Abstract
Extrachromosomale circulaire DNA's (eccDNAs) zijn gemeenschappelijke genetische elementen in Saccharomyces cerevisiae en worden gerapporteerd in andere eukaryoten ook. EccDNAs bijdragen aan genetische variatie tussen somatische cellen van meercellige organismen en evolutie van eencellige eukaryoten. Gevoelige methoden voor het detecteren van eccDNA zijn nodig om duidelijk te maken hoe deze elementen van invloed zijn stabiliteit van het genoom en hoe milieu- en biologische factoren veroorzaken de vorming ervan in eukaryote cellen. Deze video presenteert een gevoelige eccDNA-zuivering methode genaamd Circle-Seq. De methode omvat kolom zuivering van circulaire DNA, het verwijderen van de resterende lineaire chromosomaal DNA, rolling-circle amplificatie van eccDNA, deep sequencing, en in kaart brengen. Uitgebreide exonuclease behandeld moesten voldoende lineaire chromosomaal DNA degradatie. De rollende cirkel amplificatie stapine-height:. normale; "> φ 29 polymerase verrijkt voor circulair DNA meer dan lineaire DNA Validatie van de Circle-Seq methode op drie S. cerevisiae CEN.PK populaties van 10 10 cellen gedetecteerd honderden eccDNA profielen in de maten groter dan 1 kilobase . Herhaalde bevindingen van ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 genen op cirkelvormige DNA in zowel S288c en CEN.PK suggereert dat DNA circularization wordt geconserveerd tussen stammen in deze loci. Kortom, de Circle-Seq methode heeft brede toepassing van genoom-schaal screening op eccDNA in eukaryoten alsook voor het detecteren van specifieke eccDNA.
Introduction
Detecteren vroege of voorbijgaande chromosomale amplificatie is moeilijk, omdat het vereist identificeren veranderingen in enkel DNA moleculen in grote populaties van cellen. Chromosomale copy-number variations (CNV) en zijn over het algemeen goed herkend na hun oprichting, waardoor alleen de laatste CNV structuur als bewijs van het mechanisme dat de variatie 1,2 gegenereerd. Het opsporen en herstellen van extrachromosomaal circulair DNA (eccDNA) in eerdere stadia van CNV vorming misschien lopende processen te ontrafelen in genomische herschikkingen.
Eerder, de novo ontdekt eccDNA was elektronmicrografen 3, Giemsa kleuring van metafase chromosomen 4, of tweedimensionale gelelektroforese 5. Deze werkwijzen bieden weinig of geen informatie over de sequentie van het circulaire DNA. Gerichte technieken zoals Southern blotting 6,7, inverse PCR 8 of fluorescentie in situ hybridization 9 bewijzen alleen over de specifieke eccDNA elementen. Geen van deze werkwijzen de volgorde van alle bestaande types eccDNA in een celpopulatie.
Genomic divergentie in een pool van cellen kan worden gekenmerkt door genome sequencing en / of tegelwerk arrays 10,11. Detecteren van een deletie of amplificatie door gebruikelijke DNA- zuiveringswerkwijzen vereist gewoonlijk dat een gemuteerd allel vormen ten minste 0,1-1% van de celpopulatie 12,13. Acentrisch eccDNAs verwachting nog transient in een celkweek te wijten aan hun gebrek centromeren en mogelijke afwezigheid van DNA-synthese bij replicatie. Aldus aangezien de meeste eccDNAs vermoedelijk zijn in kleine hoeveelheden en hun sequenties lijken het genoom, alternatieve DNA extractiemethoden nodig eccDNAs detecteren.
Verschillende circulaire DNA zuiveringstechnieken profiteren van de structurele verschillen tussen de chromosomen en circulaire DNA. Bijvoorbeeld, high-speed ultracentrifugatie in cesium-chloride gradiënten wordt gebruikt om 350-3000 basenparen (bp) grote eccDNAs isoleren van de humane HeLa kanker cellijn 14. Echter, kan een hoge-snelheid breken of nick de ruggengraat van supercoiled cirkelvormige DNA-structuren, het veranderen van de sedimentatie snelheid 15 en de eccDNA opbrengst. Dutta en medewerkers ontwikkelde een methode voor de novo, genoom-schaal identificatie van circulair DNA uit muizenweefsels en uit kweken van kip en menselijke cellen 16,17. Hun methode is extractie van kernen uit gehomogeniseerde weefsel door sucrose ultracentrifugatie gevolgd door plasmidezuivering en verscheidene rondes van enzymatische reacties en DNA extracties. Hun protocol identificeert vooral 200-400 bp eccDNAs, genaamd microDNAs. Dutta en collega's ook poging tot zuivering van microDNAs uit Saccharomyces cerevisiae, maar waren niet in staat om microDNA opnemen van deze gistsoort 16.
We hebben een nieuwe methode ontwikkeldde novo detectie van eccDNA uit gist genaamd Circle-Seq. Met deze methode kan genoom-schaal onderzoek naar circulaire DNA moleculen groot genoeg om hele genen dragen en zo groot als 86 kilobasen (kb) mitochondriaal DNA (mtDNA). The Circle-Seq methode werd ontwikkeld op basis van een gevestigde prokaryotische plasmide zuiveringsmethode 18,19, geoptimaliseerd voor eukaryotische gistcellen en gecombineerd met diepe sequencing. Met behulp van de Circle-Seq aanpak, 1756 verschillende eccDNAs, alle groter zijn dan 1 kb, werden gedetecteerd uit tien S. cerevisiae S288c populaties 20. Een maat cut-off gekozen richten op eccDNA die groot genoeg hele genen dragen waren. Circle-Seq was zeer gevoelig; ontdekte het één eccDNA binnen duizenden cellen 20. In de huidige studie werd cirkel-Seq gebruikt voor het isoleren en identificeren van 294 eccDNAs drie biologische replicaten van andere S. cerevisiae giststam, CEN.PK. De gegevens blijkt dat eccDNA is een veel voorkomende genetische element S. cerevisiae stammen.
Protocol
OPMERKING: Een overzicht van de circulaire DNA zuivering en sequencing methode (Circle-Seq) wordt geïllustreerd in figuur 1.
1. Teelt, Cell Harvest en Plasma Membrane Disruption
- Inoculeren gistcellen (bijvoorbeeld Saccharomyces cerevisiae) vanaf een O / N kweek in 50 ml compleet voedingsmedium gist pepton dextrose (YPD). Inoculeren bij een lage initiële celdichtheid van 1-3 x 10 5 cellen / ml of een optische dichtheid van ongeveer 0,01 OD 600.
- Incubeer de cellen bij 30 ° C onder roeren bij 150 omwentelingen per minuut (rpm) tot cellen te bereiken maximale celdichtheid van ongeveer 1 x 10 10 cellen, na ongeveer 24 tot 48 uur of een optische dichtheid bij OD 600> 10,0.
OPMERKING: De vorming tijd niet cruciaal lagere concentraties cel kan worden gebruikt.
- Incubeer de cellen bij 30 ° C onder roeren bij 150 omwentelingen per minuut (rpm) tot cellen te bereiken maximale celdichtheid van ongeveer 1 x 10 10 cellen, na ongeveer 24 tot 48 uur of een optische dichtheid bij OD 600> 10,0.
- Breng de kweek ontgroeid een 50 ml conische buis, pellet de cellen door centrifugatie bij800 g gedurende 3 min en gooi de supernatant.
- Was de pellet met 25 ml bufferoplossing van 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, opnieuw pellet van de cellen door centrifugatie bij 800 xg gedurende 3 min en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de cel pellet in 1,2 ml van een plasmide kolom zuivering kit resuspensiebuffer.
- Optionele stap: Voeg sterk verdund plasmiden als controles voor de zuivering van cirkelvormige DNA-elementen 20.
LET OP: In de huidige dataset, werd een 7,7 pi plasmide mengsel toegepast voor elk monster dat 10 10 cellen. Het plasmide voorraad mengsel bestond uit drie plasmiden in verschillende concentraties; pBR322 op 38 ng / sample, pUC19 bij 0,5 ng / sample en pUG72 bij 0,01 ng / sample. - Breng de celsuspensie in twee 2 ml micro-centrifugebuisjes, elk aangevuld met 0,5 mm glasparels bij een 1: 3 verhouding van het totale volume suspensie.
- Vortex elke buis op maximale snelheid gedurende 10 minuten aan plasma cel verstorenmembranen. Pellet de korrels door centrifugatie bij 268 xg gedurende 30 seconden en zet de gecombineerde 1,2 ml supernatans van de twee microcentrifugebuizen naar een nieuwe buis.
Opmerking: Als alternatief voor stap 1,6-1,7, zymolyase gebruiken om cellen in 0,6 ml resuspensie bufferoplossing verstoren. Tien eenheden van zymolyase verstoren 5 x 10 7 cellen in 1,5 uur bij 35 ° C.
2. EccDNA Verrijking met kolomchromatografie
- Volg het protocol van een kit voor kolom zuivering van plasmiden. Kortom, behandel elk monster met 1,2 ml alkalische oplossing, meng voorzichtig en incubeer 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 1,2 ml neutralisatiebuffer meng voorzichtig en centrifugeer bij 9650 xg gedurende 5 minuten.
- Laad de oplossing op een kolom geëquilibreerd met 1 ml equilibratie-oplossing en de vloeistof door de kolom te stromen door de zwaartekracht.
- Was de kolom met 4 ml wasoplossing. Wanneer de oplossing door het hars is gepasseerd, wordt voorzichtig 0,3 ml elutie zolutie de meeste 0,35 ml kolom leeg volume te vervangen.
- Elueer DNA in een nieuwe collectie buis met 1 ml elutie-oplossing en neerslaan van het DNA door het toevoegen van 0,8 ml neerslag mengsel. Centrifugeer bij 9650 xg gedurende 10 min.
- Was de DNA pellet met 0,5 ml 70% ethanol, centrifuge bij 9650 xg gedurende 5 min, lucht drogen gedurende 5 tot 15 minuten en los het gezuiverde DNA in 25 pi steriel water.
OPMERKING: Alleen korte termijn opslag van DNA in het water wordt aanbevolen. Bij voorkeur, ga dan naar stap 3.
3. Digestie van Resterende Linear chromosomaal DNA
- Optionele stap: Als u specifieke vertering van lineair DNA te vergemakkelijken door exonuclease, de behandeling van de gezuiverde DNA met een zeldzame-cutting endonuclease zoals Notl. Voor 5 ug DNA, 1 eenheid gebruikt Notl, 5 ui 10x spijsvertering en steriel water tot een totaal volume van 50 pl. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 16 uur en warmte inactiveren het endonuclease bij 80 ° C gedurende 5 minuten.
- Voeg 20eenheden exonuclease (2 ui), 4 gl ATP (25 mM), 34 pl steriel water en 10 pl 10x reactiebuffer direct naar 50 gl-endonuclease gesplitst DNA een 1x reactievolume van 100 pl te bereiken, waarvoor het ATP-afhankelijke exonuclease kit.
- Voer hydrolyse van lineaire enkelstrengs en dubbelstrengs DNA bij 37 ° C gedurende 5 dagen of meer. Voeg een extra 4 pl ATP (25 mM), 0,6 gl 10x reactiebuffer en 20 eenheden exonuclease elke 24 uur om de enzymatische digestie DNA in een reactievolume 1x voortgezet.
- Na verwijdering van lineair DNA, 2 pi monster van de exonuclease behandelde oplossing verwijdering van chromosomaal DNA door lineaire kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) met een chromosomale merker bevestigen zoals actine gen WERKW1 20.
- Elke 20 ui qPCR reactie volume bevat 2 pl-exonuclease behandelde monster, 150 nm WERKW1 primers 5'-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 'en 5'-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 ', 2% (volume / volume) dimethylsulfoxide en 10 gl groen fluorescent hoofdmengsel.
- Gebruik de reactie toestand; 3 min bij 95 ° C, gevolgd door 45 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 30 sec bij 60 ° C.
LET OP: WERKW1 is een bijzonder geschikte marker voor lineair DNA sinds copy number variations in dit gen zijn schadelijk 21-23 dus eccDNA mag niet dragen WERKW1. - Alternatieven voor analyse van DNA door digestie qPCR standaard PCR (4,3) of propidium iodide kleuring (4,4).
- Gebruik 2 pi-exonuclease behandelde monster als PCR sjabloon met WERKW1 primers 5'-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 'en 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3'. Als positieve WERKW1 controle, gebruiken 50-100 ng genomische S. cerevisiae DNA als matrijs. PCR-reactiecondities; 3 min bij 95 ° C, gevolgd door 35 cycli van 30 sec bij 95 ° C, 30 sec bij 56 ° C en 1 minuut bij 72 ° C.
- Run PCR reacties van gel electrophoresis op 1% agarose met 0,5 ug / ml ethidiumbromide. Kijk voor een 0,8 kb WERKW1 band.
- De afwezigheid of aanwezigheid van lineair DNA kan ook worden onderzocht door propidium iodide kleuring voor en na DNA amplificatie.
- Meng elk DNA monster op een 1: 1 volume van een 1: 1000 H 2 O-verdunde oplossing van 20 mM voorraad propidiumjodide. Laat oplossing in het donker gedurende 10-20 min bij RT en analyseren van DNA-kleuring met behulp van fluorescentie microscopie op 100x vergroting met behulp van een rode excitatie fluorescentie filter bij 663-738 nm en een blootstelling-tijd van 5 tot 30 sec. Als DNA-kleuring control, gebruik Ø29-geamplificeerd genomisch DNA van gist en / of-Ø29 plasmide geamplificeerd.
- Warmte inactiveren exonuclease oplossing bij 70 ° C gedurende 30 minuten.
4. DNA Amplificatie
- Versterken de gezuiverde en verrijkt eccDNA uit stap 3.5) met Ø29 DNA polymerase 24-26 accordgens het protocol van de fabrikant polymerase.
- In het kort, meng 5 ui verrijkt eccDNA met 5 pl denaturatie buffer.
- Na 3 min bij kamertemperatuur, voeg 10 ul neutralisatie buffer. Meng voorzichtig en voeg 30 ul master mix met 29 pi reactiebuffer en 1 pl Ø29 DNA polymerase. Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 16 uur of meer (tot 72 uur). Warmte inactiveren Ø29 DNA polymerase bij 65 ° C gedurende 3 min.
5. Sequencing en gegevensanalyse
- Shear de versterkte eccDNA met een gerichte ultrasonicator tot een gemiddelde doelstelling piek grootte van 300 bp. Gebruik de volgende instellingen voor een 130 ul DNA-monster: 450W piek intensiteit macht, 60 sec behandeling, 30% inschakelduur, 200 cycli per burst, 7 ° C.
- Voeg barcode index labels en adapters om de gefragmenteerde leest voor de synthese van bibliotheken voor sequentiebepaling, met behulp van een geschikte methode voor bibliotheek voorbereiding.
- Hebben diepe sequencing, bijvoorbeeld zoals 141-nucleotide Eenzijdige leest op een high-throughput sequencing platform.
- Kaart leest om de gist verwijzing genoom in onderzoek en laat leest toewijzen aan meerdere regio's. Gebruik bijvoorbeeld een vrij beschikbare workflowsysteem 27,28 en korte-read aligner mapping software 29.
- Identificeer leest van gebieden van vermoedelijke eccDNAs gebruikmakend van aangrenzende leest bijvoorbeeld meer dan zeven opeenvolgende leest (> 1 kb) zonder gaten 20.
LET OP: De software is beschikbaar 27,28 voor een verkenning in kaart gebracht leest op genomische regio's van belang.
Representative Results
Om de methode Circle-Seq, drie S. valideren cerevisiae CEN.PK populaties van 1 x 10 10 cellen werden gescreend na cellen afzonderlijk YPD gedurende tien generaties werden gekweekt. Chromosomaal DNA lineaire eliminatie werd bevestigd door het ontbreken van een qPCR WERKW1 signaal zoals eerder beschreven 20 (gegevens niet getoond). Gezuiverd en verrijkt eccDNA werd de sequentie tot 68 miljoen leest (141-nucleotide single-end gelezen) en toegewezen aan de CEN.PK113-7D verwijzing genoom (versie 19 juni 2012). Opnamen van vermeende eccDNAs van de drie monsters genaamd C1, C2 en C4 werden toegewezen aan genomische regio in kaart gebracht door opeenvolgend lezen langer dan 1 kb. Gebaseerd op 10.000 Monte Carlo simulaties, het belang van elke regio in kaart gebracht door opeenvolgende leest langer dan 1 kb geschat. Uit deze 79, 159 en 56 regio's werden geannoteerd zoveel kans eccDNA sequenties (p <0.1, dataset 1). Het aantal opgenomen contiguoons leest> 1 kb verhoogd als een functie van diepte sequentie suggereert dat nog eccDNA elementen zouden zijn opgenomen indien monsters werden gesequenced verder (figuur 2). Zoals verwacht, de cirkel-Seq werkwijze geëxtraheerd talrijke leest van een aantal bekende cirkelvormige DNA-elementen waaronder de 2μ plasmide, mitochondriaal DNA, ribosomale RNA genen op chromosoom XII en de drie interne controle plasmiden pBR322, pUC19 en pUG72 die werden ingespoten in monsters net voor kolomzuivering (figuur 3).
De video toont een voorbeeld aaneengesloten staat dat toegewezen aan de HXT7 _ARS432_ HXT6 locus op chromosoom IV. Eerder, de [HXT6 / 7 kring] werd gedetecteerd met cirkel-Seq tien S288c populaties (elk 1 x 10 10 cellen) en de circulaire DNA structuur werd bevestigd door omgekeerde PCR-analyse 20. De [HXT6 / 7 circle] Ook opgenomen in elk van de drie CEN.PK populaties (Figuur 4A). Bovendien zijn de meeste conventionele eccDNA genen onder identieke monsters van CEN.PK overlapt eccDNA genen van de S288c datasets (figuur 4B).
Om de specificiteit van de cirkel-Seq testprotocol voor circulair DNA-zuivering, twee monsters, elk met 30 ug genomisch DNA getest. Eén monster werd aangevuld met 100 ng plasmide-DNA en eccDNA van beide monsters werden gezuiverd door de Kring-Seq protocol. Na scheiding kolom, de DNA-opbrengst was 1,27% (380 ng) voor het monster zonder plasmide (GD) en 1,60% (480 ng) voor het monster met plasmide (GD + P). De efficiëntie van exonuclease behandeling werd getest op lineaire DNA gehalte na 29 uur en 72 uur met PCR tegen WERKW1. Nr monsters bevatten geamplificeerd ACT1 (gegevens niet getoond). Een deel van elke exonuclease behandelde monster werd verder eenmplified door de Ø29 polymerase en de produkten van enzymatische reacties werden geanalyseerd door propidiumjodide kleuring (figuur 5A-F) en agarose gelelektroforese (Figuur 5G). Monsters na exonuclease behandeling vertoonden minimale propidiumjodide-kleuring (figuur 5A-B). De Ø29 - geamplificeerd met uitsluitend genoom DNA openbaarde draadvormige structuren (Figuur 5C), vergelijkbaar met het controlemonster (figuur 5E). De Ø29 - geamplificeerd monster dat toegevoegd plasmide had geopenbaard brandpunten (figuur 5D) lijkt op het plasmide controle (Figuur 5F). De beelden gaven aan dat Ø29 polymerase verrijkt voor circulair DNA meer dan lineair DNA. Meest lineaire chromosomaal DNA werd uit de monsters na 29 uur exonuclease behandeling (figuur 5A-B, G). Echter uitgebreide exonuclease behandeling gedurende meer dan 100 uur en die meer dan 100 eenheden is moesten alle chromosomaal lineair DNA te verwijderen, zoals Ø29 - geamplificeerde monsters vertoonden nog een achtergrond van draadachtige structuren na 72 uur exonuclease behandeling (Figuur 5C-D).
. Figuur 1. Schema van de cirkel-Seq methode Het protocol heeft 5 stappen: 1) celcultuur, 2) zuivering en verrijking van eccDNA met kolomchromatografie 3) digestie resterende lineaire chromosomaal DNA in het eluaat fractie 4) amplificatie van DNA door Ø29 DNA polymerase, en 5) sequentiebepaling hoog verrijkt eccDNA en kartering van leest de S. cerevisiae verwijzing genoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg "/>
Figuur 2. Grenzend leest> 1 kb als functie van de diepte sequentie. EccDNA van 1 x 10 10 cellen toenemen als functie van de diepte sequentie (in miljoenen toegewezen gelezen). Getoond: biologische drievoud van haploïde CEN.PK S. cerevisiae populaties (C1, C2, C4), gescheiden door 10 10 celdelingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Detectie van bekende cirkelvormige DNA-elementen. (AB) Strooi percelen lees dekking (lees dichtheid) in procent voor plasmiden in CEN.PK biologische repliceert C1, C2 en C4. (A) toegewezen leest het endogene gist plasmiden waren: 2μ; [RDNA cirkel] (Ribosomale RNA genen van chromosoom XII); en mtDNA (het mitochondriale DNA). (B) Unieke leest toegewezen aan plasmiden beheersen. Controle plasmiden werden spiked in monsters vóór kolom zuivering. Plasmide verhoudingen per cel waren: pBR322 (plustekens) 1: 1, pUC19 (cirkels) 01:50 en pUG72 (driehoeken) 1: 2500.
Figuur 4. Gemeenschappelijke eccDNA elementen in CEN.PK en S288c. (A) Venn diagram weergave van overlap tussen de 476 genen op 294 eccDNA elementen in de drie CEN.PK monsters (C1, C2, C4). De 16 gemeenschappelijke overlappende eccDNA genen / plasmiden worden geannoteerd (alle gen namen zijn in dataset 1). (B) Venn diagram van alle gevonden genen vermeende eccDNAs de drie monsters CEN.PK (C1, C2, C4), vergeleken met alle opgeslagen genen vermeende eccDNAs van 10 S288c monsters: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (zie referentie 20). Getoond zijn 13 biologische repliceert (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) met genen / plasmiden en vermeende eccDNA regio's die een minimum van 2-stam achtergronden en 3 of meer experimentele opstellingen overlappen. C monsters, CEN.PK; R en Z monsters, S288c BY4741; S monsters, S288c M3750. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Visualisatie van DNA-monsters na exonuclease en ø 2 9 behandeling. (AF) propidiumjodide kleuring van DNA. Schaal bar, 10 micrometer. (A, C en E) De monsters met genomisch DNA (GD); (B en D) monsters met GD plus plasmide (GD + P). (
aset 1 "src =" / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/>
Dataset 1. Potentiële DNA circularization regio's in CEN.PK. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Getoond worden reeks gegevens en analyses voor 348 regio's. Kolommen zijn AD, eccDNA mapping. Een (eerste kolom van links), steekproef waaruit vermeende eccDNA werd geïdentificeerd; B-chromosoom; CD, begin en einde coördinaten van vermeende eccDNAs. EH, eccDNA content. E, autonoom replicerende sequentie (ARS) in het gebied; F, volledige gen in de regio; G, deel van gen opgenomen in het gebied; H, BLASTN geïdentificeerde gen. IO, EccDNA dekking en p-waarden. Ik, de langste regio met een unieke geannoteerde sequentie in bp; J, aantal van alle in kaart gebrachte leest; K, dekking van alle in kaart gebracht door leest fragmenten per kb van een miljoen toegewezen leest (FPKM); L, p-waarde voor vermeende eccDNA ten opzichte van optreden door het toeval van Monte Carlo simulaties; M, het aantal uniquely kaart gebracht leest; NEE; als K en L met alleen uniek in kaart gebracht leest (UFPKM). Parameters voor kartering lees- en Monte Carlo simulaties waren zoals beschreven 20.
Discussion
The Circle-Seq methode maakt het mogelijk genoom-schaal detectie van eccDNA uit gistcellen met sequentie-niveau resolutie. De werkwijze is een mild eccDNA zuivering die niet intensief vortex of pipetteren vereist en gebruikt scheidingskolom door zwaartekracht eccDNA breuk die leiden tot exonuclease vertering in de volgende stap. Deze kenmerken van de werkwijze kan cruciaal voor het detecteren van grote eccDNAs die gensequenties bevatten. Circle-Seq gedetecteerd talrijke eccDNAs met inbegrip van volledige genen (dataset 1). Gedetecteerd ook 86-kb gist mitochondriaal DNA. Zo, dit protocol vergemakkelijkt de zuivering van grote cirkelvormige DNA-elementen. Houden het aantal DNA extractiestappen tot een minimum vermindert het risico van verlies eccDNA en maximaliseert de opbrengst. Op basis van de resultaten voor de controle, spiked-in plasmiden, Circle-Seq is zeer gevoelig, het detecteren van een enkel cirkelvormig DNA van 2.500 cellen. Bovendien verwijderen overvloedige endogene plasmiden zoals 2μ; plasmide of mitochondriaal DNA kan aanzienlijk verhogen gevoeligheid. Harden van 2μ van gistkweken beschreven 30. Alternatief kan 2μ en mitochondriaal DNA verwijderd worden bereikt met een zeldzaam snijdend endonucléase zoals Swal. Echter, het restrictie-enzym stap zou kunnen richten op andere eccDNAs van belang en beperking van de totale opbrengst eccDNA.
Kritische stappen eccDNA detectie waren verwijdering van lineair DNA (stap 3) en DNA-sequentie (stap 5) om een juiste diepte. De meerderheid van eccDNAs opnemen van een celpopulatie, kan sequentie-analyse nodig 20. Gepaarde-end sequencing moet nog meer vertrouwen van eccDNA detectie, zoals circulaire DNA kruispunten zullen naar verwachting gepaard-end opleveren leest die kaart discordantly. Deze verschillen ondersteunen de ontdekking van circulaire DNA-structuren en kan eventueel worden gebruikt als extra eccDNA-detectiefilter.
The Circle-Seq methode werd gevalideerd met behulp van drie onafhankelijke S. cerevisiae CEN.PK populaties. Gedetecteerd sequenties opgenomen eerder gemeld eccDNAs, endogene plasmiden en spiked-in plasmiden en honderden vermeende eccDNAs (dataset 1). Deze bevindingen ondersteunen de vorige Circle-Seq datasets van S. cerevisiae S288c 20. De ontdekking van verschillende eccDNAs tot CEN.PK en S288c populaties gemeenschappelijke zien dat deze loci een neiging als cirkelvormige elementen (figuur 4) bestaan. We hebben eerder aangetoond dat de [GAP1 kring] verrijkt onder stikstof gelimiteerde gevallen bij de CEN.PK achtergrond 8, hoewel bewijs [GAP1 kring] in andere stam achtergronden is niet gevonden. Vinden van eccDNA uit de CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 en HXT6 HXT7 loci in zowel S288c en CEN.PK suggereert dat een aanleg voor DNA circularization is congeserveerd tussen de giststammen. Er moet nog worden weergegeven als [HXT6 / 7 cirkel], [ASP3-1 cirkel], [COS111 kring] en [CUP1-1 RSC30 kring] selectief voordeel toekennen aan cellen of als hun bestaan is slechts een effect van een hoog percentage DNA circularization.
Samengenomen, geven de resultaten aan dat Circle-Seq goed geschikt voor het detecteren kilobase-sized eccDNAs en heeft voordelen voor het identificeren eccDNAs complete genen. Circle-Seq is een zeer gevoelige methode die hele genoom-schaal schermen van eccDNAs maakt uit gist. The Circle-Seq methode kan een nieuw veld van onderzoek gericht op het ophelderen van de rol van eccDNA in het genereren van gen-deleties en amplificaties openen. Gezien het feit dat DNA architectuur en structuur grotendeels behouden van eukaryotische gist tot hogere eukaryoten, de Circle-Seq methode moet in principe worden applicablE om alle eukaryote cellen, met lichte wijzigingen. Momenteel gaat de werkwijze blijken geen beperkingen, maar het vermogen om megabase-sized eccDNAs zuiveren moet nog worden getoond. Bovendien, het gebruik van Ø29 DNA polymerase, waarbij een rollende cirkel amplificatie werkwijze 31 gebruikt, wordt een voorkeur voor kleinere eccDNAs maken eccDNA kwantificering bemoeilijkt. Circle-Seq detecteert eccDNAs groot genoeg is om de volledige genen dragen, waardoor het geschikt is voor studies over double minuten cirkelvormige DNA uit menselijke lichaamscellen. Dubbele minuut kan bijdragen aan kanker toen proto-oncogenen zijn geamplificeerd van deze elementen 32-37. Studies van eccDNAs in kiemlijncellen kunnen worden gebruikt om kiemlijn mutatie meten en evalueren zaadkwaliteit, bijvoorbeeld bij vee. Aldus cirkel-Seq heeft de potentie om inzicht geven in de snelheid waarmee genetische variatie ontstaat in de vorm van copy number variation, en leiden tot een nieuw begrip van ziekten die inhouden gen copy-number variation 38-40.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
| Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
| Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
| Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
| Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used. |
| NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
| Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
| pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. |
| QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
| REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase. |
| Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
| Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
| Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
| Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 genexxx::KanMX. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
| Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
| Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
| Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
| Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methods | |||
| 2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
| Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
| Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: 29. | |
| Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
| Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: 27-28. |
References
- Kugelberg, E., Kofoid, E., et al. The Tandem Inversion Duplication in Salmonella enterica.: Selection Drives Unstable Precursors to Final Mutation Types. Genetics. 185 (1), 65-80 (2010).
- Reams, A. B., Kofoid, E., Savageau, M., Roth, J. R. Duplication Frequency in a Population of Salmonella enterica. Rapidly Approaches Steady State With or Without Recombination. Genetics. 184 (4), 1077-1094 (2010).
- Smith, C. A., Vinograd, J. Small polydisperse circular DNA of HeLa cells. Journal of Molecular Biology. 69 (2), 163-178 (1972).
- Carroll, S. M., DeRose, M. L., et al. Double Minute Chromosomes Can Be Produced from Precursors Derived from a Chromosomal Deletion. Molecular and cellular biology. 8 (4), 1525-1533 (1988).
- Cohen, S., Yacobi, K., Segal, D. Extrachromosomal Circular DNA of Tandemly Repeated Genomic Sequences in Drosophila. Genome research. 13 (6A), 1133-1145 (2003).
- Horowitz, H., Haber, J. E. Identification of Autonomously Replicating Circular Subtelomeric Y' Elements in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 5 (9), 2369-2380 (1985).
- Moore, I. K., Martin, M. P., Dorsey, M. J., Paquin, C. E. Formation of Circular Amplifications in Saccharomyces cerevisiae by a Breakage-Fusion-Bridge Mechanism. Environmental and molecular mutagenesis. 36 (2), 113-120 (2000).
- Gresham, D., Usaite, R., Germann, S. M., Lisby, M., Botstein, D., Regenberg, B. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18551-18556 (2010).
- Windle, B., Draper, B. W., Yin, Y. X., O'Gorman, S., Wahl, G. M. A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation, and amplicon integration. Genes & development. 5 (2), 160-174 (1991).
- Gresham, D., Ruderfer, D. M., et al. Genome-Wide Detection of Polymorphisms at Nucleotide Resolution with a Single DNA Microarray. Science. 311 (5769), 1932-1936 (2006).
- Kidd, J. M., Cooper, G. M., et al. Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes. Nature. 453 (7191), 56-64 (2008).
- Gresham, D., Desai, M. M., Botstein, D., Dunham, M. J. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genetics. 4 (12), 1-19 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic Variation and the Fate of Beneficial Mutations in Asexual Populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- van Loon, N., Miller, D., Murnane, J. P. Formation of extrachromosomal circular DNA in HeLa cells by nonhomologous recombination. Nucleic Acids Research. 22 (13), 2447-2452 (1994).
- Vinograd, J., Lebowitz, J. Physical and Topological Properties of Circular Dna. Journal of General Physiology. 49 (6P2), 103 (1966).
- Shibata, Y., Kumar, P., et al. Extrachromosomal MicroDNAs and Chromosomal Microdeletions in Normal Tissues. Science. 336 (6077), 82-86 (2012).
- Dillon, L. W., Kumar, P., et al. Production of Extrachromosomal MicroDNAs Is Linked to Mismatch Repair Pathways and Transcriptional Activity. Cell Reports. 11 (11), 1749-1759 (2015).
- Li, L. L., Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Metamobilomics - our knowledge on the pool of plasmid encoded traits in natural environments using high-throughput sequencing. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 18, 5-7 (2012).
- Brown Kav, A., Sasson, G., Jami, E., Doron-Faigenboim, A., Benhar, I., Mizrahi, I. Insights into the bovine rumen plasmidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5452-5457 (2012).
- Møller, H. D., Parsons, L., Jørgensen, T. S., Botstein, D., Regenberg, B. Extrachromosomal circular DNA is common in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 201508825 (2015).
- Drubin, D. G., Miller, K. G., Botstein, D. Yeast Actin-Binding Proteins - Evidence for a Role in Morphogenesis. The Journal of cell biology. 107 (6), 2551-2561 (1988).
- Magdolen, V., Drubin, D. G., Mages, G., Bandlow, W. High levels of profilin suppress the lethality caused by overproduction of actin in yeast cells. FEBS letters. 316 (1), 41-47 (1993).
- Sandrock, T. M., Brower, S. M., Toenjes, K. A., Adams, A. Suppressor analysis of fimbrin (Sac6p) overexpression in yeast. Genetics. 151 (4), 1287-1297 (1999).
- Blanco, L., Bernad, A., Lázaro, J. M., Martìn, G., Garmendia, C., Salas, M. Highly Efficient DNA Synthesis by the Phage ø29 DNA Polymerase. The Journal of biological chemistry. 264 (15), 8935-8940 (1989).
- Dean, F. B. Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification. Genome research. 11 (6), 1095-1099 (2001).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using ø29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17332-17336 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy Team, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biology. 11 (8), 86 (2010).
- Giardine, B., Riemer, C., et al. Galaxy: A platform for interactive large-scale genome analysis. Genome research. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357 (2012).
- Tsalik, E. L., Gartenberg, M. R. Curing Saccharomyces cerevisiae of the 2 micron plasmid by targeted DNA damage. Yeast. 14 (9), Chichester, England 847-852 (1998).
- Norman, A., Riber, L., Luo, W., Li, L. L., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. An Improved Method for Including Upper Size Range Plasmids in Metamobilomes. PLoS ONE. 9 (8), e104405 (2014).
- Storlazzi, C. T., Lonoce, A., et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome research. 20 (9), 1198-1206 (2010).
- Von Hoff, D. D., Needham-VanDevanter, D. R., Yucel, J., Windle, B. E., Wahl, G. M. Amplified human MYC localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (13), 4804-4808 (1988).
- Raymond, E., Faivre, S., et al. Effects of hydroxyurea on extrachromosomal DNA in patients with advanced ovarian carcinomas. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 7 (5), 1171-1180 (2001).
- Shimizu, N. Extrachromosomal Double Minutes and Chromosomal Homogeneously Staining Regions as Probes for Chromosome Research. Cytogenetic and genome research. 124 (3-4), 3-4 (2009).
- Eckhardt, S. G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).
- Vogt, N., Lefèvre, S. -H., et al. Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11368-11373 (2004).
- Ahn, K., Gotay, N., et al. High rate of disease-related copy number variations in childhood onset schizophrenia. Molecular psychiatry. 19 (5), 568-572 (2013).
- Girirajan, S., Johnson, R. L., et al. Global increases in both common and rare copy number load associated with autism. Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).
- Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma. Nucleic Acids Research. , (2014).
