coloque cuidadosamente a cultura na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 (com umidificação) para assegurar uma distribuição de crescer esferóides no poço.
- Alterar os meios de cultura a cada 72 horas.
- Para estudar o efeito da dura RBM (rico em AGE)na migração de células tumorais da próstata, imagem células PC3 usando vídeo brightfield microscopia de lapso de tempo usando temperatura / CO 2 controle e uma câmara úmida 17.
Nota: células PC3 crescer em fios sobre RBM nativa e não fazem ácinos com um lúmen, mas se deixou de crescer mais de 72 horas na RBM nativa eles vão formar esferóides 3D. - Após a aquisição de dados, controlar manualmente as células PC3 e calcular sua velocidade de migração, de forma (relação de alongamento) e persistência da migração 17-19.
Nota: Persistência = relação D / T, D = distância do início ao fim da trajetória celular, T = comprimento total da trajetória celular.
Representative Results
3D próstata Acini cultivadas em RBM Stiff
Após 6 dias de cultura, os PEC derivada de tecido de próstata normal (RWPE-1) (Figura 1A) e no tecido HBP (BPH-1) (Figura 1B) forma ácinos no nativo (tratados com PBS) RBM que estão organizados em esferóides uniformes de epitelial células. Estes ácinos também têm as características de PECs altamente organizadas com espaço apical-para-basal polaridade e um luminal visível 13,20.
O ácinos formado por PEC derivadas a partir de tecido de próstata normal (RWPE-1) (Figura 1A) e no tecido HBP (BPH-1) (Figura 1B) em endureceu RBM (rico em AGE) (tratado com GLA) têm uma arquitectura interrompido (deslocando de esferoidal de forma poligonal e células salientes / migração do ácinos no RBM rico-AGE) (Figura 1A). Estes ácinos são também caracterizados por PEC altamente desorganizada que perderam a sua polaridade para-apical-basal com uma pequena ou inexistente espaço luminal 13.
Figura 1:. Células da próstata epiteliais cultivadas como 3D glandular Acini em Native e Stiff membrana basal reconstituída (RBM) (A) imagens de campo claro de células RWPE-1 cultivadas durante 12 h até 6 dias em géis RBM tratados com PBS (nativo) ou glicoaldeído 50 mM durante 14 h (-AGE rica; rígida); Barra de escala = 50 mm. (B) as células BPH-1, crescidas como descrito no painel A; Barras de escala = 50 um; dados são representativos de 3 experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Tabela 1:. Características da próstata epitelial RWPE-1 ácinos cultivadas em Native, Semi-Stiff e Stiff basal reconstituída Membrane (RBM) RWPE-1 ácinos foram cultivadas em RBM pré-tratados com PBS, durante 14 horas (nativo), glicoaldeído (GLA ) durante 6 horas (semi-rígidos) ou GLA, durante 14 horas (dura). Por forma acinar, o percentual (%) ± desvio padrão (SD) da rodada, acini semi-poligonal e poligonais foram calculados a partir de 5 experiências independentes (50 ácinos quantificados por condição). tamanho acinar relativo foi calculado (nativo RBM = 100%) a partir de 3 experiências independentes. Para invasividade,% ± SD ácinos com uma ou mais células protuberantes foram calculadas a partir de 3 experiências independentes. mudança da dobra é calculado dividindo o valor médio obtido em condições semi-rígidas ou rígidas por o valor correspondente para condições nativas. Valores de p calculados utilizando o teste t de Student (α = 0,05).
Células PC3 cultivadas em RBM nativa migrar mantendo contato célula-célula contínua, enquanto que as células PC3 cultivadas em rich-AGE (dura) RBM movimento independentemente um do outro (Figura 2A). Depois de 72 horas em células PC3 cultura formar focos (esferóides) sobre nativa (tratado PBS) RBM, enquanto que as células PC3 sobre dura RBM (rico em AGE) não fazer a partir de esferóides e migrar de forma independente (Figura 2B). Células PC3 sobre dura RBM (rico em AGE) são mais alongado do que as células PC3 cultivadas em RBM nativa (Figura 2C). Células PC3 sobre RBM dura migrar mais rapidamente do que células PC3 cultivadas em RBM nativa (Figura 2D). Células PC3 sobre RBM dura exibir uma diminuição na persistência em comparação com células PC3 cultivadas em RBM nativa (Figura 2E).
Figura 2:. A migração do tumor de células da próstata em Native e Stiff membrana basal reconstituída (RBM) (A) imagens de campo claro de células PC3 cultivados em géis RBM tratados com PBS (nativo) ou glicoaldeído 50 mM durante 14 h (rico em AGE, duro) . As células foram fotografadas utilizando um microscópio de campo claro (objetiva de 10X) e uma taxa de aquisição de uma imagem por hora durante 12 horas seguido de células de rastreamento para gerar trajetórias. As imagens mostradas correspondem aos pontos de tempo após 0, 3, 6, 9 e 12 horas. Trajetórias de células individuais são mostrados para o ponto de tempo de 12 horas. Barra de escala = 100 pm. Células (B) PC3 cultivadas em RBM nativa ou rígida, durante 72 h, e visualizada como se descreveu no painel (A). Barra de escala = 100 pm. Detalhe mostra a área selecionada a 2X ampliação. (C) Média ± SD comprimento célula (um); diferença significativa entre RBM nativa e RBM rígida (p = 1,2 x 10 -23). (
Discussion
Um protocolo para a geração de ácinos glandular 3D a partir de CME em géis RBM puros 6 foi modificada em um estudo anterior pela adição de 4 mg / ml tipo I colágeno para matriz RBM. A adição de colagénio resultou no módulo de elasticidade do gel RBM aumento de 175 ± 37-1589 ± 380 Pascais. Este aumento de 9,1 vezes na rigidez modulado o crescimento, sobrevivência, migração e diferenciação das CMEs 21. O protocolo foi modificado de novo através da inclusão de um passo de tratamento com D - (-) - ribose para promover a reticulação não enzimática do colagénio do tipo I, que tinha sido adicionado ao gel RBM. O resultante aumento de 15 vezes na rigidez foi encontrado para cooperar com a transformação oncogénica de MECs para promover o seu comportamento invasivo 22. A abordagem experimental do tipo adicionando I colágeno para géis RBM facilita a interação direta do CME com fibras de colágeno, o que só ocorre no tecido humano após a barreira física entre o estromae epitélio fornecida pela BM sofre degradação proteolítica. Ao gerar ácinos glandular 3D a partir de PECs em géis RBM puros pré-tratados com GLA, o protocolo atual abre o caminho para estudar como BM rigidez per se pode acionar o seu comportamento invasivo (Figura 3). Os níveis de BM rigidez induzidas neste protocolo tem relevância fisiológica. A incubação com GLA 50 mM durante 6 h e 14 h, respectivamente, aumentou os módulos elásticos do gel RBM pura para 175 ± 90 e 322 ± 160 em comparação com 122 ± 55 Pascais em géis RBM tratados com PBS (Tabela 1). Este aumento de 1,7 a 3,2 vezes em RBM rigidez recapitula a 2,5 a 3,4 vezes aumento na rigidez observada em comparação com maligno da próstata normal ou o tecido de BPH 23-26. Conforme descrito em uma publicação recente 13 as alterações morfológicas induzidas pela acumulação de AGE e RBM rigidez no PEC ácinos pode ser quantificada para uma mudança estatisticamente significante de arundada de forma poligonal, diminuição luminal / área total acinar, e as células salientes migram do acina no-AGE rica RBM (Figura 3). Imunotransferência também pode ser usado para avaliar os marcadores de EMT (por exemplo, perda de E-caderina 13) e o comportamento contráctil (por exemplo leve da miosina de cadeia fosforilada-2, pMLC2 13) em PEC cultivadas em normais versus RBM rígida (Figura 3). A avaliação subsequente por meio da coloração de imunofluorescência e microscopia confocal podem ser aplicadas para visualizar o BM (por exemplo, a laminina, colagénio IV e acumulação de AGE 13), a polaridade apical-para-basal celular (por exemplo, localização apical EEA1: antigénio endossomal precoce 1; e GM130: 130 kDa cis-Golgi marcador 13) e padrões de moléculas de adesão celular (por exemplo, a e-caderina de localização para junções célula-célula 13) (Figura 3).
Figura 3:. Visão geral dos diferentes protocolos aqui apresentados O diagrama mostra como preparar e endurecer a membrana basal reconstituída (RBM) com glicoaldeído (reação de Maillard), como propagar células para a RBM rígida, como analisar o RBM rígido ( extensão da reacção de Maillard) e procedimentos que podem ser utilizados para analisar as alterações celulares e moleculares induzidos por RBM rica em produtos FGA. AGE, produtos finais da glicação avançada; BM, membrana basal; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol; EEA1, cedo antigénio endossomal 1; GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; GLA, glicoaldeído; GEE, éster etílico de glicina; GM130, 130 kDa marcadores cis-Golgi; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), miosina de cadeia leve 2 fosforilada em locais treonina 18 e serina 19; RBM, membrana basal reconstituída; SDS-PAGE, electroforese em dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de sódio. Para bar RWPE1 ácinos Escala = 10 mm; para células de tumor PC3barra de escala = esferóides 100 um. Esta figura foi modificado a partir da referência 13. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
solução de problemas etapas será necessário se D - (-) - ribose é escolhido como o agente de ligação cruzada para RBM. Durante o desenvolvimento do protocolo, verificou-se que o tratamento com 1 M D - (-) - ribose durante 72 horas, como descrito anteriormente para géis RBM / colágeno 22, resultou na desidratação e encolhimento dos géis RBM. A avaliação de concentrações mais baixas de D - (-) - ribose e tempos de tratamento mais curtos pode ajudar a ultrapassar esta limitação.
Uma limitação potencial em futuras aplicações do protocolo pode ser encontrado em níveis mais elevados de RBM rigidez são desejados. Se os tempos de incubação mais longos e maiores concentrações de GLA são utilizados para induzir níveis mais elevados de rigidez de gel RBM será necessário avaliar se estas condições de tratamento ter um impacto sobre a sobrevivência e proliferação celular, tal como previamente descrito 13. Deve também notar-se que a incubação de células RWPE-1 com soro induz uma transição EMT-fenotípica e como a exposição a soro ou materiais contendo soro deve ser evitada. Por exemplo, se experiências envolvem a transfecção de ARN interferente curto oligonucleótidos (siARN), o procedimento deve ser optimizada utilizando células RWPE-1 cultivadas em KSFM, sem mudar as células para meio de transfecção baixo soro. Este inconveniente pode comprometer o nível de silenciamento de genes obtidos quando utilizando siRNA transiente abordagens no modelo. Para algumas proteínas alvo, seria aconselhável empregar vectores shRNA induzíveis para o silenciamento do gene ajustável ea redução desejada em níveis de proteína. Adaptações que incorporam reticulação enzimática por células do estroma ou células de tumor associado lisil-oxidase (LOX) 17 também poderia ser incorporada modelos futuros.
jove_content "> Este protocolo facilitará o futuro estudo de mecanismos pró-invasivos desencadeadas por idade-dependente BM rigidez nas PECs (RWPE-1, BPH-1) e avaliação de metas anti-metastáticos em PTCs invasivos (PC3). Dado que BPH é considerado como sendo uma desordem metabólica 27, este protocolo também abre o caminho para a melhor compreensão da relação entre distúrbios metabólicos e aumento do risco de cancro da próstata. Dado que a BM rigidez induzida por sua exposição a produtos FGA pode ser um gatilho para a invasividade noutros cancro tipos, que será de interesse para usar o protocolo de criar modelos similares que incorporam células epiteliais normais e células tumorais de outros órgãos (por exemplo, mama, cólon, ovário, pâncreas).As etapas críticas no âmbito do protocolo, juntamente com os seus horários, estão resumidos na Figura 4. Durante o passo inicial é essencial para manter a solução estoque de RBM a 4 ° C, enquanto que derrete para evitar a sua polymerization. Pontas de pipeta não deve ser colocado na solução estoque rM até que tenham sido arrefecida a 4 ° C. Para o próximo passo, é também importante para garantir que as lâminas de câmaras foram equilibrados a 4 ° C antes de serem revestidos com a solução RBM. Assim que a temperatura da solução é aumentada RBM acima de 4 ° C, ele irá sofrer polimerização irreversível para formar um gel. É essencial que o RBM não é perturbada durante a fase de polimerização para garantir que ela forma uma superfície plana apropriada para a cultura de células e análise microscópica. A duração da incubação com GLA com ou sem inibidores da reacção de Maillard (cianoboro-hidreto de sódio e amingoguanidine) irá determinar qual a rigidez do gel torna-se RBM. Recomenda-se a utilização de uma incubação de 6 h com GLA se forem necessárias condições semi-rígidas, e 14 h de incubação, se as condições rígidas são necessárias (Tabela 1). tempos de incubação alternativo ou concentrações de GLA pode ser usado se diferentes níveisde rigidez são desejados. Neste caso análise reológica dos géis RBM precisa de ser incorporado como um passo essencial. A seguir ao passo de têmpera da reacção de Maillard, por incubação com Gee e os passos de lavagem subsequentes com PBS, os géis RBM podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4 ° C durante até 48 h antes de seu uso para cultura de células. Uma vez que as culturas de células são configurados é importante mudar o meio de cultura (incluindo quaisquer tratamentos) a cada dois dias. Recomenda-se a manter as culturas de células 3D durante 3-12 dias de acordo com os parâmetros sob investigação. Para 3D PEC ácinos, recomenda-se analisar as culturas após 6 dias, e para a análise 3D PTC esferóides é recomendado após 3 dias de cultura na primeira instância.
Figura 4:. Vista geral simples do protocolo com a passos críticos e sincronismos indicou a flodiagrama w descreve como preparar e endurecer a membrana basal reconstituída (RBM) com glicoaldeído (reação de Maillard) com passos críticos e horários indicados. Os pontos em que o protocolo pode ser parado, e géis RBM armazenados, são também indicados. RBM, membrana basal reconstituída; GLA, glicoaldeído; GEE, éster etílico de glicina; ON, durante a noite; PBS, solução salina tamponada com fosfato; RT, temperatura ambiente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I - Material for monolayer culture | |||
| BPH-1 | CaP Cell Line Database | PCaCL-132 | Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu |
| Complete keratinocyte serum-free media | ThermoFisher Scientific | 17005-075 | Do not warm at 37 ºC before use |
| Fetal calf serum | First Link UK Ltd | 02-00-850 | Store at -20 ºC in aliquots |
| PC3 | American Type Culture Collection | CRL-1435 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets | Oxoid | BR0014G | |
| RPMI 1640 medium | Sigma-Aldrich | R5886 | warm in 37 ºC water bath before use |
| RWPE-1 | American Type Culture Collection | CRL-11609 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| II - Material for 3D culture | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Aminoguanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 396494 | Irritating to eyes, respiratory system and skin |
| Chamber slides, 8-well | Thermo Scientific Nunc Lab-Tek | TKT-210-816M | |
| Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract | AMS Biotechnology | 3445-005-01 | Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots |
| Cyanogen bromide | Sigma-Aldrich | C91492 | Toxic by contact skin and inhalation |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) | Sigma-Aldrich | 50060 | Irritating to eyes |
| Glycolaldehyde dimer (GLA) | Sigma-Aldrich | G6805 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation |
| Syringe filter 0.22 microns | Appleton Woods | BC680 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| III - Material to quantify Maillard reaction | |||
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThemoFisher Scientific | D3571 | light sensitive and store at -20 ºC in aliquots |
| Cloning cylinders | Sigma-Aldrich | C1059 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11001 | light sensitive |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11034 | light sensitive |
| Goat serum | Abcam | ab7481 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Vectashield mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb | TransGenic Inc | KH012 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | F8775 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody | Acris Antibodies | R1041 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-laminin A/C pAb | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-7292 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dialysis cassette Slide-A-Lyzer | ThemoFisher Scientific | 66333 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IV - Equipment | |||
| ARG2 controlled strain rotational rheometer | T.A. Instruments | ||
| Axiovert S100 (20X magnification) microscope | Zeiss | ||
| CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope | Solent Scientific | ||
| Confocal Axiovert 200M (40X, 63X magnification) microscope | Zeiss | ||
| Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast | Olympus | ||
| PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer | BMG Labtech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| V - Software | |||
| Image J 1.47v | National Institute of Health, USA | ||
| MetaXpress | Molecular Divices |
References
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