Abstract
Ekstrakromosomale cirkulære DNA (eccDNAs) er almindelige genetiske elementer i Saccharomyces cerevisiae og er rapporteret i andre eukaryoter også. EccDNAs bidrager til den genetiske variation blandt somatiske celler i flercellede organismer og til udviklingen af encellede eukaryoter. Der er behov for følsomme metoder til påvisning eccDNA at afklare, hvordan disse elementer påvirker genom stabilitet og hvordan miljømæssige og biologiske faktorer inducerer deres dannelse i eukaryote celler. Denne video præsenterer en følsom eccDNA-rensningsmetode kaldet Circle-Seq. Metoden omfatter kolonne rensning af cirkulært DNA, fjernelse af resterende lineære kromosomale DNA, rullende cirkel forstærkning af eccDNA, dyb sekventering, og kortlægning. Omfattende exonukleasebehandling var nødvendig for tilstrækkelig lineær kromosomale DNA-nedbrydning. Det rullende-cirkel amplifikation trinine-height:. normal; "> φ 29 polymerase beriget for cirkulært DNA i lineær DNA Validering af Circle-Seq metode på tre S. cerevisiae CEN.PK populationer af 10 10 celler opdaget hundredvis af eccDNA profiler i størrelser større end 1 kilobase . Gentagne fund af ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 gener på cirkulært DNA i både S288C og CEN.PK tyder på, at DNA cirkularisering er bevaret mellem stammer på disse loci. i sum, Circle-Seq metode har bred anvendelighed til genom-skala screening for eccDNA i eukaryoter såvel som til påvisning af specifikke eccDNA typer.
Introduction
Detektering tidligt eller forbigående kromosomale amplifikation er vanskeligt, fordi det kræver at identificere ændringer i enkelte DNA-molekyler i store populationer af celler. Kromosomale kopi-nummer variationer (CNVs) er generelt opdages godt efter deres etablering, så kun den endelige CNV struktur som bevis for den mekanisme, der genererede variation 1,2. Afsløring og inddrive ekstrakromosomalt cirkulært DNA (eccDNA) i tidligere stadier af CNV dannelse kunne belyse igangværende processer i genomiske omlejringer.
Tidligere de novo opdagelse af eccDNA var elektronmikrofotografier 3, Giemsa-farvning af metafasekromosomer 4 eller todimensional gelelektroforese 5. Disse metoder giver lidt eller ingen information om sekvensen af det cirkulære DNA. Målrettede teknikker såsom Southern blotting 6,7, omvendt PCR 8 eller fluorescens in situ hybridization 9 fremlægge dokumentation kun om bestemte eccDNA elementer. Ingen af disse metoder giver sekvensen af alle eksisterende eccDNA typer i en cellepopulation.
Genomisk divergens i en pulje af celler kan karakteriseres ved genom sekventering og / eller flisebelægning arrays 10,11. Detektering af en sletning eller amplifikation ved traditionelle DNA oprensningsmetoder kræver sædvanligvis, at en muteret allel repræsenterer mindst 0,1-1% af cellepopulationen 12,13. Acentriske eccDNAs forventes at være endnu mere transient i en cellekultur grund af deres manglende centromerer og potentiel mangel af DNA syntese ved replikation. Således da de fleste eccDNAs formodentlig er i små mængder og deres sekvenser ligner genomet, er der behov for alternative DNA ekstraktionsmetoder til påvisning eccDNAs.
Adskillige cirkulære DNA oprensningsteknikker udnytte de strukturelle forskelle mellem kromosomer og cirkulært DNA. For eksempel højhastighedsforbindelse ultracentrifugation i cæsium chlorid gradienter anvendes til at isolere 350-3000 basepar (bp) store eccDNAs fra den humane HeLa cancercellelinie 14. Dog kan høj hastighed knække eller nick rygraden i supercoilede cirkulære DNA-strukturer, ændre sedimentationshastigheden 15 og eccDNA udbytte. Dutta og medarbejdere udviklet en fremgangsmåde til de novo, genom-skala identifikation af cirkulært DNA fra musevæv samt fra kulturer af kylling og humane celler 16,17. Deres metode er ekstraktion af kerner fra homogeniseret væv ved saccharose ultracentrifugering efterfulgt af plasmid oprensning og flere runder af enzymatiske reaktioner og DNA ekstraktioner. Deres protokol identificerer primært 200-400 bp eccDNAs, kaldet microDNAs. Dutta og kolleger forsøgte også rensning af microDNAs fra Saccharomyces cerevisiae, men var ude af stand til at optage microDNA fra denne gær arter 16.
Vi har udviklet en ny fremgangsmåde tilde novo detektion af eccDNA fra gær kaldet Circle-Seq. Denne metode giver genom omfattende undersøgelser for cirkulære DNA-molekyler store nok til at bære hele gener og så stort som 86 kilobase (kb) mitokondrie-DNA (mtDNA). The Circle-Seq metode blev udviklet fra en veletableret prokaryot plasmid oprensningsmetode 18,19, optimeret til eukaryote gærceller og kombineret med dyb sekventering. Brug af Circle-Seq tilgang, 1756 forskellige eccDNAs, alle større end 1 kb, blev påvist fra ti S. cerevisiae S288C befolkninger 20. En størrelse cut-off blev valgt at fokusere på eccDNA der var store nok til at bære hele gener. Cirkel-Seq var meget følsomme; det detekterede et enkelt eccDNA inden tusindvis af celler 20. I den aktuelle undersøgelse blev Circle-Seq bruges til at isolere og identificere 294 eccDNAs fra tre biologiske gentagelser af en anden S. cerevisiae gærstamme, CEN.PK. Dataene viser, at eccDNA er en fælles genetisk element i S. cerevisiae-stammer.
Protocol
BEMÆRK: En oversigt over cirkulært DNA oprensning og sekventering metode (Circle-Seq) er illustreret i figur 1.
1. Dyrkning, Cell Harvest og plasmamembranen Forstyrrelse
- Pode gærceller (f.eks Saccharomyces cerevisiae) fra en olie / N-kulturen i 50 ml komplet næringssubstrat af gærpepton dextrose (YPD). Podning ved en lav initial celletæthed på 1-3 x 10 5 celler / ml eller en optisk densitet på ca. 0,01 OD600.
- Inkuber cellerne ved 30 ° C med omrøring ved 150 omdrejninger pr minut (rpm), indtil cellerne når maksimal celledensitet på ca. 1 x 10 10 celler, omtrent efter 24 til 48 timer eller en optisk densitet ved OD 600> 10,0.
BEMÆRK: Dyrkningstiden er ikke afgørende, da kan anvendes lavere koncentrationer celle.
- Inkuber cellerne ved 30 ° C med omrøring ved 150 omdrejninger pr minut (rpm), indtil cellerne når maksimal celledensitet på ca. 1 x 10 10 celler, omtrent efter 24 til 48 timer eller en optisk densitet ved OD 600> 10,0.
- Overfør forvokset kultur til et 50 ml konisk rør, pelletere cellerne ved centrifugering ved800 xg i 3 min og kassér supernatanten.
- Vask pelleten med 25 ml pufferopløsning af 10 mM Tris-CI, 1 mM EDTA, pH 8,0, re-pelletere cellerne ved centrifugering ved 800 xg i 3 min og kassér supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1,2 ml resuspensionsbuffer leveres fra et plasmid kolonne-oprensning kit.
- Valgfri trin: Tilføj stærkt fortyndet plasmider som kontroller til rensning af cirkulære DNA elementer 20.
BEMÆRK: I den aktuelle datasæt, blev et plasmid blanding 7,7 pi for hver prøve indeholdende 10 10 celler. Plasmidet stock blanding bestod af tre plasmider i forskellige koncentrationer; pBR322 ved 38 ng / prøve, pUC19 på 0,5 ng / prøve, og pUG72 på 0,01 ng / prøve. - Overfør cellesuspensionen i to 2 ml mikrocentrifugerør, hver suppleret med 0,5 mm glasperler i et 1: 3-forhold af det samlede suspension.
- Vortex hvert rør ved maksimal hastighed i 10 min for at forstyrre plasma cellemembraner. Pelletere perlerne ved centrifugering ved 268 x g i 30 sek og overføre 1,2 ml kombineret supernatant fra de to mikrocentrifugerør til et nyt rør.
BEMÆRK: Alternativ til trin 1,6-1,7, bruge zymolyase at forstyrre celler i 0,6 ml resuspension bufferopløsning. Ti enheder af zymolyase kan forstyrre 5 x 10 7 celler i 1,5 timer ved 35 ° C.
2. EccDNA berigelse ved søjlekromatografi
- Følge protokollen fra et kit til kolonne oprensning af plasmider. Kort fortalt, behandles hver prøve med 1,2 ml alkalisk opløsning, bland forsigtigt og inkuberes 3 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 1,2 ml neutraliseringsbuffer, bland forsigtigt og centrifuger ved 9650 xg i 5 min.
- Indlæse opløsningen på en søjle ækvilibreret med 1 ml ækvilibreringsopløsningen og tillade væske at strømme gennem kolonnen ved tyngdekraften.
- Kolonnen udvaskes med 4 ml vaskeopløsning. Når opløsningen er passeret gennem harpiksen, tilsættes forsigtigt 0,3 ml eluering såurening at erstatte det meste af 0,35 ml søjle void volumen.
- Eluere DNA i en ny samling rør med 1 ml elueringsopløsning og udfælde DNA'et ved tilsætning 0,8 ml udfældningsblanding. Centrifuger ved 9650 xg i 10 min.
- Vask DNA-pelleten med 0,5 ml 70% ethanol, centrifugeres ved 9650 xg i 5 min, lufttørre i 5 til 15 min og opløse det oprensede DNA i 25 pi sterilt vand.
BEMÆRK: Kun kortvarig opbevaring af DNA i vand anbefales. Fortrinsvis gå direkte til trin 3.
3. Fordøjelse af Resterende Linear Kromosomal DNA
- Eventuelt trin: For at lette specifikke fordøjelse af lineært DNA ved exonuklease, behandle det oprensede DNA med en sjælden-skæring endonuklease såsom Notl. For 5 ug DNA, bruge 1 enhed Notl, 5 pi 10x fordøjelse buffer og sterilt vand til et samlet volumen på 50 pi. Inkubér reaktionen ved 37 ° C i 16 timer og varme inaktivere endonukleasen ved 80 ° C i 5 min.
- Tilføj 20enheder exonuklease (2 pi), 4 pi ATP (25 mM), 34 pi sterilt vand og 10 pi 10x reaktionsbuffer direkte til 50 pi endonuklease-spaltet DNA at nå en 1x reaktionsvolumen på 100 pi, ved anvendelse af ATP-afhængige exonuklease kit.
- Udfør hydrolyse af lineær enkeltstrenget og dobbeltstrenget DNA ved 37 ° C i 5 dage eller mere. Tilføje en ekstra 4 pi ATP (25 mM), 0,6 pi 10 x reaktionsbuffer og 20 enheder exonuklease hver 24 timer for at fortsætte den enzymatiske DNA spaltning ved en 1x reaktionsvolumen.
- Efter fjernelse af lineært DNA, at prøve 2 pi fra exonuklease behandlede opløsning bekræfte fjernelse af kromosomal lineært DNA ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), under anvendelse af en kromosomal markør, såsom actin-genet ACT1 20.
- Hver 20 pi qPCR reaktion volumen indeholder 2 pi exonuclease-behandlede prøve, 150 Nm AKT1 primere 5'-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 'og 5'-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 ', 2% (volumen / volumen) dimethylsulfoxid, og 10 pi grønt fluorescerende masterblanding.
- Brug reaktionsbetingelserne; 3 min ved 95 ° C efterfulgt af 45 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 30 sekunder ved 60 ° C.
BEMÆRK: ACT1 er et særligt egnet markør for lineære DNA siden kopi nummer variationer i dette gen er skadelig 21-23 så eccDNA bør ikke bære ACT1. - Alternativer til analyse af DNA fordøjelse ved qPCR er standard PCR (4.3) eller propidiumiodid-farvning (4.4).
- Brug 2 pi exonuclease-behandlede prøve som PCR skabelon med AKT1 primere 5'-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 'og 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3'. Som positiv AKT1 kontrol, bruge 50-100 ng genomisk S. cerevisiae DNA som template. PCR-reaktionsbetingelser; 3 min ved 95 ° C, efterfulgt af 35 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 56 ° C og 1 min ved 72 ° C.
- Kør PCR-reaktioner ved gel electrophoresis på 1% agarose med 0,5 ug / ml ethidiumbromid. Kig efter en 0,8 kb ACT1 band.
- Fravær eller nærvær af lineært DNA kan også undersøges af propidiumiodid-farvning før og efter DNA-amplifikation.
- Bland hver DNA-prøve i en 1: 1 volumen med en 1: 1.000 H2O-fortyndet opløsning af 20 mM propidiumiodid lager. Efterlad opløsning i mørke i 10-20 min ved stuetemperatur og analysere DNA-farvning ved fluorescensmikroskopi ved 100x forstørrelse under anvendelse af en rød excitation fluorescens filter ved 663-738 nm og en eksponering-tid på 5 til 30 sek. Som DNA-farvning kontrol, brug ø29-amplificeret genomisk DNA fra gær og / eller ø29-amplificeret plasmid.
- Varmeinaktiveres exonuklease opløsning ved 70 ° C i 30 min.
4. DNA Amplification
- Forstærk den rensede og beriget eccDNA fra trin 3.5) med ø29 DNA-polymerase 24-26 overenskomsting til protokollen af polymerase producenten.
- Kort fortalt blandes 5 pi beriget eccDNA med 5 pi denaturering buffer.
- Efter 3 minutter ved stuetemperatur, tilsættes 10 pi neutraliseringsbuffer. Bland forsigtigt tilsættes 30 pi store blanding indeholdende 29 pi reaktionsbuffer og 1 pi ø29-DNA-polymerase. Inkubér reaktionen ved 30 ° C i 16 timer eller mere (op til 72 timer). Varmeinaktiveres ø29-DNA-polymerase ved 65 ° C i 3 minutter.
5. Sekventering og dataanalyse
- Forskyde amplificerede eccDNA med en fokuseret ultralydsapparat til en gennemsnitlig target peak størrelse på 300 bp. Brug følgende indstillinger for en 130 pi DNA-prøve: 450 W peak intensitet magt, 60 sek behandling, 30% duty faktor, 200 cyklusser per brast, 7 ° C.
- Tilføj stregkode indeks etiketter og adaptere til den fragmenterede læser til syntese af biblioteker for sekvensering, ved hjælp af en passende metode til biblioteket forberedelse.
- Dybe sekventering, for eksempel som 141-nukleotid single-enden aflæses på en high-throughput sekventering platform.
- Kort læser til gær henvisningen genom under efterforskning og tillade læser at kortlægge til flere regioner. For eksempel bruger en frit tilgængelig workflow-system 27,28 og korte læse aligner mapping-software 29.
- Identificer læser fra regioner af formodede eccDNAs hjælp sammenhængende læser, for eksempel mere end syv sammenhængende læser (> 1 kb) uden mellemrum 20.
BEMÆRK: Software er tilgængelig 27,28 for at udforske kortlagt læser på genomiske regioner af interesse.
Representative Results
For at validere Circle-Seq metode, tre S. cerevisiae CEN.PK populationer af 1 x 10 10 celler blev screenet efter celler blev dyrket separat i YPD i ti generationer. Kromosomalt lineære DNA elimination blev bekræftet ved fraværet af en qPCR AKT1 signal som tidligere beskrevet 20 (data ikke vist). Renset og beriget eccDNA blev sekventeret op til 68 mio læser (141-nukleotid single-end læser) og mappet til CEN.PK113-7D henvisning genom (version 19 af Juni 2012). Optagelser af formodede eccDNAs fra de tre prøver navngivne C1, C2 og C4 blev tildelt genomiske regioner kortlagt af sammenhængende læser længere end 1 kb. Baseret på 10.000 Monte Carlo-simuleringer, betydningen af hver region kortlagt af sammenhængende læser længere end 1 kb blev estimeret. Fra denne 79, 159 og 56 regioner blev kommenteret som sandsynlige eccDNA sekvenser (p <0,1, Datasæt 1). Antallet af indspillede contiguoos læser> 1 kb steg som en funktion af sekvens dybde tyder på, at endnu flere eccDNA elementer ville have været registreret, hvis prøverne var blevet sekventeret yderligere (figur 2). Som forventet Circle-Seq metode ekstraheret talrige læser fra et antal kendte cirkulære DNA-elementer, herunder 2μ plasmid, mitokondrie-DNA, ribosomalt RNA-gener på kromosom XII, og de tre interne kontrolsystemer plasmider pBR322, pUC19 og pUG72 der blev tilsat til prøver lige før søjleoprensning (figur 3).
Videoen viser et eksempel på sammenhængende læser, at mappet til HXT7 _ARS432_ HXT6 locus på kromosom IV. Tidligere blev [HXT6 / 7 cirkel] detekteret ved Circle-Seq i ti S288C populationer (hver med 1 x 10 10 celler) og den cirkulære DNA-struktur blev bekræftet ved omvendt PCR-analyse 20. Den [HXT6 / 7 circle] blev også registreret i hver af de tre CEN.PK populationer (figur 4A). Desuden er de fleste af de fælles eccDNA generne blandt udtages af CEN.PK overlappede eccDNA gener fra de S288C datasæt (figur 4B).
For at teste specificiteten af Circle-Seq protokol for cirkulært DNA oprensning, to prøver, hver med 30 pg genomisk DNA, blev testet. En prøve blev suppleret med 100 ng plasmid-DNA og eccDNA fra begge prøver blev renset ved Circle-Seq protokol. Efter kolonne separation blev DNA udbytte 1,27% (380 ng) for prøven uden plasmid (GD) og 1,60% (480 ng) for prøven med plasmid (GD + P). Effektiviteten af exonukleasebehandling blev testet for lineære DNA-indhold efter 29 timer og 72 timer ved anvendelse af PCR mod AKT1. Ingen prøver indeholdt amplificeret AKT1 (data ikke vist). En fraktion af hver exonuklease-behandlede prøve blev yderligere enmplified af ø29 polymerase og produkterne af enzymatiske reaktioner blev analyseret ved propidiumiodidfarvning (figur 5A-F) og agarosegelelektroforese (fig 5G). Prøver efter exonukleasebehandling viste minimal propidium jod-plet (figur 5A-B). Den ø29 - amplificerede prøve med kun genomisk DNA afslørede trådlignende strukturer (figur 5C) i lighed med kontrolprøven (figur 5E). Den ø29 - amplificeret prøve, der havde tilsat plasmid afslørede foci (Figur 5D) ligner plasmidet kontrol (figur 5F). Billederne viste, at ø29 polymerase beriget med cirkulært DNA løbet lineært DNA. De fleste lineære kromosomale DNA blev fjernet fra prøver efter 29 timers exonukleasebehandling (figur 5A-B, G). Dog var omfattende exonukleasebehandling i mere end 100 timer og mere end 100 enheder nødvendig for at fjerne alle kromosomale lineært DNA, som ø29 - amplificerede prøver stadig viste en baggrund af trådlignende strukturer efter 72 timer exonukleasebehandling (figur 5C-D).
. Figur 1. Oversigt over Circle-Seq metode Protokollen har 5 trin: 1) celledyrkning, 2) oprensning og berigelse af eccDNA ved søjlekromatografi, 3) spaltning af de resterende lineære kromosomale DNA i eluatet fraktion, 4) amplifikation af DNA ved ø29 DNA-polymerase, og 5) sekventering af højt beriget eccDNA og kortlægning af læser til S. cerevisiae henvisning genom. Klik her for at se en større version af dette tal.
p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg "/>
Figur 2. Sammenhængende læser> 1 kb som funktion af sekvens dybde. EccDNA fra 1 x 10 10 celler øges som en funktion af sekvens dybde (i millioner kortlagt læser). Vist: biologiske tre eksemplarer fra haploide CEN.PK S. cerevisiae populationer (C1, C2, C4) adskilt med 10 10 celledelinger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Påvisning af kendte cirkulære DNA elementer. (AB) Scatter plots af read-dækning (læs densitet) i procent for plasmider i CEN.PK biologiske replikerer C1, C2 og C4. (A) kortlagt læser for de endogene gærplasmider var: 2μ; [RDNA cirkel] (ribosomale RNA gener fra kromosom XII); og mtDNA (mitochondria'et). (B) Unique læser kortlagt til at styre plasmider. Kontrol- plasmider blev tilsat til prøverne før søjleoprensning. Plasmid nøgletal per celle var: pBR322 (plustegn) 1: 1, pUC19 (cirkler) 01:50, og pUG72 (trekanter) 1: 2.500.
Figur 4. Fælles eccDNA elementer i CEN.PK og S288C. (A) Venn-diagram viser overlap blandt de 476 gener på 294 eccDNA elementer i de tre CEN.PK prøver (C1, C2, C4). De 16 fælles overlappende eccDNA gener / plasmider kommenteret (alle gen navne er i Dataset 1). (B) Venn-diagram af alle registrerede gener på putative eccDNAs fra de tre CEN.PK prøver (C1, C2, C4), sammenlignet med alle optagne gener på formodede eccDNAs fra 10 S288C prøver: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (se reference 20). Vist er 13 biologiske gentagelser (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) med gener / plasmider og formodede eccDNA regioner, der overlappede minimum 2 stammebaggrunde og enten 3 eller flere forsøgsopstillinger. C prøver, CEN.PK; R og Z prøver, S288C BY4741; S prøver, S288C M3750. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Visualisering af DNA-prøver efter exonuclease og ø 2 9 behandling. (AF) propidiumiodidfarvning af DNA. Scale bar, 10 um. (A, C og E) Prøver med genomisk DNA (GD); (B og D) prøver med GD plus plasmid (GD + P). (
AIndstil 1 "src =" / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/>
Datasæt 1. Potentielle DNA cirkularisering regioner i CEN.PK. Klik her for at downloade denne fil.
Vist er sekvensdata og analyser for 348 regioner. Kolonner er AD, eccDNA kortlægning. A (første søjle fra venstre), prøve, hvorfra formodede eccDNA blev identificeret; B, kromosom; CD, start og slut koordinater af formodede eccDNAs. EH, eccDNA indhold. E, autonomt replikerende sekvens (ARS) i området; F, fuldstændige gen i regionen; G, en del af genet indeholdt i regionen; H, BLASTN-identificerede gen. IO, EccDNA dækning og p-værdier. Jeg, længste region med et unikt kommenteret sekvens i bp; J, antallet af alle kortlagt læser; K, dækning af alle kortlagt læser af fragmenter pr kb fra en million kortlagt læser (FPKM); L, p-værdi for formodede eccDNA forhold til forekomsten tilfældigt fra Monte Carlo-simuleringer; M, antal uniquely kortlagt læser; INGEN; som K og L kun bruger entydigt kortlagt læser (UFPKM). Parametre for kortlægning af læser og Monte Carlo-simuleringer var som beskrevet 20.
Discussion
The Circle-Seq metode tillader genom-skala detektion af eccDNA fra gærceller med sekvens-niveau opløsning. Fremgangsmåden er en mild eccDNA rensning, der ikke kræver intensiv vortex eller pipettering og bruger kolonne separation ved tyngdekraften at begrænse eccDNA brud som ville føre til exonukleasefordøjelse i det efterfølgende trin. Disse træk ved fremgangsmåden kan være afgørende for at detektere store eccDNAs som indeholder gensekvenser. Circle-Seq opdaget adskillige eccDNAs herunder fuld gener (Datasæt 1). Det detekterede også 86-kb gær mitokondrie-DNA. Således er denne protokol letter oprensning af store cirkulære DNA-elementer. At holde antallet af DNA-ekstraktionstrin til et minimum reducerer risikoen for eccDNA tab og maksimerer udbyttet. Baseret på resultater for kontrol, spiked-in plasmider, Cirkel-Seq er meget følsomme, påvisning af et enkelt cirkulært DNA fra 2.500 celler. Endvidere fjerner rigelige endogene plasmider, såsom 2μ; plasmid eller mitokondrie-DNA kan markant øge følsomheden. Hærdning af 2μ fra gærkulturer er blevet beskrevet 30. Alternativt kan 2μ og mitokondrie-DNA fjernelse opnås med en sjælden-skæring endonuklease, såsom Swal. Imidlertid kunne restriktionsenzymet trin målrette andre eccDNAs af interesse og begrænse det samlede eccDNA udbytte.
Kritiske trin for eccDNA detektion var fjernelse af lineært DNA (trin 3) og DNA-sekventering (trin 5) til en korrekt dybde. For at optage størstedelen af eccDNAs fra en celle population, kan dyb sekventering være påkrævet 20. Parret ende sekventering bør give endnu større tillid eccDNA afsløring, som cirkulære DNA vejkryds forventes at give parret ende læser dette kort discordantly. Disse uoverensstemmelser understøtter opdagelsen af cirkulære DNA-strukturer og kan potentielt anvendes som en yderligere eccDNA-detektion filter.
Den Circle-Seq metoden blev valideret ved brug tre uafhængige S. cerevisiae CEN.PK befolkninger. Fundne sekvenser omfattede tidligere rapporteret eccDNAs, endogene plasmider og spidse-i plasmider og hundredvis af formodede eccDNAs (Datasæt 1). Disse resultater understøtter tidligere Circle-Seq datasæt fra S. cerevisiae S288C 20. Opdagelsen af flere eccDNAs fælles for CEN.PK og S288C populationer indikerer, at disse loci har en tilbøjelighed til at eksistere som cirkulære elementer (figur 4). Vi har tidligere vist, at [GAP1 cirkel] er beriget under kvælstof begrænsede betingelser i CEN.PK baggrunden 8, selvom bevis for [GAP1 cirkel] i andre stammebaggrunde ikke er fundet. Finding af eccDNA fra CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111, og HXT6 HXT7 loci i både S288C og CEN.PK tyder på, at en disposition for DNA cirkularisering er conserveret mellem gærstammer. Det er fortsat til at blive vist, hvis [HXT6 / 7 cirkel], [ASP3-1 cirkel], [COS111 cirkel], og [CUP1-1 RSC30 cirkel] giver selektive fordele til celler, eller hvis deres eksistens blot er en effekt af høje DNA cirkularisering.
Tilsammen indikerer resultaterne, at Circle-Seq er velegnet til påvisning kilobase mellemstore eccDNAs og har fordele til at identificere eccDNAs med komplette gener. Circle-Seq er en yderst følsom metode, der muliggør hele genom-skala skærme eccDNAs fra gær. The Circle-Seq metode kan åbne et nyt felt for forskning med henblik på at belyse den rolle, eccDNA i at generere gen sletninger og amplificeringer. I betragtning af at DNA-arkitektur og struktur i høj grad er bevaret fra eukaryote gær til højere eukaryoter, Circle-Seq metode bør i princippet være applicable til alle eukaryote celler, med mindre ændringer. På nuværende tidspunkt kræver fremgangsmåden ikke synes at have nogen begrænsninger, selv om dens evne til at oprense megabasestørrelse eccDNAs har endnu ikke vist. Desuden er anvendelsen af ø29 DNA-polymerase, som anvender en rullende cirkel amplifikation metode 31, skaber en bias mod mindre eccDNAs gør eccDNA kvantificering vanskeligere. Circle-Seq registrerer eccDNAs store nok til at bære fuld gener, hvilket gør den velegnet til undersøgelser af dobbelt minutter-cirkulære DNA fra humane somatiske celler. Dobbelt minutter kan bidrage til kræft, når proto-onkogener forstærkes på disse elementer 32-37. Studier af eccDNAs i germlinie celler kunne anvendes til måling af kimlinie mutationsrater og vurdere sædkvaliteten, for eksempel i husdyr. , Cirkel-Seq har således potentialet til opnåelse indsigt i den hastighed, hvormed den genetiske variation opstår i form af kopiantal variation, og føre til en hidtil ukendt forståelse af sygdomme, der involverer genet kopi-nummer variation 38-40.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
| Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
| Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
| Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
| Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used. |
| NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
| Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
| pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. |
| QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
| REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase. |
| Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
| Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
| Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
| Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 genexxx::KanMX. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
| Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
| Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
| Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
| Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methods | |||
| 2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
| Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
| Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: 29. | |
| Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
| Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: 27-28. |
References
- Kugelberg, E., Kofoid, E., et al. The Tandem Inversion Duplication in Salmonella enterica.: Selection Drives Unstable Precursors to Final Mutation Types. Genetics. 185 (1), 65-80 (2010).
- Reams, A. B., Kofoid, E., Savageau, M., Roth, J. R. Duplication Frequency in a Population of Salmonella enterica. Rapidly Approaches Steady State With or Without Recombination. Genetics. 184 (4), 1077-1094 (2010).
- Smith, C. A., Vinograd, J. Small polydisperse circular DNA of HeLa cells. Journal of Molecular Biology. 69 (2), 163-178 (1972).
- Carroll, S. M., DeRose, M. L., et al. Double Minute Chromosomes Can Be Produced from Precursors Derived from a Chromosomal Deletion. Molecular and cellular biology. 8 (4), 1525-1533 (1988).
- Cohen, S., Yacobi, K., Segal, D. Extrachromosomal Circular DNA of Tandemly Repeated Genomic Sequences in Drosophila. Genome research. 13 (6A), 1133-1145 (2003).
- Horowitz, H., Haber, J. E. Identification of Autonomously Replicating Circular Subtelomeric Y' Elements in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 5 (9), 2369-2380 (1985).
- Moore, I. K., Martin, M. P., Dorsey, M. J., Paquin, C. E. Formation of Circular Amplifications in Saccharomyces cerevisiae by a Breakage-Fusion-Bridge Mechanism. Environmental and molecular mutagenesis. 36 (2), 113-120 (2000).
- Gresham, D., Usaite, R., Germann, S. M., Lisby, M., Botstein, D., Regenberg, B. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18551-18556 (2010).
- Windle, B., Draper, B. W., Yin, Y. X., O'Gorman, S., Wahl, G. M. A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation, and amplicon integration. Genes & development. 5 (2), 160-174 (1991).
- Gresham, D., Ruderfer, D. M., et al. Genome-Wide Detection of Polymorphisms at Nucleotide Resolution with a Single DNA Microarray. Science. 311 (5769), 1932-1936 (2006).
- Kidd, J. M., Cooper, G. M., et al. Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes. Nature. 453 (7191), 56-64 (2008).
- Gresham, D., Desai, M. M., Botstein, D., Dunham, M. J. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genetics. 4 (12), 1-19 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic Variation and the Fate of Beneficial Mutations in Asexual Populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- van Loon, N., Miller, D., Murnane, J. P. Formation of extrachromosomal circular DNA in HeLa cells by nonhomologous recombination. Nucleic Acids Research. 22 (13), 2447-2452 (1994).
- Vinograd, J., Lebowitz, J. Physical and Topological Properties of Circular Dna. Journal of General Physiology. 49 (6P2), 103 (1966).
- Shibata, Y., Kumar, P., et al. Extrachromosomal MicroDNAs and Chromosomal Microdeletions in Normal Tissues. Science. 336 (6077), 82-86 (2012).
- Dillon, L. W., Kumar, P., et al. Production of Extrachromosomal MicroDNAs Is Linked to Mismatch Repair Pathways and Transcriptional Activity. Cell Reports. 11 (11), 1749-1759 (2015).
- Li, L. L., Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Metamobilomics - our knowledge on the pool of plasmid encoded traits in natural environments using high-throughput sequencing. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 18, 5-7 (2012).
- Brown Kav, A., Sasson, G., Jami, E., Doron-Faigenboim, A., Benhar, I., Mizrahi, I. Insights into the bovine rumen plasmidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5452-5457 (2012).
- Møller, H. D., Parsons, L., Jørgensen, T. S., Botstein, D., Regenberg, B. Extrachromosomal circular DNA is common in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 201508825 (2015).
- Drubin, D. G., Miller, K. G., Botstein, D. Yeast Actin-Binding Proteins - Evidence for a Role in Morphogenesis. The Journal of cell biology. 107 (6), 2551-2561 (1988).
- Magdolen, V., Drubin, D. G., Mages, G., Bandlow, W. High levels of profilin suppress the lethality caused by overproduction of actin in yeast cells. FEBS letters. 316 (1), 41-47 (1993).
- Sandrock, T. M., Brower, S. M., Toenjes, K. A., Adams, A. Suppressor analysis of fimbrin (Sac6p) overexpression in yeast. Genetics. 151 (4), 1287-1297 (1999).
- Blanco, L., Bernad, A., Lázaro, J. M., Martìn, G., Garmendia, C., Salas, M. Highly Efficient DNA Synthesis by the Phage ø29 DNA Polymerase. The Journal of biological chemistry. 264 (15), 8935-8940 (1989).
- Dean, F. B. Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification. Genome research. 11 (6), 1095-1099 (2001).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using ø29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17332-17336 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy Team, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biology. 11 (8), 86 (2010).
- Giardine, B., Riemer, C., et al. Galaxy: A platform for interactive large-scale genome analysis. Genome research. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357 (2012).
- Tsalik, E. L., Gartenberg, M. R. Curing Saccharomyces cerevisiae of the 2 micron plasmid by targeted DNA damage. Yeast. 14 (9), Chichester, England 847-852 (1998).
- Norman, A., Riber, L., Luo, W., Li, L. L., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. An Improved Method for Including Upper Size Range Plasmids in Metamobilomes. PLoS ONE. 9 (8), e104405 (2014).
- Storlazzi, C. T., Lonoce, A., et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome research. 20 (9), 1198-1206 (2010).
- Von Hoff, D. D., Needham-VanDevanter, D. R., Yucel, J., Windle, B. E., Wahl, G. M. Amplified human MYC localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (13), 4804-4808 (1988).
- Raymond, E., Faivre, S., et al. Effects of hydroxyurea on extrachromosomal DNA in patients with advanced ovarian carcinomas. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 7 (5), 1171-1180 (2001).
- Shimizu, N. Extrachromosomal Double Minutes and Chromosomal Homogeneously Staining Regions as Probes for Chromosome Research. Cytogenetic and genome research. 124 (3-4), 3-4 (2009).
- Eckhardt, S. G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).
- Vogt, N., Lefèvre, S. -H., et al. Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11368-11373 (2004).
- Ahn, K., Gotay, N., et al. High rate of disease-related copy number variations in childhood onset schizophrenia. Molecular psychiatry. 19 (5), 568-572 (2013).
- Girirajan, S., Johnson, R. L., et al. Global increases in both common and rare copy number load associated with autism. Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).
- Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma. Nucleic Acids Research. , (2014).
