Summary
Burada çapraz ve ileri glikasyon nihai ürünlerin (AGE) tarafından uyarılan bazal membran (BM) artan sertlik patolojik ilgisi biyofiziksel mikro modelleme için bir protokol açıklar.
Abstract
Burada, yaşa bağlı patolojiler ve metabolik hastalıklar (örneğin, kanser, diyabet, mikrovasküler hastalık, retinopati, nefropati ve nöropati) sırasında artan kalınlığı ve bazal membran (BM) sertliği ile ilgili biyofiziksel mikro-incelemek için kullanılabilecek bir protokol açıklar . modelin öncül Maillard reaksiyonu ile ileri glikasyon son ürün (AGE) üretimini teşvik etmek için glikoladehid (GLA) ile işlenmesi suretiyle yeniden BM (RBM) matrisin enzimatik olmayan çapraz bağlar. YAŞ nesil, non-enzimatik çapraz bağlanmasını onaylamak için kullanılır ve GLA sertliği artırılabilir laboratuvar teknikleri örnekleri RBM özetlenmiştir tedavi. fotometrik analiz ve immünoflüoresan mikroskopi, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid tarafından enzimatik olmayan çapraz bağlama ile onun yaş içerik: Bu belirlenmesi için (GLA ile muamele edilmiş) ve sert RBM (fosfat tamponlu tuzlu su, PBS ile muamele edilmiş) yerel RBM hazırlanmasını içerirjel elektroforezi (SDS-PAGE) ve konfokal mikroskopi, ve artan sertlik ile reometre. Burada tarif edilen prosedür, hastalıklı insan prostat dokusu karşı sağlıklı yapılan ölçümler ile uyumlu olarak, 3.2 kata kadar RBM sertliğini (esneklik modülü, E) geliştirmek için de kullanılabilir. yaşlanma ve hastalıklı prostat ile ilişkili biyofiziksel mikro yeniden üç prostat hücre tipleri yerli RBM ve sert RBM için getirilmiştir bezi: RWPE-1, prostat epitel hücreleri (PEC) normal prostat bezinin türetilmiş; BPH-1, benign prostat hiperplazisi (BPH) etkilenen bir prostat bezinin türetilen PECS; ve PC3, metastatik prostat kanseri hücreleri kaynaklanan ikincil kemik tümörü türetilmiş. Birden çok parametre boyut, şekil ve sert RBM karşı doğal ilgili RWPE-1 ve BPH-1 tarafından oluşturulan 3D glandüler asinüs invaziv özellikleri ve ortalama hücre boyu, göç eden hız ve 3D spher hücre hareketinin devam etmesi de dahil olmak üzere, ölçülebiliraynı koşullar altında, PC3 hücrelerinin oluşturduğu Giller. yollar ve proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal de değerlendirilebilir.
Protocol
GLA Tedavi Bağlı BM Rijitlik 1.İndüksiyon (Non-enzimatik çapraz bağlanması)
- 4 ° C'de inkübe edilerek BM matrisi (10 mi) içindeki bir dondurulmuş şişesinden çözülme şişenin içeriği haline kadar sıvı (8-16 saat) (soğuk oda ya da buzdolabında buz üzerinde durmaya bırakılmıştır).
Dikkat: soğuk oda / buzdolabı kullanılmazsa, buz ile tüm şişe kapağı. Bu katılaşan gelen BM stok solüsyonu önleyecektir. - Gelecekteki deneyler için ve tekrarlanan donma çözülme döngüleri önlemek BM matrisin her yeni 10 ml flakon 25 x 0.4 ml hacimde hazırlamak. üretici tarafından belirtilen son kullanma tarihine kadar -80 ° C'de saklayın flakon. Gerektiğinde, 2 saat süreyle buz üzerinde durmaya 4 ° C'de şişe eritin.
- buz düz bir yüzey hazırlayın. Kaplama işlemi sırasında, 4 ° C bir sıcaklıkta muhafaza etmek için buz üzerine 8 oyuklu oda cam slayt yerleştirin. 4 ° C 'de BM matrisinin bir şişe çözülme.
Not: BM matrisinin bir 0.4 ml hacimli ampullere CoA'ya yeterlidirBütün bir 1 x 8-iyi odasının slayt t. katılaşmasını BM matrisi önlemek için taşıma sırasında buzla kaplı şişeyi tutun. - makas kullanılarak 200 ul pipet boşaltım ucunu kesti. 4 ° C'ye kadar kör uçlu 200 ul pipet soğutun ve 200 ul kapasitesi pipetleme yardımına onu koyun. pipet içine soğuk BM matris solüsyon 40 ul alın ve soğutulmuş 8-iyi odasının cam slayt bir kuyuya aktarın.
Not: BM çözeltisi 40 ul 0.8 cm2 arasında bir yüzey alanı kapsayacak şekilde yeterlidir. BM çözümünün katılaşmasını önlemek için kaplama işlemi sırasında soğutulmuş pipet uçları tutun. BM matris çözüm içine hava kabarcıkları tanıtmak ve iyi eşit kenarlarında görünür menisküs oluşmadan kaplanmıştır garanti etmez. - Gerekli kuyu ve odaların sayısına göre adımı tekrarlayın 1.4.
- Kaplamadan sonra, polimerizasyonun teşvik etmek için 30 dakika boyunca 37 ° C 'de 8 oyuklu odasına slayt yerDM'nin. Sıvı RBM istenmeyen rahatsızlık önlemek için çok dikkatli bir şekilde inkübatör kapağını kapatın. RBM jel dehidratasyonu önlemek için 30 dakika inkübasyon süresi aşmayın.
Not: Elde edilen jel ana yeniden BM (RBM) 'dir. 37 ° C inkübasyon adımı% 5 CO2 gerektirmez. Buna karşın rahatlık açısından 37 ° C ve% 5 (nemlendirme) CO2 ayarlanmış bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde, bu adımı gerçekleştirmek. - 0.2 M fosfat tampon maddesi (pH 7.8) içinde seyreltilmiş 50 mM glikoladehid (GLA) hazırlayın. 50 ml'lik bir şırınga kullanılarak bir 0.22 mikron bir şırınga filtreden geçirilerek çözelti sterilize edin.
- 50 mM GLA'nın 250 ul nihai hacim içinde bir çapraz bağlama reaksiyonu için 0.5 M sodyum siyanoborohidrid ya da 100 mM GLA (2x stok), 125 | il 0.2 M fosfat tamponu, 100 | il (pH 7,8-2,5 M aminoguanidin 25 ul ). 50 ml'lik bir şırınga kullanılarak bir 0.22 mikron bir şırınga filtreden geçirilerek stok solüsyonları sterilize edin.
Dikkat: Davlumbaz çalışırken bir laboratuvar önlüğü, eldiven, faceshield ve solunum giyen sodyum siyanoborohidrit tutun.
- 50 mM GLA'nın 250 ul nihai hacim içinde bir çapraz bağlama reaksiyonu için 0.5 M sodyum siyanoborohidrid ya da 100 mM GLA (2x stok), 125 | il 0.2 M fosfat tamponu, 100 | il (pH 7,8-2,5 M aminoguanidin 25 ul ). 50 ml'lik bir şırınga kullanılarak bir 0.22 mikron bir şırınga filtreden geçirilerek stok solüsyonları sterilize edin.
- polimerize RBM jel kapak ve sert RBM jel üretilmesi için bir yarı-sert bir RBM jel ya da 14 saat üretilmesi için, 6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe GLA çözeltisi 250 ul ekle.
Not: GLA hacmi polimerize RBM jel kapsamalıdır ilave edildi ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır. Farklı GLA inkübasyon süreleri kullanıldığında, RBM jelleri (2.4 Adım bakınız) RBM sertlikteki kat artışı belirlemek için analiz edilmelidir.- 37 ° C'de 14 saat süre ile, steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 250 ul bir nativ RBM jel kuluçkalanmasıyla bir negatif kontrol hazırlayın.
- 50 mM sodyum siyanoborohidrür ya da 250 mM aminoguanidin ilavesiyle, çapraz bağlama reaksiyonu esnasında Schiff baz veya Amadori adükt düzenlenmesi oluşumu engellenir İki ilave kontrol hazırlayın.
- 1 M glisin e hazırlanmasıPBS içinde seyreltilmiş methyl ester (GEE). 50 ml'lik bir şırınga kullanılarak bir 0.22 mikron bir şırınga filtreden geçirilerek çözelti sterilize edin.
- Belirtilen inkübasyon süresinden sonra, dikkatli bir şekilde çapraz bağlanmış RBM jellerinden GLA çözüm kaldırmak kontrol nativ RBM jeller kontrol RBM jeller ve PBS inhibitörleri içeren GLA çözeltisi. RBM jeller, tüm Gee çözeltisi 250 ul ilave edin ve 1 saat süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
Not: Bu adım, çapraz bağlama reaksiyonu söndürür. - GLA ve GEE tüm izlerini silmek için 500 ul PBS içinde her RBM köpükler 10 kez yıkayın. bunların su kaybını önlemek için PBS 400 ul, 37 ° C'de gece boyunca RBM jeller inkübe edin.
- YAŞ birikimi, non-enzimatik çapraz ve viskoelastik özellikleri (Adımlar 2,1-2,4) için RBM jeller analiz edin. onların viskoelastik özelliklerinin reometrik analizi için klonlama halkaları RBM jelleri (2.4 Adım) hazırlar.
- Hücre kültürü için, RBM köpükler 500 ul kültürü ile 2 kez yıkayın benihücrelerin ekim önce dia (adımları 5 ve 6). Jel yüzeye dokunarak pipet olmadan nazikçe yıkar gerçekleştirin.
Olmayan Enzimatik çapraz bağlama ve RBM Sertliği 2. Niceleme GLA ile Tedavi
- fotometrik Analizi
- GLA-tedavi AGE birikimini ölçmek ve Maillard reaksiyonu boyutunu belirlemek için fotometrik analizi kullanılarak RBM jeller kontrol edin.
- Adım 1.11 sonra 8-kuyu oda slaytlar RBM jelleri PBS kaldırmak ve 250 ul buz gibi soğuk çift distile su ekleyin. Matris tamamen sıvılaştırılmış sağlamak için 16-24 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
Not: Bu çözümde RBM peptidler oto-floresan özellikleri çağlar içerir. - 1.5 ml tüp sıvılaştırılmış BM çözeltisini ve bir spektrofotometre (eksitasyon dalga boyu = 370 nm; emisyon dalga boyu = 440 nm) kullanılarak çözeltinin floresan emisyon ölçümü.
- Adım 1.11 sonra 8-kuyu oda slaytlar RBM jelleri PBS kaldırmak ve 250 ul buz gibi soğuk çift distile su ekleyin. Matris tamamen sıvılaştırılmış sağlamak için 16-24 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- GLA-tedavi AGE birikimini ölçmek ve Maillard reaksiyonu boyutunu belirlemek için fotometrik analizi kullanılarak RBM jeller kontrol edin.
- Siyanojen bromür Peptides SDS-PAGE analizi
- GLA çapraz bağlanma ve makro elyaf oluşumuna sebep olduğunu teyit etmek için bir poliakrilamid jeli üzerinde, GLA ile muamele edilmiş ve kontrol RBM jeller giderin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 x g'de Aşama 2.1.1.2 toplanan sıvılaştırılmış BM çözeltisi santrifüjleyin.
- 2 g / asetonitril içinde seyreltilmiş siyanojen bromid ihtiva eden bir stok çözelti hazırlayın.
Dikkat: Bir laboratuvar önlüğü, eldiven, faceshield ve solunum giyerek her zaman davlumbaz siyanojen bromür anlaştım. - +% 70 h / h formik asit, 20 mg / ml siyanojen bromür 500 ul süpernatan, yeniden askıya BM jeli pelet çıkarın ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir.
- 3.5 kDa kesilmiş bir moleküler ağırlığa sahip bir diyaliz kaseti içine yeniden süspansiyon haline BM jeli pelet transfer etmek için 1 ml tek kullanımlık şırınga kullanın.
- 500 çift damıtılmış su ilave edildi ve manyetik bir karıştırma çubuğu ihtiva eden 500 ml'lik bir cam kabın içine kaseti daldırın.bir manyetik karıştırıcı üzerine bu yerleştirin ve siyanojen bromür ve formik asidin tüm izlerini silmek için (soğuk bir odada) gece boyunca 4 ° C 'de (16 saat) diyaliz.
- 1.5 ml tüp içine kaset diyaliz BM çözüm aktarmak için 1 ml tek kullanımlık şırınga kullanın.
- % 12 h / h poliakrilamid jeli 10,11 her dengeleme örnek 25 ul analiz eder. SDS-PAGE takiben, siyanojen bromür-matris peptidler 13 elektroforetik desen görselleştirmek için poliakrilamid jel 12 gümüş boyama yürütmek.
- GLA çapraz bağlanma ve makro elyaf oluşumuna sebep olduğunu teyit etmek için bir poliakrilamid jeli üzerinde, GLA ile muamele edilmiş ve kontrol RBM jeller giderin.
- Immünoflüoresan mikroskopi analizi
- GLA immunofluorescent boyama tedavi gerçekleştirmek ve anti-AGE / pentosidin, anti-kollajen IV ve çapraz RBM biriken yaş ve kollajen IV / laminin lif yapısal yeniden düzenlenmeleri görselleştirmek için konfokal mikroskobu ile takip anti-laminin antikorları 13 jelleri ile RBM jeller kontrol eder.
Not: Her zaman enti kapsayacak şekilde yeterli hacim kullanımıpipet ile RBM yüzeyine dokunmadan inkubasyon ve yıkama sırasında RBM jel yeniden. Immünofloresan 3D acininin kültürleri analiz ayrıntılar için referans 6 bakınız ve 3D asini konfokal mikroskopi için başvuru 14 bkz.- Yıkama GLA PBS + 300 ul, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (PBS, 0.1 mM CaCl2 ve 0.5 mM MgCI2 ihtiva eden) ile 8-kuyu oda slaytlar 2 kere muamele edilmiş ve kontrol RBM jeller.
- PBS + sonra her RBM jel karşılamak için PBS + içinde seyreltilmiş h paraformaldehid (PFA) w /% 4 300 ul çıkarın. RBM bileşenleri gidermek için, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- PFA solüsyonu w / v% 4 çıkarın. 75 mM NH4CI + 0.5 mM MgCl2 çözeltisi 300 ul ilave edin ve tespit sönmesi için (5x tekrar) oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- HPO 4, 3.5 mM NaH 130 mM NaCl, 7 mM Na 2: steril su içinde aşağıdaki çözümü yaparak İmmünofloresan tampon (tampon IF) hazırlayın2 PO 4, 7.7 mM NaN3,% 0.1 w / v sığır serum albümin,% 0.5 h / h polietilen glikol-tert-oktilfenil eter ve% 0.05 hacim / hacim polietilen glikol sorbitan monolaurat.
- tamamlamak suretiyle tampon engelleme IF hazırlayın IF% 20 v / v keçi serumu ile tampon.
- söndürme çözüm çıkarın ve RBM jelleri engelleme tampon spesifik olmayan reaksiyonları önlemek için IF 300 ul ekleyin. bir çalkalama platformu üzerinde, oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
- IF Bloklama tamponunu çıkarın ve sulandırılmış birincil antikor 300 ul 4 ° C 'de 16 saat boyunca RBM jeller inkübe bloke edici tampon alınırsa (1: 500, fare anti-pentosidin mAb, 1/250 tavşan anti-kolajen IV pAb 1; / 250 tavşan anti-laminin A / C pAb).
Not: daha uzun bir süre 20 saat İnkübasyonlar 4 ° C'de RBM sıvılaştırmak için. - bir çalkalama platformu üzerinde oda sıcaklığında IF tampon 300 ul ile 3 kez (10 dk), birincil antikor çıkarın ve yıkayın.
- IF tamponu çıkarın vebloke edici tampon IF 500: 1 seyreltilmiş bir fluorokrom ile konjüge edilmiş sekonder antikor 300 ul (keçi anti-tavşan veya anti-fare IgG: [H + L]) ekleyin. bir çalkalama platformu üzerinde, oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
- ikinci antikorları ayıklamak ve oda sıcaklığında 10 dakika süre ile tampona 300 ul inkübe edin. IF tamponunu çıkarın ve oda sıcaklığında PBS + 300 ul 3 x 10 dakika yıkama.
- (Basamak 2.3.1.2 ve 2.3.1.3), yukarıda tarif edildiği gibi, saptamak ve ikinci kez gidermek.
- montaj medya lekeli RBM jeller monte edin ve Epifluorescent veya konfokal mikroskopi kullanılarak ana bileşenleri yoğun demetleri oluşumunu analiz.
Not: Immünofloresan 3D acininin kültürleri analiz ayrıntıları referansı 6 görmek ve 3D asini epifluorescent ve konfokal mikroskopi için başvuru 14 için bkz.
- GLA immunofluorescent boyama tedavi gerçekleştirmek ve anti-AGE / pentosidin, anti-kollajen IV ve çapraz RBM biriken yaş ve kollajen IV / laminin lif yapısal yeniden düzenlenmeleri görselleştirmek için konfokal mikroskobu ile takip anti-laminin antikorları 13 jelleri ile RBM jeller kontrol eder.
- Reolojik analiz
- GLA'nın reometrik analizine muamele gerçekleştirmek ve v ölçmek için RBM jeller kontroliscoelasticity (sertlik).
- 8 mm çapında dairesel bir kalıp içinde 1 mm kalınlığında olan RBM jeller ayarlayın. Bunu yapmak için, 24-çukurlu kültür plakasının bir kuyu içine bir klonlama halkası (8 mm çapında) yerleştirin ve BM Adımlar 1.3-1.6 de tarif edildiği gibi hazırlanan matris çözeltisi ilave edilir.
Not: deneyler için kullanılan RBM jeller doğru tekrarlama için reometrik analiz için hazırlanmıştır RBM jeller 8 oyuklu kabinlerde ayarlanan RBM jeller aynı yüzey alanına ve kalınlığı olmalıdır. Şekil 3'te analiz RBM jeller 1 mm kalınlığında ve 8 mm çapında idi. - (Basamak 1.11 1.8) yukarıda tarif edildiği gibi 14 saat boyunca 6 saat boyunca PBS, GLA ve GLA ile klonlama halkaları kurulmuş RBM jeller tedavi edin.
- Sabit bir frekans 1Hz Osilasyon ve 21 ° C'lik bir sıcaklıkta,% 1-3 soyun bir dizi içinde, paralel levha geometrisini tırtıklı bir 8 mm olan bir reometre 8 mm çapında RBM jeller elastikiyet modülüne (E) ölçün. hakkında ek ayrıntılar içinECM jellerin reometrik analiz referansları referans 13,15,16 bkz.
Not: E ', aşağıdaki denklem e = 2 * kullanımı yoluyla G oluşan kesilme depolama modülü (G') belirlenir * (1 + V) referans 13,15 tarif edildiği gibi V, 0.5 Poisson oranıdır 16.
- 8 mm çapında dairesel bir kalıp içinde 1 mm kalınlığında olan RBM jeller ayarlayın. Bunu yapmak için, 24-çukurlu kültür plakasının bir kuyu içine bir klonlama halkası (8 mm çapında) yerleştirin ve BM Adımlar 1.3-1.6 de tarif edildiği gibi hazırlanan matris çözeltisi ilave edilir.
- GLA'nın reometrik analizine muamele gerçekleştirmek ve v ölçmek için RBM jeller kontroliscoelasticity (sertlik).
3. Kültür ve Normal PEC hattının taşınması, RWPE-1
- Büyüme RWPE-1 5 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş keratinosit serumsuz ortamdaki hücreler (KSFM), 50 ug / ml büyükbaş hayvan hipofız bezi ekstraktı (BPB) ve 50 | ig / ml streptomisin, 50 U / ml penisilin ( ) KSFM tamamlayın.
Not: epitelial-To-mezenşimal uyarılmasını önlemek için (EMT) -benzeri geçiş serum RWPE-1 hücreleri maruz değildir. Tam KSFM 4 ° C'de depolama çıkardıktan sonra, 30 dakika boyunca oda sıcaklığına ulaşması ve EGF ve BPE inaktive gibi bir 37 ° C su banyosu içinde, sıcak yok izin verin. - tam aspireRWPE-1 hücrelerinin konfluent 10 cm2 tabaktan KSFM, önceden ısıtılmış PBS, 5 ml ile yıkayın ve hücreler çözeltisi ile kaplanmıştır sağlamak 5 mi% 0.05 h / h tripsin ekleyin.
- 5 ila 10 dakika için 37 ° C ve% 5 CO2 (nemlendirme) standart koşullar ayarlanmış bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde hücreleri yerleştirin. 5 dakika sonra trypsinization ölçüde kontrol edin ve yavaşça hücreleri ayırmak için kültür plaka dokunun.
Not: aynı anda birden fazla iki plaka kolu için tavsiye edilir, böylece RWPE-1 hücreleri, tripsinizasyon ve uzun süre hoş değildir. Klonal seçimi önlemek için plaka tüm hücreleri ayırmak için de önemlidir.
- 5 ila 10 dakika için 37 ° C ve% 5 CO2 (nemlendirme) standart koşullar ayarlanmış bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde hücreleri yerleştirin. 5 dakika sonra trypsinization ölçüde kontrol edin ve yavaşça hücreleri ayırmak için kültür plaka dokunun.
- Tüm RWPE-1 hücreleri, ilişkisiz sonra, tripsin gidermek için% 2 hac / hac cenin dana serumu (FCS) ihtiva eden sıcak bir 5 ml PBS ilave edin. Yavaşça bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmadan önce hücre agrega kırmak için aşağı yukarı pipet ve.
- x 125-150 de kopuk hücreleri Santrifüj25 ° C'de 5 dakika boyunca süpernatanı atmak ve tek hücrelerden oluşan bir süspansiyon elde edilene kadar tam KSFM 5 ml hücre pelet yeniden askıya.
- Aktarım 1 yeni bir tüpe yeniden süspansiyon hücreleri mi ve 1 hücreleri yaymak için tam KSFM 9 ml ekleyin: takip eden deney kullanım için 5 kanalı seyreltme. asinüsü kurmak için bir hemasitometre kullanarak hücrelerin geri kalanını sayın (Bölüm 5.1).
Not: Kültür sonra uzun süreli beri 10'dan fazla pasajlar için yapmayın kültür RWPE-1 hücreleri Doğru mimarisi ile asinüsü oluşturmazlar. - kültür Ortam EGF ve BPE aktif kalmasını sağlamak için her 48 saat değiştirin.
Not: 48 saat ötesine herhangi tedaviler için bu orta değişikliği ekleyin.
4. Kültür ve BPH Hücre Hattı Taşıma, BPH-1
- RPMI kültür BPH-1 hücreleri, 1640 ortamında 50 U / ml penisilin ve 50 | ig / ml streptomisin,% 5 v / v FCS ile tamamlanmaktadır. Isınmakültür ortamı, PBS ve% 0.25 w / v kullanımdan önce 37 ° C tripsin 0.53 M EDTA çözeltisi.
Not: hücreler,% 2.5 v / v FCS 8 ortam içinde kültive edilebilir. - BPH-1 hücrelerinin konfluent 10 cm2 tabaktan kültür ortamı aspire ve tripsin reaksiyonu söndürmek olabilir serumlu kültür ortamı tüm izlerini çıkarmak için PBS 3 ml hücreleri 2 x yıkayın.
- PBS aspire ve hücreleri kapsayan tripsin-EDTA çözeltisi 3 ml. 5 dakika için 37 ° C ve (nemlendirme)% 5 CO2 ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde plaka koyun. Hücreler yuvarlak ama çanak bağlı kalır zaman tripsin-EDTA çözüm çıkarın. 5 ml PBS ile hücreleri yıkanır.
- PBS uzaklaştırıldıktan sonra, tek bir hücre süspansiyonu üretmek için aşağı kültür ortamı 5 ml ilave edilir ve yavaşça yukarı pipet ve. 15 ml'lik bir tüpe hücreleri aktarın.
- tam ortam 8 ml ile yeni bir santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 2 ml alın ve BPH-1 hücreleri plaka ontsonraki deneysel kullanım için 5 pasaj seyreltme: 1 at oa 10 cm 2 kültür plakası. asinüsü kurmak için bir hemasitometre kullanarak hücrelerin geri kalanını sayın (Bölüm 5.2).
Not: Uygun bir mimari ile asinüsü oluşturmayan eski BPH-1 hücreleri gibi, geçit sayısının kaydını tutun. Bir geçit sayısı 10'dan fazla arzu edilmez. - kültür Ortam her 72 saat değiştirin.
Yerli ve Sert RBM üzerinde Prostat Bezi asini 5. 3D Kültürü
- RWPE-1 hücreleri, asinüsü oluşturan komple KSFM 300 ul içinde aşama 3,5 hazırlanan 5000 hücreleri seyreltilmesi için kullanılıyorsa dengeleme çözeltisi,% 2 h / h ile takviye edilmiştir.
- BPH-1 hücreleri, asinüsü oluşturan dengeleme çözeltisi,% 2 h / h ile desteklenmiş RPMI 1640 kültür ortamı 300 ul adım 4.5 hazırlanan 2500 hücreleri seyreltilmesi için kullanılıyorsa.
Not: BPH-1 hücreleri cul 6 gün sonra asinüs benzer bir dağıtım elde etmek için kullanılır BPH-1 hücrelerinin, böylece daha düşük sayıda RWPE-1 hücreleri daha büyükTure. - Yavaşça 37 ° C ve% 5 CO 2 set bir kuluçka kültürlerin yer dikkatle yerli ve AGE-kasıldı RBM üzerine hücreleri tohum ve (nemlendirme) ile kuyudaki ve her hücrenin bölünmesinden büyüyen asini eşit dağılımını sağlamak için bir acina üretmek.
- Her 2 günde bir hücreleri büyüme faktörleri, normal acina için gerekli olmasını sağlamak için,% 2 h / h BM çözeltisi içeren taze kültür ortamı ile kültür ortamı yerine homeostasis.
- Aydınlık mikroskopi 13 ile büyüyen kültürlerde asiner morfolojisi izleyin.
Not: kültür 3 gün sonra tek tek hücreler> 3 hücrelerinin bir küme oluşturacak ve • bir çapı olan 1 hafta prostat bezi asinüs sonra 50 um gözlemlenecektir. - Hücre-matris adezyonlar, hücre-hücre adezyon, apico-bazal polarite ve invaziv 13 markerler için spesifik antikorlar kullanılarak immünofloresans gerçekleştirmek için 2.3 tanımlanan protokol takip edin.
Yerli ve Sert RBM 6. 3D Kültür Prostat Tümör Hücre Büyüklükleri
- 50 ug / ml streptomisin,% 10 v / v FCS ve 50 U / ml penisilin içeren RPMI 1640 ortamı içinde kültür PC3 hücreleri. kullanımdan önce, 37 ° C'de kültür ortamı, PBS ve% 0.25 w / v tripsin 0.53 M EDTA çözeltisi ısıtın.
- PC3 hücrelerinin konfluent 10 cm2 kültür kabı kültür ortamı aspire ve hücreler tripsin reaksiyonu söndürmek için FCS tüm izlerini silmek için PBS 3 ml 2x yıkayın.
- PBS aspire ve hücreleri kapsayan ve 1 dakika boyunca inkübasyona tripsin-EDTA çözeltisi 3 ml.
- Hücreler yuvarlak olmak, ama dikkatlice tripsin-EDTA çözeltisi aspire PBS 3 ml ile yıkanır, çanak bağlı kaldığındaTripsin tüm izlerini silmek.
- PBS uzaklaştırıldıktan sonra, tek bir hücre süspansiyonu üretmek için aşağı kültür ortamı 5 ml ilave edilir ve yavaşça yukarı pipet ve. 15 ml'lik bir tüpe hücreleri aktarın.
- Yeni bir santrifüj tüpüne PC3 hücre süspansiyonu 1 ml alın ve kültür ortamı 9 ilave edin. Daha sonra, deneysel kullanım için, 10 cm 2 kültür kabı (1:10 seyreltme) ile, hücreler plaka. Bir hemasitometre kullanarak kalan hücre sayımı.
- kültür bir gradyan jel oluşumuna imkan vermek için BM çözeltisi,% 2 h / h ile desteklenmiş RPMI 1640 kültür ortamı 300 ul içinde aşama 6.6 hazırlanan 2.500 PC3 hücreleri seyreltilir.
- Yavaşça yerli ve AGE-kasıldı RBM üzerine hücreleri tohum ve dikkatle kuyuda parçacıklarının büyüyen eşit dağılımını sağlamak için 37 ° C ve (nemlendirme) ile% 5 CO 2 set inkübatör içine kültürü yerleştirin.
- kültür Ortam her 72 saat değiştirin.
- sert (YAŞ-zengin) RBM etkisini araştırmak içinprostat tümörü hücre göçü, sıcaklık / CO2 kontrol ve nemlendirilmiş bir odasını 17 kullanılarak aydınlık, video time-lapse mikroskopi kullanılarak görüntü PC3 hücreleri üzerinde.
Not: PC3 hücreleri yerli RBM üzerinde ipliklerini yetişen ve bir lümen asinüsü formu yok, ama yerli RBM fazla 72 saat büyümeye bırakılırsa onlar 3D parçacıklarının oluşturacaktır. - Veri toplama sonra, elle PC3 hücreleri izlemek ve onların göç hızı, şekli (uzama oranı) ve göç 17-19 sürekliliğini hesaplayın.
Not: Sebat = oranı D / T, D = mesafe baştan hücre yörünge, hücre yörünge T = toplam uzunluğunun sonuna kadar.
Representative Results
Sert RBM 3D Prostat asinüsü Kültür
Kültürde 6 gün sonra, Halk, normal prostat dokusu elde edilen (RWPE-1) (Şekil 1 A) Prostat dokusu (SPH-1) epitel düzgün sferoidler şeklinde düzenlenir (Şekil 1B) yerli (PBS ile tedavi edilmiş) RBM form acininin hücreler. Bu acininin da kutuplarına-bazal-apikal ve görünür bir lümen alanı 13,20 ile son derece organize Halk özelliklerine sahip.
Normal prostat dokusu elde Halk oluşturduğu acininin (RWPE-1) (Şekil 1 A) ve (GLA ile muamele edilmiş) sertleştirilmiş (AGE zengin) RBM BPH dokusunun (BPH-1), (Şekil 1B), bir bozulmuş bir mimariye sahip (vites şekil ve hücrelerde çokgen için sfero itibaren) AGE zengin RBM) (Şekil 1A içine asinüs göç / çıkıntılı. Bunlar acininin aynı zamanda küçük veya hiç lümen boşluk 13 ile apikal-to-bazal polarite kaybetmiş yüksek dağınık Halk ile karakterize edilir.
Şekil 1:. Ana ve sert tekrar oluşturulmuş temel membran (RBM) 3D Bez asinüs olarak yetiştirilir Prostat Epitelyal hücreler (A), RWPE-1 hücrelerinin aydınlık ve görüntüler, PBS (ana) ya da işlemden RBM jelleri üzerinde 6 gün, 12 saat kadar yetiştirilen 14 saat (; sert AGE-zengin) için 50 mM glikoladehid; Ölçek çubuğu 50 mikron =. Panel A'da açıklandığı gibi büyütüldü (B) BPH-1 hücreleri; Ölçek çubukları 50 mikron =; Veri 3 bağımsız deneyler temsilcisidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1 "src =" / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg "/>
Tablo 1:. Yerli Yarı Sert ve sert tekrar oluşturulmuş temel membran (RBM) Yetiştirilen Prostat Epitelyal RWPE-1 asinüs özellikleri RWPE-1 acininin GLA (RBM 14 saat (yerli) izleyerek, sulu PBS ile önceden tedavi edilen büyütüldü ) 6 saat (yarı-sert) veya 14 saat (sert) için GLA. asiner şekli için, yüzde (%) yuvarlak standart sapma (SD) ±, yarı köşeli ve çokgen acininin (50 acininin durum başına miktarı) 5 bağımsız deneyden hesaplandı. Bağıl asiner boyutu 3 bağımsız deneyler (yerli RBM =% 100) hesaplandı. invaziflik için, bir veya daha fazla çıkıntı yapan hücrelerin SD asinüs ±% 3 bağımsız deney ile hesaplandı. Katlama değişim doğal koşullar için karşılık gelen değeri ile yarı sert veya sert koşullar altında elde edilen ortalama değer bölünmesi ile hesaplanır. P değerleri, Öğrenci t-testi (α = 0.05) kullanılarak hesaplandı.
PC3 hücreleri AGE-zengin (sertleßmiß) üzerinde büyümüş, oysa yerel RBM yetiştirilen PC3 hücreleri birbirlerine (Şekil 2A) için bağımsız olarak, sürekli hücre-hücre teması sağlanarak RBM hareket geçirmek. Kültür PC3 hücreleri 72 saat yerli üzerine odaklar (sferoidler) oluşturmak sonra sferoidler değil yapmak ve bağımsız (Şekil 2B) göç sert (YAŞ-zengin) RBM üzerinde PC3 hücreleri ise, RBM (PBS tedavi). Sert (YAŞ-zengin) RBM üzerinde PC3 hücreleri yerli RBM (Şekil 2C) yetiştirilen PC3 hücreleri daha uzundur. Sert RBM üzerinde PC3 hücreleri yerli RBM (Şekil 2B) yetiştirilen PC3 hücreleri daha hızlı göç ederler. Sert RBM ilgili PC3 hücreleri doğal RBM (Şekil 2E) üzerinde büyümüş PC3 hücreleri ile karşılaştırıldığında kalıcılık olarak bir azalma sergilerler.
Şekil 2:. Yerli ve Sert Sulandırılmış Bodrum Membran (RBM) üzerine Prostat Tümör Hücre Göç (A) 14 saat süreyle PBS (yerli) veya 50 mM glikoladehid ile tedavi RBM jeller üzerinde yetiştirilen PC3 hücreleri aydınlık görüntüleri (YAŞ zengin, sert) . Hücreler, bir aydınlık mikroskop (10x objektif) ve yörüngeleri üretmek için takip hücre ardından 12 saat boyunca saat başına 1 resim bir alıcı oranı kullanılarak görüntülendi. Gösterilen görüntüler, 0, 3, 6, 9 ve 12 saat sonraki zaman noktalarında karşılık gelmektedir. tek hücre yörüngeleri 12 saat bir zaman noktası için gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Panel (A) 'da tarif edildiği gibi (B)' PC3 hücreleri 72 saat için yerli veya sert RBM kültüre ve görüntüsü alınmıştır. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Detay 2X büyütme seçilen alanı göstermektedir. (C) Ortalama ± SD hücre uzunluğu (um); yerli RBM ve sert RBM arasında anlamlı bir fark (p = 1.2 x 10 -23). (
Discussion
Saf RBM jeller 6 MECS 3D glandüler asinüs üretilmesi için bir protokol I RBM matrise kolajen 4 mg / ml tip eklenmesiyle yapılan bir çalışmada değiştirildi. kollajen eklenmesi 1589 ± 380 Pascal 175 ± 37 artan RBM jel elastik modül ile sonuçlanmıştır. Sertlik Bu 9.1 katlık bir artış MECS 21 büyüme, hayatta kalma, göç ve farklılaşmayı modüle. - (-) - RBM jele ilave edilmiştir tip I kollajenin enzimatik olmayan çapraz bağlanmasını teşvik etmek riboz Protokol D ile muamele aşaması içerecek şekilde tekrar modifiye edildi. Sertlik Elde edilen 15 kat artış onların invaziv davranış 22 teşvik etmek MECS onkojenik dönüşümü ile işbirliği bulunmuştur. Ben RBM jeller kollajenin ekleme Çeşidi deneysel yaklaşım sadece stroma arasındaki fiziksel bariyer sonra insan dokusunda meydana kolajen lifleri ile MECS doğrudan etkileşimi kolaylaştırırve BM sağladığı epitel proteolitik bozulmaya uğrar. Saf RBM jeller GLA ile ön işlemden de Halk 3D bez asinüsü üreterek, mevcut protokol BM sertliği başına onların invaziv davranış (Şekil 3) tetikleyebilir nasıl incelemek için bir yol açar. Bu protokol kaynaklı BM sertlik seviyeleri fizyolojik alaka var. 6 saat, 14 saat süre ile, 50 mM GLA ile inkübasyon, sırasıyla PBS (Tablo 1) ile muamele RBM jeller 122 ± 55 Pascal göre 175 ± 90 ve 322 ± 160 saf RBM jel elastik modülü artmıştır. RBM sertliği bu 1,7-3,2 misli artış normal prostatta ve BPH dokusunun 23-26 ile karşılaştırıldığında habis gözlenen sertlik 2.5- 3.4-kat artış tartışıldı. Son yayında PEC asini YAŞ ve RBM sertlik birikimi ile oluşturulan 13 morfolojik değişiklikler belirtildiği gibi ar dan istatistiksel olarak anlamlı vardiyası için sayısal olabilirçokgen şekline ounded luminal / toplam asinar alan ve yaş bakımından zengin RBM (Şekil 3) içerisine acina taşıma çıkıntı yapan hücrelerin azalmıştır. İmmünoblotting da EMT belirteçleri değerlendirmek ve kasılma davranışı (örneğin fosforlu miyosin hafif zincir-2, pMLC2 13) sert RBM normale karşı yetiştirilen Halk (Şekil 3) (E-kadherin 13 örneğin kaybı) kullanılabilir. 130: ve GM130 erken endozomal antijeni 1: immünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi kullanılarak daha fazla değerlendirilmesi (örneğin, laminin, kolajen IV ve AGE birikimi 13), hücresel apikal-to-bazal polarite (örneğin, apikal EEA1 lokalizasyonu BM görselleştirmek için uygulanabilir kDa sis-Golgi işaretleyici 13) ve yapışma moleküllerinin hücre modelleri (hücre-hücre kavşaklarından 13 örneğin e-kaderin yerelleştirme) (Şekil 3).
Şekil 3:. Burada sunulan Farklı Protokoller genel şeması (hazırlamak ve glikoladehid (Maillard reaksiyonu) ile yeniden bazal membran (RBM), sert RBM için hücreleri tohum nasıl nasıl sert RBM analiz pekiştirmek için nasıl tasvir Maillard reaksiyonu), ve yaş bakımından zengin RBM neden olduğu hücresel ve moleküler değişimleri analiz etmek için kullanılabilir prosedürlerin ölçüde. YAŞ, gelişmiş Glikasyon Son; BM, bazal membran; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol; EEA1 erken endozomal antijeni 1; GAPDH, gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz, GLA izleyerek, sulu; GEE glisin etil ester; GM130, 130 kDa'lık bir sis-Golgi işaretleyici; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), miyozin hafif zincir-2 siteleri fosforile 18 ve serin 19 treonine; RBM, tekrar oluşturulmuş temel membran; SDS-PAGE sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi. RWPE1 acininin Ölçek çubuğu = 10 mm; PC3 tümör hücresi içinSferoidler Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakam referans 13 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- (-) - Riboz RBM için çapraz bağlama maddesi olarak seçilmiştir D ise giderme adımları gereklidir. - (-) - 72 saat boyunca riboz, daha önce RBM / kollajen jel 22 için tarif edildiği gibi, RBM jeller dehidrasyon ve çekme ile sonuçlanmıştır protokolü gelişimi sırasında, 1 M, D ile tedavi olduğu bulunmuştur. - (-) - D düşük konsantrasyonlarda değerlendirilmesi riboz ve daha kısa tedavi süreleri bu sınırlamayı aşmak için yardımcı olabilir.
RBM sertlik yüksek seviyelerde arzu nerede protokol gelecekteki uygulamalar bir potansiyel sınırlama karşılaştı olabilir. uzun inkübasyon süreleri ve GLA'nın daha yüksek konsantrasyonlar RBM jel sertliği yüksek seviyelerini indüklemek için, kullanılacak ise gerekli olacaktır Bu tedavi koşulları hücrenin hayatta kalması ve çoğalması üzerinde bir etkisi olup olmadığını önceden 13 açıklandığı gibi, değerlendirmek. Ayrıca, serum ile RWPE-1 hücrelerinin inkübasyon kaçınılmalıdır serum veya serum ihtiva eden malzeme, bir fenotipik EMT benzeri geçiş ve maruz indükler unutulmamalıdır. Deneyler kısa RNA (siRNA) oligonükleotidleri müdahale transfeksiyonunu içeren, örneğin, işlemin düşük serum transfeksiyon ortamı hücrelerin geçmeden KSFM yetiştirilen RWPE-1 hücreleri kullanılarak optimize edilmelidir. geçici siRNA kullanılarak modelde yaklaştığında genin seviyesini tehlikeye atabilecek Bu dezavantajı elde susturulması. Bazı protein hedefleri için ayarlanabilir gen susturma ve protein düzeyleri istenen düşüşün indüklenebilir shRNA vektörler istihdam için tavsiye edilir. Stromal hücre veya tümör hücresi bağlantılı lisil oksidaz (LOX) 17 enzimatik çapraz bağlanmasını dahil uyarlamalar da gelecek modelleri içine dahil edilebilir.
jove_content "> Bu protokol yanlısı invaziv Halk AGE-bağımlı BM sertliği tarafından tetiklenen mekanizmaların (RWPE-1, BPH-1) ve invaziv PTCs (PC3) anti-metastatik hedeflerin değerlendirilmesi gelecekteki çalışma kolaylaştıracaktır. BPH göz önüne alındığında bir metabolik bozukluk 27 olarak kabul edilir, bu protokol aynı zamanda metabolik bozukluklar ve artan prostat kanseri riski arasındaki bağlantıyı bizim daha iyi anlaşılması yönünde önünü açıyor. AGEs onun maruz tarafından uyarılan BM sertlik diğer kanser invazivlik için bir tetikleyici olabilir göz önüne alındığında türleri, diğer organların (örneğin meme, kolon, yumurtalık, pankreas) normal epitel hücreleri ve tümör hücrelerini birleştirmek benzer modeller kurmak için protokolünü kullanmak için ilgi olacaktır.Birlikte zamanlamaları ile bir protokol dahilinde kritik adımlar, Şekil 4'te özetlenmiştir. İlk aşamasında o onun pol önlemek için thaws ise 4 ° C'de RBM stok solüsyonu korumak için esastırymerization. bunlar, 4 ° C'ye soğutulmuş kadar pipet uçları rM hazır çözelti içine yerleştirilmesi gerekir. Bir sonraki adım için bunların RBM çözeltisi ile kaplanır önce bölmeli lamlar 4 ° C'ye dengelenmiş emin olmak için önemlidir. En kısa RBM çözeltinin sıcaklığı, 4 ° C üzerinde bir artış gibi bir jel oluşturmak için geri dönüşü olmayan bir polimerizasyon geçirecektir. Temel RBM bir daha da hücre kültürü ve mikroskobik analizi için uygun bir yüzey oluşturur sağlamak için polimerleştirme aşamasında rahatsız olduğunu. veya Maillard reaksiyonu (sodyum siyanoborohidrit ve amingoguanidine) önleyicileri olmayan GLA ile inkübasyon süresi RBM jel haline kadar sert belirleyecektir. Sert koşullar (Tablo 1) gerekiyorsa Yarı sert koşullar gerekiyorsa GLA ile 6 saat inkübasyon kullanılması tavsiye ve 14 saat inkübasyon edilir. GLA Alternatif inkübasyon süreleri veya konsantrasyonları farklı düzeylerde ise kullanılabilirsertliğin arzu edilir. RBM jellerinin Bu durumda, reolojik analizde temel bir adım olarak dahil edilmesi gerekir. GEE ile inkübasyon ve PBS ile müteakip yıkama adımları ile Maillard reaksiyonu söndürülmesi adımını takiben, RBM jeller hemen kullanılabilir ya da önceki hücre kültürü için kullanımı ile en fazla 48 saat boyunca 4 ° C'de saklanır. hücre kültürleri ayarlandıktan sonra her iki gün (herhangi bir tedavi de dahil olmak üzere), kültür ortamı değiştirmek önemlidir. Araştırma altındaki parametrelerine göre 3-12 gün için 3 boyutlu hücre kültürleri korumak için tavsiye edilir. 3D için PEC 6 gün sonra kültürleri analiz etmek tavsiye ve 3D PTC ilk etapta kültür 3 gün sonra tavsiye edilir analiz sferoidler için olan asinüsü.
Şekil 4:. Kritik Adımlar ve Zamanlamaları'na ile Protokol Basit Bakış gösterilen flow şeması hazırlamak ve belirtilen kritik adımlar ve zamanlamaları ile glikoladehid (Maillard reaksiyonu) ile yeniden bazal membran (RBM) pekiştirmek için nasıl göstermektedir. Protokol durdurulabilir ve RBM jeller saklanan Nokta de belirtilmiştir. RBM, tekrar oluşturulmuş temel membran; GLA izleyerek, sulu; GEE glisin etil ester; AÇIK, gecede; PBS, fosfat tamponlu salin; RT, oda sıcaklığı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I - Material for monolayer culture | |||
| BPH-1 | CaP Cell Line Database | PCaCL-132 | Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu |
| Complete keratinocyte serum-free media | ThermoFisher Scientific | 17005-075 | Do not warm at 37 ºC before use |
| Fetal calf serum | First Link UK Ltd | 02-00-850 | Store at -20 ºC in aliquots |
| PC3 | American Type Culture Collection | CRL-1435 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets | Oxoid | BR0014G | |
| RPMI 1640 medium | Sigma-Aldrich | R5886 | warm in 37 ºC water bath before use |
| RWPE-1 | American Type Culture Collection | CRL-11609 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| II - Material for 3D culture | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Aminoguanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 396494 | Irritating to eyes, respiratory system and skin |
| Chamber slides, 8-well | Thermo Scientific Nunc Lab-Tek | TKT-210-816M | |
| Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract | AMS Biotechnology | 3445-005-01 | Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots |
| Cyanogen bromide | Sigma-Aldrich | C91492 | Toxic by contact skin and inhalation |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) | Sigma-Aldrich | 50060 | Irritating to eyes |
| Glycolaldehyde dimer (GLA) | Sigma-Aldrich | G6805 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation |
| Syringe filter 0.22 microns | Appleton Woods | BC680 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| III - Material to quantify Maillard reaction | |||
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThemoFisher Scientific | D3571 | light sensitive and store at -20 ºC in aliquots |
| Cloning cylinders | Sigma-Aldrich | C1059 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11001 | light sensitive |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11034 | light sensitive |
| Goat serum | Abcam | ab7481 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Vectashield mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb | TransGenic Inc | KH012 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | F8775 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody | Acris Antibodies | R1041 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Rabbit anti-laminin A/C pAb | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-7292 | Store at -20 ºC in aliquots |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dialysis cassette Slide-A-Lyzer | ThemoFisher Scientific | 66333 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IV - Equipment | |||
| ARG2 controlled strain rotational rheometer | T.A. Instruments | ||
| Axiovert S100 (20X magnification) microscope | Zeiss | ||
| CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope | Solent Scientific | ||
| Confocal Axiovert 200M (40X, 63X magnification) microscope | Zeiss | ||
| Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast | Olympus | ||
| PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer | BMG Labtech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| V - Software | |||
| Image J 1.47v | National Institute of Health, USA | ||
| MetaXpress | Molecular Divices |
References
- Timpl, R., Brown, J. C. Supramolecular assembly of basement membranes. Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).
- Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks. Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).
- Halfter, W., et al. Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes. Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).
- Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane. Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).
- To, M., et al. Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes. Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18. Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).
- Hayward, S. W., et al. Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).
- Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3). Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).
- Rodriguez-Teja, M., et al. AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival. J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations. J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).
- Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK. Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).
- Caley, M. P., et al. Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces. Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).
- Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis. J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).
- Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly. J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).
- Rodriguez-Teja, M., et al. Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147. Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Carson, W. C., et al. Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic. Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).
- Hoyt, K., et al. Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer. Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).
- Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression. Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).
- Zhang, M., et al. Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology. Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).
- Corona, G., et al. Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions. Int J Endocrinol. , Article ID:329456 (2014).
